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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(3): 221-228

Published online March 31, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.3.221

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Apoptotic Effects of Butanol Fraction of Lysimachia foenum-graecum by Regulating Akt/mTOR Signaling Pathways in AGS Gastric Cancer Cells

Hyo Jae Lee1 , Ji Won Seo1 , Sang Hyeon Kim1, Chang Yeol Lee1, Sang Yong Kim2, and Young Min Kim1

1Department of Biological Science and Biotechnology, Hannam University
2Department of Food Science & Bio Technology, Shinansan University

Correspondence to:Young Min Kim, Department of Biological Science and Biotechnology, College of Life Science and Nano Technology, Hannam University, 1646, Yuseong-daero, Yuseong-gu, Daejeon 34054, Korea, E-mail: kym@hnu.ac.kr
Author information: Hyo Jae Lee (Graduate student), Ji Won Seo (Graduate student), Sang Hyeon Kim (Graduate student), Chang Yeol Lee (Student), Sang Yong Kim (Professor), Young Min Kim (Professor)

Received: November 22, 2021; Revised: January 7, 2022; Accepted: February 3, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Lysimachia foenum-graecum is a herbal plant known to be effective in relieving headaches, toothaches, and inflammation. It is known to have antioxidant, anti-obesity, and anti-inflammatory effects. However, anti-gastric cancer effects have so far not been reported. The purpose of this study was to investigate the apoptotic effects of the butanol fraction of Lysimachia foenum-graecum (LFB) in AGS human gastric cancer cells. The antiproliferative activity of LFB was confirmed by MTT analysis, and the apoptotic effect was confirmed by Annexin-V analysis. In addition, it was confirmed through western blotting that the LFB treatment reduced the expression levels of p-Akt and p-mTOR in a concentration-dependent manner. Akt plays a role in cell proliferation and migration of cancer cells by regulating important signaling factors such as mTOR and p53. mTOR induces the ubiquitination of p53 and plays an important role in tumorigenesis and the survival of cancer cells. This inhibition of Akt and mTOR leads to apoptosis by regulating the signaling molecules of the intrinsic pathway. In addition, LFB increases the expression level of the effector caspase, caspase-3, in a concentration-dependent manner. The expression of apoptosis-related signal proteins was confirmed by treatment with LY2940002 (Akt inhibitor) and rapamycin (mTOR inhibitor). These results indicate that LFB induces apoptosis through the endogenous pathway by suppressing the expression of Akt and mTOR.

Keywords: AGS, Akt/mTOR pathway, apoptosis, intrinsic pathway, Lysimachia foenum-graecum

우리나라 2018년 위암 발생률은 세계 1위를 기록한다고 보고되었다(Bray 등, 2018). 또한 국내 위암 발생률은 인구 10만 명당 52.1명의 발생률을 보이며 이는 전체 암 중 2위라는 높은 발생률을 보인다(Jung 등, 2020). 위암의 발생 원인은 감염, 유전, 식습관 등의 다양한 환경적 유전적 원인에 의해 발생하며, 이러한 위암의 기존 치료법에는 외과적 수술과 항암 화학요법, 방사선요법 등이 있다(Van Cutsem 등, 2016; Amable, 2016). 이러한 기존의 항암 치료법은 합병증이 일어날 가능성이 높고, 거기에 오심, 구토, 설사, 우울증 등의 부작용이 심해 환자들의 삶의 질이 낮아진다(Kim, 2012). 따라서 이러한 부작용들을 줄여주고 암 환자들의 삶의 질을 높이기 위해 암세포에서만 작용하고 정상세포에는 영향을 끼치지 않는 천연물 소재를 활용한 항암치료가 주목받고 있다(Prakash 등, 2013). 이 중 영릉향(Lysimachia foenum-graecum)은 전통적인 한약재로 두통, 치통, 염증 완화에 효과가 있다고 알려져 있다(Chartarrayawadee 등, 2020). 이러한 영릉향의 항비만, 항산화 그리고 유방암에 대한 항암 효과는 연구가 되어 있으나 다른 암종에 대한 연구는 미비하다(Lee 등, 2013; Li 등, 2009; Seo 등, 2011). Apoptosis는 대표적인 항암 기전이자 치명적으로 손상된 세포를 없애기 위한 프로그램화된 세포 죽음으로써 이러한 apoptosis가 제대로 일어나지 않는다면 세포의 암화가 진행되므로 매우 중요한 과정이다(Gonzalvez와 Ashkenazi, 2010). Apoptosis의 신호경로는 extrinsic pathway와 intrinsic pathway로 나눠진다(Kawk 등, 2019). Akt는 serine-threonine kinase로 mTOR, p53과 같은 중요 신호 분자의 발현을 조절하여 세포 증식 및 이동 등의 signaling pathway에 관여한다(Luo 등, 2003). Akt에 의해서 활성화된 mTOR은 p53의 ubiquitination을 유도하며, 종양 형성과 세포의 성장 및 증식을 조절한다(Sheppard 등, 2012). p53은 DNA 손상, 산화적 스트레스 등의 다양한 스트레스 신호에 대한 DNA 복구, apoptosis와 같은 세포의 반응을 일으키는 중요 신호전달 분자이다(Michael과 Oren, 2003). 또한 p53은 apoptosis 억제 단백질인 Bcl-2를 저해하고, apoptosis 유도 단백질인 Bax와 Bak의 oligomerization을 일으킨다. 이로 인해 mitochondrial outer membrane permeabilization을 유도하여 caspase cascade가 일어난다(Nam 등, 2019; Vazquez 등, 2008). 그중 effector caspase인 caspase-3가 분절되어 활성화되면 DNA의 손상을 수정하고 보호하는 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)를 분절시킨다. 이로 인해 DNA가 fragmentation 되어 intrinsic pathway를 통한 apoptosis가 유도된다(Peña-Blanco와 García-Sáez, 2018; Porter와 Jänicke, 1999; Slee 등, 1999). 따라서 본 연구에서는 영릉향 부탄올 분획물(LFB)이 AGS 위암 세포에서의 apoptosis 유도 효과와 apoptosis 관련 단백질의 발현에 미치는 점을 확인하고자 하였으며, Akt/mTOR 신호전달 경로를 확인하여 LFB에 의한 apoptosis 효과가 intrinsic pathway를 통해 유도되는 것을 증명하고자 하였다.

실험 재료

본 연구에서 이용된 영릉향은 한약재시장(Daejeon, Korea)에서 구입하였으며, Lee 등(2013)Um 등(2014)의 시험법을 바탕으로 영릉향 분쇄가루 100 g에 에탄올 800 mL를 가하여 완전히 침지시킨 후 상온에서 72시간 동안 환류 추출하였다. 이러한 방법으로 추출한 영릉향을 감압 농축기(N-1200A, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 40°C에서 감압 농축하여 에탄올 추출물을 수득하였다. 이 추출물을 증류수 800 mL에 용해한 뒤 n-BuOH 800 mL로 추출하여 부탄올 분획물을 얻었다. 이후 감압 농축기를 이용해 감압 농축시키고 용매를 제거한 다음 동결 건조하여 실험에 사용하기 전까지 -80°C에서 보관하였다. 농도별 영릉향 부탄올 분획물(25, 50, 75, 100, 125, 150 μg/mL)은 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 이용해 만들고 -20°C에 보관하여 사용하였다. LY2940002는 Calbiochem(San Diego, CA, USA)에서, rapamycin은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, DMSO에 용해해 각각 20 mM과 100 nM로 만들어 사용하였다.

세포 배양

본 연구에 사용한 AGS 인체 위암세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양받았으며, 10% FBS(HyClone Laboratories Inc., Logan, UT, USA)와 1% antibiotics(HyClone Laboratories Inc.)가 포함된 RPMI 1640 media(HyClone Laboratories Inc.)를 사용하였다. CCD-986Sk 인체 정상 섬유아세포는 ATCC에서 분양받았으며 10% FBS(HyClone Laboratories Inc.)와 1% antibiotics(HyClone Laboratories Inc.)가 포함된 DMEM media(HyClone Laboratories Inc.)를 사용하여 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 배양하였다. 48시간마다 Trypsin-EDTA(HyClone Laboratories Inc.)를 이용하여 세포를 부유 상태로 만든 다음 1×106 cells/mL로 분주하고 계대 배양하였다.

MTT assay

AGS 세포와 CCD-986Sk 세포를 12-well plate에 1×105 cells/mL로 seeding 한 후 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. 그다음 LFB를 농도별(25, 50, 75, 100, 125, 150 μg/mL)로 처리하고 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간과 48시간을 배양하였으며, LY294002(20 mM)와 rapamycin(100 nM)을 처리할 때에는 LFB보다 1시간 전에 처리한 뒤 24시간 동안 배양하였다. MTT solution을 well당 40 μL씩 처리 후 50분 동안 incubator에 배양하였다. 그 뒤 PBS를 well당 1 mL 분주하여 washing 후 DMSO를 well당 150 μL씩 넣어주었다. 이후 96-well plate에 100 μL씩 취해 옮겨준 다음 FLUOstar Omega(BMG labtech, Ortenberg, Germany)를 이용하여 595 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

Observation of AGS cell morphological change

6-well plate에 AGS 세포를 well당 1×106 cells/mL로 분주하여 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 동안 배양한 후 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리하였다. 배양 후 AGS 세포에서 일어난 형태 변화를 Inverted microscope(Zeiss, Oberkochen, Germany)로 관찰하였다.

MuseTM Annexin V & Dead Cell staining

Apoptosis를 정량적으로 분석하기 위해 MuseTM Annexin V & Dead Cell Kit(Merck Millipore, Burlington, MS, USA)을 사용하였다. AGS 세포를 6-well plate에 1×105 cells/mL로 seeding 후, 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. 그다음 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리해준 후 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. 그 후 PBS를 사용하여 세포를 세척한 뒤 Trypsin-EDTA(HyClone Laboratories Inc.)를 이용하여 세포를 부유시킨 후 원심분리하여 모아주었다. 모아준 세포는 PBS를 이용하여 washing하고 MuseTM Annexin V & Dead Cell Kit(Merck Millipore)을 처리한 후 20분간 반응시켰다. 반응 후 MuseTM Cell Analyzer (Merck Millipore)를 사용하여 분석하였다.

Caspase-3/7 activity assay

6-well plate에 AGS 세포를 1×105 cells/mL로 seeding 후, 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. 그다음 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리해준 후 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. 그 후 PBS를 사용하여 세포를 세척한 뒤 trypsin- EDTA(HyClone Laboratories Inc.)를 이용하여 세포를 부유시킨 후 원심분리하여 모아주었다. 모아준 세포는 PBS를 이용하여 washing하고 MuseTM caspase-3/7 reagent (Merck Millipore)와 혼합된 1X Assay Buffer BA(Merck Millipore)를 처리하고, 빛을 차단한 뒤 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 20분간 배양하였다. 배양 종료 후 MuseTM caspase-3/7 7-AAD working solution(Merck Millipore)을 150 μL씩 각 tube에 처리하였다. 처리 후 MuseTM Cell Analyzer(Merck Millipore)를 사용하여 분석하였다.

Western blotting

6-well plate에 AGS 세포를 well당 1×106 cells/mL로 분주하여 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. 그다음 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리한 후 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. LY294002(20 mM)와 rapamycin(100 nM)은 LFB를 처리하기 1시간 전에 처리하였다. 그다음 세포에 RIPA lysis buffer[25 mM Tris-Cl(pH 7.4), 1% NP40, 0.5% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF]를 well당 150 μL씩 첨가한 뒤 scrapper를 이용하여 단백질을 분리하였다. 그 후 14,000 rpm, 4°C에서 20분 동안 원심분리하여 상등액만을 취하였다. 얻어진 상등액은 FLUOstar Omega(BMG labtech)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질을 정량하였다. Electrophoresis는 8%, 12% acrylamide gel을 이용하여 실시하였으며, nitrocellulose membrane에 transfer 하였다. 그 후 4% bovine serum albumin(BSA)을 이용하여 상온에서 2시간 blocking 하였다. 1차 항체는 4°C에서 16시간 동안 처리한 뒤 2차 항체를 1~2시간 동안 반응시킨 다음 ECL solution(Thermo, Rockford, IL, USA)을 Blue X-ray film에 감광하여 실험 결과를 측정하였다. 또한 모든 단백질 발현량을 Image J program(NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 면적을 수치화하고 그래프로 나타내었다.

통계처리

통계프로그램인 SPSS(Statistical Package for the Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 22.0 프로그램을 사용하였고 실험 설계에 대한 분산 분석은 독립표본 t-test를 통하여 검정하였다. 각 자료는 최소 3번 이상의 반복된 실험을 통해 얻은 결과로 검정하였고 P<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

LFB가 AGS 세포의 증식에 미치는 효과 확인

LFB가 AGS 세포에 특이적으로 세포독성을 나타내는지 확인하기 위해 LFB를 농도별(25, 50, 75, 100, 125, 150 μg/mL)로 처리한 뒤 MTT assay를 통해 세포독성을 측정하였다. 그 결과 인체 정상 섬유아세포인 CCD-986Sk 세포에서는 control 군과 비교했을 때 모든 농도군에서 생존율이 85% 이상으로 유지되며 유의하지 않은 것으로 확인하였다. 이를 통해 LFB가 정상세포에서 독성이 없음을 확인하였다(Fig. 1A). 반면 AGS 인체 위암 세포에 LFB를 처리했을 때는 control 대비 농도 및 시간에 의존적으로 세포의 증식이 유의하게 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 1B, 1C). 또한 AGS 세포에 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리했을 때 밀도가 높으며, 형태도 정상적인 AGS 세포의 형태를 보이는 control 군과 비교했을 때 LFB 처리 군에서는 농도 의존적으로 세포의 밀도가 감소하며 apoptosis와 같이 세포 형태의 응축 같은 형태학적인 변화가 일어난 것을 확인하였다(Fig. 1D). 결과적으로 LFB는 인체 정상 섬유아세포 CCD-986Sk의 증식에는 유의하지 않게 영향을 미치며 AGS 위암 세포주에 있어 특이적이고 농도 및 시간에 의존적으로 세포의 증식을 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 세포증식 억제 효과가 apoptosis 유도에 의해 일어나는 것인지 연구하기 위해 위 결과를 바탕으로 주요 농도를 50, 100, 150 μg/mL로 결정하여 이후 실험을 진행하였다.

Fig. 1. The effect of Lysimachia foenum-graecum (LFB) on the cell viability of AGS cells and CCD-986Sk cells. (A) CCD-986Sk cells were pretreated with LFB for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. N.S: not significant. (B) AGS cells were pretreated with LFB for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *P<0.05 and **P<0.01 compared to control (each experiment, n=3). (C) AGS cells were pretreated with LFB for 48 h. Cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. **P<0.01 and ***P<0.001 compared to control (each experiment, n=3). (D) AGS cells morphology change after treatment of LFB for 24 h. Original magnification ×200 (each experiment, n=3).


LFB에 의한 AGS 세포의 apoptosis 유도 효과 확인

앞선 실험에서 LFB 처리에 의한 AGS 세포의 증식 억제를 확인하였다. 이러한 AGS 세포에서 LFB의 세포증식 억제 효과가 necrosis에 의한 것인지 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위해 AGS 세포에 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 24시간 처리한 후, MuseTM Annexin V & Dead Cell Kit으로 staining 한 뒤 flow cytometry를 실시하였다. 그 결과 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리한 군의 경우 세포 생존율이 각각 61.14%, 38.94%, 36.11%로 농도 의존인 감소를 확인하였다. 또한 apoptosis도 마찬가지로 control 군의 apoptosis 유발 빈도는 약 12.03%로 낮았으나, LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리한 군의 경우 각각 35.38%, 50.21%, 58.31%로 농도 의존적인 apoptosis 유도를 확인하였다. Fig. 2BFig. 2A의 apoptotic cell, necrotic cell, alive cell 각각을 그래프로 표현한 것이다(Fig. 2A, 2B). 이러한 결과 LFB의 농도별 처리에 따른 AGS 위암 세포 특이적인 생존율 및 증식 억제가 necrosis가 아닌 apoptosis 유도에 의한 것임을 확인하였다.

Fig. 2. The effect of LFB on the induction of apoptosis in AGS cells. (A) AGS cells were treated with LFB at different concentrations (50, 100, and 150 µg/mL) for 24 h. Data analysed by flow cytometry. Data shows four populations of live, dead, early apoptosis, and late apoptosis. (B) The cells were classified into 5 categories based on their stage: live, necrosis, early apoptosis, late apoptosis, and total apoptosis. LFB shown to induce apoptotic cell in the AGS cells mainly with the increased in total apoptotic cells and the apparent decreased in the live cells. LFB also significantly induced the total apoptotic cells in a dose-dependent manner. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *P<0.05, **P<0.01, and *P<0.001 compared to control (each experiment, n=3).

LFB가 AGS 세포에서 intrinsic pathway 관련 apoptosis 단백질 발현에 미치는 영향과 caspase activity 효과

Akt는 암세포의 성장과 생존에서 중요한 역할을 하며 mTOR이나 p53과 같은 신호 분자들을 조절한다(Park 등, 2011). 또한 p53의 활성에 따른 상향 조절은 중요 apoptosis 억제 단백질인 mTOR을 불활성화하여 intrinsic pathway를 경유하는 apoptosis를 유도한다(Nam 등, 2018). 이러한 신호 분자의 조절은 intrinsic pathway에서 중요한 Bcl-2 family 단백질을 조절한다(Kim 등, 2016). Bcl-2 family 중에는 apoptosis 억제 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL과 apoptosis 유도 단백질인 Bax, Bak가 존재하여 이 둘이 길항적으로 조절된다고 알려져 있다(Jo 등, 2019). 이러한 apoptosis 과정을 통해 caspase-3가 활성화되면서 DNA의 수선을 담당하는 PARP 단백질을 분절시켜 불활성화 상태인 cleaved-PARP가 생성된 후에 특징적인 apoptosis가 일어나게 된다(Park 등, 2018). 본 실험에는 AGS 세포에서 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리한 뒤 apoptosis 조절 단백질들의 발현 정도를 확인하기 위해 western blotting을 실시하였다. 그 결과 농도별 LFB 처리에 따라 농도 의존적으로 암세포의 생장과 증식에 영향을 미치는 Akt의 활성 상태인 p-Akt가 감소하고, 같은 apoptosis 억제 단백질인 p-mTOR 또한 감소함을 확인하였다. 이러한 apoptosis 억제 단백질의 발현 감소에 따라 p53의 발현이 증가하였으며, Bcl-2 family의 apoptosis 억제 단백질인 Bcl-2의 발현 감소와 apoptosis 유도 단백질인 Bax, Bak의 발현 증가를 확인하였다. 더해서 pro caspase-3의 감소와 cleaved caspase-3의 증가를 확인하였으며, 이로 인해 PARP 단백질의 분절을 일으켜 생성된 cleaved PARP의 농도 의존적인 증가를 확인할 수 있었다(Fig. 3A, 3C). Apoptosis에서 intrinsic pathway는 caspase가 활성화되어 apoptosis가 유도되는데, 본 실험에서는 LFB를 처리했을 때 caspase 활성을 확인하기 위해서 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리한 뒤 caspase-3/7 activity assay를 실시하였다. 그 결과 control 군에서는 10.9%로 낮은 apoptosis 유발 빈도를 보였으나, 각각 50 μg/mL 군에서 37.87%, 100 μg/mL 군에서 46.93%, 150 μg/mL 군에서 51.7%로 농도 의존적인 apoptosis 유발 빈도 증가를 확인하였다(Fig. 3B). 이러한 결과 LFB가 AGS 세포에서 intrinsic pathway를 통해 apoptosis를 유도하는 것을 확인하였다.

Fig. 3. The LFB effects on the expression of apoptosis regulatory proteins. (A) AGS cells were treated with the indicated concentrations of LFB for 24 h. The expression of p-mTOR, p-Akt, p53, pro caspase-3, cleaved caspase-3, Bcl-2, PARP, cleaved PARP, Bax, Bak, and β-actin were analyzed by Western blot analysis. The β-actin served as protein loading control (each experiment, n=3). (B) AGS cells were treated with LFB at different concentrations (50, 100, and 150 µg/mL) for 24 h. Data analysed using a Muse™ caspase-3/7 kit, as described in Materials and Methods. Data shows four populations of live, dead, early apoptosis, and late apoptosis. (C) Semi-quantitative analysis of (A). The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001 compared to control (each experiment, n=3).

Akt, mTOR 저해제가 AGS 세포의 증식과 apoptosis 조절단백질 발현에 미치는 영향

앞선 실험에서 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리한 뒤 실시한 western blotting과 caspase-3/7 activity의 결과를 통해 LFB가 Akt/mTOR signaling pathway를 경유하여 apoptosis를 유도한다는 가설을 세웠다. Apoptosis가 유도되는 신호 경로를 확인하기 위해 상위 단백질인 Akt와 mTOR의 활성을 각각 억제하는 LY294002와 rapamycin을 AGS 세포에 처리하여 MTT assay와 western blotting을 실시하였다. 그 결과 control 군과 LFB(100 μg/mL) 군을 비교했을 때 58.7% 정도의 생존율을 확인하였다. LY2940002를 단독 처리한 군은 Akt의 활성이 억제되어 63.2%의 생존율을 나타내었으며, LFB와 LY294002를 병행 처리한 군의 경우 단독 처리한 군보다 더 적은 34.6%의 생존율을 보였다. 또한 control 군과 비교하여 rapamycin을 단독 처리한 군은 67.1%의 생존율을 나타내었으며, LFB와 rapamycin을 병행 처리한 군의 경우에는 42.1%의 더 낮은 생존율을 보였다. 이 결과 Akt와 mTOR의 억제가 AGS 세포의 생장 및 증식 억제에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었으며, LFB 또한 저해제와 비슷한 증식 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다(Fig. 4A). 그리고 Akt와 mTOR을 억제함으로써 Akt/mTOR signaling pathway에 관여하는 단백질들의 발현 경향을 확인해보기 위해 Fig. 4A와 동일한 실험 조건으로 western blotting을 시행하였다. 그 결과 Akt 및 mTOR 저해제와 LFB(100 μg/mL) 처리에 따른 apoptosis 관련 단백질의 발현을 보면 apoptosis를 유도하는 단백질인 p53, Bax, Bak, cleaved caspase-3, cleaved PARP의 발현과 활성은 증가하였고, apoptosis 억제 단백질인 p-Akt, p-mTOR, Bcl-2, pro caspase-3는 감소하는 경향을 확인하였다(Fig. 4B, 4C). 이러한 결과 LFB가 Akt와 mTOR을 억제하여 이를 경유하는 signaling pathway를 통해 apoptosis를 유도한다는 가설을 확인하였다.

Fig. 4. The effects 7on cell anti-proliferation and the control of the signal proteins via inhibition of Akt/mTOR. AGS cells were treated with 20 μM LY 294002 (Akt inhibitor), 100 nM rapamycin (mTOR inhibitor) and LFB (100 µg/mL) for 24 h. (A) The cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. **P<0.01 and ***P<0.001 compared to control (each experiment, n=3). (B) The cell were treated with 20 μM LY294002, 100 nM rapamycin and 100 µg/mL LFB for 24 h. The expression of p-mTOR, p-Akt, p53, pro caspase-3, cleaved caspase-3, Bcl-2, PARP, cleaved PARP, Bax, Bak, and β-actin were analyzed by western blot analysis. The β-actin served as protein loading control (each experiment, n=3). (C) Semi-quantitative analysis of (B). The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001 compared to control (each experiment, n=3).

영릉향(Lysimachia foenum-graecum)은 두통, 치통, 염증 완화에 효과가 있는 한약재로 항산화, 항비만, 항염 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 위암에서 영릉향의 항암 효과는 보고되지 않았으며, 본 연구에서는 AGS 인체 위암 세포에서 영릉향 부탄올 분획물(LFB)의 apoptosis 효과를 확인하고자 하였다. MTT assay를 통해 세포 증식 억제 효과를, Annexin V & Dead Cell staining을 통해 LFB의 apoptosis 유도 효과를 확인하였다. 또한, western blotting을 통해 LFB 처리가 농도 의존적으로 종양 형성과 암세포의 생존에 있어서 중요한 역할을 하는 p-Akt와 p-mTOR의 활성 수준을 감소시키는 것을 확인하였다. 더해서 LFB 처리가 농도 의존적으로 intrinsic pathway의 신호 단백질을 조절하여 apoptosis를 유도하는 것을 확인하였다. 그리고 caspase-3/7 activity assay를 통해 LFB가 농도 의존적으로 effecter caspase인 caspase-3의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 마지막으로 LY294002(Akt inhibitor)와 rapamycin(mTOR inhibitor)을 처리하여 apoptosis 관련 신호 단백질의 발현 조절을 확인하였다. 그 결과 LFB가 Akt와 mTOR의 발현을 억제하여 이를 경유하는 signaling pathway를 통해 apoptosis를 유도하는 것을 확인하였다.

본 연구는 2021년도 ㈜포바이오코리아의 용역사업 지원에 의해 수행되었음.

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(3): 221-228

Published online March 31, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.3.221

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

AGS 위암세포주에서 Akt/mTOR 신호경로를 통한 영릉향 부탄올 분획물에서의 Apoptosis 유도 효과

이효재1․서지원1․김상현1․이창열1․김상용2․김영민1

1한남대학교 생명나노대학 생명시스템과학과
2신안산대학교 식품생명과학과

Received: November 22, 2021; Revised: January 7, 2022; Accepted: February 3, 2022

Apoptotic Effects of Butanol Fraction of Lysimachia foenum-graecum by Regulating Akt/mTOR Signaling Pathways in AGS Gastric Cancer Cells

Hyo Jae Lee1 , Ji Won Seo1 , Sang Hyeon Kim1, Chang Yeol Lee1, Sang Yong Kim2, and Young Min Kim1

1Department of Biological Science and Biotechnology, Hannam University
2Department of Food Science & Bio Technology, Shinansan University

Correspondence to:Young Min Kim, Department of Biological Science and Biotechnology, College of Life Science and Nano Technology, Hannam University, 1646, Yuseong-daero, Yuseong-gu, Daejeon 34054, Korea, E-mail: kym@hnu.ac.kr
Author information: Hyo Jae Lee (Graduate student), Ji Won Seo (Graduate student), Sang Hyeon Kim (Graduate student), Chang Yeol Lee (Student), Sang Yong Kim (Professor), Young Min Kim (Professor)

Received: November 22, 2021; Revised: January 7, 2022; Accepted: February 3, 2022

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Lysimachia foenum-graecum is a herbal plant known to be effective in relieving headaches, toothaches, and inflammation. It is known to have antioxidant, anti-obesity, and anti-inflammatory effects. However, anti-gastric cancer effects have so far not been reported. The purpose of this study was to investigate the apoptotic effects of the butanol fraction of Lysimachia foenum-graecum (LFB) in AGS human gastric cancer cells. The antiproliferative activity of LFB was confirmed by MTT analysis, and the apoptotic effect was confirmed by Annexin-V analysis. In addition, it was confirmed through western blotting that the LFB treatment reduced the expression levels of p-Akt and p-mTOR in a concentration-dependent manner. Akt plays a role in cell proliferation and migration of cancer cells by regulating important signaling factors such as mTOR and p53. mTOR induces the ubiquitination of p53 and plays an important role in tumorigenesis and the survival of cancer cells. This inhibition of Akt and mTOR leads to apoptosis by regulating the signaling molecules of the intrinsic pathway. In addition, LFB increases the expression level of the effector caspase, caspase-3, in a concentration-dependent manner. The expression of apoptosis-related signal proteins was confirmed by treatment with LY2940002 (Akt inhibitor) and rapamycin (mTOR inhibitor). These results indicate that LFB induces apoptosis through the endogenous pathway by suppressing the expression of Akt and mTOR.

Keywords: AGS, Akt/mTOR pathway, apoptosis, intrinsic pathway, Lysimachia foenum-graecum

서 론

우리나라 2018년 위암 발생률은 세계 1위를 기록한다고 보고되었다(Bray 등, 2018). 또한 국내 위암 발생률은 인구 10만 명당 52.1명의 발생률을 보이며 이는 전체 암 중 2위라는 높은 발생률을 보인다(Jung 등, 2020). 위암의 발생 원인은 감염, 유전, 식습관 등의 다양한 환경적 유전적 원인에 의해 발생하며, 이러한 위암의 기존 치료법에는 외과적 수술과 항암 화학요법, 방사선요법 등이 있다(Van Cutsem 등, 2016; Amable, 2016). 이러한 기존의 항암 치료법은 합병증이 일어날 가능성이 높고, 거기에 오심, 구토, 설사, 우울증 등의 부작용이 심해 환자들의 삶의 질이 낮아진다(Kim, 2012). 따라서 이러한 부작용들을 줄여주고 암 환자들의 삶의 질을 높이기 위해 암세포에서만 작용하고 정상세포에는 영향을 끼치지 않는 천연물 소재를 활용한 항암치료가 주목받고 있다(Prakash 등, 2013). 이 중 영릉향(Lysimachia foenum-graecum)은 전통적인 한약재로 두통, 치통, 염증 완화에 효과가 있다고 알려져 있다(Chartarrayawadee 등, 2020). 이러한 영릉향의 항비만, 항산화 그리고 유방암에 대한 항암 효과는 연구가 되어 있으나 다른 암종에 대한 연구는 미비하다(Lee 등, 2013; Li 등, 2009; Seo 등, 2011). Apoptosis는 대표적인 항암 기전이자 치명적으로 손상된 세포를 없애기 위한 프로그램화된 세포 죽음으로써 이러한 apoptosis가 제대로 일어나지 않는다면 세포의 암화가 진행되므로 매우 중요한 과정이다(Gonzalvez와 Ashkenazi, 2010). Apoptosis의 신호경로는 extrinsic pathway와 intrinsic pathway로 나눠진다(Kawk 등, 2019). Akt는 serine-threonine kinase로 mTOR, p53과 같은 중요 신호 분자의 발현을 조절하여 세포 증식 및 이동 등의 signaling pathway에 관여한다(Luo 등, 2003). Akt에 의해서 활성화된 mTOR은 p53의 ubiquitination을 유도하며, 종양 형성과 세포의 성장 및 증식을 조절한다(Sheppard 등, 2012). p53은 DNA 손상, 산화적 스트레스 등의 다양한 스트레스 신호에 대한 DNA 복구, apoptosis와 같은 세포의 반응을 일으키는 중요 신호전달 분자이다(Michael과 Oren, 2003). 또한 p53은 apoptosis 억제 단백질인 Bcl-2를 저해하고, apoptosis 유도 단백질인 Bax와 Bak의 oligomerization을 일으킨다. 이로 인해 mitochondrial outer membrane permeabilization을 유도하여 caspase cascade가 일어난다(Nam 등, 2019; Vazquez 등, 2008). 그중 effector caspase인 caspase-3가 분절되어 활성화되면 DNA의 손상을 수정하고 보호하는 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)를 분절시킨다. 이로 인해 DNA가 fragmentation 되어 intrinsic pathway를 통한 apoptosis가 유도된다(Peña-Blanco와 García-Sáez, 2018; Porter와 Jänicke, 1999; Slee 등, 1999). 따라서 본 연구에서는 영릉향 부탄올 분획물(LFB)이 AGS 위암 세포에서의 apoptosis 유도 효과와 apoptosis 관련 단백질의 발현에 미치는 점을 확인하고자 하였으며, Akt/mTOR 신호전달 경로를 확인하여 LFB에 의한 apoptosis 효과가 intrinsic pathway를 통해 유도되는 것을 증명하고자 하였다.

재료 및 방법

실험 재료

본 연구에서 이용된 영릉향은 한약재시장(Daejeon, Korea)에서 구입하였으며, Lee 등(2013)Um 등(2014)의 시험법을 바탕으로 영릉향 분쇄가루 100 g에 에탄올 800 mL를 가하여 완전히 침지시킨 후 상온에서 72시간 동안 환류 추출하였다. 이러한 방법으로 추출한 영릉향을 감압 농축기(N-1200A, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 40°C에서 감압 농축하여 에탄올 추출물을 수득하였다. 이 추출물을 증류수 800 mL에 용해한 뒤 n-BuOH 800 mL로 추출하여 부탄올 분획물을 얻었다. 이후 감압 농축기를 이용해 감압 농축시키고 용매를 제거한 다음 동결 건조하여 실험에 사용하기 전까지 -80°C에서 보관하였다. 농도별 영릉향 부탄올 분획물(25, 50, 75, 100, 125, 150 μg/mL)은 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 이용해 만들고 -20°C에 보관하여 사용하였다. LY2940002는 Calbiochem(San Diego, CA, USA)에서, rapamycin은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, DMSO에 용해해 각각 20 mM과 100 nM로 만들어 사용하였다.

세포 배양

본 연구에 사용한 AGS 인체 위암세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양받았으며, 10% FBS(HyClone Laboratories Inc., Logan, UT, USA)와 1% antibiotics(HyClone Laboratories Inc.)가 포함된 RPMI 1640 media(HyClone Laboratories Inc.)를 사용하였다. CCD-986Sk 인체 정상 섬유아세포는 ATCC에서 분양받았으며 10% FBS(HyClone Laboratories Inc.)와 1% antibiotics(HyClone Laboratories Inc.)가 포함된 DMEM media(HyClone Laboratories Inc.)를 사용하여 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 배양하였다. 48시간마다 Trypsin-EDTA(HyClone Laboratories Inc.)를 이용하여 세포를 부유 상태로 만든 다음 1×106 cells/mL로 분주하고 계대 배양하였다.

MTT assay

AGS 세포와 CCD-986Sk 세포를 12-well plate에 1×105 cells/mL로 seeding 한 후 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. 그다음 LFB를 농도별(25, 50, 75, 100, 125, 150 μg/mL)로 처리하고 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간과 48시간을 배양하였으며, LY294002(20 mM)와 rapamycin(100 nM)을 처리할 때에는 LFB보다 1시간 전에 처리한 뒤 24시간 동안 배양하였다. MTT solution을 well당 40 μL씩 처리 후 50분 동안 incubator에 배양하였다. 그 뒤 PBS를 well당 1 mL 분주하여 washing 후 DMSO를 well당 150 μL씩 넣어주었다. 이후 96-well plate에 100 μL씩 취해 옮겨준 다음 FLUOstar Omega(BMG labtech, Ortenberg, Germany)를 이용하여 595 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

Observation of AGS cell morphological change

6-well plate에 AGS 세포를 well당 1×106 cells/mL로 분주하여 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 동안 배양한 후 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리하였다. 배양 후 AGS 세포에서 일어난 형태 변화를 Inverted microscope(Zeiss, Oberkochen, Germany)로 관찰하였다.

MuseTM Annexin V & Dead Cell staining

Apoptosis를 정량적으로 분석하기 위해 MuseTM Annexin V & Dead Cell Kit(Merck Millipore, Burlington, MS, USA)을 사용하였다. AGS 세포를 6-well plate에 1×105 cells/mL로 seeding 후, 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. 그다음 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리해준 후 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. 그 후 PBS를 사용하여 세포를 세척한 뒤 Trypsin-EDTA(HyClone Laboratories Inc.)를 이용하여 세포를 부유시킨 후 원심분리하여 모아주었다. 모아준 세포는 PBS를 이용하여 washing하고 MuseTM Annexin V & Dead Cell Kit(Merck Millipore)을 처리한 후 20분간 반응시켰다. 반응 후 MuseTM Cell Analyzer (Merck Millipore)를 사용하여 분석하였다.

Caspase-3/7 activity assay

6-well plate에 AGS 세포를 1×105 cells/mL로 seeding 후, 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. 그다음 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리해준 후 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. 그 후 PBS를 사용하여 세포를 세척한 뒤 trypsin- EDTA(HyClone Laboratories Inc.)를 이용하여 세포를 부유시킨 후 원심분리하여 모아주었다. 모아준 세포는 PBS를 이용하여 washing하고 MuseTM caspase-3/7 reagent (Merck Millipore)와 혼합된 1X Assay Buffer BA(Merck Millipore)를 처리하고, 빛을 차단한 뒤 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 20분간 배양하였다. 배양 종료 후 MuseTM caspase-3/7 7-AAD working solution(Merck Millipore)을 150 μL씩 각 tube에 처리하였다. 처리 후 MuseTM Cell Analyzer(Merck Millipore)를 사용하여 분석하였다.

Western blotting

6-well plate에 AGS 세포를 well당 1×106 cells/mL로 분주하여 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. 그다음 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리한 후 5% CO2, 37°C 조건으로 incubator에서 24시간 배양하였다. LY294002(20 mM)와 rapamycin(100 nM)은 LFB를 처리하기 1시간 전에 처리하였다. 그다음 세포에 RIPA lysis buffer[25 mM Tris-Cl(pH 7.4), 1% NP40, 0.5% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF]를 well당 150 μL씩 첨가한 뒤 scrapper를 이용하여 단백질을 분리하였다. 그 후 14,000 rpm, 4°C에서 20분 동안 원심분리하여 상등액만을 취하였다. 얻어진 상등액은 FLUOstar Omega(BMG labtech)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질을 정량하였다. Electrophoresis는 8%, 12% acrylamide gel을 이용하여 실시하였으며, nitrocellulose membrane에 transfer 하였다. 그 후 4% bovine serum albumin(BSA)을 이용하여 상온에서 2시간 blocking 하였다. 1차 항체는 4°C에서 16시간 동안 처리한 뒤 2차 항체를 1~2시간 동안 반응시킨 다음 ECL solution(Thermo, Rockford, IL, USA)을 Blue X-ray film에 감광하여 실험 결과를 측정하였다. 또한 모든 단백질 발현량을 Image J program(NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 면적을 수치화하고 그래프로 나타내었다.

통계처리

통계프로그램인 SPSS(Statistical Package for the Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 22.0 프로그램을 사용하였고 실험 설계에 대한 분산 분석은 독립표본 t-test를 통하여 검정하였다. 각 자료는 최소 3번 이상의 반복된 실험을 통해 얻은 결과로 검정하였고 P<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

결과 및 고찰

LFB가 AGS 세포의 증식에 미치는 효과 확인

LFB가 AGS 세포에 특이적으로 세포독성을 나타내는지 확인하기 위해 LFB를 농도별(25, 50, 75, 100, 125, 150 μg/mL)로 처리한 뒤 MTT assay를 통해 세포독성을 측정하였다. 그 결과 인체 정상 섬유아세포인 CCD-986Sk 세포에서는 control 군과 비교했을 때 모든 농도군에서 생존율이 85% 이상으로 유지되며 유의하지 않은 것으로 확인하였다. 이를 통해 LFB가 정상세포에서 독성이 없음을 확인하였다(Fig. 1A). 반면 AGS 인체 위암 세포에 LFB를 처리했을 때는 control 대비 농도 및 시간에 의존적으로 세포의 증식이 유의하게 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 1B, 1C). 또한 AGS 세포에 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리했을 때 밀도가 높으며, 형태도 정상적인 AGS 세포의 형태를 보이는 control 군과 비교했을 때 LFB 처리 군에서는 농도 의존적으로 세포의 밀도가 감소하며 apoptosis와 같이 세포 형태의 응축 같은 형태학적인 변화가 일어난 것을 확인하였다(Fig. 1D). 결과적으로 LFB는 인체 정상 섬유아세포 CCD-986Sk의 증식에는 유의하지 않게 영향을 미치며 AGS 위암 세포주에 있어 특이적이고 농도 및 시간에 의존적으로 세포의 증식을 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 세포증식 억제 효과가 apoptosis 유도에 의해 일어나는 것인지 연구하기 위해 위 결과를 바탕으로 주요 농도를 50, 100, 150 μg/mL로 결정하여 이후 실험을 진행하였다.

Fig 1. The effect of Lysimachia foenum-graecum (LFB) on the cell viability of AGS cells and CCD-986Sk cells. (A) CCD-986Sk cells were pretreated with LFB for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. N.S: not significant. (B) AGS cells were pretreated with LFB for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *P<0.05 and **P<0.01 compared to control (each experiment, n=3). (C) AGS cells were pretreated with LFB for 48 h. Cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. **P<0.01 and ***P<0.001 compared to control (each experiment, n=3). (D) AGS cells morphology change after treatment of LFB for 24 h. Original magnification ×200 (each experiment, n=3).


LFB에 의한 AGS 세포의 apoptosis 유도 효과 확인

앞선 실험에서 LFB 처리에 의한 AGS 세포의 증식 억제를 확인하였다. 이러한 AGS 세포에서 LFB의 세포증식 억제 효과가 necrosis에 의한 것인지 apoptosis에 의한 것인지 확인하기 위해 AGS 세포에 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 24시간 처리한 후, MuseTM Annexin V & Dead Cell Kit으로 staining 한 뒤 flow cytometry를 실시하였다. 그 결과 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리한 군의 경우 세포 생존율이 각각 61.14%, 38.94%, 36.11%로 농도 의존인 감소를 확인하였다. 또한 apoptosis도 마찬가지로 control 군의 apoptosis 유발 빈도는 약 12.03%로 낮았으나, LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리한 군의 경우 각각 35.38%, 50.21%, 58.31%로 농도 의존적인 apoptosis 유도를 확인하였다. Fig. 2BFig. 2A의 apoptotic cell, necrotic cell, alive cell 각각을 그래프로 표현한 것이다(Fig. 2A, 2B). 이러한 결과 LFB의 농도별 처리에 따른 AGS 위암 세포 특이적인 생존율 및 증식 억제가 necrosis가 아닌 apoptosis 유도에 의한 것임을 확인하였다.

Fig 2. The effect of LFB on the induction of apoptosis in AGS cells. (A) AGS cells were treated with LFB at different concentrations (50, 100, and 150 µg/mL) for 24 h. Data analysed by flow cytometry. Data shows four populations of live, dead, early apoptosis, and late apoptosis. (B) The cells were classified into 5 categories based on their stage: live, necrosis, early apoptosis, late apoptosis, and total apoptosis. LFB shown to induce apoptotic cell in the AGS cells mainly with the increased in total apoptotic cells and the apparent decreased in the live cells. LFB also significantly induced the total apoptotic cells in a dose-dependent manner. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *P<0.05, **P<0.01, and *P<0.001 compared to control (each experiment, n=3).

LFB가 AGS 세포에서 intrinsic pathway 관련 apoptosis 단백질 발현에 미치는 영향과 caspase activity 효과

Akt는 암세포의 성장과 생존에서 중요한 역할을 하며 mTOR이나 p53과 같은 신호 분자들을 조절한다(Park 등, 2011). 또한 p53의 활성에 따른 상향 조절은 중요 apoptosis 억제 단백질인 mTOR을 불활성화하여 intrinsic pathway를 경유하는 apoptosis를 유도한다(Nam 등, 2018). 이러한 신호 분자의 조절은 intrinsic pathway에서 중요한 Bcl-2 family 단백질을 조절한다(Kim 등, 2016). Bcl-2 family 중에는 apoptosis 억제 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL과 apoptosis 유도 단백질인 Bax, Bak가 존재하여 이 둘이 길항적으로 조절된다고 알려져 있다(Jo 등, 2019). 이러한 apoptosis 과정을 통해 caspase-3가 활성화되면서 DNA의 수선을 담당하는 PARP 단백질을 분절시켜 불활성화 상태인 cleaved-PARP가 생성된 후에 특징적인 apoptosis가 일어나게 된다(Park 등, 2018). 본 실험에는 AGS 세포에서 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리한 뒤 apoptosis 조절 단백질들의 발현 정도를 확인하기 위해 western blotting을 실시하였다. 그 결과 농도별 LFB 처리에 따라 농도 의존적으로 암세포의 생장과 증식에 영향을 미치는 Akt의 활성 상태인 p-Akt가 감소하고, 같은 apoptosis 억제 단백질인 p-mTOR 또한 감소함을 확인하였다. 이러한 apoptosis 억제 단백질의 발현 감소에 따라 p53의 발현이 증가하였으며, Bcl-2 family의 apoptosis 억제 단백질인 Bcl-2의 발현 감소와 apoptosis 유도 단백질인 Bax, Bak의 발현 증가를 확인하였다. 더해서 pro caspase-3의 감소와 cleaved caspase-3의 증가를 확인하였으며, 이로 인해 PARP 단백질의 분절을 일으켜 생성된 cleaved PARP의 농도 의존적인 증가를 확인할 수 있었다(Fig. 3A, 3C). Apoptosis에서 intrinsic pathway는 caspase가 활성화되어 apoptosis가 유도되는데, 본 실험에서는 LFB를 처리했을 때 caspase 활성을 확인하기 위해서 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리한 뒤 caspase-3/7 activity assay를 실시하였다. 그 결과 control 군에서는 10.9%로 낮은 apoptosis 유발 빈도를 보였으나, 각각 50 μg/mL 군에서 37.87%, 100 μg/mL 군에서 46.93%, 150 μg/mL 군에서 51.7%로 농도 의존적인 apoptosis 유발 빈도 증가를 확인하였다(Fig. 3B). 이러한 결과 LFB가 AGS 세포에서 intrinsic pathway를 통해 apoptosis를 유도하는 것을 확인하였다.

Fig 3. The LFB effects on the expression of apoptosis regulatory proteins. (A) AGS cells were treated with the indicated concentrations of LFB for 24 h. The expression of p-mTOR, p-Akt, p53, pro caspase-3, cleaved caspase-3, Bcl-2, PARP, cleaved PARP, Bax, Bak, and β-actin were analyzed by Western blot analysis. The β-actin served as protein loading control (each experiment, n=3). (B) AGS cells were treated with LFB at different concentrations (50, 100, and 150 µg/mL) for 24 h. Data analysed using a Muse™ caspase-3/7 kit, as described in Materials and Methods. Data shows four populations of live, dead, early apoptosis, and late apoptosis. (C) Semi-quantitative analysis of (A). The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001 compared to control (each experiment, n=3).

Akt, mTOR 저해제가 AGS 세포의 증식과 apoptosis 조절단백질 발현에 미치는 영향

앞선 실험에서 LFB를 농도별(50, 100, 150 μg/mL)로 처리한 뒤 실시한 western blotting과 caspase-3/7 activity의 결과를 통해 LFB가 Akt/mTOR signaling pathway를 경유하여 apoptosis를 유도한다는 가설을 세웠다. Apoptosis가 유도되는 신호 경로를 확인하기 위해 상위 단백질인 Akt와 mTOR의 활성을 각각 억제하는 LY294002와 rapamycin을 AGS 세포에 처리하여 MTT assay와 western blotting을 실시하였다. 그 결과 control 군과 LFB(100 μg/mL) 군을 비교했을 때 58.7% 정도의 생존율을 확인하였다. LY2940002를 단독 처리한 군은 Akt의 활성이 억제되어 63.2%의 생존율을 나타내었으며, LFB와 LY294002를 병행 처리한 군의 경우 단독 처리한 군보다 더 적은 34.6%의 생존율을 보였다. 또한 control 군과 비교하여 rapamycin을 단독 처리한 군은 67.1%의 생존율을 나타내었으며, LFB와 rapamycin을 병행 처리한 군의 경우에는 42.1%의 더 낮은 생존율을 보였다. 이 결과 Akt와 mTOR의 억제가 AGS 세포의 생장 및 증식 억제에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었으며, LFB 또한 저해제와 비슷한 증식 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었다(Fig. 4A). 그리고 Akt와 mTOR을 억제함으로써 Akt/mTOR signaling pathway에 관여하는 단백질들의 발현 경향을 확인해보기 위해 Fig. 4A와 동일한 실험 조건으로 western blotting을 시행하였다. 그 결과 Akt 및 mTOR 저해제와 LFB(100 μg/mL) 처리에 따른 apoptosis 관련 단백질의 발현을 보면 apoptosis를 유도하는 단백질인 p53, Bax, Bak, cleaved caspase-3, cleaved PARP의 발현과 활성은 증가하였고, apoptosis 억제 단백질인 p-Akt, p-mTOR, Bcl-2, pro caspase-3는 감소하는 경향을 확인하였다(Fig. 4B, 4C). 이러한 결과 LFB가 Akt와 mTOR을 억제하여 이를 경유하는 signaling pathway를 통해 apoptosis를 유도한다는 가설을 확인하였다.

Fig 4. The effects 7on cell anti-proliferation and the control of the signal proteins via inhibition of Akt/mTOR. AGS cells were treated with 20 μM LY 294002 (Akt inhibitor), 100 nM rapamycin (mTOR inhibitor) and LFB (100 µg/mL) for 24 h. (A) The cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. **P<0.01 and ***P<0.001 compared to control (each experiment, n=3). (B) The cell were treated with 20 μM LY294002, 100 nM rapamycin and 100 µg/mL LFB for 24 h. The expression of p-mTOR, p-Akt, p53, pro caspase-3, cleaved caspase-3, Bcl-2, PARP, cleaved PARP, Bax, Bak, and β-actin were analyzed by western blot analysis. The β-actin served as protein loading control (each experiment, n=3). (C) Semi-quantitative analysis of (B). The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001 compared to control (each experiment, n=3).

요 약

영릉향(Lysimachia foenum-graecum)은 두통, 치통, 염증 완화에 효과가 있는 한약재로 항산화, 항비만, 항염 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 위암에서 영릉향의 항암 효과는 보고되지 않았으며, 본 연구에서는 AGS 인체 위암 세포에서 영릉향 부탄올 분획물(LFB)의 apoptosis 효과를 확인하고자 하였다. MTT assay를 통해 세포 증식 억제 효과를, Annexin V & Dead Cell staining을 통해 LFB의 apoptosis 유도 효과를 확인하였다. 또한, western blotting을 통해 LFB 처리가 농도 의존적으로 종양 형성과 암세포의 생존에 있어서 중요한 역할을 하는 p-Akt와 p-mTOR의 활성 수준을 감소시키는 것을 확인하였다. 더해서 LFB 처리가 농도 의존적으로 intrinsic pathway의 신호 단백질을 조절하여 apoptosis를 유도하는 것을 확인하였다. 그리고 caspase-3/7 activity assay를 통해 LFB가 농도 의존적으로 effecter caspase인 caspase-3의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 마지막으로 LY294002(Akt inhibitor)와 rapamycin(mTOR inhibitor)을 처리하여 apoptosis 관련 신호 단백질의 발현 조절을 확인하였다. 그 결과 LFB가 Akt와 mTOR의 발현을 억제하여 이를 경유하는 signaling pathway를 통해 apoptosis를 유도하는 것을 확인하였다.

감사의 글

본 연구는 2021년도 ㈜포바이오코리아의 용역사업 지원에 의해 수행되었음.

Fig 1.

Fig 1.The effect of Lysimachia foenum-graecum (LFB) on the cell viability of AGS cells and CCD-986Sk cells. (A) CCD-986Sk cells were pretreated with LFB for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. N.S: not significant. (B) AGS cells were pretreated with LFB for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *P<0.05 and **P<0.01 compared to control (each experiment, n=3). (C) AGS cells were pretreated with LFB for 48 h. Cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. **P<0.01 and ***P<0.001 compared to control (each experiment, n=3). (D) AGS cells morphology change after treatment of LFB for 24 h. Original magnification ×200 (each experiment, n=3).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 221-228https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.3.221

Fig 2.

Fig 2.The effect of LFB on the induction of apoptosis in AGS cells. (A) AGS cells were treated with LFB at different concentrations (50, 100, and 150 µg/mL) for 24 h. Data analysed by flow cytometry. Data shows four populations of live, dead, early apoptosis, and late apoptosis. (B) The cells were classified into 5 categories based on their stage: live, necrosis, early apoptosis, late apoptosis, and total apoptosis. LFB shown to induce apoptotic cell in the AGS cells mainly with the increased in total apoptotic cells and the apparent decreased in the live cells. LFB also significantly induced the total apoptotic cells in a dose-dependent manner. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *P<0.05, **P<0.01, and *P<0.001 compared to control (each experiment, n=3).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 221-228https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.3.221

Fig 3.

Fig 3.The LFB effects on the expression of apoptosis regulatory proteins. (A) AGS cells were treated with the indicated concentrations of LFB for 24 h. The expression of p-mTOR, p-Akt, p53, pro caspase-3, cleaved caspase-3, Bcl-2, PARP, cleaved PARP, Bax, Bak, and β-actin were analyzed by Western blot analysis. The β-actin served as protein loading control (each experiment, n=3). (B) AGS cells were treated with LFB at different concentrations (50, 100, and 150 µg/mL) for 24 h. Data analysed using a Muse™ caspase-3/7 kit, as described in Materials and Methods. Data shows four populations of live, dead, early apoptosis, and late apoptosis. (C) Semi-quantitative analysis of (A). The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001 compared to control (each experiment, n=3).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 221-228https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.3.221

Fig 4.

Fig 4.The effects 7on cell anti-proliferation and the control of the signal proteins via inhibition of Akt/mTOR. AGS cells were treated with 20 μM LY 294002 (Akt inhibitor), 100 nM rapamycin (mTOR inhibitor) and LFB (100 µg/mL) for 24 h. (A) The cell viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. **P<0.01 and ***P<0.001 compared to control (each experiment, n=3). (B) The cell were treated with 20 μM LY294002, 100 nM rapamycin and 100 µg/mL LFB for 24 h. The expression of p-mTOR, p-Akt, p53, pro caspase-3, cleaved caspase-3, Bcl-2, PARP, cleaved PARP, Bax, Bak, and β-actin were analyzed by western blot analysis. The β-actin served as protein loading control (each experiment, n=3). (C) Semi-quantitative analysis of (B). The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. *P<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001 compared to control (each experiment, n=3).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51: 221-228https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.3.221

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