에너지 과잉섭취와 신체활동 감소에 의한 체내 에너지 불균형은 체지방 축적을 촉진하여 비만을 초래한다. 비만은 2형 당뇨병, 심혈관질환, 암 등의 만성질환 위험을 증가시키는 중요한 요인으로 알려져 있다(Mohammed 등, 2018). 2019년 국민건강영양조사 보고에 의하면 만 19세 이상 성인 비만 유병률은 2010년 남성 36.4%, 여성 24.8%에서 2019년 남성 41.8%, 여성 25.0%로 꾸준히 증가하는 추세이며(KCDC, 2019), 우리나라의 중요한 영양 문제가 되었다.

체내 지방조직 생성 과정인 adipogenesis에는 지방세포의 크기가 커지는 hypertrophy와 지방세포의 수가 증가하는 hyperplasia가 포함되며, 이 과정에서 분화과정과 관련된 전사인자들에 의하여 지방전구세포에서 지방세포로의 분화가 일어난다(Marcelin 등, 2019). 지방세포 분화 초기에는 CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP) β의 발현이 증가하며, 이후 주요 지방생성 전사인자인 C/EBPα와 peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR) γ의 발현이 증가하여 지방세포로 분화된다(Guo 등, 2015).

또한, adipogenesis 과정에는 지방세포로의 산소와 영양소를 공급하기 위한 신혈관생성(angiogenesis)이 필요하다(Ali 등, 2013). 신혈관생성 과정에서 vascular endothelial growth factors(VEGFs)에 의해 내피세포가 증가하고(Cheng 등, 2019), extracellular matrix(ECM) 성분을 분해하는 matrix metalloproteinases(MMPs)가 분비된다(Carmeliet과 Jain, 2011). MMPs는 zinc-dependent proteins로 ECM 장벽을 파괴하여 주변 조직으로의 혈관 세포 이동, 혈관신생 인자의 방출 등과 같은 다양한 방식으로 혈관 형성 과정에 기여한다(Bellafiore 등, 2013; Zitka 등, 2010). MMP family는 총 28개로 이루어져 있으며, 23개는 인체 조직에서 발현된다(Wang과 Khalil, 2018). 지방세포가 분화되는 과정에서 MMPs 중 MMP-2와 MMP-9이 분비되며, 이들은 gelatinase로 Ⅳ형 콜라겐을 분해하여 신혈관생성 과정을 촉진한다(Shin과 Yoon, 2020). 지방조직의 증식은 신혈관형성에 의해 가속화되어 지방세포가 성장하고 발달하면서 체지방이 축적되므로 지방조직에서 신혈관형성을 억제하는 것은 체지방 축적을 억제하거나 감소시키는 기전으로 작용할 수 있을 것이다.

Quercetin은 과일과 채소에 풍부하며 특히 양파 껍질에 다량 함유되어있는 플라보노이드이다. Quercetin은 항산화(Boots 등, 2008; Xu 등, 2019; Song 등, 2020) 및 항염증(Li 등, 2016; Tang 등, 2019) 등에 효과가 있으며, 지방세포에서 AMP activated protein kinase(AMPK)의 조절을 통해 세포사멸을 유도한다고 알려져 있다(Ahn 등, 2008). Hong 등(2021)의 선행연구는 3T3-L1 세포에 quercetin을 처리했을 때 지방세포 내 지방축적 및 지방분화가 억제된다고 보고하였으나 그 기전은 확실히 규명하지 못하였다.

그러므로 본 연구는 MMPs를 활성화하는 phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)를 quercetin과 함께 처리하여 quercetin이 MMPs 활성을 억제함으로써 지방세포 내 지방축적, 지방분화와 신혈관생성을 억제한다는 기전을 규명하는 것을 목적으로 하였다.

재료 및 시약

Quercetin은 Sigma-Aldrich(Burlington, MA, USA)에서 구입하여 absolute ethyl alcohol에 녹여 -4°C에서 냉동 보관하면서 사용하였다. PMA(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)는 100 ng/mL로 dimethyl sulfoxide에 녹여 사용하였다. 세포 배양액에 사용된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), bovine serum albumin(BSA), fetal bovine serum(FBS), trypsin-ethylenediaminetetraacetic(EDTA), penicillin/streptomycin(P/S)은 WelGENE(Daegu, Korea)에서 구입하였다. Insulin, dexamethasone isobuthylmethylxanthine, TRI reagent, chloroform, isopropanol, Oil-Red-O solution은 Sigma-Aldrich(Burlington, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. mRNA 발현 실험에 사용되는 SYBR Green PCR Master Mix는 Applied Biosystems(Waltham, MA, USA)에서, HiSenScript^TM RH[-] RT PreMix kit은 iNtRON Biotechnology(Seongnam, Korea)에서 구입하여 사용하였다.

세포배양

3T3-L1 지방전구세포(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)는 10% BSA와 P/S가 포함된 DMEM 배지에서 37°C, 5% CO2 조건으로 배양하였으며, 배지는 2일마다 교체하였다. 지방세포로의 분화 유도를 위해 분화유도물질(10 μg/mL insulin, 1 μM dexamethasone, 0.5 mM isobuthylmethylxanthine)과 10% FBS, P/S가 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 그 후 분화를 유지하기 위하여 DMEM과 함께 10% FBS, P/S, 10 μg/mL insulin이 함유된 post-differentiation media를 사용하여 배양하였다.

세포증식 측정

Quercetin이 지방세포 증식에 미치는 영향을 측정하기 위해 MTT assay를 실시하였다(Kim 등, 2013). 3T3-L1 세포는 1.0×104 cells/mL 농도로 24-well plate에 분주하고 지방세포로 분화시켰다. 지방세포로 분화된 세포에 quercetin을 처리하지 않거나 quercetin을 5, 10, 20 μM 농도로 처리한 후 0, 24, 48시간이 지날 때마다 MTT assay로 세포증식을 측정하였다.

MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma)는 1 mg/mL의 농도로 세포가 배양된 well당 1 mL씩 분주하고, 37°C, 5% CO₂ incubator에서 3시간 배양하였다. 그 후 well당 0.5 mL의 isopropanol을 첨가하여 용해한 다음 490 nm에서 microplate reader(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

본 논문의 목적이 quercetin이 MMPs를 억제하여 지방세포의 분화, 지방축적 및 신혈관생성을 억제한다는 기전을 규명하는 것으로, MMPs를 활성화하는 PMA(Waheed Roomi 등, 2015)를 quercetin과 함께 처리했을 때 세포증식에 미치는 영향을 MTT assay로 관찰하였다. 3T3-L1 세포를 1.0×10⁴ cells/mL 농도로 24-well plate에 분주하고 지방세포로 분화시켰다. 그리고 지방세포로 분화된 세포에 quercetin을 처리하지 않거나 quercetin을 5, 10, 20 μM 농도로 처리하여 24시간 배양하고, PMA를 100 ng/mL 농도로 포함한 배지로 2시간 배양하여 위에 기술한 동일한 방법으로 MTT assay를 실시하였다.

MMPs의 mRNA 발현과 활성

MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현은 real-time polymerase chain reaction(RT-PCR)으로 측정하였다(Kim 등, 2020; Hong 등, 2021). 3T3-L1 세포를 분화시킨 후 quercetin을 처리하지 않거나 quercetin을 5, 10, 20 μM 농도로 처리하여 24시간 배양하고, PMA를 100 ng/mL 농도로 포함한 배지로 2시간 배양하여 세포를 얻었다. 세포에 1 mL TRI reagent와 200 μL chloroform을 첨가하여 원심분리하고 isopropanol 500 μL를 첨가하였다. 그 후 75% ethanol로 pellet을 씻고 RNase-free dH2O/0.1 mM EDTA를 첨가한 뒤 260 nm와 280 nm에서 microplate reader(Molecular Devices)를 사용해 흡광도를 측정하여 RNA의 순도와 농도를 계산하였다. cDNA를 얻기 위하여 HiSenScriptTM RH[-] RT PreMix kit에 sample과 RNase-free dH2O/0.1 mM EDTA가 총 20 μL가 되도록 하였고, 42°C에서 30분, 85°C에서 10분 반응시켰다. cDNA sample, nuclease free water, 2× SYBR green Master mix, primer를 strap tube에 첨가한 후, Applied Biosystems StepOne software v.2.1로 측정하였으며, 분석은 △△CT 방법으로 하였다. 사용된 primers의 염기서열은 Table 1과 같으며, β-actin을 대조 지표로 사용하였다. MMP-2와 MMP-9의 활성은 MMP-2와 MMP-9 colorimetric drug discovery kit(Enzo Life Science)을 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 세포를 분화시킨 후 quercetin을 처리하지 않거나 quercetin을 5, 10, 20 μM 농도로 처리하여 24시간 배양하고, PMA를 100 ng/mL 농도로 포함한 배지로 2시간 배양하여 세포를 얻었다. 원심분리 후 얻은 pellet은 centrifugal filter units(Merck Millipore, Burlington, MA, USA)를 이용하여 3,500 rpm, 4°C, 30분 동안 원심분리하여 농축하였다. 농축액을 가지고 제조사의 방법에 따라 MMP-2와 MMP-9의 활성을 측정하였다.

Table 1 . Primer sequences of transcription factors related to adipocyte differentiation used for real time PCR analysis.

Gene1)	Primer	Sequence2)
β-Actin	Forward primer	5'-GTTTGAGACCTTCAACACCCC-3'
	Reverse primer	5'-GTGGCCATCTCCTGCTCGAAGTC-3'
C/EBPβ	Forward primer	5'-CCGGGCAGCACCACGACTTCC-3'
	Reverse primer	5'-CTTCTTGGCCTTGCTCTTGACCTG-3'
C/EBPα	Forward primer	5'-AGACATCAGCGCCTACATCG-3'
	Reverse primer	5'-TGTAGGTGCATGGTGGTCTG-3'
PPARγ	Forward primer	5'-TTGATTTCTCCAGCATTTCT-3'
	Reverse primer	5'-TGTTGTAGAGCTGGGTCTTT-3'
FABP4	Forward primer	5'-CATGATCATCAGCGTAAATG-3'
	Reverse primer	5'-TCACCATCTCGTTTTCTCTT-3'
VEGF-A	Forward primer	5'-TCTCACCGGAAAGACCGAT-3'
	Reverse primer	5'-CCCAAAGTGCTCCTCGAA-3'
VEGFR-2	Forward primer	5'-GATGCAGGAAACTACACGGTCA-3'
	Reverse primer	5'-GAGATCAAGGCTTTCTCACCGA-3'
MMP-2	Forward primer	5'-GGCCATGCCATGGGGCTGGA-3'
	Reverse primer	5'-AGCATTCAGGGCTAACATCCAACT-3'
MMP-9	Forward primer	5'-AGGCCTCTACAGAGTCTTTG-3'
	Reverse primer	5'-CAGTCCAACAAGAAAGGACG-3'

¹⁾C/EBP β, CCAAT/ enhancer binding protein β; C/EBPα, CCAAT/ enhancer binding protein α; PPARγ, peroxisome proliferator-activated receptor γ; FABP4, fatty acid binding protein 4; VEGF-A, vascular endothelial growth factor-A; VEGFR-2, vascular endothelial growth factors receptor-2; MMP-2, matrix metalloproteinase-2; MMP-9, matrix metalloproteinase-9..

²⁾T, thymine; A, adenine; C, cytosine; G, guanin..

.

Oil-Red-O 염색

지방세포 내 지방축적은 Oil-Red-O 염색으로 측정하였다(Benchamana 등, 2019). 3T3-L1 세포를 분화시킨 후 quercetin을 처리하지 않거나 quercetin을 5, 10, 20 μM 농도로 처리하여 24시간 배양하고, PMA를 100 ng/mL 농도로 포함한 배지로 2시간 배양하였다. 세포는 PBS로 세척 후 10% formalin으로 1시간 동안 실온에서 고정시켰다. Oil-Red-O 용액을 첨가하여 30분간 실온에서 지방구를 염색시키고 증류수로 세척한 후 100% isopropanol로 세포를 용해시켜 510 nm에서 microplate reader(Molecular Devices)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

Glycerol-3-phosphate dehydrogenase(GPDH) 활성

GPDH 활성은 GPDH assay kit(Abcam, Cambridge, UK)을 사용하여 측정하였다. 3T3-L1 세포를 분화시킨 후 quercetin을 처리하지 않거나 quercetin을 5, 10, 20 μM 농도로 처리하여 24시간 배양하고, PMA를 100 ng/mL 농도로 포함한 배지로 2시간 배양하여 세포를 얻었다. 원심분리 후 얻은 pellet을 이용하여 제조사의 방법에 따라 GPDH 활성을 측정하였다.

지방세포분화 관련 전사인자의 mRNA 발현

지방세포분화와 관련된 전사인자의 mRNA 발현은 RT-PCR로 측정하였다. 실험방법은 위에 기술한 MMPs의 mRNA 발현 방법과 동일하며, 사용된 primers의 염기서열은 Table 1과 같다.

혈관내피세포 성장인자의 mRNA 발현

신혈관생성에서 중요한 역할을 하는 혈관내피세포 성장인자인 VEGF-A와 VEGFR-2의 mRNA 발현은 RT-PCR로 측정하였다. 실험방법은 위에 기술한 MMPs의 mRNA 발현 방법과 동일하며, 사용된 primers의 염기서열은 Table 1과 같다.

통계분석

본 연구의 모든 실험은 독립적으로 3회 반복하였다. 모든 실험 결과는 SPSS 26.0(IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용하여 평균과 표준오차를 계산하였다. 각 군 간의 차이는 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 한 후, Duncan’s multiple range test로 P<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.

Quercetin이 세포증식에 미치는 영향

Quercetin이 세포증식에 미치는 영향을 평가하기 위해 quercetin을 처리하지 않거나 5, 10, 20 μM의 quercetin을 처리하고 48시간 배양한 결과, 24시간까지는 세포증식에 유의적인 차이가 없었으나 48시간 배양 시에는 농도 의존적으로 유의적인 세포증식 감소가 나타났다(P<0.05)(Fig. 1A). 따라서 quercetin 처리시간은 quercetin이 세포증식에 영향을 주지 않은 24시간으로 결정하였다. 또한 다양한 농도의 quercetin에 PMA 100 ng/mL를 함께 처리하여 2시간 배양했을 때 세포증식에 영향을 주지 않았다(Fig. 1B). 따라서 quercetin을 처리하지 않거나 5, 10, 20 μM의 quercetin을 24시간 처리한 후 PMA 100 ng/mL를 2시간 처리하는 조건으로 다른 실험을 진행하였다.

Fig 1. Effect of quercetin on cell proliferation in 3T3-L1 adipocyte. 3T3-L1 cells were plated at a density of 1.0×10⁴ cells/mL in 24-well plate with DMEM supplemented with 10% BSA for 2 days. It was replaced with a culture fluid containing DMEM, 10% FBS, 1 μM/mL Dex, 10 μg/mL insulin, and 0.5 mM/mL IBMX for differentiation. (A) The cell monolayer were incubated in post-differentiation medium with 0, 5, 10, and 20 μM quercetin. Viable cell numbers were estimated by MTT assay at 0, 24, and 48 h after quercetin treatments. (B) The cell monolayer were incubated in post-differentiation medium with 0, 5, 10, and 20 μM quercetin for 24 h, and then the monolayer were incubated with PMA (100 ng/mL) for 2 h. Viable cell numbers were estimated by MTT assay at 24 h after PMA treatments. Each bar represents the mean±SE. Comparisons among different concentrations of quercetin that produced significant differences (P<0.05) are indicated by different letters above each bar (Duncan’s multiple range test). NS, not significant; MTT, 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate.

Quercetin이 MMPs의 mRNA 발현 및 활성에 미치는 영향

MMP-2 mRNA 발현은 quercetin과 PMA를 모두 처리하지 않은 대조군보다 PMA만을 처리한 군에서 25.6% 유의적으로 증가하여 PMA가 MMP-2 mRNA 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 그리고 MMP-2 mRNA 발현은 PMA와 함께 quercetin을 처리하면 PMA만을 처리한 군보다 quercetin 5, 10, 20 μM 처리군에서 각각 32.3%, 52.0%, 81.7%만큼 농도 의존적으로 유의적인 감소가 나타났다(P<0.05)(Fig. 2A). MMP-2 활성도 quercetin과 PMA를 모두 처리하지 않은 대조군보다 PMA만을 처리한 군에서 MMP-2 활성이 유의적으로 증가하였으며, PMA와 같이 quercetin을 처리하면 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 유의적으로 감소하였다(P<0.05)(Fig. 2B). MMP-9 mRNA 발현은 quercetin과 PMA를 모두 처리하지 않은 대조군보다 PMA만을 처리한 군에서 33.6% 유의적으로 증가하여 PMA가 MMP-9 mRNA 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 그러나 PMA와 함께 quercetin을 처리하면 PMA만을 처리한 군보다 quercetin 5, 10, 20 μM 처리군에서 각각 30.7%, 67.8%, 80.9%만큼 농도 의존적으로 유의적인 감소가 나타났다(P<0.05)(Fig. 2C). MMP-9 활성도 quercetin과 PMA를 모두 처리하지 않은 대조군보다 PMA만을 처리한 군에서 MMP-9의 활성이 유의적으로 증가하였으며, PMA와 같이 quercetin을 처리하면 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 유의적으로 감소하였다(P<0.05)(Fig. 2D).

Fig 2. Effect of quercetin on the mRNA expression and the activity of MMP-2 and MMP-9 in PMA-stimulated 3T3-L1 adipocyte. 3T3-L1 cells were plated at a density of 1.0×10⁴ cells/mL in 24-well plate with DMEM supplemented with 10% BSA for 2 days. It was replaced with a culture fluid containing DMEM, 10% FBS, 1 μM/mL Dex, 10 μg/mL insulin, and 0.5 mM/mL IBMX for differentiation. The cell monolayer were incubated in post-differentiation medium with 0, 5, 10, and 20 μM quercetin for 24 h, and then the monolayer were incubated with PMA (100 ng/mL) for 2 h. Total mRNA was isolated by TRI reagent and real-time PCR was performed for MMP-2 [A] and MMP-9 [C]. MMP-2 and MMP-9 activity were estimated by the MMP-2 and MMP-9 colorimetric drug discovery kit [B, D]. Each bar represents the mean±SE. Comparisons among different concentrations of quercetin that produced significant differences (P<0.05) are indicated by different letters above each bar (Duncan’s multiple range test). MMP, matrix metalloproteinase; PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate.

MMPs는 zinc-dependent proteins로 ECM을 분해하여 주변 조직으로의 혈관 세포를 이동시키고, 혈관신생 인자를 분비하여 신혈관형성 과정에 관여한다(Bouloumié 등, 2001). 지방조직의 ECM은 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌과 같은 단백질로 구성되어 있으며(Ali 등, 2013), Ⅳ형 콜라겐이 주요 성분이다(Kruegel과 Miosge, 2010). 기저막을 분해하는 것은 신혈관생성 과정에서 필수적이며, 특히 지방세포에서 Ⅳ형 콜라겐을 분해하는 MMP-2와 MMP-9이 주요하게 관여한다(Bellafiore 등, 2013). Bouloumié 등(2001)은 인체 지방세포와 3T3-F442A 지방세포에서 MMP-2와 MMP-9이 분비되며, 지방세포 분화과정에 중요하게 관여한다고 보고하였다. Chavey 등(2003)도 3T3-F442A 지방세포에서 MMP-2와 MMP-9이 분비되고, 지방세포 분화과정에서 활성화된다고 보고하였다. Bauters 등(2015)은 3T3-F442A 지방세포에서 MMP-2 유전자를 knockdown 시켰을 때 분화가 감소했지만, MMP-2를 과발현시켰을 때는 분화가 촉진되었다고 보고하였다. 그러므로 MMP-2와 MMP-9은 지방세포분화와 신혈관생성에서 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있다.

PMA는 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate, phorbol ester 등으로 불리며, 다양한 종류의 세포에서 활성화된 신호전달 경로와 cytokine이 MMPs의 발현을 조절하여 MMPs 활성을 촉진시키는 역할을 한다고 알려져 있다(Waheed Roomi 등, 2015). Woo 등(2016)은 PMA를 3T3-L1 세포에 처리했을 때 MMP-2와 MMP-9의 단백질 발현이 약 50% 이상 증가하였다고 보고하였고, Oh 등(2012)은 3T3-L1 세포에 PMA를 처리했을 때 MMP-2의 단백질 발현은 82%, MMP-9의 단백질 발현은 40% 증가하였다고 보고하여 3T3-L1 세포에서 PMA를 처리하면 MMPs가 활성화된다는 것이 확인되었다.

본 연구에서 3T3-L1 세포에 PMA를 처리하면 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현과 활성이 모두 유의적으로 증가하였고, PMA와 함께 quercetin을 처리하면 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현과 활성이 농도 의존적으로 억제되는 것으로 나타났다.

Quercetin이 세포 내 지방축적과 GPDH 활성에 미치는 영향

Quercetin과 PMA를 함께 처리했을 때 세포 내 지방축적과 중성지방 합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Oil- Red-O 염색과 GPDH 활성 실험을 진행하였다. OilRed-O 염색 결과, quercetin과 PMA를 모두 처리하지 않은 대조군보다 PMA만을 처리한 군에서 지방축적이 유의적으로 증가하였다. 그러나 PMA와 함께 quercetin을 처리하면 지방축적이 quercetin 처리농도에 따라 농도 의존적으로 감소하였다(Fig. 3A). GPDH 활성 실험 결과는 quercetin과 PMA를 모두 처리하지 않은 대조군보다 PMA만을 처리한 군에서 GPDH 활성이 유의적으로 증가하였다. 그러나 PMA와 함께 quercetin을 처리하면 GPDH 활성이 quercetin 처리농도에 따라 농도 의존적으로 감소하였다(Fig. 3B).

Fig 3. Effect of quercetin on lipid accumulation and GPDH activity in PMA-stimulated 3T3-L1 adipocyte. 3T3-L1 cells were plated at a density of 1.0×10⁴ cells/mL in 24-well plate with DMEM supplemented with 10% BSA for 2 days. It was replaced with a culture fluid containing DMEM, 10% FBS, 1 μM/mL Dex, 10 μg/mL insulin, and 0.5 mM/mL IBMX for differentiation. The cell monolayer were incubated in post-differentiation medium with 0, 5, 10, and 20 μM quercetin for 24 h, and then the monolayer were incubated with PMA (100 ng/mL) for 2 h. [A] Lipid accumulation was estimated by the Oil-Red-O staining. [B] GPDH activity was estimated by the GPDH activity assay kit. Each bar represents the mean±SE. Comparisons among different concentrations of quercetin that produced significant differences (P<0.05) are indicated by different letters above each bar (Duncan’s multiple range test). PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate; GPDH, glycerol-3-phosphate dehydrogenase.

Eseberri 등(2019)은 3T3-L1 세포에 quercetin을 0, 0.1, 1, 10 μM로 24시간 처리했을 때 10 μM 농도에서 세포 내 중성지방량이 유의적으로 감소하였다고 보고하여 본 연구 결과와 일치하였다. 그러나 Park 등(2008)은 인체 primary adipocyte에 quercetin을 12.5, 25 μM로 처리했을 때 12.5 μM 처리군에서는 세포 내 지방축적이 대조군보다 유의적으로 증가하였으나 25 μM에서는 감소하였다고 보고하였는데, 세포의 종류에 따라 quercetin의 지방세포 내 지방축적 효과가 다를 수 있다는 것을 보여주고 있다. 그리고 Oh 등(2012)은 3T3-L1 세포에 PMA를 처리했을 때 지방축적이 유의적으로 증가하였다고 보고하였으며, 이는 본 연구와 같은 결과로 PMA로 MMPs가 활성화되면 지방세포 내 지방축적이 유의적으로 증가한다는 것을 확인할 수 있다. 그러나 본 연구에서 PMA와 함께 quercetin을 처리하면 세포 내 지방축적이 유의적으로 감소하여 quercetin은 MMPs를 억제하고 지방세포 내 지방축적을 감소시킨다는 기전을 확인할 수 있었다.

GPDH는 지방세포에서 중성지방 합성에 중요한 역할을 하는 효소이다(Bae 등, 2014). 체내에서 중성지방이 합성될 때 GPDH는 지방세포에서 dihydroxyacetone phosphate로부터 glycerol-3–phosphate를 합성하여 중성지방 합성을 촉진하는 역할을 한다. 그러므로 GPDH 활성은 지방세포에서 중성지방 축적을 알 수 있는 지표로 사용된다(Mráček 등, 2013). Bae 등(2014)과 Hong 등(2021)은 3T3-L1 세포에서 quercetin을 처리했을 때 GPDH의 활성이 억제되었다고 보고하였다. 본 연구에서는 PMA에 의해 MMPs 활성이 촉진된 조건에서 GPDH 활성이 유의적으로 증가하였으나, PMA와 함께 quercetin을 처리하면 GPDH 활성이 유의적으로 억제되었다는 결과를 도출하였다. 이는 quercetin은 MMPs를 억제하여 지방세포 내 중성지방 합성에 관여하는 효소 활성을 감소시켜 세포 내 지방축적을 억제시킨다는 기전을 확인한 것으로 사료된다.

Quercetin이 지방세포분화와 관련된 전사인자의 mRNA 발현에 미치는 영향

Quercetin과 PMA를 함께 처리했을 때 지방세포의 분화 초기부터 후기까지 관여하는 전사인자의 mRNA 발현을 관찰하였다. C/EBPβ mRNA 발현은 quercetin과 PMA를 모두 처리하지 않은 대조군보다 PMA만을 처리한 군에서 44.5% 유의적으로 증가하였다. 그러나 C/EBPβ mRNA 발현은 PMA와 함께 quercetin을 처리하면 PMA만을 처리한 군보다 quercetin 5, 10, 20 μM 처리군에서 각각 37.8%, 52.0 %, 93.0%만큼 농도 의존적으로 유의적인 감소가 나타났다(P<0.05)(Fig. 4A). C/EBPα mRNA 발현은 quercetin과 PMA를 모두 처리하지 않은 대조군보다 PMA만을 처리한 군에서 35.8% 유의적으로 증가하였다. 그러나 C/EBPα의mRNA 발현은 PMA와 함께 quercetin을 처리하면 PMA만을 처리한 군보다 quercetin 5, 10, 20 μM 처리군에서 각각 37.9%, 57.8%, 73.6%만큼 농도 의존적으로 유의적인 감소가 나타났다(P<0.05)(Fig. 4B). 그리고 PPARγ mRNA 발현은 quercetin과 PMA를 모두 처리하지 않은 대조군보다 PMA만을 처리한 군에서 35.7% 유의적으로 증가하였다. 그러나 PMA와 함께 quercetin을 처리하면 PMA만을 처리한 군보다 quercetin 5, 10, 20 μM 처리군에서 각각 41.2%, 75.6%, 87.0%만큼 농도 의존적으로 유의적인 감소가 나타났다(P<0.05)(Fig. 4C). FABP4 mRNA 발현도 quercetin과 PMA를 모두 처리하지 않은 대조군보다 PMA만을 처리한 군에서 35.5% 유의적으로 증가하였다. 그러나 FABP4 mRNA 발현은 PMA와 함께 quercetin을 처리하면 PMA만을 처리한 군보다 quercetin 5, 10, 20 μM 처리군에서 각각 30.0%, 79.0%, 89.7%만큼 농도 의존적으로 유의적인 감소가 나타났다(P<0.05)(Fig. 4D). 즉 지방세포분화와 관련된 전사인사들의 mRNA 발현은 PMA에 의해 증가하였고, PMA와 같이 quercetin을 처리하면 농도 의존적으로 감소하였다.

Fig 4. Effect of quercetin on the mRNA expression of C/EBPβ, C/EBPα, PPARγ, and FABP4 in PMA-stimulated 3T3-L1 adipocyte. 3T3-L1 cells were plated at a density of 1.0×10⁴ cells/mL in 24-well plate with DMEM supplemented with 10% BSA for 2 days. It was replaced with a culture fluid containing DMEM, 10% FBS, 1 μM/mL Dex, 10 μg/mL insulin, and 0.5 mM/mL IBMX for differentiation. The cell monolayer were incubated in post-differentiation medium with 0, 5, 10, and 20 μM quercetin for 24 h, and then the monolayer were incubated with PMA (100 ng/mL) for 2 h. Total mRNA was isolated by Tri reagent and real-time PCR was performed. (A) C/EBPβ, CCAAT/enhancer binding protein β; (B) C/EBPα, CCAAT/enhancer binding protein α; (C) PPARγ, peroxisome proliferator-activated receptor γ; (D) FABP, fatty acid binding protein. Each bar represents the mean±SE. Comparisons among different concentrations of quercetin that produced significant differences (P<0.05) are indicated by different letters above each bar (Duncan’s multiple range test). PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate.

C/EBP family는 basic-leucine zipper domain 전사인자 계열에 속하며 현재까지 α, β, γ, δ, ε, ζ의 형태가 보고되었으며, 지방세포 분화과정의 주요 조절 역할을 한다(Yang 등, 2011). C/EBPβ의 발현은 지방세포분화의 초기 단계에서 증가하며(Park과 Kim, 2002), C/EBPβ는 3T3–L1 preadipocytes 분화 유도 시 2시간 이내로 즉시 발현된다고 알려져 있다(Zhang 등, 2004). Guo 등(2015)은 3T3-L1 preadipocytes에서 C/EBPβ의 억제는 adipogenesis를 억제한다고 보고하였다. 또한 C/EBPβ는 지방세포분화 후기 발현을 유도하는 주요 전사인자인 C/EBPα와 PPARγ의 발현을 촉진한다. C/EBPα는 지방세포분화 중에 발현되며 성숙한 지방세포에서 활성 상태를 유지한다고 보고하였고(Boughanem 등, 2019), C/EBPα가 발현되지 않으면 백색지방세포의 분화가 일어나지 않는다고 보고되었다(Linhart 등, 2001). 또한, Yang 등(2011)은 C/EBPα가 결핍된 mice에서 지질 축적이 현저하게 감소하였다고 보고하였다. PPARs는 세포의 분화와 다양한 대사 과정, 특히 지질과 포도당의 항상성에 중요한 유전자를 조절하는 전사인자이다(Janani와 Ranjitha Kumari, 2015). PPARs는 steroid receptor superfamily에 속하는 ligand activated nuclear hormone receptors(NRs) 계열로, α, β/δ, γ 형태로 존재한다(Berger와 Moller, 2002). PPARγ는 지방세포분화 말기에 발현되어(Medina-Gomez 등, 2007) 에너지 균형, 지질 생합성 조절, 지질단백질 대사 및 인슐린 민감도에 관여한다(Janani와 Ranjitha Kumari, 2015). Koutnikova 등(2003)은 PPARγ가 결핍된 mice는 체내 백색지방을 축적하지 않았으며 성장이 지체되고 고지혈증을 일으켰다고 보고하여 PPARγ가 생체 내 지방 발생의 주요 조절인자임을 확인하였다. FABP4는 adipocyte protein 2라고도 불리며 PPARγ의 주요 표적 유전자로 분화된 지방세포에서 발현된다(Garin-Shkolnik 등, 2014).

Hong 등(2021)은 3T3-L1 세포에 quercetin을 5, 10, 20 μM의 농도로 처리하면 C/EBPβ, C/EBPα, PPARγ 및 FABP의 mRNA 발현이 유의적으로 감소한다고 보고하였고, Chien 등(2005)은 3T3-L1 세포에 quercetin을 25, 50, 75, 100 μM의 농도로 처리했을 때 C/EBPα와 PPARγ의 mRNA 발현이 농도 의존적으로 감소하였다고 보고하였다. 또한, Bae 등(2014)은 3T3-L1 세포에 quercetin을 1, 2, 4 μg/mL 농도로 처리했을 때 C/EBPα, PPARγ, FABP4의 mRNA 발현이 감소하였다고 보고하여 본 연구 결과와 일치하였다. 그러나 Sakuma 등(2021)은 3T3-L1 세포에 quercetin을 10, 25, 50 μM 농도로 처리했을 때 C/EBPα와 PPARγ의 mRNA 발현에 영향을 주지 않았다는 상반된 결과를 보고하고 있다. 본 연구에서 PMA에 의하여 MMPs를 활성화시키면 지방분화와 관련된 전사인자인 C/EBPβ, C/EBPα, PPARγ 및 FABP4의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였으나, PMA와 같이 quercetin을 처리하면 증가한 전사인자들의 mRNA 발현이 유의적으로 감소하였으므로 quercetin에 의한 전사인자의 mRNA 발현 억제는 MMPs 작용억제에 의한 것이라는 기전을 확인할 수 있었다. 그리고 quercetin에 의한 지방분화와 관련된 전사인자의 mRNA 발현 억제는 Oil-Red-O 염색으로 측정한 지방축적 감소와 일관된 결과를 보여주고 있다.

Quercetin이 혈관내피세포 성장인자의 mRNA 발현에 미치는 영향

Quercetin과 PMA를 함께 처리했을 때 신혈관생성에 관여하는 혈관내피세포 성장인자인 VEGF-A와 그 수용체인 VEGFR-2의 mRNA 발현을 관찰하였다. VEGF-A mRNA 발현은 quercetin과 PMA를 모두 처리하지 않은 대조군보다 PMA만을 처리한 군에서 37.8% 유의적으로 증가하였다. 그러나 PMA와 함께 quercetin을 처리하면 VEGF-A mRNA 발현은 PMA만을 처리한 군보다 quercetin 5, 10, 20 μM 처리군에서 각각 30.5%, 60.8%, 87.8%만큼 농도 의존적으로 유의적인 감소가 나타났다(P<0.05)(Fig. 5A). VEGF-A의 수용체인 VEGFR-2의 mRNA 발현은 quercetin과 PMA를 모두 처리하지 않은 대조군보다 PMA만을 처리한 군에서 35.6% 유의적으로 증가하였다. 그러나 PMA와 함께 quercetin을 처리하면 VEGFR-2의 mRNA 발현은 PMA만을 처리한 군보다 quercetin 5, 10, 20 μM 처리군에서 각각 32.3%, 46.7%, 81.9%만큼 농도 의존적으로 유의적인 감소가 나타났다(P<0.05)(Fig. 5B).

Fig 5. Effect of quercetin on the mRNA expression of VEGF-A and VEGFR-2 in PMA-stimulated 3T3-L1 adipocyte. 3T3-L1 cells were plated at a density of 1.0×10⁴ cells/mL in 24-well plate with DMEM supplemented with 10% BSA for 2 days. It was replaced with a culture fluid containing DMEM, 10% FBS, 1 μM/mL Dex, 10 μg/mL insulin, and 0.5 mM/mL IBMX for differentiation. The cell monolayer were incubated in post-differentiation medium with 0, 5, 10, and 20 μM quercetin for 24 h, and then the monolayer were incubated with PMA (100 ng/mL) for 2 h. Total mRNA was isolated by TRI reagent and real-time PCR was performed. (A) VEGF-A, vascular endothelial growth factor-A; (B) VEGFR-2, vascular endothelial growth factors receptor-2. Each bar represents the mean±SE. Comparisons among different concentrations of quercetin that produced significant differences (P<0.05) are indicated by different letters above each bar (Duncan’s multiple range test). PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate.

지방조직은 모세혈관의 조밀한 네트워크로 둘러싸인 내분비 기관으로 호르몬, 혈관신생 인자 및 사이토카인의 생성을 조절한다(Bouloumié 등, 2001). 신혈관생성은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 만들어지는 것을 의미한다(Kim 등, 2001). 지방조직에서의 신혈관생성은 지방세포 대사에 필요한 산소와 영양소를 공급하여(Eilken과 Adams, 2010; Carmeliet과 Jain, 2011), 지방조직의 성장과 증식에서 중요한 역할을 한다(Cao, 2010). 신혈관생성 과정에서 혈관내피세포 성장인자인 VEGF는 내피세포 증식을 조절하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Nijhawans 등, 2020). VEGF는 분자량이 약 45 kDa인 homodimeric 당단백질로 혈관신생의 핵심 인자이며, 혈관 내피세포에서 발현되는 2개의 VEGF 수용체인 VEGFR-1, VEGFR-2와 결합한다(Carmeliet, 2005). 특히 VEGF-A는 VEGFR–2와 결합하여 강력하게 내피세포의 유사분열을 촉진한다(Corvera와 Gealekman, 2014). Tam 등(2009)은 고지방식이로 비만이 유도된 mice 모델에서 VEGFR-2를 차단하는 항혈관신생 치료가 지방조직의 증식을 억제할 수 있다고 보고하였다. 또한, Sung 등의 연구(2013)는 VEGF가 결핍된 mice의 지방조직 무게가 정상군에 비하여 유의적으로 낮았다고 보고하였다.

본 연구에서 PMA에 의하여 MMPs를 활성화시키면, VEGF-A와 그 수용체인 VEGFR-2의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였으며, quercetin은 증가한 VEGF-A와 VEGFR-2의 mRNA 발현을 유의적으로 감소시켰다. 그러므로 quercetin에 의한 VEGF-A와 VEGFR-2의 mRNA 발현 억제는 MMPs 작용을 억제하기 때문이라는 것을 보여주고 있다. 또한, PPARγ는 VEGF의 발현을 촉진하는데(Cao, 2013), 본 연구에서 quercetin은 PMA 처리로 MMPs가 활성화되었을 때 PPARγ와 VEGF-A, 그 수용체인 VEGFR-2의 mRNA 발현을 함께 감소시키는 결과를 보여주고 있어 quercetin에 의한 MMPs 억제는 지방세포분화 감소와 신혈관생성을 함께 억제한다는 것을 알 수 있다.

본 연구는 3T3-L1 지방전구세포에서 quercetin이 MMPs를 억제하여 지방세포의 분화와 지방축적, 신혈관생성을 억제한다는 기전을 규명하는 것을 목적으로 수행되었다. 3T3-L1 지방전구세포에 PMA를 처리하면 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현과 활성이 유의적으로 증가하였으며, PMA와 함께 quercetin을 처리하면 quercetin의 처리농도가 증가함에 따라 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현과 활성이 유의적으로 감소하였다. 그리고 PMA를 처리하면 3T3-L1 세포에서 세포 내 지방축적과 GPDH 활성, 지방세포분화와 관련된 전사인자인 C/EBPβ, C/EBPα, PPARγ 및 FABP4의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였으며, PMA와 quercetin을 함께 처리하면 세포 내 지방축적과 GPDH 활성, 지방세포분화와 관련된 전사인자들의 mRNA 발현이 quercetin의 처리농도가 증가함에 따라 유의적으로 감소하였다. 또한 3T3-L1 지방전구세포에 PMA를 처리하면 혈관내피세포 성장인자인 VEGF-A와 그 수용체인 VEGFR-2의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였으며, PMA와 함께 quercetin을 처리하면 quercetin의 처리농도가 증가함에 따라 VEGF-A와 그 수용체인 VEGFR-2의 mRNA 발현이 감소하였다. 그러므로 본 실험 조건에서 quercetin은 MMPs를 억제해 지방세포의 분화와 지방축적, 신혈관생성을 저해한다는 작용기전을 확인하였다.

본 연구는 한국연구재단(과제번호: 2018R1D1A1B07043918)의 지원을 받아 수행한 연구 결과로 이에 감사드립니다.