인구증가로 인한 식량부족, 가축사육에 의한 환경오염 등 가축을 사육하는 것에 대한 문제들이 제기되며 기존 축산물을 대체할 식량자원으로 양질의 단백질과 지방산, 각종 무기질 함량이 우수한 식용곤충이 주목받고 있다(Jung 등, 2021). 국내에서는 갈색거저리 유충, 쌍별귀뚜라미, 장수풍뎅이 유충, 흰점박이꽃무지 유충, 백강잠, 식용 누에, 메뚜기, 아메리카 왕거저리 유충, 수벌 번데기, 풀무치까지 총 10종류의 식용곤충이 식품의약품안전처의 식품공전(Ministry of Food and Drug Safety, 2021)에 등록되었다. 그중 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)는 딱정벌레목 장수풍뎅이과에 속하는 곤충으로 한국, 일본, 중국, 인도에 분포한다. 장수풍뎅이 유충은 탄수화물, 지방, 단백질을 포함한 세 가지 필수 영양소를 고르게 함유하고 있을 뿐 아니라 다른 식용곤충에 비해 트레오닌, 히스티딘 등의 필수아미노산과 철, 마그네슘과 같은 무기질 성분을 다량 함유(Baek 등, 2017)하고 있어, 이를 활용해 기능성 식품 소재로 개발하려는 연구들이 활발하게 진행되고 있다(Kim 등, 2021). 지금까지 장수풍뎅이 유충은 항산화 효능(Lee 등, 2017b), 항비만 효과(Kim 등, 2016), 간 보호 효과(Lee 등, 2015), 항염증 효과(Lee 등, 2017a) 등에 대한 연구들이 보고되어 있지만, 아직 면역 활성 기능성 식품 소재로 활용될 수 있는지에 관한 연구는 보고된 바 없다.

면역계는 항원과 같은 외부인자로부터 신체를 보호하고 생체 내 환경의 변화에 대응하여 항상성을 유지하는 중요한 생물학적 방어 수단 중 하나가 다양한 면역세포의 상호작용을 통해 이루어진다(Ji 등, 2021). 이 중 대식세포는 신체의 모든 주요 기관에 분포하여 체내에 침입하는 병원체와 이물질을 탐식, 제거하고 면역조절 인자들을 통해 면역 활성을 유도하는 선천성 면역의 주요 구성 요소이며, 전문 항원 제시 세포(professional antigen presenting cell)로서 선천성 면역계와 후천성 면역계를 연결하는 핵심 면역세포로 알려져 있다(Yu 등, 2012). 활성화된 대식세포는 mitogen activated protein kinases(MAPKs)의 활성과 nuclear factor-κB(NF-κB)의 전사 등에 의해 사이토카인 생성 및 세포 표면활성인자의 발현인자 증가 등을 포함하는 면역 반응을 일으킨다(Byun, 2017). 대식세포의 활성으로 인한 선천 면역체계의 자극은 T세포와 같은 후천 면역세포들을 활성화하여 여러 질병 위협에 대한 숙주 내성을 증가시킨다는 것이 널리 알려졌다. 최근 선천 면역반응 조절기능을 이용한 감염질환의 예방, 항암 면역치료법 등이 화제가 되면서 면역력을 강화하는 천연물을 비롯한 건강기능 식품 소재에 관한 연구들이 활발하게 진행되고 있다(Shen 등, 2017).

따라서 본 연구에서는 장수풍뎅이 유충 열수 추출물(Allomyrina dichotoma larva hot water extracts, ADLE)을 처리하여 대식세포의 세포 생존율, nitric oxide(NO)와 염증성 사이토카인 분비능과 세포 표면활성인자(cluster of differentiation, CD80/86; major histocompatibility complex, MHC clsssⅠ/Ⅱ)의 발현, MAPKs 인산화 및 NF-κB의 발현에 미치는 영향을 관찰함으로써 ADLE의 대식세포 내 작용 기전과 면역 활성 효과를 확인하였다.

장수풍뎅이 유충 열수 추출물 제조

본 연구에 사용된 장수풍뎅이 유충은 (주)퓨처푸드랩(Busan, Korea)에서 구매하였다. 장수풍뎅이 유충을 동결건조한 후 실험실용 분쇄기(NSG-1002SS, Hanil, Seoul, Korea)로 분쇄하여 분말화하였다. 장수풍뎅이 유충 분말 30 g에 증류수를 600 mL 가하고 70°C에서 3시간 동안 500 rpm으로 교반, 가열하여 열수 추출하였다. 추출물을 거름종이(No. 4, Whatman, Kent, UK)로 여과한 후 이를 2,250×g에서 10분간 2회 원심분리하여 상등액을 획득하였다. 이 추출 상등액을 회전 감압농축기를 이용해 농축한 후 동결건조하고 -70°C에서 보관하여 본 실험에 사용하였다.

대식세포 배양

마우스 유래의 대식 세포주인 RAW 264.7 cell은 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포 배양을 위해 10% fetal bovine serum(Gibco, Carlsbad, CA, USA), 1% antibiotics(100 unit/mL penicillin and 100 unit/mL streptomycin)가 포함된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640 배지(Life Technology, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였고, 이는 37°C, 5% CO₂ incubator(Thermo, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다.

세포 생존율 평가

ADLE가 RAW 264.7 cell 대식세포 증식률에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 실시하였다. 96 well plate에 1×10⁴ cells/well의 농도로 RAW 264.7 cell을 분주한 후 37°C, 5% CO₂ incubator에서 12시간 동안 배양하여 세포를 완전히 부착시켰다. 200 ng/mL 농도의 lipopolysaccharide(LPS)와 농도별(1, 10, 25, 50, 100, 200 μg/mL)로 ADLE를 처리한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 그 후 5 mg/mL 농도의 MTT(thiazolyl blue, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 용액을 well당 20 μL 첨가하여 2시간 동안 반응시키고 배양 상등액을 제거하였다. MTT 시약의 첨가로 생성된 formazan을 녹이기 위해 dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich Co.)를 100 μL씩 첨가한 뒤 microplate reader(BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 control(medium only)의 흡광도 값을 기준으로 세포 생존율을 비교하였다.

사이토카인 분비 유도능 평가

ADLE 처리가 사이토카인 분비에 미치는 영향을 확인하기 위하여 enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)로 확인하였다. 48 well plate에 RAW 264.7 cell을 5×10⁴ cells/well이 되도록 분주한 후 37°C, 5% CO₂ incubator에서 12시간 배양해 세포를 완전히 부착시켰다. 200 ng/mL 농도의 LPS와 농도별(1, 10, 25, 50, 100, 200 μg/mL) ADLE를 처리한 후 24시간 동안 배양하고 배양 상등액을 분리하였다. 분리된 배양 상등액을 사용하여 tumor necrosis factor(TNF)-α와 interleukin(IL)-6의 함량을 측정하였다. 사이토카인의 함량은 ELISA kit(eBioscience Co., San Diego, CA, USA)을 사용하여 측정하였으며 흡광도는 450 nm에서 측정하였다. 이때 사이토카인의 농도는 kit에 포함되어 있던 TNF-α와 IL-6의 표준용액(0~2 ng/mL)으로부터 산출된 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

NO 유도능 평가

앞서 사이토카인 분비 유도능 평가에서 사용한 배양 상등액 중 세포독성이 나타나지 않으면서 사이토카인이 분비되는 농도인 100, 200 μg/mL를 사용하여 NO 분비량을 확인하였다. 상등액 100 μL에 동량의 Griess(Sigma-Aldrich Co.) 시약을 처리하고 암실에서 10분 동안 반응시킨 후 microplate reader를 이용해 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 NO의 농도는 sodium nitrite(NaNO₂, Sigma-Aldrich Co.)를 통해 얻은 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

세포 표면활성인자(cell surface molecules) 평가

ADLE의 처리가 대식세포의 세포 표면활성인자의 발현에 미치는 영향을 측정하기 위하여 RAW 264.7 cell을 각 48 well plate에 5×10⁴ cells/well 농도로 분주한 후, 37°C, 5% CO₂ incubator에서 12시간 배양하여 완전히 부착시켰다. ADLE를 100, 200 μg/mL의 농도로, LPS를 200 ng/mL 농도로 처리한 후 24시간 동안 반응시킨 후 세포를 회수하였다. 항체의 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 회수된 세포에 1 μg/mL의 Fcγ Ⅰ/Ⅲ(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)을 처리하여 4°C에서 20분간 반응시킨 후, 대식세포 표면활성인자 분석을 위하여 anti-CD 80-PE, anti-CD86-PE, anti-MHCⅠ 및 Ⅱ-PE(BD Biosciences)와 같은 세포 표면 항체를 1,000배씩 희석하여 각각의 세포에 처리하고 30분 동안 반응시킨 후 이를 유세포 분석기(FACS callibur, BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.

웨스턴 블롯 분석

6 well plate에 2×10⁵ cells/well의 농도로 RAW 264.7 cell을 분주하여 12시간 동안 완전히 부착시키고 LPS를 200 ng/mL의 농도로, ADLE를 100, 200 μg/mL의 농도로 처리하였다. 30분 동안 37°C, 5% CO₂ incubator에 반응시킨 후 세포를 수집하여 PBS로 3회 세척하고 RIPA Buffer(Rockford, IL, USA)를 첨가한 뒤 13,000 rpm에서 30분간 원심분리해서 cell lysate를 분리하였다. 핵 내의 단백질을 분리하기 위하여 수집한 세포에 저장성 완충액[10 mM N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid)(HEPES), pH 7.9, 1.5 mM magnesium chloride(MgCl₂), 10 mM potassium chloride(KCl), 0.5 mM dithiothreitol(DTT), 1 μM leupeptin과 0.2 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF)]을 20분간 처리한 후 12,000×g에서 1분간 원심분리하여 세포질과 핵을 분리하였다. 분리한 핵을 고장성 완충액[20 mM HEPES, pH 7.9, 25% glycerol, 420 mM ethylene diamine tetra acetic acid, 0.5 mM DTT, 1 μM leupeptin, 0.2 mM PMSF]으로 처리하여 10,000×g에서 20분간 원심분리하여 핵단백질을 추출하였다. BCA protein detection kit(Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA)을 사용하여 단백질을 정량하고, well당 20 μg의 cell lysate를 10% polyacrylamide gel에 각각 loading 하여 SDS-PAGE로 변성 분리하였다. 이를 polyvinylidene difluoride membrane(Millipore; Merck KGaA, Darmstadt, Germany)으로 transfer 하였고, membrane은 anti-body의 비특이적 결합을 방지하기 위해 blocking solution(5% skim milk) 20 mL로 1시간 동안 방치하였다. 이후 TBST(20 nM tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween- 20, pH 7.5)로 10분씩 3회 세척한 뒤 p-p38, p-ERK(extracellular signal-regulated kinases), p-JNK(c-Jun amino-terminal kinases) 및 p-IκB-α, NF-κB의 발현량을 측정하기 위해 1차 항체(Cell Signaling Technology, Danvers, MN, USA)를 1:3,000으로 희석하여 2시간 동안 반응시키고 TBST로 5분간 3회 세척하였다. 이후 2차 항체(goat-anti rabbit IgG, Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 1:3,000으로 희석하여 1시간 동안 반응시키고 TBST로 15분간 4회 세척하고 electrochemiluminescence(Millipore, Merck KGaA) reagent를 사용하여 인화하였다.

통계분석

이상의 실험에서 얻어진 결과는 GraphPad Prism 5.0 프로그램(GraphPad Prism Software, San Diego, CA, USA)을 이용하여 일원배치 분산분석(one-way ANOVA test)으로 분석하였고, 시료 간의 유의성은 multiple Tukey’s test를 이용하여 P<0.05, P<0.01 및 P<0.001 수준에서 비교하였다.

ADLE가 세포 생존율에 미치는 영향

ADLE가 대식세포의 세포독성을 나타내지 않는 농도를 확인하기 위하여 RAW 264.7 cell에서 ADLE를 처리하고 24시간이 지난 후 생존율을 MTT assay를 통해 확인하였다. ADLE는 농도별(1, 10, 25, 50, 100, 200 μg/mL)로 처리하고, 양성대조군으로는 톨-유사수용체4(Toll-like receptor 4) 자극 리간드로 염증반응을 유도하는 LPS(200 ng/mL)를 처리하였다. 모든 농도의 ADLE 처리군 및 LPS 처리군은 음성대조군(negative control, NC) 기준 100%에 근접한 세포 생존율을 나타내어 세포독성이 나타나지 않은 것을 관찰하였다(Fig. 1).

Fig 1. Effect of Allomyrina dichotoma larvae hot-water extracts (ADLE) on macrophage cell line (RAW 264.7 cells). Cell viability after ADLE treatment with various doses (0, 1, 10, 25, 50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h in RAW 264.7 cells. Lipopolysaccharide (LPS) was treated at the concentration of 200 ng/ mL as a positive control. After 24 h, cell viability was evaluated by MTT assay. The results are expressed as mean±SD (n=3).

ADLE가 사이토카인 분비능에 미치는 영향

외부로부터 생체로 유입된 병원균 혹은 바이러스와 세균 같은 항원에 의해 대식세포는 활성화되어 이를 직접 탐식하거나 여러 사이토카인을 분비하여 면역 활성을 일으키는데, 이에 대표적인 사이토카인에는 TNF-α, IL-6가 있다. TNF-α와 IL-6는 후천 면역세포인 T세포 매개 면역 활성을 유도하는 데 중요한 역할을 하고, 결과적으로 B 림프구의 항체 생성 활성화에도 필수적인 역할을 한다고 알려져 있다(Kim, 2005). ADLE 면역 활성을 평가하기 위해 사이토카인(TNF-α, IL-6) 분비능을 확인하였다. 농도별(1, 10, 25, 50, 100, 200 μg/mL) ADLE와 LPS(200 ng/mL)를 처리한 결과, ADLE 처리군에서 TNF-α 생성능은 100 및 200 μg/mL의 농도에서 각각 NC 대조군 대비 911.8 pg/mL(약 9.4배) 및 881.9 pg/mL(약 9.1배), IL-6 생성능은 100 및 200 μg/mL의 농도에서 각각 NC 대조군 대비 525 pg/mL(약 175배) 및 545 pg/mL(약 181배)로 유의하게 증가하였다(Fig. 2). 따라서 이후의 실험에서 ADLE의 농도를 사이토카인 생성능의 증가가 통계적으로 유의하게 나타난 100 및 200 μg/mL로 고정하여 실험하였다.

Fig 2. Effect of Allomyrina dichotoma larva hot-water extracts (ADLE) on cytokine (TNF-α, IL-6) production activity of in macrophage cell line (RAW 264.7 cells). ADLE were treated with various concentration (1, 10, 25, 50, 100, and 200 μg/mL). Lipopolysaccharide (LPS) was treated at the concentration of 200 ng/mL as a positive control. After 24 h, cytokine productions in culture supernatant were measured by using ELISA kit. The results are expressed as mean±SD (n=3). Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test. ^***P<0.001 compared to control (CON) group.

ADLE가 NO 분비능에 미치는 영향

활성화된 대식세포가 분비하는 NO는 강한 이원자 자유라디칼로 병원성 항원에 의해 감염된 세포나 암세포의 증식을 제어하는 등 체내의 방어기능에 중요한 역할을 수행한다(Kim 등, 2005). 따라서 ADLE의 처리가 대식세포의 활성화 지표인 NO 생성을 효과적으로 유도하는지 평가하였다. RAW 264.7 cell에 양성대조군으로 LPS 처리된 그룹은 NC 대조군(1.3 µM) 대비 10.9 µM(8.2배)의 통계적으로 유의한 NO 생성능이 확인되었다. ADLE 처리군은 100 및 200 μg/mL 농도에서 각각 NC 대조군(1.3 µM) 대비 15.3 µM(11.5배) 및 15.7 µM(11.9배)로 NO 생성능의 증가를 확인하였다(Fig. 3). 따라서 ADLE는 100 및 200 μg/mL 농도에서 사이토카인과 NO 생성을 유도하여 대식세포에서 면역 활성 효능을 증가시키는 것으로 사료된다.

Fig 3. Effect of Allomyrina dichotoma larva hot-water extracts (ADLE) on nitric oxide (NO) production activity of in macrophage cell line (RAW 264.7 cells). ADLE were treated at the concentration of 100, 200 μg/mL in RAW 264.7 cells. After 24 h, NO production in culture supernatant was analyzed by Griess reagent assay. The results are expressed as mean±SD (n=3). Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test. ^***P<0.001 compared to control (CON) group.

ADLE의 대식세포 세포 표면활성인자에 미치는 영향

대식세포를 포함한 다양한 면역세포들은 표면의 분자 구조를 통해 서로를 구분하며 이를 분화집단(CD)이라고 일컫는다. 따라서 이러한 CD는 세포를 분리하고 분석하는 연구에서 매우 유용하게 사용되며, 대표적인 공동자극인자(costimulatory molecules)인 CD80 및 CD86의 발현은 T세포의 증식 및 활성화에 꼭 필요한 요소라고 알려져 있다(Byun과 Byun, 2015). 대식세포는 병원체를 탐식 후 표면에 존재하는 주조직적합성복합체(MHC)를 통해 항원을 제시함으로써 T세포를 활성화하여 후천성 면역 반응의 활성화에 기여한다(Geum과 Jung, 2021). 따라서 ADLE의 처리가 대식세포의 CD80, CD86 및 MHC class I/Ⅱ 발현을 증가시키는지 확인하기 위하여 유세포 분석기를 이용하여 이를 관찰하였다. 분석 결과 각 공동자극인자의 발현은 NC 대조군 대비 ADLE 100 μg/mL 농도에서 CD80 30%, CD86 4.7%, MHC-class I 57.2%, MHC class Ⅱ 17.9%, 200 μg/mL 농도에서 CD80 30.5%, CD86 2.6%, MHC-class I 57.6%, MHC class Ⅱ 20.6% 증가하였다(Fig. 4). 이는 결과적으로 면역세포의 활성화를 유도하는 것으로 사료된다.

Fig 4. Effect of Allomyrina dichotoma larva hot-water extracts (ADLE) on surface molecules in RAW 264.7 cells. After 24 h of ADLE or lipopolysaccharide treatment, cells were stained with anti-CD80/86, anti-MHC-I/II for 30 min. Surface marker expression was measured by flow cytometer. The results are expressed as mean±SD (n=3). Statistical analysis was performed using one-way ANOVA followed by Tukey’s post-hoc test. ^***P<0.001 compared to control (CON) group.

ADLE가 MAPKs 및 NF-κB의 인산화에 미치는 영향

대식세포의 초기면역반응은 세포 밖 조절 단백질 인산화효소(ERK), c-Jun NH2-단백질 인산화효소(JNK)와 세린/트레오닌 단백질 인산화효소(serine/theronine protein kinase; p38)를 포함하는 MAPKs의 인산화 및 NF-κB의 전사가 중요하게 관여한다고 알려져 있다(Byun, 2013). 앞선 실험의 ADLE의 처리에 의한 대식세포 활성화가 MAPKs 인산화와 NF-κB의 핵 내 전사에 의한 것인지 알아보기 위하여, RAW 264.7 cell에 100, 200 μg/mL의 농도의 ADLE와 LPS를 처리하고 MAPKs와 NF-κB의 인산화 정도를 관찰하였다. 그 결과 100, 200 μg/mL로 처리된 ADLE와 LPS 처리 그룹 모두에서 phosphorylated forms/ total form으로 나타낸 MAPKs(ERK, JNK, p38)의 인산화 비율이 NC 대조군 대비 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 5A). 더불어 ADLE(100, 200 μg/mL) 처리군에서 NF-κBp65의 발현은 각각 NC 대조군 대비 3.3배, 9.7배 증가하였으며 IκB-α의 인산화는 1.8배, 32.6배로 증가하였다(Fig. 5B 및 5C). 이는 ADLE 처리군에서 MAPKs와 IκB-α의 인산화 및 NF-κBp65의 발현이 효과적으로 유도된 것을 시사하며, 본 연구에서 ADLE의 처리에 의한 대식세포의 면역 활성은 MAPKs 및 NF-κB 활성을 기반으로 이루어진 것으로 사료된다.

Fig 5. Effect of Allomyrina dichotoma larva hot-water extracts (ADLE) on MAPK and NF-κB signals in macrophage cell line (RAW 264.7 cells). ADLE were treated at the concentration of 100 and 200 μg/mL for 30 min. Lipopolysaccharide (200 ng/mL) was used as a positive control. Activation of (A) MAPKs (phosphorylated ERK, JNK, p38) and (B) NF-κB (phosphorylated IκB-α, IκB-α degradation, and nuclear translocation of p65) signals were analyzed via western blotting. The relative intensity for phosphorylated MAPKs and NF-κB signals were normalized with total MAPKs or Lamin B. The results are expressed as mean±SD (n=3). Statistical analysis was performed using multiple Tukey’s test with a significant level of ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared to control (CON) group.

본 연구는 장수풍뎅이 유충 열수 추출물의 면역증진 기능성 소재로서의 활용 가능성을 알아보고자 마우스 대식 세포주인 RAW 264.7 cell에서의 활성 능력을 평가하였다.

대식세포는 식세포 작용(phagocytosis)을 통해 병원체 및 죽은 조직을 제거하고 분해하여 주조직적합성복합체를 통해 항원을 제시한다. 이러한 항원 제시 세포에서 유도되는 CD80 및 CD86과 같은 공동자극인자의 발현과 NO, IL-6 및 TNF-α와 같은 면역자극인자 분비는 결과적으로 T림프구 증식과 도움 T림프구 분화를 유도하기 때문에(Yu 등, 2012), 대식세포의 활성 평가를 통해 선천 면역 자극으로 인한 면역 활성 여부를 파악하는 데 유용하게 활용되고 있다(Geum 등, 2020). 이러한 면역 반응의 활성화에는 MAPKs의 인산화와 NF-κB의 핵 내 전사와 같은 신호전달이 중요하게 작용하며, MAPKs의 인산화는 산화질소, 사이토카인 유전자 발현을 촉진하여 대식세포를 활성화한다고 알려져 있다(Yoo 등, 2022). NF-κB는 정상상태에서 inhibitor of kappa B(IκB)와 결합하여 불활성화 상태로 존재하다가 특정 신호에 따라 IκB는 IκB kinase(Ikk)에 의해 분해되고, 유리된 NF-κB는 핵으로 이동하여 사이토카인, adhesion molecule 등의 염증반응 관련 인자의 유전자 발현을 촉진해 대식세포의 활성을 유도하는 핵심전사인자이다(Cho 등, 2018). 본 연구에서 장수풍뎅이 유충 열수 추출물인 ADLE를 RAW 264.7 cell에 처리한 결과 TNF-α, IL-6, NO 생성이 유도되었고, 주조직적합성복합체 및 공동자극인자의 발현 증가를 확인하였다. 더불어 ADLE 처리로 RAW 264.7 cell 내 MAPKs 인산화와 NF-κB의 핵 내 전사가 유도된 것을 확인하였다. 종합적으로 ADLE는 MAPKs와 NF-κB 신호전달을 통해 대식세포 활성을 유도하는 것으로 사료된다.

최근 단백질, 불포화지방산 및 무기질을 풍부하게 함유하는 식용곤충이 대체식량 자원뿐만 아니라 기능성 소재로도 주목받으면서, 식용곤충을 면역 활성 소재로 활용하고자 하는 연구개발 또한 꾸준히 이루어지고 있다(Hwang과 Choi, 2015). 중국의 식용 흑개미로 알려진 Polyrhachis vicina Roger의 초임계 유체 추출물은 마우스 혈청의 NO 함량, 용혈 항체와 같은 면역 활성 지표를 증가시켰으며, 이를 토대로 흑개미 추출물의 건강식품 소재로서의 가능성이 제시되었다(Tang과 Dai, 2018). Kim 등(2020)에 따르면 식용 메뚜기 유래 단백질 추출물은 수지상세포의 성숙 및 활성을 효과적으로 유도하여 CD4+ 및 CD8+ T세포의 생성을 촉진하여 우수한 항암 면역증진 효능을 갖는다고 보고되었다. 최근 이렇게 식용곤충으로부터 유용한 성분을 분리해내고, 이들의 면역증진 효과를 확인하여 기능성 소재로 활용하고자 하는 연구가 꾸준히 진행되고 있으며, 본 연구에 활용된 장수풍뎅이 유충은 다른 식용곤충들에 비해 칼슘 및 철을 다량 함유하고 있다고 알려져 있다(Baek 등, 2017; Ghosh 등, 2017). 칼슘은 이온 농도를 조절하여 T세포 및 B세포와 같은 면역세포의 증식, 분화, 사멸과정을 통제(Hogan 등, 2003)하며, 철은 호중구의 성숙과 살균능력에 직접 영향을 끼치고 체액성 및 세포성면역 반응조절에 중요한 작용을 한다고 보고되었다(Suh와 Jeon, 2018). 더불어 Ghosh 등(2017)에 따르면 장수풍뎅이 유충은 아미노산들 가운데 글루타티온의 주성분인 글리신, 글루타민산, 시스테인을 많이 함유하고 있으며, 글루타티온은 면역세포의 성장, 기능 그리고 활성을 조절하여 독성완화(Boo, 2000), 면역기능 증가(Amatore 등, 2019) 및 항산화 효과(Ceballos-Picot 등, 1996) 활용을 목적으로 한 연구들로 널리 알려져 있다.

이러한 선행연구들에 근거하여 장수풍뎅이 유충의 추출물이 함유한 풍부한 아미노산과 무기질 성분이 대식세포 내 면역 활성을 유도하는 지표 성분으로 예상되며, 면역증진 기능성 소재로서의 활용 가능성을 확인하였다. 그러나 추후 ADLE의 면역 활성을 유도하는 정확한 지표 성분을 분석하고, 이를 분리 정제하여 실제 동물모델에서도 면역 활성 효능을 갖는지 검증하는 후속 연구가 필요하다.

본 연구는 장수풍뎅이 유충 열수 추출물(ADLE)이 면역 활성을 유도하는 기능성 소재로 활용 가능한지 알아보기 위하여 대식 세포주인 RAW 264.7 cell을 활용하여 면역 활성능을 평가하였다. ADLE 처리는 세포독성을 나타내지 않는 농도에서 RAW 264.7 cell의 사이토카인(IL-6 및 TNF-α) 및 NO 생성을 유도하였고, 세포 표면활성인자(MHC-I, MHC-II, CD80 및 CD86)의 발현을 효과적으로 증가시켰다. 기전 분석 결과, ADLE 처리에 의한 대식세포의 면역 활성은 MAPKs의 인산화 및 NF-κB의 핵 내 전사에 의한 것임을 확인하였다. 종합적으로 ADLE의 처리는 MAPKs의 인산화와 NF-κB의 전사를 유도하여 사이토카인 및 NO의 생성과 세포 표면활성인자의 발현을 증가시켜 RAW 264.7 cell의 면역 활성을 유도하는 것으로 관찰되었다. 이러한 연구 결과는 장수풍뎅이 유충 열수 추출물이 면역증강 기능성 소재로 유용하게 활용될 수 있다는 가능성을 제시한다.

본 연구는 2019년도 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기본연구사업(No. NRF-2019R1F1A1061378)으로 수행되었으며, 그 지원에 감사드립니다.