위궤양(gastric ulcer)은 상부위장관 장애의 흔한 유형으로 위의 점막과 근육층이 염증으로 인해 손상된 상태를 말한다. 위벽은 4개의 층으로 이루어져 있는데, 보통 첫 번째 층만 손상되어 위장 점막의 결손이 발생한 상태를 위염이라 일컫고, 두 번째 층 이상으로 손상되어 점막의 결손이 점막하층 이하까지 발생한 상태를 위궤양이라고 한다(Banks, 1986). 이러한 위궤양은 위 점막 내 프로스타글란딘, 점액 생성 및 항산화제 등과 같은 보호인자(defense factor)와 염산, 펩신 분비와 같은 공격인자(offense factor) 사이의 불균형이 주요인으로 알려져 있으며(Laine 등, 2008), 이 외에도 NSAID 남용, Helicobacter pylori 균 감염, 흡연, 음주, 불규칙한 식습관, 스트레스 및 비스테로이드성 소염진통제 남용과 같은 요인도 존재한다(Yeğen 등, 2018). 또한, 과도한 음주로 인한 알코올 섭취는 점막 투과성, 점막 손상, 세포 괴사 및 염증 반응을 증가시킨다고 알려져 있다(Yang 등, 2018; Etani 등, 2017). 주로 사용되는 치료제는 위산 분비 억제제, 점막 저항력 증강제, 항 헬리코박터균제로 분류되며, 현재 양성자 펌프 억제제가 위궤양의 치료를 위한 1차 치료로 사용되고 있으나, 이러한 치료제는 지속해서 사용하기엔 비용이 클 뿐만 아니라 부작용이 크고 재발률도 높아 위궤양을 앓고 있는 현대인들에게 많은 불편을 초래하고 있다(Zheng 등, 2016). 따라서 한의학에서는 소화 기능 장애를 조절하고 위 점막 장벽을 강화할 수 있는 새로운 천연 기능성 소재의 개발에 대한 연구가 증가하는 추세이다(Yao, 2015).

구주소나무(Pinus sylvestris L.)는 소나무종 중에서 지리적 분포가 가장 크며 전 세계적으로 가장 널리 분포하는 침엽수이다(Matías와 Jump, 2012). 몽골의 북부지역, 즉 러시아와 국경 남쪽의 일부 지역에 분포하여 자라는 것으로 알려져 있으며, 몽골에서 구주소나무(Pinus sylvestris var. mongolica)는 약용 작물로 사용되어 왔다. 이러한 약용 식물은 질병 치료뿐만 아니라 건강 및 식품 안전과 품질을 향상시키면서 환경을 보존하는 데 유용한 생리활성 화합물로 사용된다(Makkar 등, 2009). 현재 구주소나무 추출물의 약리 효능으로 항산화(Dziedzinski 등, 2020; Karonen 등, 2004), 항염증(Laavola 등, 2015; Csikós 등, 2018) 및 항균(Dziedzinski 등, 2020)의 작용에 관한 여러 연구가 진행 중이지만, 몽골 구주소나무의 약리효능에 대한 연구는 미비한 것으로 나타났다.

이에 본 연구에서는 기존 연구들로부터 항산화와 항염증 효과를 보였던 구주소나무의 연구 결과들을 바탕으로 HCl/ethanol에 노출되어 급성 위궤양이 유발된 동물에 몽골 구주소나무 추출물을 적용하여 항산화 효과, 염증 완화 효과 및 그 기전을 확인함으로써 위 점막 보호 효과를 가지는 새로운 천연 기능성 소재로써 활용 가능성을 확인하였다.

시료 추출

본 실험에 사용된 몽골 구주소나무(Pinus sylvestris var. mongolica)는 Traditional Medical Research Institute(Bangkok, Thailand)에서 건조된 파우더 형태로 공급받았다. 200 g의 몽골 구주소나무의 가지 부분을 10배수의 증류수를 가하여 열탕추출기(DWT-1800T, Daewoong Bio, Hwaseong, Korea)를 이용하여 100°C에서 2시간 추출하였다. 그 후 회전 감압농축기(Buchi B-480, Buchi Labortechnik AG, Flawil, Switzerland)를 이용하여 농축했으며, 동결건조기(Labconco, Kansas, MO, USA), vortex mixer(VXMNAL, OHAUS, Seoul, Korea)를 이용하여 건조가 진행되었다. 파우더 형태로 건조된 시료는 -80°C에서 냉동 보관하였다가 실험 직전 증류수에 녹여 사용하였다.

시약

본 실험에 사용된 potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, sucrose octasulfate aluminum complex(Sucralfate), hydrochloric acid(HCl), ethyl alcohol은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Nitrocellulose membranes는 Amersham GE Healthcare(Little Chalfont, UK)에서 구입하였고, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 2(NOX2), p22^phox, nuclear factor erythroid 2–related factor 2(Nrf2), kelch-like ECH-associated protein 1(KEAP1), heme oxygenase-1(HO-1), superoxide dismutase(SOD), sirtuin 1(Sirt1), inhibitor of nuclear factor kappa B alpha(IκBα), phosphorylation inhibitor of nuclear factor kappa B alpha(p-IκBα), phosphorylation of nuclear factor-kappa B p65(NF-κBp65), inducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2), tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleukin-1 beta(IL-1β), histone, β-actin은 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)로부터 구입하여 사용하였다. AMP-activated protein kinase(AMPK), phospho-AMP-activated protein kinase(p-AMPK)는 Cell Signaling Technology, Inc.(Beverly, MA, USA)에서 구입하여 사용했으며, 2차 항체는 GeneTex, Inc.(Irvine, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Protease inhibitor mixture, ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)에서 구입하여 사용했으며, 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate와 dihydrorhodamine 123는 Molecular Probes(Eugene, OR, USA)에서, enhanced chemiluminescence(ECL) western blotting detection reagents는 GE Healthcare로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit은 Thermo Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입하였다.

총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량 측정

열수 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin Ciocalteu’s의 방법을 이용하여 함량(mg gallic acid equivalents(GAE)/g)을 측정하였다(Rama 등, 2013). 10% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent 500 μL, 시료 100 μL 및 7.5% sodium carbonate 400 μL를 혼합하여 실온의 암소에서 30분 동안 반응시킨 후 Microplate reader(765 nm, Tecan, Zürich, Switzerland)로 흡광도를 측정하였다. 표준물질인 gallic acid를 이용하여 표준 검량선을 구했으며 총 폴리페놀 함량을 산출하였다.

총 플라보노이드는 aluminum chloride를 사용한 비색법을 사용하여 함량(mg quercetin equivalents(QE)/g)을 구하였다(Rama 등, 2013). 560 μL 증류수, 1 M potassium acetate solution 20 μL, 100 μL 시료, 10% aluminium chloride solution 20 μL 및 methanol 300 μL를 혼합하여 실온의 암소에서 30분간 반응시켜 주었다. 그다음 Microplate reader(415 nm)로 흡광도를 측정하였으며, 표준물질인 quercetin을 이용하여 표준 검량선을 구했으며 총 플라보노이드 함량을 산출하였다.

DPPH와 ABTS 라디칼 소거능 분석

시료의 항산화능 분석을 위해 DPPH 자유 라디칼 소거법을 활용하였다(Blois, 1958). 농도별로 희석한 몽골 구주소나무 열수 추출물 100 μL와 60 μM DPPH 용액 100 μL를 각각 plate에 분주하여 혼합시킨 후 실온의 암실에 30분간 반응시켰으며 Microplate reader(540 nm)로 흡광도를 측정하였다. L-Ascorbic acid는 양성대조군으로 사용되었으며, 아래의 식에 흡광도를 대입하여 산출된 라디칼 소거 활성이 50% 저해된 농도의 값을 IC₅₀으로 표기하였다.

시료의 열수 추출물의 항산화능 분석을 위해 ABTS 라디칼 소거법을 활용하였다(Re 등, 1999). 2.4 mM potassium persulfate와 7 mM ABTS를 혼합하여 약 16시간 동안 실온의 암실에서 ABTS+을 형성시켜 주었다. 이를 흡광도 415 nm에서 측정하여 0.70±0.02의 값이 되도록 에탄올을 사용하여 희석하였다. 시료 5 μL와 희석한 ABTS 용액 95 μL를 혼합한 후 15분간 반응시킨 다음 Microplate reader(415 nm)로 흡광도를 측정하였다. L-Ascorbic acid는 양성대조군으로 사용되었으며, 아래의 식에 흡광도를 대입하여 산출된 라디칼 소거 활성이 50% 저해된 농도의 값을 IC₅₀으로 표기하였다.

$$\begin{array}{l}\text{DPPH and ABTS radical scavenging activity (\%)}\\ \text{=}\left[1-\left(\frac{O{D}_{sample}}{O{D}_{control}}\right)\right]\times 100\\ {\text{OD}}_{\text{sample}}\text{: absorbance of sample}\\ {\text{OD}}_{\text{control}}\text{: absorbance without sample}\end{array}$$

실험동물

6주령의 웅성 ICR(DBL, Chungbuk, Korea)을 구입하여 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험을 진행하였으며, 동물 사육실 조건은 conventional system으로 온도 22±2°C, 습도 50±5%, 명암주기(light:dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였고, 사료(조단백질 18% 이상, 조지방 5.0% 이상, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 1.0% 이상, 인 0.85% 이상, 칼륨 0.55% 이상, 나트륨 0.25% 이상, 마그네슘 0.15% 이상; NIH-41, Zeigler Bros, Inc., Gardners, PA, USA)와 물을 충분히 공급하였다. 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대구한의대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)의 승인(승인번호: DHU2021-092)을 받았다.

급성 위궤양 동물 모델

실험군은 정상군(Normal), 대조군(Control), Sucralfate 10 mg/kg 투여군(SC), Pinus sylvestris var. mongolica 열수 추출물 100 mg/kg 투여군(PS100) 및 Pinus sylvestris var. mongolica 열수 추출물 200 mg/kg 투여군(PS200) 총 5군으로 각각 8마리씩 분류하였으며, 실험 24시간 전부터 절식하여 물만 제공하였다. 정상군을 제외한 모든 동물은 각각 농도에 맞는 약물을 단회 경구 투여해주었고, 1시간 30분 후 150 mM HCl/60% ethanol 0.55 mL를 단회 경구 투여하여 위궤양을 유발하였다(Oh 등, 2020). 1시간 30분 후 isoflurane으로 흡입 마취하여 복대 정맥에서 혈액 채취 후 위 조직을 적출하였다.

육안적인 위 점막 손상도 측정

적출한 위 조직의 손상도는 I-Solution lite(Innerview Co., Daejeon, Korea) 프로그램을 사용하여 위 점막의 손상된 면적을 측정하였으며, 위 전체 면적과 비교한 후 아래의 식을 이용하여 나타내었다(Oh 등, 2020).

$$Ulcerindex(\%)=\frac{위손상면적}{위전체면적}\times 100$$

조직 내 malondialdehyde 측정

Malondialdehyde(MDA)는 Mihara와 Uchiyama(1978)의 방법으로 측정하였으며, 1,1,3,3-tetramethoxypropane은 본 실험에서 표준물질로 사용되었다. 측정하고자 하는 샘플과 1% phosphoric acid를 혼합한 후 0.67% thiobarbituric acid를 첨가하여 95°C에서 45분간 가열시켰다. 그다음 butanol을 혼합시킨 후 원심분리(3,000 rpm, 10분)하였으며 Microplate reader(540 nm)로 상층액의 흡광도 값을 측정하였다.

조직 Western blotting

위 조직의 세포질을 얻기 위해 100 mM Tris-HCl(pH 7.4), 5 mM Tris–HCl(pH 7.5), 2 mM MgCl₂, 15 mM CaCl₂, 1.5 M sucrose, 0.1 M DTT, protease inhibitor cocktail을 첨가한 buffer A를 넣고 tissue grinder(Bio Spec Products, Bartlesville, OK, USA)로 분쇄한 후 아이스 위에서 30분간 정치시켰다. 그 후 10% NP-40 용액을 첨가하여 12,000 rpm으로 2분간 원심분리하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다. 핵을 얻기 위해 10% NP-40가 더해진 buffer A에 두 번 헹구고 100 μL의 buffer C(50 mM HEPES, 0.1 mM EDTA, 50 mM KCl, 0.3 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 10% glycerol)를 첨가해 재부유시킨 뒤 10분마다 vortex를 3번 하였다. 4°C에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 핵을 포함하고 있는 상층액을 얻어 -80°C에서 각각 냉동 보관하였다. 위 조직 세포질에서 NOX2, p22^phox, KEAP1, HO-1, SOD, AMPK, p-AMPK, Sirt1, IκBα, p-IκBα, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β 및 β-actin과 핵에서 NF-κBp65, Nrf2와 histone 단백질 발현을 측정하기 위하여 12 μg의 단백질을 8~14% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 준비된 membrane에 각각의 1차 antibody(1:1,000)를 처리하여 4°C에서 overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 antibody에 사용되는 2차 antibody(1:3,000)를 사용하여 상온에서 1시간 30분 반응시킨 후 PBS-T로 6분마다 5회 세척하였다. 그 후 ECL 용액에 노출시켜 Sensi-Q2000 Chemidoc(Lugen Sci Co., Ltd, Seoul, Korea)을 이용해 단백질 발현을 확인하였으며, 해당 band를 ATTO Densitograph Software(ATTO Corp., Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 band를 정량하였다. 각각의 단백질 수준을 정상군의 단백질 수준으로 나눈 후 상대적 비로 나타내었다.

통계분석

In vitro의 수치는 평균과 표준오차, in vivo의 수치는 평균과 표준편차로 표시하였으며, SPSS program for windows version 25(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 one-way analysis of variance(ANOVA) test를 실시한 후 least-significant differences(LSD) test로 사후검증을 실시하여 각 군의 평균 차이에 대한 통계적 유의성을 P< 0.05, P<0.01, P<0.001에서 검증하였다.

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정 결과

PS의 총 폴리페놀 및 플라보노이드를 측정한 결과 총 폴리페놀 함량은 105.86±2.35 mg GAE/g으로 나타났으며, 총 플라보노이드 함량은 10.17±0.12 mg QE/g으로 높은 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 나타냈다. 기존 연구에서 구주소나무의 폴리페놀 함량은 70 mg GAE/g 정도로 나타났음을 보고했으며(Dróżdż와 Pyrzynska, 2021), 이는 몽골 구주소나무 폴리페놀 함량의 약 30% 감소한 함량으로 비교적 낮은 함량을 나타냈지만, 큰 차이는 없는 것으로 나타났다. 또한, 구주소나무의 플라보노이드 함량은 8.29 mg QE/g으로 나타났으며(Dziedzinski 등, 2020), 이는 몽골 구주소나무의 플라보노이드 함량 대비 비교적 낮은 함량을 나타냈다(Table 1).

Table 1 . Total polyphenol and total flavonoid contents of Pinus sylvestris L..

Sample	Total polyphenol (mg GAE/g)	Total flavonoid (mg QE/g)
PS	105.86±2.35	10.17±0.12

All values are mean±SEM of three replications..

PS: Pinus sylvestris var. mongolica water extract..

GAE, gallic acid equivalents; QE, quercetin equivalents..

DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성 측정

PS의 항산화 활성을 확인하기 위하여 DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하였다. DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 표준물질로 사용한 L-ascorbic acid의 IC50값은 0.89±0.02 μg/mL로 나타났으며, PS의 IC50값은 20.54±1.88 μg/mL로 나타났다. ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 표준물질로 사용한 L-ascorbic acid의 IC50값은 2.93±0.10 μg/mL로 나타났으며, PS의 IC50값은 29.49±0.77 μg/mL로 나타났다(Fig. 1).

Fig 1. Scavenging activity of PS on DPPH and ABTS radical. (A) Scavenging activity of L-ascorbic acid and PS against DPPH free radical, (B) scavenging activity of L-ascorbic acid and PS against ABTS radical. All values are mean±SEM of three replications. PS: Pinus sylvestris var. mongolica water extract.

육안적인 위 점막 손상도 변화

위 점막 손상도를 육안으로 관찰한 결과, 위 점막의 손상이 나타나지 않은 정상군의 위 점막(0.80±0.13%)에 비해 150 mM HCl/60% ethanol로 유발한 대조군의 위 점막(35.18±2.86%)은 출혈 및 점막의 결손이 발생한 것을 확인할 수 있었다(P<0.001). 양성대조군인 SC군(8.65±1.77%)(P<0.001)과 PS100투여군(10.24±1.66%)(P<0.001), PS200투여군(8.87±1.56%)(P<0.001)의 경우 대조군에 비해 출혈 및 점막의 결손을 포함한 위 점막의 손상이 유의하게 감소한 것으로 보아, PS 처리로 인해 150 mM HCl/60% ethanol로 유발한 위 점막의 손상을 완화했음을 확인할 수 있었다(Fig. 2).

Fig 2. Optical change stomach tissues of HCl/ethanol-induced acute gastric mice. All data are expressed mean±SD (n=8). Normal, normal group; Control, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with distilled water group; SC, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with sucralfate 10 mg/kg group; PS100, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with Pinus sylvestris var. mongolica water extract 100 mg/kg group; PS200, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with Pinus sylvestris var. mongolica water extract 200 mg/kg group. Significance: ^###P<0.001 vs. normal group, ^***P<0.001 vs. control group.

조직 내 malondialdehyde 측정

ROS는 호중구에 의해 생성되어 세포 지질과의 반응 및 지질 과산화물을 생성한다. 따라서 점막 손상을 유발하는 산화적 스트레스의 지표로 지질 과산화의 주요 대사산물인 MDA 분석이 주로 사용된다(Phaniendra 등, 2015). 이에 본 연구에서 조직 내 MDA(nmol/mg)를 측정한 결과 정상군 대비 대조군에서 72% 유의하게 증가하였으나(P<0.001), 대조군 대비 PS100군은 17%가량 유의하게 감소하였고(P<0.01) SC군과 PS200군의 경우 약 25% 이상 유의하게 감소하였다(P<0.001)(Fig. 3A). 이는 PS가 조직 내 MDA 수치를 감소시켜 산화적 스트레스를 감소시킴으로써 150 mM HCl/60% ethanol로 인한 급성 위궤양을 완화하는 것으로 판단된다.

Fig 3. Effect of PS on MDA level and expression of NADPH-related proteins in stomach tissue. All date are expressed mean±SD (n=8). Normal, normal group; Control, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with distilled water group; SC, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with sucralfate 10 mg/kg group; PS100, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with Pinus sylvestris var. mongolica water extract 100 mg/kg group; PS200, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with Pinus sylvestris var. mongolica water extract 200 mg/kg group. Significance: ^###P<0.001 vs. normal group, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs. control group.

Western blotting

산화적 스트레스 관련 단백질 분석: 산화적 스트레스는 ROS의 과생성, 세포막의 지질 과산화 및 항산화 체계의 불균형으로 인해 발생하게 된다. 이는 위점막의 상피층, 위 점액 장벽 및 땀샘을 파괴하게 되고, 결국 점막 및 점막하 세포를 손상시켜 혈관 내피 및 백혈구 침윤을 야기한다. 최근 연구에 따르면 산화적 스트레스 관련 인자인 NADPH oxidase-2(NOX2)를 억제함으로써 산화적 스트레스를 개선시켜 위장 보호 효능이 있음을 보고하였으며(Badr 등, 2019), NOX의 서브유닛인 p22^phox 또한 NOX와 마찬가지로 산화적 스트레스와 관련하여 ROS 생성에 관여한다고 알려져 있다(Lambeth, 2004).

본 실험 결과, NOX2의 발현이 정상군 대비 대조군에서 약 39% 유의하게 증가했으며(P<0.001), 대조군 대비 SC군과 PS100군에서 약 25% 감소하였다. 또한, PS200군의 경우 정상군의 수준과 비슷하게 감소하였다(P<0.01). p22^phox의 발현은 정상군 대비 대조군에서 76% 유의하게 증가했으며(P<0.001), 대조군 대비 PS200군에서 21% 유의하게 감소하였다(P<0.05). SC군과 PS100군의 경우 감소하는 경향만 나타났다(Fig. 3B, 3C). 이는 PS가 산화적 스트레스 관련 단백질을 억제함으로써 급성 위궤양을 완화한 것으로 판단된다.

항산화 관련 단백질 분석: Nrf2/KEAP1 신호전달체계는 ROS로 인한 세포 내 스트레스와 독성을 완화하는 조절시스템이다. Nrf2는 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 전사인자로 세포질에서 KEAP1과 복합체를 형성하여 존재하다가 외부 자극에 의해 KEAP가 비활성화되면서 Nrf2가 분리되어 핵 안으로 유도됨으로써 ROS로 인한 세포 독성을 보호할 수 있으며, HO-1과 SOD 같은 항산화 효소들의 발현 또한 촉진하는 것으로 알려져 있다(He 등, 2012).

본 실험 결과 Nrf2의 단백질 발현이 정상군 대비 대조군에서 35% 유의하게 감소했으며(P<0.01), 대조군 대비 SC군과 PS100군에서 약 33% 유의하게 증가하였고(P<0.05) PS200군에서 약 52%가량 유의하게 증가하였다(P<0.01). 반면, KEAP1의 발현은 정상군 대비 대조군에서 약 97% 유의하게 증가했으며(P<0.001), 대조군 대비 SC군과 PS100군에서 약 16% 유의하게 감소하였고(P<0.05) PS200군의 경우 약 26%가량 유의하게 감소하였다(P<0.01). HO-1에서 정상군 대비 대조군에서 30% 유의하게 감소하였으나(P<0.01), 대조군 대비 PS200군에서 약 30% 증가하여 정상군의 수준과 비슷하였다(P<0.05). SOD의 경우 정상군 대비 대조군에서 26% 감소하였으나(P<0.05), 대조군 대비 SC군과 PS200군에서 약 33% 유의하게 증가하여 정상군의 수준과 비슷하였다(Fig. 4).

Fig 4. Expression of antioxidant-related proteins in stomach tissue. All date are expressed mean±SD (n=8). Normal, normal group; Control, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with distilled water group; SC, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with sucralfate 10 mg/kg group; PS100, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with Pinus sylvestris var. mongolica water extract 100 mg/kg group; PS200, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with Pinus sylvestris var. mongolica water extract 200 mg/kg group. Significance: ^#P<0.05, ^##P<0.01, ^###P<0.001 vs. normal group, ^*P<0.05, ^**P<0.01 vs. control group.

이러한 결과는 PS 투여가 150 mM HCl/60% ethanol로 인한 급성 위궤양 동물 모델에서 Nrf2/KEAP1의 신호전달경로를 활성화하여 항산화 효소를 증가시킴으로써 급성 위궤양의 진행을 완화한 것으로 판단된다.

AMPK/Sirt1 단백질 분석: AMPK는 주요 에너지 센서 효소이자 대사 항상성을 조절하며, 세포 내의 에너지를 소모할 경우 AMP에 의해 활성화되어 ATP의 사용을 억제하는 인자로 잘 알려져 있다(Hardie 등, 2012). Sirt1은 세포 대사 센서로 작용하며 포도당 항상성, 지질대사, 세포 노화 및 세포 자멸사 등 다양한 대사 경로를 조절하는데, 이전 연구들로부터 AMPK/Sirt1의 신호전달로 인해 NF-κBp65의 활성을 억제하여 염증을 완화하며 산화적 스트레스를 억제한다는 것을 확인할 수 있었다(Velagapudi 등, 2017; Goldfine과 Shoelson, 2017).

따라서 본 연구에서 AMPK/Sirt1 단백질의 발현을 확인한 결과, p-AMPK는 정상군 대비 대조군에서 22% 유의하게 감소했으나(P<0.001), SC군과 PS100군의 경우 약 18% 이상 유의하게 증가하였으며(P<0.001, P<0.01, resp) PS200군은 28% 유의하게 증가하여 정상군의 수준과 비슷하게 나타났다(P<0.001). Sirt1의 발현 또한 정상군 대비 대조군에서 25% 유의하게 감소하였으며(P<0.001), SC군, PS100군 및 PS200군에서 각각 30%, 24%, 32%가량 유의하게 증가하여 정상군의 수준과 비슷하였다(P<0.01, P<0.01, P<0.001, resp)(Fig. 5). 이러한 결과는 PS 투여가 AMPK/Sirt1을 활성화함으로써 급성 위궤양을 유발하여 발생한 염증을 완화할 것이라 판단된다.

Fig 5. Expression of AMPK/Sirt1 pathway in stomach tissue. All date are expressed mean±SD (n=8). Normal, normal group; Control, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with distilled water group; SC, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with sucralfate 10 mg/kg group; PS100, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with Pinus sylvestris var. mongolica water extract 100 mg/kg group; PS200, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with Pinus sylvestris var. mongolica water extract 200 mg/kg group. Significance: ^###P<0.001 vs. normal group, ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs. control group.

염증 관련 단백질 분석: NF-κB는 핵 내 전사인자로 알려져 있으며, 세포질에서 IκBα에 의해 비활성화 상태로 존재하다가 산화적 스트레스와 같은 다양한 자극에 의해 인산화되어 NF-κB가 핵 내로 이동하여 전염증성 단백질과 염증성 사이토카인과 같은 염증 관련 인자들의 전사 조절 역할을 하면서 염증 반응을 촉진한다고 알려져 있다(Ngabire 등, 2018).

이에 본 실험에서 NF-κBp65, iNOS 및 COX-2의 발현을 확인한 결과, 정상군 대비 대조군에서 NF-κBp65의 발현이 39% 유의하게 증가했으나(P<0.01), 대조군 대비 SC군과 PS100군은 약 22%가량 유의하게 감소하였고(P<0.01) PS200군의 경우 약 30% 유의하게 감소하여 정상군의 수준과 비슷하였다(P<0.001). 정상군 대비 대조군에서 iNOS의 발현이 64%가량 유의하게 증가했으나(P<0.001), 대조군 대비 PS100군과 PS200군에서 각각 18%, 27%가량 유의하게 감소하였다(P<0.05, P<0.01, resp). COX-2의 경우 정상군 대비 대조군에서 62%가량 유의하게 증가했으나(P<0.01), 대조군 대비 SC군과 PS200군에서 약 30%, 24%가량 유의하게 감소하였다(P<0.01, P<0.05, resp)(Fig. 6). TNF-α 및 IL-6의 발현을 확인한 결과, 정상군 대비 대조군에서 TNF-α의 발현이 48% 유의하게 증가하였으나(P<0.001), 대조군 대비 SC군, PS100군 및 PS200군에서 각각 17%, 19% 및 23%가량 유의하게 감소하였다(P<0.01, P<0.01, P<0.001, resp). IL-1β의 발현 또한 정상군 대비 대조군에서 87% 이상 유의하게 증가했으나(P<0.001), PS100군과 PS200군에서 각각 20%, 32%가량 감소하였고(P<0.05, P<0.001, resp) SC군의 경우 감소하는 경향만 보였다(Fig. 7).

Fig 6. Expression of inflammation-related proteins in stomach tissue. All date are expressed mean±SD (n=8). Normal, normal group; Control, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with distilled water group; SC, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with sucralfate 10 mg/kg group; PS100, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with Pinus sylvestris var. mongolica water extract 100 mg/kg group; PS200, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with Pinus sylvestris var. mongolica water extract 200 mg/kg group. Significance: ^##P<0.01, ^###P<0.001 vs. normal group, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs. control group.

Fig 7. Expression of inflammation cytokines in stomach tissue. All date are expressed mean±SD (n=8). Normal, normal group; Control, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with distilled water group; SC, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with sucralfate 10 mg/kg group; PS100, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with Pinus sylvestris var. mongolica water extract 100 mg/kg group; PS200, 150 mM HCl/60% ethanol-induced with Pinus sylvestris var. mongolica water extract 200 mg/kg group. Significance: ^###P<0.001 vs. normal group, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs. control group.

이는 PS가 AMPK/Sirt1의 활성화를 통해 NF-κBp65의 활성을 억제함으로써 iNOS와 COX-2의 발현과 TNF-α와 IL-1β 같은 사이토카인의 발현을 억제해 급성 위궤양을 개선하는 것으로 사료된다.

본 실험에서는 150 mM HCl/60% ethanol로 유발한 급성 위궤양 동물 모델에 몽골 구주소나무 추출물이 미치는 효과를 확인하기 위하여 약물투여 1시간 30분 후 150 mM HCl/60% ethanol을 0.55 mL 투여하여 유발하였고, 1시간 30분 후 동물을 희생시켜 위 조직을 적출하였다. 몽골 구주소나무 추출물의 투여는 위 조직 내 MDA 함량과 산화적 스트레스 관련 단백질인 NOX2와 p22^phox의 발현을 유의하게 감소시켰으며, Nrf2/KEAP1의 신호전달을 통해 HO-1과 SOD의 발현을 증가시켰다. 또한, AMPK/Sirt1의 활성화로 NF-κB, iNOS 및 COX-2를 포함한 전염증 관련 단백질과 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β 발현을 유의하게 감소시켰다. 이러한 결과로 미루어볼 때, 몽골 구주소나무 추출물은 산화적 스트레스 관련 단백질의 조절을 통해 항산화 관련 단백질을 증가시킬 뿐만 아니라, AMPK/Sirt1의 활성화를 통해 염증 관련 단백질과 염증성 사이토카인을 조절함으로써 급성 위궤양을 완화하는 것으로 판단된다.

본 연구는 농촌진흥청 “농업과학기술개발협력연구사업(과제번호 PJ015272012021)”의 지원으로 수행되었다.