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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(6): 523-530

Published online June 30, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.6.523

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Synergistic Effects Exerted by the Combination of Aster glehni and Vitamin B Complex on Cognitive Improvement

Jeongho Jeong , Mi Kyung Lim, and Soyeon Lee

R&D Center, Koreaeundan Healthcare Co., Ltd.

Correspondence to:Soyeon Lee, R&D Center, Koreaeundan Healthcare Co., Ltd., 165, Manhae-ro, Danwon-gu, Ansan-si, Gyeonggi 15405, Korea, E-mail: sylee@eundan.co.kr

Received: March 15, 2022; Revised: April 11, 2022; Accepted: April 21, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Aster glehni Franchet et Sckmidt is mainly grown in Ulleungdo Island, Republic of Korea. It has been known as a medicinal herb that relieves frequent coughing, high fever, and severe pain. Although several recent studies have reported that Aster glehni might have neuroprotective and memory-enhancing effects, research on the effects of improving cognitive function is insufficient. This study was therefore undertaken to investigate whether ethanolic extracts from leaves and stems of Aster glehni (EAG) have an effect on improving cognitive functions, through in vitro and in vivo assays. In addition, synergistic effects on cognitive improvement were evaluated by applying a combination of EAG with the vitamin B complex (VBC). The in vivo studies determined that EAG exerts cognitive improvement effects by reducing escape latency and increasing the time spent in the platform quadrant in the Morris water maze test. EAG treatment also inhibited acetylcholinesterase activity and increased the level of acetylcholine in mouse brain tissues. Moreover, we observed a protective effect against β-amyloid-induced neurotoxicity in human neuroblastoma cells. These effects were further enhanced when combined with VBC. Therefore, these findings indicate that EAG treatment in combination with VBC has the potential to improve cognitive function more effectively than a single treatment.

Keywords: Aster glehni, vitamin B complex, synergistic effect, cognitive improvement, acetylcholinesterase

최근 현대사회는 의료, 보건 기술의 발달로 인해 평균수명이 늘어나면서 고령화 사회로 접어들고 있으며 이로 인해 노인성 질환에 대한 관심이 높아지고 있다. 치매는 고령화로 인해 발생하는 대표적인 노인성 질환 중 하나이며, 특히 치매 환자 중 60%가 알츠하이머병을 앓고 있는 것으로 알려져 있다(Blennow 등, 2006). 알츠하이머병은 인지기능이 점차 감소하는 것이 특징이며 주로 amyloid beta(Aβ)에 의한 노인성 신경반이 축적되거나 과인산화된 타우 단백질로 구성된 신경섬유 엉킴이 반복적으로 일어남에 따라 발생한다고 보고되고 있다(Chen 등, 2017). 특히 콜린성 신경전달물질인 acetylcholine(ACh)의 생성 및 분비기능 장애가 알츠하이머병과 깊은 관련이 있는 것으로 밝혀졌으며(Ferreira-Vieira 등, 2016; Hasselmo와 Bower, 1993), 이러한 결과를 토대로 acetylcholinesterase(AChE) 활성 저해를 통해 ACh 생성을 억제하는 donepezil, rivastigmine 등의 알츠하이머병 치료제가 개발되었다(Hansen 등, 2008). 하지만 이러한 약물들은 장기간 복용 시 메스꺼움, 구토, 설사와 같은 부작용들이 발생하는 것으로 보고되었다(Rogers 등, 1998). 따라서 부작용을 최소화하면서 우수한 인지기능 개선효능이 있는 천연물 소재의 개발이 필요한 상황이다.

섬쑥부쟁이(Aster glehni)는 울릉도에서 주로 재배되며 예로부터 기침 및 진통 완화, 해열 작용에 탁월한 효능을 가지는 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2017). 또한 최근 연구들을 통해 항염증, 항비만, 요산 수치 저하와 같은 다양한 효능들이 밝혀지고 있어 섬쑥부쟁이의 잠재적 효능에 관한 관심이 증가하고 있다(Choi 등, 2017a; Lee 등, 2013a; Park 등, 2018). 비타민은 신체기능 조절에 관여하는 필수적인 영양소이며 대부분 체내에서 합성되지 않아 반드시 식품으로부터 섭취해야 한다(Lee 등, 2005). 수용성비타민 중 비타민 B1은 탄수화물 대사와 신경전달에 필요한 보조 인자로 작용하며, 비타민 B2는 피부, 눈, 결합 조직을 포함한 생체 조직의 정상적인 기능을 위한 필수적인 영양소로 작용한다(Suh와 Kim, 2011; Kim, 2005). 나이아신(비타민 B3)의 경우 대사 과정에서 전자전달에 중요한 역할을 하는 조효소의 전구체이며(Wei 등, 2014), 판토텐산(비타민 B5)은 지방산 합성에 관여하는 효소의 필수적인 구성 성분으로 알려져 있다(Tahiliani와 Beinlich, 1991). 비타민 B6는 아미노산 대사에 관여하는 조효소로 작용하여 면역계 및 신경전달물질 합성에 관여하며(Choi 등, 2017b), 비오틴(비타민 B7)은 신체 내 각종 대사를 조절하는 조효소로 사용되어 손톱, 머리카락, 피부와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되어 있다(Streit와 Entcheva, 2003). 엽산(비타민 B9)과 비타민 B12는 핵산 합성에 필수적인 영양소로 작용하여 체내 아미노산 대사와 밀접한 관련이 있으며(Jin과 Lim, 2001; Ji 등, 2009), 고혈압, 심혈관계 질환을 야기하는 것으로 알려진 호모시스테인을 메티오닌으로 전환하는 과정에서 핵심적인 보조인자 역할을 한다(Ubbink 등, 1993).

우리의 선행연구에서 in vitroin vivo 실험을 통해 섬쑥부쟁이의 인지능력 및 기억력 개선에 대한 가능성을 확인하였으며(Liao 등, 2019; Lim 등, 2021), 비타민 B군들의 단독 처리를 통한 신경세포 보호 효과를 확인하였다. 그러나 이러한 연구 결과에도 불구하고 인지능력 개선을 목적으로 하는 천연물 소재의 개발을 위한 연구가 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 scopolamine으로 기억력 손상을 유도한 마우스에게 섬쑥부쟁이 잎, 줄기 70% 주정추출물을 투여한 후 Morris water maze test를 통하여 장기 기억력 및 공간 기억력 평가를 수행하였으며, 실험동물에서 적출한 뇌조직으로부터 AChE 활성 및 ACh 함량을 측정하였다. 또한 인체 유래 신경모세포종에서 신경세포사멸 억제 효과 확인을 통해 인지개선 효능을 판단하고자 하였다. 최근 국내외로 치매에 대한 관심이 증가함에 따라 인지개선에 대한 기능성 식품소재 개발 및 관련 시장이 발달하고 있으며, 이로 인해 천연물 소재를 사용한 인지개선 효능 연구가 활발히 진행되고 있다. 더불어 단일 소재뿐 아니라 다른 기능성 소재와 같이 병용했을 경우, 단독으로 사용했을 때보다 인지개선 효능이 더욱 증가하였다(Lin 등, 2020; Seo 등, 2018).

비타민 B 복합체는 세포 대사에서 중요한 역할을 수행하는 수용성비타민으로 면역기능 및 신경계 기능을 강화하고 근육의 건강 유지와 신진대사를 촉진하는 효과가 알려져 있으며, 이외에도 인지력 개선 및 치매의 치료와 예방에 효과가 있는 유효물질로도 보고되었다(Lee 등, 2013b). 따라서 본 연구에서는 이러한 연구 결과와 더불어 섬쑥부쟁이와 in vitro 상가·상승효과 물질 검색에서 우수한 신경세포 보호 효과를 보인 비타민 B군 복합물을 후보군으로 선정하였으며, 병용 시 인지개선에 대한 상승효과가 발생하는지 확인하였다. 또한 이러한 검증을 통해 최대의 상승효과가 발생하는 최적의 조합 및 과학적 근거를 제시하고자 하였다.

시료 추출 및 제조

본 연구에 사용한 섬쑥부쟁이는 울릉도에서 채취하였으며, 섬쑥부쟁이의 잎과 줄기를 자연 건조하여 분말화하였다. 70% 에탄올을 원재료의 15배로 넣고 75~80°C에서 4시간 동안 1차 추출을 진행하였고, 1차 추출을 마친 원재료에 다시 10배의 70% 에탄올을 넣고 75~80°C에서 2시간 동안 2차 추출하였다. 추출물을 여과한 후 50~55°C에서 농축하였으며 농축한 고형물과 동량의 덱스트린을 첨가하여 95°C에서 30분 동안 고압 멸균하고 분무 건조하였다(Lim 등, 2021). 건조한 분말을 최종적으로 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물(EAG)로 사용하였다(수득률: 26.67%). 비타민 B 복합물(VBC)은 고려은단헬스케어의 메가도스B 제품을 사용하였다. 본 실험에 사용한 시약으로 scopolamine, donepezil, thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT), dimethyl sulfide(DMSO), 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), acetylthiocholine iodide는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, amyloid beta는 Bachem(Torrance, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

실험동물

수컷 ICR 마우스를 오리엔트바이오(Seognam, Korea)에서 구입하였고 실험 시작 전 1주 동안 정해진 사육환경에서 순응시켰다. 사육환경은 온도(23±3°C), 상대습도(50±20%), 환기횟수(15~20회/시간), 12시간 간격(07:00~19:00)의 조명주기, 조도(150~300 lux)를 일정하게 유지하였으며 사료와 음용수는 자유롭게 급여하였다. 순응 기간 중 이상이 발생한 개체를 제외하고 각 군 간 평균 체중이 균일하도록 군 분리한 후 본 실험을 진행하였다. 본 동물실험은 동물실험윤리위원회(우정바이오)의 승인(승인번호: WJIACUC20191119-4-24)을 받아 수행하였다.

Morris water maze test

5주령 수컷 ICR 마우스(25~27 g)를 정상대조군, scopolamine 유도군, 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 투여군(30, 100, 300 mg/kg), 양성대조군(donepezil, 5 mg/kg)으로 나누어 실험군을 설정하였으며 각 실험군당 10마리로 구성하였다. Training trial 실시 1시간 전 마우스에 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 donepezil을 10% Tween 80 용액에 용해시켜 4일간 매일 경구투여하였으며 30분 후 0.9% saline에 용해시킨 scopolamine(1 mg/kg)을 복강투여하여 기억력 손상을 유도하였다. Morris water maze test는 5일간 진행되었으며 training trial과 probe trial로 구분하여 시험을 실시하였다. 본 실험 시작 전 원형수조(diameter: 90 cm, height: 45 cm)에 물을 30 cm까지 채우고 도피대를 수면 1 cm 아래로 숨겼다. 위치를 확인할 수 있게 네 가지의 각기 다른 표지를 벽의 4면에 부착하고 검정색 식용 안료로 물을 흐리게 하여 수면에서 도피대가 보이지 않게 하였다. Training trial은 총 4일 동안 진행되었으며 실험 시작 하루 전 마우스를 물이 가득 찬 원형수조에서 도피대 없이 60초 동안 자유롭게 수영시켜 환경에 적응시켰다. 본 실험에서 마우스를 수조의 사분면 중 한 구획에 내려놓은 다음 도피대까지 찾아가는 시간을 60초 동안 측정하고, 20분 후 다시 같은 위치에 마우스를 내려놓고 도피대까지 찾아가는 시간을 60초 동안 측정하였다. 이러한 과정을 시험기간 동안 마우스의 위치를 바꿔가면서 실시하며 도피대를 찾는 데까지 걸린 시간을 측정하였다. 시험 5일째에 마우스의 공간 기억력 평가를 위해 probe trial을 진행하였다. 수조 위 도피대를 제거하고 시험 첫날 마우스를 내려놓았던 위치에 마우스를 다시 놓은 후 도피대가 있는 구획에서의 수영 시간과 수영 속도를 측정하였다.

신경세포사멸 억제 효과

인체 유래 신경모세포종인 SH-SY5Y 세포는 한국세포주은행에서 분양받았으며 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s minimal essential medium(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 시험물질들의 신경세포사멸 억제 효과를 확인하기 위해 MTT assay를 통해 세포생존율을 측정하였다. SH-SY5Y 세포를 96-well plate에 well당 1×104개씩 분주하였으며, Aβ를 처리하지 않는 경우 시험물질들을 48시간 동안 처리하여 배양하였고 Aβ를 처리하는 경우 시험물질들을 1시간 전처리한 후 Aβ를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 이후 5 mg/mL MTT 시약을 배지에 첨가하고 37°C, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 생성된 MTT 포르마잔 결정을 DMSO에 용해시키고 마이크로플레이트 리더기(BioTek Co., Winooski, VT, USA)로 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 대조군을 기준으로 하여 백분율로 계산하였다.

AChE 활성 평가 및 ACh 함량 측정

4주령 수컷 ICR 마우스(18~22 g)를 정상대조군, scopolamine 유도군, 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 단독 투여군(10, 30 mg/kg), 비타민 B 복합물 단독 투여군(3, 10 mg/kg), 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 병용 투여군, 양성대조군(donepezil, 5 mg/kg)으로 나누어 실험군을 설정하였으며 각 실험군당 6마리로 구성하였다. 정해진 투여농도에서 마우스의 체중에 따른 용량을 계산하여 시료들을 칭량하고 멸균 증류수에 현탁 시킨 후 14일 동안 매일 경구투여하였다. 실험 마지막 날 scopolamine(1 mg/kg)을 부검 30분 전 마우스에 복강투여하여 기억력 손상을 유도하였다. 이후 모든 마우스를 isoflurane으로 흡입 마취하고 복대정맥을 절단하여 방혈치사 및 장기적출을 실시하였으며, 적출한 장기들은 -80°C에서 냉동 보관하였다.

AChE 활성은 Ellman 법(Ellman 등, 1961)을 변형하여 실시하였으며 모든 실험 과정은 4°C를 유지하여 진행하였다. 마우스 뇌 무게의 5배 용량의 100 mM sodium phosphate buffer(pH 8.0)를 첨가하고 homogenizer pestle로 분쇄하여 제조한 균질액을 13,000 rpm, 20분, 4°C에서 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액을 수득하고 단백질을 추출하여 본 실험에 사용하였다. 먼저 BCA assay를 통해 추출한 단백질의 농도를 측정하였으며 이후 추출한 단백질 12.5 μL, 100 mM sodium phosphate buffer(pH 8.0) 650 μL, 10 mM 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) 25 μL를 첨가하여 3분간 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 7.5 mM acetylthiocholine iodide 5 μL를 추가하고 96-well plate에 분주한 후 마이크로플레이트 리더기로 412 nm 파장에서 10분 동안 1분 간격으로 흡광도 변화를 관찰하였다.

ACh 함량 측정을 위해 마우스 뇌를 분쇄하여 제조한 균질액을 acetylcholine assay kit(MyBioSource, San Diego, CA, USA)에 동봉된 1× assay buffer로 50배 희석한 후에 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였다. ACh 함량은 마이크로플레이트 리더기로 540 nm 파장에서 측정한 흡광도를 acetylcholine standard graph에 대입하여 계산하였으며 뇌 균질액의 단백질 농도를 보정한 후 값으로 나타내었다.

통계분석

Morris water maze test의 실험 결과는 mean±SE로 나타내었으며 이를 제외한 나머지 실험 결과는 mean±SD로 나타내었다. Morris water maze test의 경우 모든 데이터에 대한 통계처리로 one-way ANOVA를 진행하였으며, 사후검정으로 Student-Newman-Keuls test를 실시하여 유의성이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다. Morris water maze test를 제외한 나머지 실험에서 실험군 간 통계적 차이는 Student’s t-test로 분석하였으며 유의성이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

기억손상 마우스 모델에서 Morris water maze test를 통한 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물의 기억력 개선 효과

본 연구에서는 cholinergic system을 방해하여 기억력 손상을 유도하는 scopolamine을 투여하여 기억력을 손상시킨 마우스 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물의 기억력 개선 효과를 판단하기 위해 Morris water maze test를 수행하였다(Fig. 1). 이전에 진행된 선행연구에서 scopolamine으로 기억력 손상을 유도한 마우스에서 섬쑥부쟁이 잎 70% 주정추출물 투여 시 passive avoidance test, Y-maze test, Morris water maze test 등의 행동 실험을 통해 기억력 및 행동 능력이 개선되는 것을 확인할 수 있었다(Liao 등, 2019). 하지만 섬쑥부쟁이 잎, 줄기 70% 주정추출물의 기억력 개선 효능을 밝혀내기 위한 행동 실험은 아직 진행되지 않았기 때문에 본 연구에서 섬쑥부쟁이 잎, 줄기 70% 주정추출물을 실험 물질로 선정하여 Morris water maze test를 통한 기억력 개선 효능을 확인하고자 하였다.

Fig. 1. Effects of EAG (30, 100, and 300 mg/kg) on scopolamine-induced impairment of long-term learning and memory in the Morris water maze test. (A) escape latency during the training trial, (B) swimming time in target quadrant, and (C) swimming speed during probe trial were examined. Training trials were conducted among 4 days. EAG (30, 100, and 300 mg/kg, p.o.), DNZ (5 mg/kg, p.o.), and the equal volume of vehicle solution (10% Tween 80 solution, p.o.) was used to treat the animals 1 h before the first training trial each day. And 30 min later, memory impairment was caused by scopolamine (1 mg/kg, i.p.). All values are expressed as mean±SEM (n=10). Comparisons between experimental groups were determined by one-way ANOVA and statistical significance was set as P<0.05. #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs normal group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs scopolamine-administered group. EAG, ethanolic extract of Aster glehni; DNZ, donepezil; NS, not significant.

Fig. 1A에서는 training trail에서 4일간 반복적인 훈련을 통해 변하는 탈출 시간을 나타내었다. 실험 결과, scopolamine 투여군의 경우 도피대를 찾아 탈출하는 데 걸리는 시간이 정상군에 비해 더딘 것을 확인하였다. 이는 scopolamine에 의해 기억력이 감퇴하여 4일간의 반복적인 학습에도 불구하고 도피대를 찾는 학습이 잘 이루어지지 않았다는 것을 의미한다. 반면 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 투여군의 경우 훈련 2일째부터 scopolamine 투여군에 비해 탈출 시간이 유의하게 감소하기 시작하였으며, 특히 마지막 4일째에 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 300 mg/kg 투여군(16.5±3.2 s)에서 scopolamine 투여군(35.1±5.5 s) 대비 탈출 시간이 유의하게 감소하였다(P<0.05, (P<0.01, (P<0.001). 추가로 앞서 진행된 training trail과 연결하여 5일째에 공간 기억력을 평가하기 위해 probe test를 진행하였으며 도피대가 존재했던 사분면에서의 수영 시간 및 수영 속도를 측정하였다. Scopolamine 투여군(14.3±0.7 s)에서 정상군(25.5±1.4 s)과 비교하여 도피대가 있는 사분면에서의 수영 시간이 유의적으로 감소하였는데, 이는 scopolamine 투여를 통해 기억력 손상이 나타나 도피대가 위치한 사분면을 기억하지 못한다는 것을 의미하며 scopolamine에 의해 감소했던 수영 시간은 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 100 mg/kg 투여군(20.9±2.0 s)과 300 mg/kg 투여군(23.5±1.4 s)에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 1B). 더불어 모든 투여군에서 수영 속도의 변화가 관찰되지 않았기 때문에 이러한 실험 결과가 활동성 변화에 의해 야기된 것이 아님을 확인하였다(Fig. 1C). 이러한 결과들을 통해 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 투여로 scopolamine에 의해 발생한 기억력 및 학습장애가 개선되는 것을 확인할 수 있었다.

결론적으로 scopolamine으로 기억력 손상을 유도한 마우스 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 투여했을 때 Morris water maze test를 통해 장기 기억력 및 공간 기억력이 개선되는 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과를 바탕으로 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물이 인지기능 개선에도 효과를 보이는지 확인하기 위해 추가적인 실험을 진행하였다.

인체 유래 신경모세포종인 SH-SY5Y 세포에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물에 따른 신경세포사멸 억제 효과

뇌에는 수많은 신경세포가 시냅스를 형성하고 있으므로 신경세포의 사멸은 인지기능의 장애를 유발할 수 있으며, 이미 다수의 논문에서 Aβ에 의해 사멸된 신경세포를 회복시키는 것이 인지기능 개선과 관련이 있다고 보고하고 있다(Cho 등, 2007; Park 등, 2016). 따라서 본 연구에서는 인체 유래 신경모세포종인 SH-SY5Y 세포에 Aβ를 처리하여 세포사멸을 유도한 후 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물을 처리하여 신경세포의 사멸을 억제하는 데 효과가 있는지 확인하였다. 더불어 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 선행연구를 통해 선별한 천연물질을 병용 처리하였을 때 상승효과가 발생하는지를 평가하였다.

본 연구진은 선행연구에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과의 병용 처리 시 상승효과가 나타날 가능성이 있는 물질을 탐색하기 위해 일차적으로 Aβ로 세포사멸을 유도한 SH-SY5Y 세포에 다양한 추출물 및 비타민을 단독 처리하였을 때 세포사멸이 개선된 후보군을 선정하였으며, 이후 선정한 후보군들과 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과의 병용 처리를 통해 상승효과가 가장 우수한 물질들을 선별하였다. 그 결과, 비타민 B군들과 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물을 병용하였을 때 신경세포사멸 억제에 대한 상승효과가 가장 뛰어난 것으로 나타났다. 따라서 이러한 연구 결과를 토대로 비타민 B군들이 혼합된 비타민 B 복합물을 최종 후보군으로 선정하였으며 선정한 비타민 B 복합물과 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물을 SH-SY5Y 세포에 단독 및 병용 처리하여 신경세포사멸 억제 효과 및 그에 대한 상승효과가 나타나는지 확인하였다.

먼저 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물 처리에 의해 발생하는 세포독성을 확인하기 위해서 MTT assay를 수행하였다. Aβ를 처리하지 않은 SH-SY5Y 세포에 시험물질을 단독 및 병용 처리한 후 세포생존율을 측정하였으며, 그 결과를 Fig. 2A에 제시하였다. 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 100 μg/mL와 비타민 B 복합물 0.1, 1, 10 μg/mL를 단독 및 병용 처리 시 세포독성이 발생하지 않는 것을 확인하였다. 이후 SH-SY5Y 세포에 Aβ를 처리하여 신경세포사멸을 유도한 뒤에 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물의 단독 처리에 의한 신경세포사멸 억제 효과 및 병용 처리를 통한 상승효과를 확인하였다(Fig. 2B). 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 100 μg/mL를 처리하였을 때 Aβ 처리군 대비 세포생존율이 유의하게 증가하였으며(P<0.001), 비타민 B 복합물 1, 10 μg/mL를 처리하였을 때 세포생존율이 Aβ 처리군 대비 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다(P<0.05). 더불어 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 100 μg/mL와 비타민 B 복합물 0.1, 1, 10 μg/mL를 병용 처리하였을 때, 각각의 단독 처리군 대비 세포생존율이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다(P<0.001). 병용 처리를 통해 상승효과가 발생하는지 확인하기 위해 combination index(CI)를 계산하여 분석하였다. CI 값이 1 미만일 때 상승효과가 존재한다고 판단하며(Chou, 2018), 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 100 μg/mL와 비타민 B 복합물 0.1, 1, 10 μg/mL 병용 처리군의 CI 값이 각각 0.75, 0.77, 0.92를 나타내었기 때문에 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 병용 처리 시 상승효과가 발생하는 것으로 판단하였다.

Fig. 2. Effect of EAG, VBC, and the combination treatment on cell viability in SH-SY5Y cell. SH-SY5Y cells (1×104 cells/well in 96-well plate) were (A) treated with EAG 100 μg/mL and VBC 0.1, 1, and 10 μg/mL for 24 h or (B) were pretreated with the indicated concentrations of EAG and VBC for 1 h prior to Aβ (10 μM) exposure for 24 h. The MTT assay was performed to determine the cell viability. All values are expressed as mean±SD (n=3). Comparisons between experimental groups were determined by Student’s t-test and statistical significance was set as P<0.05. ###P<0.001 vs normal group, *P<0.05, ***P<0.001 vs Aβ-induced group, P<0.05, ††P<0.01 vs EAG-treated group. EAG, ethanolic extract of Aster glehni; VBC, vitamin B complex; Aβ, β-amyloid.

이를 통해 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 단독 처리 시, 신경세포사멸 억제를 통한 신경세포 보호 효과가 발생했을 뿐만 아니라 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물 병용 처리에 의한 상승효과가 있음을 확인하였다.

기억손상 마우스 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물에 따른 AChE 활성 억제 및 ACh 함량 상승효과

AChE는 신경전달물질인 ACh을 분해하는 효소로 과도하게 활성화되면 신경전달 기능에 문제를 일으켜 인지능력을 저하시키는 것으로 알려져 있다(Talesa, 2001; Ballard 등, 2005). 여러 연구를 통해 AChE 활성 억제에 의한 ACh 함량 증가는 기억력 개선에 도움을 주는 것으로 밝혀졌다(Bohnen 등, 2005; Enz 등, 1993). 따라서 본 연구에서는 scopolamine을 투여하여 기억력 손상을 유도한 마우스 모델을 이용하여, 앞서 진행했던 실험에서 인지개선 가능성을 보인 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물을 투여한 후 AChE 활성과 ACh 함량을 측정하여 인지개선 효능이 발생하는지 확인하고, in vitro 실험과 마찬가지로 두 물질의 병용 투여를 통해 상승효과가 발생하는지 평가하고자 하였다.

먼저 마우스의 뇌에서 AChE 활성을 측정하여 Fig. 3에 나타내었다. AChE 활성은 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 10, 30 mg/kg 투여군에서 scopolamine 투여군에 비해 각각 32.6, 43.3% 유의하게 감소하였으며(P<0.001), 비타민 B 복합물 3, 10 mg/kg 투여군에서 scopolamine 투여군 대비 각각 25.3, 45.0% 유의하게 감소하였다(P<0.01, (P<0.001). 또한 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물의 상승효과를 확인하기 위해 두 가지 시료를 병용하여 투여한 결과, 모든 병용 투여군에서 각각의 단독 투여군 대비 AChE 활성이 더욱 억제되는 것을 확인하였다.

Fig. 3. . Effect of EAG (10 and 30 mg/kg), VBC (3 and 10 mg/kg), and the combination treatment on AChE activity in brain. All values were expressed as mean±SD (n=5∼6). EAG (10 and 30 mg/kg, p.o.), VBC (3 and 10 mg/kg, p.o.), DNZ (5 mg/kg, p.o.), and an equal volume of vehicle solution (DW, p.o.) were administered for 14 days. Memory impairment was induced by scopolamine (1 mg/kg, i.p.) 30 min before autopsy. Comparisons between experimental groups were determined by Student’s t-test and statistical significance was set as P<0.05. ###P<0.001 vs normal group, **P<0.01, ***P<0.001 vs scopolamine-administered group, P<0.05, ††P<0.01 vs EAG-administered group. AChE, acetylcholinesterase; Sco, scopolamine; EAG, ethanolic extract of Aster glehni; VBC, vitamin B complex; DNZ, donepezil.

또한 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 투여를 통해 변화하는 ACh 함량을 분석하기 위해 마우스 뇌에서 ACh 함량을 측정하여 Fig. 4에 제시하였다. Scopolamine 투여군에서 정상군에 비해 감소한 ACh 함량이 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 10, 30 mg/kg 투여군에서 scopolamine 투여군에 비해 각각 59.6, 88.3% 유의하게 증가하였으며, 비타민 B 복합물 3, 10 mg/kg 투여군에서 scopolamine 투여군 대비 53.3, 87.9% 유의하게 증가하였다(P<0.01). 마찬가지로 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물의 상승효과를 확인하기 위해 두 가지 시료를 병용하여 투여한 결과, 모든 병용 투여군에서 각각의 단독 투여군 대비 ACh 함량이 더욱 증가하는 것을 확인하였다. AChE 활성 및 ACh 함량에 대한 실험 결과를 토대로 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물 병용 투여군에서 상승효과가 발생했는지 확인하기 위해 분석한 결과, 모든 병용 투여군에서 CI 값을 계산하였을 때 1 미만을 나타냈기 때문에 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 병용 시 AChE 활성 억제 및 ACh 함량 증가에 대한 상승효과가 존재하는 것으로 판단하였다.

Fig. 4. Effect of EAG (10 and 30 mg/kg), VBC (3 and 10 mg/kg), and the combination treatment on ACh content in brain. All values were expressed as mean±SD (n=5∼6). EAG (10 and 30 mg/kg, p.o.), VBC (3 and 10 mg/kg, p.o.), DNZ (5 mg/kg, p.o.), and an equal volume of vehicle solution (DW, p.o.) were administered for 14 days. Memory impairment was induced by scopolamine (1 mg/kg, i.p.) 30 min before autopsy. Comparisons between experimental groups were determined by Student’s t-test and statistical significance was set as P<0.05. ###P<0.001 vs normal group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs scopolamine-administered group, P<0.05, ††P<0.01 vs EAG-administered group. Sco, scopolamine; EAG, ethanolic extract of Aster glehni; VBC, vitamin B complex; DNZ, donepezil.

결과적으로 scopolamine으로 기억손상을 유도한 마우스 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물 투여 시 AChE 활성 억제 및 ACh 함량 증가를 통한 인지개선 효능이 나타나는 것을 확인하였으며, 두 가지 물질을 병용 투여 시 각각의 단독 투여군 대비 상승효과가 발생하는 것을 확인하였다. 따라서 scopolamine에 의해 방해되었던 cholinergic system이 정상적으로 작용하여 과도한 AChE 활성을 억제시키고 감소했던 ACh 함량을 증가시킴으로써 신경전달물질 발현 증가를 통한 기억력 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구에서는 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 투여에 의한 인지기능 개선 효능을 확인하고자 하였다. 먼저 Morris water maze test를 통해 기억손상 마우스 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 투여에 의해 장기 기억력 및 공간 기억력이 향상됨으로써 인지기능 개선 기능성 소재에 대한 가능성을 확인하였다. 이에 추가로 in vitro 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물의 신경세포사멸 억제 효과를 확인하였으며, 더불어 비타민 B 복합물과의 병용 처리를 통해 상승효과가 발생하는 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과를 바탕으로 기억손상 마우스 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 투여에 의한 인지개선 효능을 평가한 결과, 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 단독 투여에 의해 scopolamine 유도군 대비 AChE 활성이 저하되고 ACh 함량이 증가하였으며, 두 시료를 병용하여 투여하였을 때 상승효과가 발생하는 것을 확인하였다. 본 연구 결과는 in vitroin vivo 실험에서 장기 기억력 및 공간 기억력 개선, 신경세포사멸 억제, AChE 활성 억제 및 ACh 함량 증가를 통해 인지기능 개선에 도움을 주는 기능성 소재로서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물의 개발 가능성을 보여주었다. 또한 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물의 병용 시 이러한 기능성이 더욱 상승하는 것을 확인하였으므로 이를 인지개선에 효과적인 기능성 제품 및 여러 가공품 개발에 적극 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구는 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술기획평가원의 고부가가치식품기술개발사업의 지원을 받아 수행되었습니다(과제번호: 117077-3).

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(6): 523-530

Published online June 30, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.6.523

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

섬쑥부쟁이 주정추출물과 비타민 B 복합물 병용에 의한 인지개선 상승효과

정정호․임미경․이소연

고려은단헬스케어 연구소

Received: March 15, 2022; Revised: April 11, 2022; Accepted: April 21, 2022

Synergistic Effects Exerted by the Combination of Aster glehni and Vitamin B Complex on Cognitive Improvement

Jeongho Jeong , Mi Kyung Lim, and Soyeon Lee

R&D Center, Koreaeundan Healthcare Co., Ltd.

Correspondence to:Soyeon Lee, R&D Center, Koreaeundan Healthcare Co., Ltd., 165, Manhae-ro, Danwon-gu, Ansan-si, Gyeonggi 15405, Korea, E-mail: sylee@eundan.co.kr

Received: March 15, 2022; Revised: April 11, 2022; Accepted: April 21, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Aster glehni Franchet et Sckmidt is mainly grown in Ulleungdo Island, Republic of Korea. It has been known as a medicinal herb that relieves frequent coughing, high fever, and severe pain. Although several recent studies have reported that Aster glehni might have neuroprotective and memory-enhancing effects, research on the effects of improving cognitive function is insufficient. This study was therefore undertaken to investigate whether ethanolic extracts from leaves and stems of Aster glehni (EAG) have an effect on improving cognitive functions, through in vitro and in vivo assays. In addition, synergistic effects on cognitive improvement were evaluated by applying a combination of EAG with the vitamin B complex (VBC). The in vivo studies determined that EAG exerts cognitive improvement effects by reducing escape latency and increasing the time spent in the platform quadrant in the Morris water maze test. EAG treatment also inhibited acetylcholinesterase activity and increased the level of acetylcholine in mouse brain tissues. Moreover, we observed a protective effect against β-amyloid-induced neurotoxicity in human neuroblastoma cells. These effects were further enhanced when combined with VBC. Therefore, these findings indicate that EAG treatment in combination with VBC has the potential to improve cognitive function more effectively than a single treatment.

Keywords: Aster glehni, vitamin B complex, synergistic effect, cognitive improvement, acetylcholinesterase

서 론

최근 현대사회는 의료, 보건 기술의 발달로 인해 평균수명이 늘어나면서 고령화 사회로 접어들고 있으며 이로 인해 노인성 질환에 대한 관심이 높아지고 있다. 치매는 고령화로 인해 발생하는 대표적인 노인성 질환 중 하나이며, 특히 치매 환자 중 60%가 알츠하이머병을 앓고 있는 것으로 알려져 있다(Blennow 등, 2006). 알츠하이머병은 인지기능이 점차 감소하는 것이 특징이며 주로 amyloid beta(Aβ)에 의한 노인성 신경반이 축적되거나 과인산화된 타우 단백질로 구성된 신경섬유 엉킴이 반복적으로 일어남에 따라 발생한다고 보고되고 있다(Chen 등, 2017). 특히 콜린성 신경전달물질인 acetylcholine(ACh)의 생성 및 분비기능 장애가 알츠하이머병과 깊은 관련이 있는 것으로 밝혀졌으며(Ferreira-Vieira 등, 2016; Hasselmo와 Bower, 1993), 이러한 결과를 토대로 acetylcholinesterase(AChE) 활성 저해를 통해 ACh 생성을 억제하는 donepezil, rivastigmine 등의 알츠하이머병 치료제가 개발되었다(Hansen 등, 2008). 하지만 이러한 약물들은 장기간 복용 시 메스꺼움, 구토, 설사와 같은 부작용들이 발생하는 것으로 보고되었다(Rogers 등, 1998). 따라서 부작용을 최소화하면서 우수한 인지기능 개선효능이 있는 천연물 소재의 개발이 필요한 상황이다.

섬쑥부쟁이(Aster glehni)는 울릉도에서 주로 재배되며 예로부터 기침 및 진통 완화, 해열 작용에 탁월한 효능을 가지는 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2017). 또한 최근 연구들을 통해 항염증, 항비만, 요산 수치 저하와 같은 다양한 효능들이 밝혀지고 있어 섬쑥부쟁이의 잠재적 효능에 관한 관심이 증가하고 있다(Choi 등, 2017a; Lee 등, 2013a; Park 등, 2018). 비타민은 신체기능 조절에 관여하는 필수적인 영양소이며 대부분 체내에서 합성되지 않아 반드시 식품으로부터 섭취해야 한다(Lee 등, 2005). 수용성비타민 중 비타민 B1은 탄수화물 대사와 신경전달에 필요한 보조 인자로 작용하며, 비타민 B2는 피부, 눈, 결합 조직을 포함한 생체 조직의 정상적인 기능을 위한 필수적인 영양소로 작용한다(Suh와 Kim, 2011; Kim, 2005). 나이아신(비타민 B3)의 경우 대사 과정에서 전자전달에 중요한 역할을 하는 조효소의 전구체이며(Wei 등, 2014), 판토텐산(비타민 B5)은 지방산 합성에 관여하는 효소의 필수적인 구성 성분으로 알려져 있다(Tahiliani와 Beinlich, 1991). 비타민 B6는 아미노산 대사에 관여하는 조효소로 작용하여 면역계 및 신경전달물질 합성에 관여하며(Choi 등, 2017b), 비오틴(비타민 B7)은 신체 내 각종 대사를 조절하는 조효소로 사용되어 손톱, 머리카락, 피부와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되어 있다(Streit와 Entcheva, 2003). 엽산(비타민 B9)과 비타민 B12는 핵산 합성에 필수적인 영양소로 작용하여 체내 아미노산 대사와 밀접한 관련이 있으며(Jin과 Lim, 2001; Ji 등, 2009), 고혈압, 심혈관계 질환을 야기하는 것으로 알려진 호모시스테인을 메티오닌으로 전환하는 과정에서 핵심적인 보조인자 역할을 한다(Ubbink 등, 1993).

우리의 선행연구에서 in vitroin vivo 실험을 통해 섬쑥부쟁이의 인지능력 및 기억력 개선에 대한 가능성을 확인하였으며(Liao 등, 2019; Lim 등, 2021), 비타민 B군들의 단독 처리를 통한 신경세포 보호 효과를 확인하였다. 그러나 이러한 연구 결과에도 불구하고 인지능력 개선을 목적으로 하는 천연물 소재의 개발을 위한 연구가 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 scopolamine으로 기억력 손상을 유도한 마우스에게 섬쑥부쟁이 잎, 줄기 70% 주정추출물을 투여한 후 Morris water maze test를 통하여 장기 기억력 및 공간 기억력 평가를 수행하였으며, 실험동물에서 적출한 뇌조직으로부터 AChE 활성 및 ACh 함량을 측정하였다. 또한 인체 유래 신경모세포종에서 신경세포사멸 억제 효과 확인을 통해 인지개선 효능을 판단하고자 하였다. 최근 국내외로 치매에 대한 관심이 증가함에 따라 인지개선에 대한 기능성 식품소재 개발 및 관련 시장이 발달하고 있으며, 이로 인해 천연물 소재를 사용한 인지개선 효능 연구가 활발히 진행되고 있다. 더불어 단일 소재뿐 아니라 다른 기능성 소재와 같이 병용했을 경우, 단독으로 사용했을 때보다 인지개선 효능이 더욱 증가하였다(Lin 등, 2020; Seo 등, 2018).

비타민 B 복합체는 세포 대사에서 중요한 역할을 수행하는 수용성비타민으로 면역기능 및 신경계 기능을 강화하고 근육의 건강 유지와 신진대사를 촉진하는 효과가 알려져 있으며, 이외에도 인지력 개선 및 치매의 치료와 예방에 효과가 있는 유효물질로도 보고되었다(Lee 등, 2013b). 따라서 본 연구에서는 이러한 연구 결과와 더불어 섬쑥부쟁이와 in vitro 상가·상승효과 물질 검색에서 우수한 신경세포 보호 효과를 보인 비타민 B군 복합물을 후보군으로 선정하였으며, 병용 시 인지개선에 대한 상승효과가 발생하는지 확인하였다. 또한 이러한 검증을 통해 최대의 상승효과가 발생하는 최적의 조합 및 과학적 근거를 제시하고자 하였다.

재료 및 방법

시료 추출 및 제조

본 연구에 사용한 섬쑥부쟁이는 울릉도에서 채취하였으며, 섬쑥부쟁이의 잎과 줄기를 자연 건조하여 분말화하였다. 70% 에탄올을 원재료의 15배로 넣고 75~80°C에서 4시간 동안 1차 추출을 진행하였고, 1차 추출을 마친 원재료에 다시 10배의 70% 에탄올을 넣고 75~80°C에서 2시간 동안 2차 추출하였다. 추출물을 여과한 후 50~55°C에서 농축하였으며 농축한 고형물과 동량의 덱스트린을 첨가하여 95°C에서 30분 동안 고압 멸균하고 분무 건조하였다(Lim 등, 2021). 건조한 분말을 최종적으로 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물(EAG)로 사용하였다(수득률: 26.67%). 비타민 B 복합물(VBC)은 고려은단헬스케어의 메가도스B 제품을 사용하였다. 본 실험에 사용한 시약으로 scopolamine, donepezil, thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT), dimethyl sulfide(DMSO), 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), acetylthiocholine iodide는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, amyloid beta는 Bachem(Torrance, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

실험동물

수컷 ICR 마우스를 오리엔트바이오(Seognam, Korea)에서 구입하였고 실험 시작 전 1주 동안 정해진 사육환경에서 순응시켰다. 사육환경은 온도(23±3°C), 상대습도(50±20%), 환기횟수(15~20회/시간), 12시간 간격(07:00~19:00)의 조명주기, 조도(150~300 lux)를 일정하게 유지하였으며 사료와 음용수는 자유롭게 급여하였다. 순응 기간 중 이상이 발생한 개체를 제외하고 각 군 간 평균 체중이 균일하도록 군 분리한 후 본 실험을 진행하였다. 본 동물실험은 동물실험윤리위원회(우정바이오)의 승인(승인번호: WJIACUC20191119-4-24)을 받아 수행하였다.

Morris water maze test

5주령 수컷 ICR 마우스(25~27 g)를 정상대조군, scopolamine 유도군, 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 투여군(30, 100, 300 mg/kg), 양성대조군(donepezil, 5 mg/kg)으로 나누어 실험군을 설정하였으며 각 실험군당 10마리로 구성하였다. Training trial 실시 1시간 전 마우스에 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 donepezil을 10% Tween 80 용액에 용해시켜 4일간 매일 경구투여하였으며 30분 후 0.9% saline에 용해시킨 scopolamine(1 mg/kg)을 복강투여하여 기억력 손상을 유도하였다. Morris water maze test는 5일간 진행되었으며 training trial과 probe trial로 구분하여 시험을 실시하였다. 본 실험 시작 전 원형수조(diameter: 90 cm, height: 45 cm)에 물을 30 cm까지 채우고 도피대를 수면 1 cm 아래로 숨겼다. 위치를 확인할 수 있게 네 가지의 각기 다른 표지를 벽의 4면에 부착하고 검정색 식용 안료로 물을 흐리게 하여 수면에서 도피대가 보이지 않게 하였다. Training trial은 총 4일 동안 진행되었으며 실험 시작 하루 전 마우스를 물이 가득 찬 원형수조에서 도피대 없이 60초 동안 자유롭게 수영시켜 환경에 적응시켰다. 본 실험에서 마우스를 수조의 사분면 중 한 구획에 내려놓은 다음 도피대까지 찾아가는 시간을 60초 동안 측정하고, 20분 후 다시 같은 위치에 마우스를 내려놓고 도피대까지 찾아가는 시간을 60초 동안 측정하였다. 이러한 과정을 시험기간 동안 마우스의 위치를 바꿔가면서 실시하며 도피대를 찾는 데까지 걸린 시간을 측정하였다. 시험 5일째에 마우스의 공간 기억력 평가를 위해 probe trial을 진행하였다. 수조 위 도피대를 제거하고 시험 첫날 마우스를 내려놓았던 위치에 마우스를 다시 놓은 후 도피대가 있는 구획에서의 수영 시간과 수영 속도를 측정하였다.

신경세포사멸 억제 효과

인체 유래 신경모세포종인 SH-SY5Y 세포는 한국세포주은행에서 분양받았으며 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s minimal essential medium(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 시험물질들의 신경세포사멸 억제 효과를 확인하기 위해 MTT assay를 통해 세포생존율을 측정하였다. SH-SY5Y 세포를 96-well plate에 well당 1×104개씩 분주하였으며, Aβ를 처리하지 않는 경우 시험물질들을 48시간 동안 처리하여 배양하였고 Aβ를 처리하는 경우 시험물질들을 1시간 전처리한 후 Aβ를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 이후 5 mg/mL MTT 시약을 배지에 첨가하고 37°C, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 생성된 MTT 포르마잔 결정을 DMSO에 용해시키고 마이크로플레이트 리더기(BioTek Co., Winooski, VT, USA)로 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 대조군을 기준으로 하여 백분율로 계산하였다.

AChE 활성 평가 및 ACh 함량 측정

4주령 수컷 ICR 마우스(18~22 g)를 정상대조군, scopolamine 유도군, 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 단독 투여군(10, 30 mg/kg), 비타민 B 복합물 단독 투여군(3, 10 mg/kg), 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 병용 투여군, 양성대조군(donepezil, 5 mg/kg)으로 나누어 실험군을 설정하였으며 각 실험군당 6마리로 구성하였다. 정해진 투여농도에서 마우스의 체중에 따른 용량을 계산하여 시료들을 칭량하고 멸균 증류수에 현탁 시킨 후 14일 동안 매일 경구투여하였다. 실험 마지막 날 scopolamine(1 mg/kg)을 부검 30분 전 마우스에 복강투여하여 기억력 손상을 유도하였다. 이후 모든 마우스를 isoflurane으로 흡입 마취하고 복대정맥을 절단하여 방혈치사 및 장기적출을 실시하였으며, 적출한 장기들은 -80°C에서 냉동 보관하였다.

AChE 활성은 Ellman 법(Ellman 등, 1961)을 변형하여 실시하였으며 모든 실험 과정은 4°C를 유지하여 진행하였다. 마우스 뇌 무게의 5배 용량의 100 mM sodium phosphate buffer(pH 8.0)를 첨가하고 homogenizer pestle로 분쇄하여 제조한 균질액을 13,000 rpm, 20분, 4°C에서 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액을 수득하고 단백질을 추출하여 본 실험에 사용하였다. 먼저 BCA assay를 통해 추출한 단백질의 농도를 측정하였으며 이후 추출한 단백질 12.5 μL, 100 mM sodium phosphate buffer(pH 8.0) 650 μL, 10 mM 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) 25 μL를 첨가하여 3분간 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 7.5 mM acetylthiocholine iodide 5 μL를 추가하고 96-well plate에 분주한 후 마이크로플레이트 리더기로 412 nm 파장에서 10분 동안 1분 간격으로 흡광도 변화를 관찰하였다.

ACh 함량 측정을 위해 마우스 뇌를 분쇄하여 제조한 균질액을 acetylcholine assay kit(MyBioSource, San Diego, CA, USA)에 동봉된 1× assay buffer로 50배 희석한 후에 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였다. ACh 함량은 마이크로플레이트 리더기로 540 nm 파장에서 측정한 흡광도를 acetylcholine standard graph에 대입하여 계산하였으며 뇌 균질액의 단백질 농도를 보정한 후 값으로 나타내었다.

통계분석

Morris water maze test의 실험 결과는 mean±SE로 나타내었으며 이를 제외한 나머지 실험 결과는 mean±SD로 나타내었다. Morris water maze test의 경우 모든 데이터에 대한 통계처리로 one-way ANOVA를 진행하였으며, 사후검정으로 Student-Newman-Keuls test를 실시하여 유의성이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다. Morris water maze test를 제외한 나머지 실험에서 실험군 간 통계적 차이는 Student’s t-test로 분석하였으며 유의성이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

결과 및 고찰

기억손상 마우스 모델에서 Morris water maze test를 통한 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물의 기억력 개선 효과

본 연구에서는 cholinergic system을 방해하여 기억력 손상을 유도하는 scopolamine을 투여하여 기억력을 손상시킨 마우스 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물의 기억력 개선 효과를 판단하기 위해 Morris water maze test를 수행하였다(Fig. 1). 이전에 진행된 선행연구에서 scopolamine으로 기억력 손상을 유도한 마우스에서 섬쑥부쟁이 잎 70% 주정추출물 투여 시 passive avoidance test, Y-maze test, Morris water maze test 등의 행동 실험을 통해 기억력 및 행동 능력이 개선되는 것을 확인할 수 있었다(Liao 등, 2019). 하지만 섬쑥부쟁이 잎, 줄기 70% 주정추출물의 기억력 개선 효능을 밝혀내기 위한 행동 실험은 아직 진행되지 않았기 때문에 본 연구에서 섬쑥부쟁이 잎, 줄기 70% 주정추출물을 실험 물질로 선정하여 Morris water maze test를 통한 기억력 개선 효능을 확인하고자 하였다.

Fig 1. Effects of EAG (30, 100, and 300 mg/kg) on scopolamine-induced impairment of long-term learning and memory in the Morris water maze test. (A) escape latency during the training trial, (B) swimming time in target quadrant, and (C) swimming speed during probe trial were examined. Training trials were conducted among 4 days. EAG (30, 100, and 300 mg/kg, p.o.), DNZ (5 mg/kg, p.o.), and the equal volume of vehicle solution (10% Tween 80 solution, p.o.) was used to treat the animals 1 h before the first training trial each day. And 30 min later, memory impairment was caused by scopolamine (1 mg/kg, i.p.). All values are expressed as mean±SEM (n=10). Comparisons between experimental groups were determined by one-way ANOVA and statistical significance was set as P<0.05. #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs normal group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs scopolamine-administered group. EAG, ethanolic extract of Aster glehni; DNZ, donepezil; NS, not significant.

Fig. 1A에서는 training trail에서 4일간 반복적인 훈련을 통해 변하는 탈출 시간을 나타내었다. 실험 결과, scopolamine 투여군의 경우 도피대를 찾아 탈출하는 데 걸리는 시간이 정상군에 비해 더딘 것을 확인하였다. 이는 scopolamine에 의해 기억력이 감퇴하여 4일간의 반복적인 학습에도 불구하고 도피대를 찾는 학습이 잘 이루어지지 않았다는 것을 의미한다. 반면 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 투여군의 경우 훈련 2일째부터 scopolamine 투여군에 비해 탈출 시간이 유의하게 감소하기 시작하였으며, 특히 마지막 4일째에 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 300 mg/kg 투여군(16.5±3.2 s)에서 scopolamine 투여군(35.1±5.5 s) 대비 탈출 시간이 유의하게 감소하였다(P<0.05, (P<0.01, (P<0.001). 추가로 앞서 진행된 training trail과 연결하여 5일째에 공간 기억력을 평가하기 위해 probe test를 진행하였으며 도피대가 존재했던 사분면에서의 수영 시간 및 수영 속도를 측정하였다. Scopolamine 투여군(14.3±0.7 s)에서 정상군(25.5±1.4 s)과 비교하여 도피대가 있는 사분면에서의 수영 시간이 유의적으로 감소하였는데, 이는 scopolamine 투여를 통해 기억력 손상이 나타나 도피대가 위치한 사분면을 기억하지 못한다는 것을 의미하며 scopolamine에 의해 감소했던 수영 시간은 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 100 mg/kg 투여군(20.9±2.0 s)과 300 mg/kg 투여군(23.5±1.4 s)에서 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 1B). 더불어 모든 투여군에서 수영 속도의 변화가 관찰되지 않았기 때문에 이러한 실험 결과가 활동성 변화에 의해 야기된 것이 아님을 확인하였다(Fig. 1C). 이러한 결과들을 통해 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 투여로 scopolamine에 의해 발생한 기억력 및 학습장애가 개선되는 것을 확인할 수 있었다.

결론적으로 scopolamine으로 기억력 손상을 유도한 마우스 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 투여했을 때 Morris water maze test를 통해 장기 기억력 및 공간 기억력이 개선되는 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과를 바탕으로 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물이 인지기능 개선에도 효과를 보이는지 확인하기 위해 추가적인 실험을 진행하였다.

인체 유래 신경모세포종인 SH-SY5Y 세포에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물에 따른 신경세포사멸 억제 효과

뇌에는 수많은 신경세포가 시냅스를 형성하고 있으므로 신경세포의 사멸은 인지기능의 장애를 유발할 수 있으며, 이미 다수의 논문에서 Aβ에 의해 사멸된 신경세포를 회복시키는 것이 인지기능 개선과 관련이 있다고 보고하고 있다(Cho 등, 2007; Park 등, 2016). 따라서 본 연구에서는 인체 유래 신경모세포종인 SH-SY5Y 세포에 Aβ를 처리하여 세포사멸을 유도한 후 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물을 처리하여 신경세포의 사멸을 억제하는 데 효과가 있는지 확인하였다. 더불어 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 선행연구를 통해 선별한 천연물질을 병용 처리하였을 때 상승효과가 발생하는지를 평가하였다.

본 연구진은 선행연구에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과의 병용 처리 시 상승효과가 나타날 가능성이 있는 물질을 탐색하기 위해 일차적으로 Aβ로 세포사멸을 유도한 SH-SY5Y 세포에 다양한 추출물 및 비타민을 단독 처리하였을 때 세포사멸이 개선된 후보군을 선정하였으며, 이후 선정한 후보군들과 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과의 병용 처리를 통해 상승효과가 가장 우수한 물질들을 선별하였다. 그 결과, 비타민 B군들과 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물을 병용하였을 때 신경세포사멸 억제에 대한 상승효과가 가장 뛰어난 것으로 나타났다. 따라서 이러한 연구 결과를 토대로 비타민 B군들이 혼합된 비타민 B 복합물을 최종 후보군으로 선정하였으며 선정한 비타민 B 복합물과 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물을 SH-SY5Y 세포에 단독 및 병용 처리하여 신경세포사멸 억제 효과 및 그에 대한 상승효과가 나타나는지 확인하였다.

먼저 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물 처리에 의해 발생하는 세포독성을 확인하기 위해서 MTT assay를 수행하였다. Aβ를 처리하지 않은 SH-SY5Y 세포에 시험물질을 단독 및 병용 처리한 후 세포생존율을 측정하였으며, 그 결과를 Fig. 2A에 제시하였다. 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 100 μg/mL와 비타민 B 복합물 0.1, 1, 10 μg/mL를 단독 및 병용 처리 시 세포독성이 발생하지 않는 것을 확인하였다. 이후 SH-SY5Y 세포에 Aβ를 처리하여 신경세포사멸을 유도한 뒤에 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물의 단독 처리에 의한 신경세포사멸 억제 효과 및 병용 처리를 통한 상승효과를 확인하였다(Fig. 2B). 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 100 μg/mL를 처리하였을 때 Aβ 처리군 대비 세포생존율이 유의하게 증가하였으며(P<0.001), 비타민 B 복합물 1, 10 μg/mL를 처리하였을 때 세포생존율이 Aβ 처리군 대비 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다(P<0.05). 더불어 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 100 μg/mL와 비타민 B 복합물 0.1, 1, 10 μg/mL를 병용 처리하였을 때, 각각의 단독 처리군 대비 세포생존율이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다(P<0.001). 병용 처리를 통해 상승효과가 발생하는지 확인하기 위해 combination index(CI)를 계산하여 분석하였다. CI 값이 1 미만일 때 상승효과가 존재한다고 판단하며(Chou, 2018), 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 100 μg/mL와 비타민 B 복합물 0.1, 1, 10 μg/mL 병용 처리군의 CI 값이 각각 0.75, 0.77, 0.92를 나타내었기 때문에 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 병용 처리 시 상승효과가 발생하는 것으로 판단하였다.

Fig 2. Effect of EAG, VBC, and the combination treatment on cell viability in SH-SY5Y cell. SH-SY5Y cells (1×104 cells/well in 96-well plate) were (A) treated with EAG 100 μg/mL and VBC 0.1, 1, and 10 μg/mL for 24 h or (B) were pretreated with the indicated concentrations of EAG and VBC for 1 h prior to Aβ (10 μM) exposure for 24 h. The MTT assay was performed to determine the cell viability. All values are expressed as mean±SD (n=3). Comparisons between experimental groups were determined by Student’s t-test and statistical significance was set as P<0.05. ###P<0.001 vs normal group, *P<0.05, ***P<0.001 vs Aβ-induced group, P<0.05, ††P<0.01 vs EAG-treated group. EAG, ethanolic extract of Aster glehni; VBC, vitamin B complex; Aβ, β-amyloid.

이를 통해 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 단독 처리 시, 신경세포사멸 억제를 통한 신경세포 보호 효과가 발생했을 뿐만 아니라 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물 병용 처리에 의한 상승효과가 있음을 확인하였다.

기억손상 마우스 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물에 따른 AChE 활성 억제 및 ACh 함량 상승효과

AChE는 신경전달물질인 ACh을 분해하는 효소로 과도하게 활성화되면 신경전달 기능에 문제를 일으켜 인지능력을 저하시키는 것으로 알려져 있다(Talesa, 2001; Ballard 등, 2005). 여러 연구를 통해 AChE 활성 억제에 의한 ACh 함량 증가는 기억력 개선에 도움을 주는 것으로 밝혀졌다(Bohnen 등, 2005; Enz 등, 1993). 따라서 본 연구에서는 scopolamine을 투여하여 기억력 손상을 유도한 마우스 모델을 이용하여, 앞서 진행했던 실험에서 인지개선 가능성을 보인 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물을 투여한 후 AChE 활성과 ACh 함량을 측정하여 인지개선 효능이 발생하는지 확인하고, in vitro 실험과 마찬가지로 두 물질의 병용 투여를 통해 상승효과가 발생하는지 평가하고자 하였다.

먼저 마우스의 뇌에서 AChE 활성을 측정하여 Fig. 3에 나타내었다. AChE 활성은 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 10, 30 mg/kg 투여군에서 scopolamine 투여군에 비해 각각 32.6, 43.3% 유의하게 감소하였으며(P<0.001), 비타민 B 복합물 3, 10 mg/kg 투여군에서 scopolamine 투여군 대비 각각 25.3, 45.0% 유의하게 감소하였다(P<0.01, (P<0.001). 또한 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물의 상승효과를 확인하기 위해 두 가지 시료를 병용하여 투여한 결과, 모든 병용 투여군에서 각각의 단독 투여군 대비 AChE 활성이 더욱 억제되는 것을 확인하였다.

Fig 3. . Effect of EAG (10 and 30 mg/kg), VBC (3 and 10 mg/kg), and the combination treatment on AChE activity in brain. All values were expressed as mean±SD (n=5∼6). EAG (10 and 30 mg/kg, p.o.), VBC (3 and 10 mg/kg, p.o.), DNZ (5 mg/kg, p.o.), and an equal volume of vehicle solution (DW, p.o.) were administered for 14 days. Memory impairment was induced by scopolamine (1 mg/kg, i.p.) 30 min before autopsy. Comparisons between experimental groups were determined by Student’s t-test and statistical significance was set as P<0.05. ###P<0.001 vs normal group, **P<0.01, ***P<0.001 vs scopolamine-administered group, P<0.05, ††P<0.01 vs EAG-administered group. AChE, acetylcholinesterase; Sco, scopolamine; EAG, ethanolic extract of Aster glehni; VBC, vitamin B complex; DNZ, donepezil.

또한 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 투여를 통해 변화하는 ACh 함량을 분석하기 위해 마우스 뇌에서 ACh 함량을 측정하여 Fig. 4에 제시하였다. Scopolamine 투여군에서 정상군에 비해 감소한 ACh 함량이 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 10, 30 mg/kg 투여군에서 scopolamine 투여군에 비해 각각 59.6, 88.3% 유의하게 증가하였으며, 비타민 B 복합물 3, 10 mg/kg 투여군에서 scopolamine 투여군 대비 53.3, 87.9% 유의하게 증가하였다(P<0.01). 마찬가지로 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물의 상승효과를 확인하기 위해 두 가지 시료를 병용하여 투여한 결과, 모든 병용 투여군에서 각각의 단독 투여군 대비 ACh 함량이 더욱 증가하는 것을 확인하였다. AChE 활성 및 ACh 함량에 대한 실험 결과를 토대로 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물 병용 투여군에서 상승효과가 발생했는지 확인하기 위해 분석한 결과, 모든 병용 투여군에서 CI 값을 계산하였을 때 1 미만을 나타냈기 때문에 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 병용 시 AChE 활성 억제 및 ACh 함량 증가에 대한 상승효과가 존재하는 것으로 판단하였다.

Fig 4. Effect of EAG (10 and 30 mg/kg), VBC (3 and 10 mg/kg), and the combination treatment on ACh content in brain. All values were expressed as mean±SD (n=5∼6). EAG (10 and 30 mg/kg, p.o.), VBC (3 and 10 mg/kg, p.o.), DNZ (5 mg/kg, p.o.), and an equal volume of vehicle solution (DW, p.o.) were administered for 14 days. Memory impairment was induced by scopolamine (1 mg/kg, i.p.) 30 min before autopsy. Comparisons between experimental groups were determined by Student’s t-test and statistical significance was set as P<0.05. ###P<0.001 vs normal group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs scopolamine-administered group, P<0.05, ††P<0.01 vs EAG-administered group. Sco, scopolamine; EAG, ethanolic extract of Aster glehni; VBC, vitamin B complex; DNZ, donepezil.

결과적으로 scopolamine으로 기억손상을 유도한 마우스 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물 투여 시 AChE 활성 억제 및 ACh 함량 증가를 통한 인지개선 효능이 나타나는 것을 확인하였으며, 두 가지 물질을 병용 투여 시 각각의 단독 투여군 대비 상승효과가 발생하는 것을 확인하였다. 따라서 scopolamine에 의해 방해되었던 cholinergic system이 정상적으로 작용하여 과도한 AChE 활성을 억제시키고 감소했던 ACh 함량을 증가시킴으로써 신경전달물질 발현 증가를 통한 기억력 개선에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

요 약

본 연구에서는 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 투여에 의한 인지기능 개선 효능을 확인하고자 하였다. 먼저 Morris water maze test를 통해 기억손상 마우스 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 투여에 의해 장기 기억력 및 공간 기억력이 향상됨으로써 인지기능 개선 기능성 소재에 대한 가능성을 확인하였다. 이에 추가로 in vitro 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물의 신경세포사멸 억제 효과를 확인하였으며, 더불어 비타민 B 복합물과의 병용 처리를 통해 상승효과가 발생하는 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과를 바탕으로 기억손상 마우스 모델에서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 투여에 의한 인지개선 효능을 평가한 결과, 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물 및 비타민 B 복합물 단독 투여에 의해 scopolamine 유도군 대비 AChE 활성이 저하되고 ACh 함량이 증가하였으며, 두 시료를 병용하여 투여하였을 때 상승효과가 발생하는 것을 확인하였다. 본 연구 결과는 in vitroin vivo 실험에서 장기 기억력 및 공간 기억력 개선, 신경세포사멸 억제, AChE 활성 억제 및 ACh 함량 증가를 통해 인지기능 개선에 도움을 주는 기능성 소재로서 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물의 개발 가능성을 보여주었다. 또한 섬쑥부쟁이 70% 주정추출물과 비타민 B 복합물의 병용 시 이러한 기능성이 더욱 상승하는 것을 확인하였으므로 이를 인지개선에 효과적인 기능성 제품 및 여러 가공품 개발에 적극 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

감사의 글

본 연구는 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술기획평가원의 고부가가치식품기술개발사업의 지원을 받아 수행되었습니다(과제번호: 117077-3).

Fig 1.

Fig 1.Effects of EAG (30, 100, and 300 mg/kg) on scopolamine-induced impairment of long-term learning and memory in the Morris water maze test. (A) escape latency during the training trial, (B) swimming time in target quadrant, and (C) swimming speed during probe trial were examined. Training trials were conducted among 4 days. EAG (30, 100, and 300 mg/kg, p.o.), DNZ (5 mg/kg, p.o.), and the equal volume of vehicle solution (10% Tween 80 solution, p.o.) was used to treat the animals 1 h before the first training trial each day. And 30 min later, memory impairment was caused by scopolamine (1 mg/kg, i.p.). All values are expressed as mean±SEM (n=10). Comparisons between experimental groups were determined by one-way ANOVA and statistical significance was set as P<0.05. #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs normal group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs scopolamine-administered group. EAG, ethanolic extract of Aster glehni; DNZ, donepezil; NS, not significant.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 523-530https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.6.523

Fig 2.

Fig 2.Effect of EAG, VBC, and the combination treatment on cell viability in SH-SY5Y cell. SH-SY5Y cells (1×104 cells/well in 96-well plate) were (A) treated with EAG 100 μg/mL and VBC 0.1, 1, and 10 μg/mL for 24 h or (B) were pretreated with the indicated concentrations of EAG and VBC for 1 h prior to Aβ (10 μM) exposure for 24 h. The MTT assay was performed to determine the cell viability. All values are expressed as mean±SD (n=3). Comparisons between experimental groups were determined by Student’s t-test and statistical significance was set as P<0.05. ###P<0.001 vs normal group, *P<0.05, ***P<0.001 vs Aβ-induced group, P<0.05, ††P<0.01 vs EAG-treated group. EAG, ethanolic extract of Aster glehni; VBC, vitamin B complex; Aβ, β-amyloid.
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Fig 3.

Fig 3.. Effect of EAG (10 and 30 mg/kg), VBC (3 and 10 mg/kg), and the combination treatment on AChE activity in brain. All values were expressed as mean±SD (n=5∼6). EAG (10 and 30 mg/kg, p.o.), VBC (3 and 10 mg/kg, p.o.), DNZ (5 mg/kg, p.o.), and an equal volume of vehicle solution (DW, p.o.) were administered for 14 days. Memory impairment was induced by scopolamine (1 mg/kg, i.p.) 30 min before autopsy. Comparisons between experimental groups were determined by Student’s t-test and statistical significance was set as P<0.05. ###P<0.001 vs normal group, **P<0.01, ***P<0.001 vs scopolamine-administered group, P<0.05, ††P<0.01 vs EAG-administered group. AChE, acetylcholinesterase; Sco, scopolamine; EAG, ethanolic extract of Aster glehni; VBC, vitamin B complex; DNZ, donepezil.
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Fig 4.

Fig 4.Effect of EAG (10 and 30 mg/kg), VBC (3 and 10 mg/kg), and the combination treatment on ACh content in brain. All values were expressed as mean±SD (n=5∼6). EAG (10 and 30 mg/kg, p.o.), VBC (3 and 10 mg/kg, p.o.), DNZ (5 mg/kg, p.o.), and an equal volume of vehicle solution (DW, p.o.) were administered for 14 days. Memory impairment was induced by scopolamine (1 mg/kg, i.p.) 30 min before autopsy. Comparisons between experimental groups were determined by Student’s t-test and statistical significance was set as P<0.05. ###P<0.001 vs normal group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs scopolamine-administered group, P<0.05, ††P<0.01 vs EAG-administered group. Sco, scopolamine; EAG, ethanolic extract of Aster glehni; VBC, vitamin B complex; DNZ, donepezil.
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