향신료는 식물의 열매, 종자, 꽃, 뿌리 등을 이용해 음식의 맛이나 향을 돋구는 데 이용하거나 식품의 보존성을 높이는 용도로 사용되며, 이는 다양한 연구를 통해 항산화 작용, 항염증 등의 효능을 보인다고 보고하였다(Tapsell 등, 2006). 또한 향신료에는 갈산과 바닐산-O-헥소사이드, 시린지산, 카페인산-O-헥소사이드, 클로로겐산, 카테킨 등의 다양한 생리활성 물질이 존재한다고 알려져 있다(Vallverdú-Queralt 등, 2014). 향신료 중에 훼누그릭(Trigonella foenum-graecum)은 중앙아시아, 동유럽에 분포하는 식물로 콩과의 한해살이풀이며 호로파, 큰노랑꽃자리풀이라고도 불린다. 잎은 주로 샐러드에 이용되고 그 외에 잎과 줄기, 종자 모두 향신료로 쓰이며 종자의 경우에는 약재로도 많이 사용되고 있다. 우리나라에서는 주로 훼누그릭 종자를 볶아 갈아서 카레에 넣어 섭취한다. 이러한 훼누그릭 종자 관련 연구는 에탄올 추출물 처리가 유방암 MCF-7 세포주에서 강력한 항암효과를 나타내었다고 보고되었다(Al-Timimi, 2019). 또한 발아된 훼누그릭 종자의 물 추출물이 강력한 항산화력을 보였는데, 이는 발아로 인한 페놀 화합물과 플라보노이드 함량 증가가 영향을 미친 것으로 나타났다(Dixit 등, 2005). 그뿐만 아니라 훼누그릭 종자의 다양한 용매 추출물의 항산화 연구에 따르면, 에탄올 추출물이 메탄올, 헥산 추출물에 비해 페놀성 화합물이 많았고 높은 항산화력을 나타내었다고 보고된 바 있다(Bhanger 등, 2008). 이외에도 훼누그릭 종자가 인도와 중국에서는 당뇨병과 고콜레스테롤혈증 치료에 사용되었고(Basch 등, 2003; Miraldi 등, 2001), 비만유도 동물에서도 항비만 활성을 보여(Handa 등, 2005) 대사성 증후군을 예방할 수 있는 중요한 향신료로써의 가능성을 보여주고 있다. 따라서 훼누그릭 종자의 한정적으로 진행되었던 용매 추출을 분획 과정을 통해 각각 분획물의 항산화력을 알아보고자 하였으며, 유지 산화 안정성 검증을 위해 옥수수유를 사용하여 실험을 진행하였다. 옥수수유의 경우 지방산 조성이 리놀레산 34~62%, 올레산 19~49%, 팔미트산 8~12%로 이루어져 있어 저장 중의 산화에 대해 민감하며(Yeon 등, 2016), 이러한 유지의 산화를 지연 및 방지하기 위해 지금까지의 식용 유지들은 합성 항산화제인 butylated hydroxytoluene, butylated hydroxyanisole 등이 첨가되었지만, 최근 합성 항산화제의 위험성이 제기되면서 현재는 사용에 제한을 두고 있다. 이와 같은 문제로 인해 식물 유래 추출물의 연구가 활발히 진행되고 있다. 이에 본 연구에서는 훼누그릭 종자를 80% 에탄올로 추출하여 헥세인, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수 순으로 분획하여, 용매에 따른 항산화력과 옥수수유에서 유지 산화 안정성을 비교해 가장 강한 효과를 나타내는 용매 추출물의 향기 성분을 분석하여 항산화제로써의 활용 가능성을 확인하고자 하였다.

훼누그릭 종자 분획물 제작

훼누그릭 종자는 인도산을 이용하였다. 훼누그릭 종자는 분쇄기(SHMF-3500SS, Hanil Electric, Wonju, Korea)를 사용하여 곱게 분쇄한 뒤, 80% 에탄올(1:15, w/v)을 이용하여 교반기(RS-1, Jeio Tech., Daejeon, Korea)로 6시간 동안 진탕 추출하였다. 이후에는 여과지(Whatman No.2, Whatman, Buckinghamshire, England)를 이용해 여과하고, 40°C water bath에서 감압농축기(rotary vacuum evaporator, BŰCHI, Zollikofen, Switzerland)를 사용해 농축한 후 동결건조기(BJD85-F8, IlShin Biobase, Seoul, Korea)를 사용해 동결건조한 뒤에 곱게 분쇄하였다. 이를 가지고 핵세인(Daejung, Siheung, Korea), 에틸아세테이트(Daejung), 부탄올(Daejung), 증류수의 순서대로 분획을 진행하였고, 각 분획물을 감압 농축한 뒤 동결건조하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성

DPPH 라디칼 소거 활성 측정은 Park 등(2022)의 방법을 참고하여 이용하였다. 메탄올(Daejung)을 용매로 0.1 mM 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH; Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 제조하였다. 제조된 DPPH 용액 0.75 mL를 각 농도로 희석한 추출 시료 용액 0.25 mL에 넣어 30분간 암실에서 반응시켰다. 그 뒤에 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco, Seoul, Korea)를 이용하여 517 nm 파장에서 DPPH 라디칼이 감소하는 정도를 측정하였다. 표준물질의 경우 ascorbic acid(Sigma Aldrich Co.)를 이용하여 시료와 같은 방법으로 진행하였다.

$$\begin{array}{l}DPPHradicalscavengingactivity\left(\%\right)=\frac{A_c-A_s}{A_c}\times 100\\ A_c:대조군의흡광도,A_s:시료의흡광도\end{array}$$

ABTS 양이온 라디칼 소거 활성

ABTS 양이온 라디칼 소거 활성 측정은 Yuan 등(2005)의 연구를 참고하였다. 7 mM 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulphonic acid(ABTS; Sigma Aldrich Co.)와 2.45 mM potassium persulfate(Sigma Aldrich Co.)를 증류수를 용매로 제조하여 1:1(v/v)로 혼합한 후에 12시간 이상 방치하여 라디칼을 형성하였다. 그 후에 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco)를 이용하여 734 nm 파장에서 흡광도 값이 0.700±0.05가 되도록 에탄올(Daejung)을 이용해 희석하였다. 이 용액을 0.95 mL와 증류수로 희석한 각 농도의 시료 0.05 mL를 넣고 암실에서 6분 동안 반응시켰다. 표준물질의 경우 ascorbic acid(Sigma Aldrich Co.)를 이용하여 시료와 같은 방법으로 진행하였다.

$$\begin{array}{l}ABTSradicalscavengingactivity\left(\%\right)=\frac{A_c-A_s}{A_c}\times 100\\ A_c:대조군의흡광도,A_s:시료의흡광도\end{array}$$

FRAP 환원력

FRAP 환원력은 Benzie와 Strain(1996)의 방법을 이용하였다. Acetic acid(Daejung)를 이용하여 pH 3.6에 맞추어 300 mM sodium acetate(Sigma Aldrich Co.)를 제조하였다. 40 mM HCl(Daejung)을 이용하여 10 mM 2,4,6-tripyridyl-S-triazine(Sigma Aldrich Co.)을 용해시켰다. 20 mM FeCl₃(Sigma Aldrich Co.)는 증류수에 용해시켜 사용하였고, 앞서 용해시킨 용액들은 각각 10:1:1(v/v/v) 비율로 섞어 37°C에서 15분 동안 평형시켜서 FRAP reagent를 제조하였다. FRAP reagent 0.9 mL와 증류수를 이용해 농도별로 희석한 시료 용액 0.03 mL를 넣은 후 30분 동안 암실에서 반응시켰다. 그 후에 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco)를 이용하여 594 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Ascorbic acid(Sigma Aldrich Co.)를 표준물질로 사용하여 농도별로 증류수에 녹여 표준곡선을 작성해 계산하였다.

총 페놀 함량 측정

총 페놀 함량 측정은 Stoilova 등(2007)의 방법을 참고하여 진행하였다. Folin-Ciocalteu(Sigma Aldrich Co.)와 증류수를 1:1(v/v)로 섞어서 각 시료의 총 페놀 함량을 측정하였다. 증류수에 각각의 농도로 희석한 시료 0.05 mL를 넣어 혼합하고 5분 동안 반응시켰다. 이후 포화한 sodium carbonate(Sigma Aldrich Co.)를 0.1 mL 넣어 섞은 후에 30분 동안 정치하였다. 이후에 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco)를 사용하여 594 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 tannic acid(Sigma Aldrich Co.)를 증류수를 이용해 농도별로 희석하여 표준곡선을 작성하여 계산하였다.

Oxygen radical absorbance capacity(ORAC)법

100 nM fluorescein sodium salt(Sigma Aldrich Co.)를 75 mM 인산 완충용액에 용해시킨 후 37°C 항온수조에서 평형시켜 이용하였다. 동일한 완충용액을 이용하여 300 mM 2,2′-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride(AAPH)(FUJIFILM Wako Chemicals, Richmond, VA, USA)를 제조하였다. 같은 완충용액을 사용하여 각각의 농도로 희석한 시료 50 μL와 fluorescein sodium salt 150 μL, AAPH는 50 μL를 넣어 온도를 37°C로 유지하고 fluorescenece micro plate reader(GeminiXPS, Moleculardevice, San Jose, CA, USA)를 이용하여 excitation 493 nm, emission 515 nm 파장에서 40분간 매분 측정하였다. 표준물질로는 Trolox(Sigma Aldrich Co.)를 시료와 동일한 완충용액으로 각각의 농도로 희석하여 사용하였다.

다양한 용매 분획물 첨가 유지 제조

각각의 분획물을 dimethyl sulfoxide(Daejung)에 혼합하여 옥수수기름(Ottogi, Anyang, Korea)에 0.1%가 되도록 첨가하였다. 대조군은 dimethyl sulfoxide를 동일한 양으로 첨가한 옥수수기름을 이용하였다. 그 후에 시료들을 dry oven(GISICO, Seoul, Korea)에서 0, 30, 60, 90분 동안 180°C에서 산화시켰고, 잔열로 산화되는 것을 막기 위해 -20°C에 보관하고 사용하였다.

Conjugated dienoic acid(CDA)가

CDA가는 AOCS(2017)법을 이용해 측정하였다. 산화된 각각의 시료를 isooctane(Daejung) 15 mL에 4,000 ppm 농도로 분산시킨 후 흡광도 값이 적정범위로 들어오도록 isooctane을 이용해 희석하였다. 그 후 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco)로 233 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

$$\begin{array}{l}Conjugateddienoicacidvalue\left(\%\right)=0.84\times \left(\frac{A_{233}}{b\times c}\times a-K_0\right)\\ A_{233}:233nm에서흡광도\\ K_0:acid의흡광도,계수\left(0.03\right)\backslash \\ a:희석배수\\ b:cell의길이\left(cm\right)\end{array}$$

p-Anisidine value(p-AV)법

p-AV는 AOCS(2017)법을 이용하였다. 산화시킨 시료를 isooctane(Daejung)에 4,000 ppm 농도로 분산시켰고, acetic acid(Daejung)를 이용하여 0.25% p-anisidine(Kantochemical, Tokyo, Japan)이 되도록 제조하였다. 제조한 용액 0.3 mL와 시료 1.5 mL를 넣고 암실에서 15분 동안 반응시켰다. 이후에 UV-VIS spectrophotomemter(Mega-U600, Scinco)를 이용하여 350 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

2-Thiobarbituric acid(TBA)가

TBA가는 Serdaroğlu와 Felekoğlu(2005)의 연구를 참고하였다. 산화된 시료 1.5 g을 benzene(Daejung) 5 mL에 녹였다. TBA(Sigma Aldrich Co.)는 100 mL의 증류수에 0.67 g을 용해시킨 후 같은 부피의 glacial acetic acid와 혼합하여 제조하였다. 시료에 제조한 TBA 시약을 5 mL 넣어 살살 흔들고 4분간 정치하여 상충액을 제거하였다. 이것을 100°C 항온수조에서 30분간 가열시킨 후, 흐르는 물에서 냉각시킨 뒤에 UV-VIS spectrophotometer(Mega-U600, Scinco)를 이용해 530 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

휘발성 물질 분리

휘발성 물질 분리 방법은 Kiralan(2012)의 방법을 참고하여 고체상 미량 추출(SPME)법을 이용하였다. 불꽃 이온화 검출기(flame ionization detector)가 설치된 GC(Hewlett-Packard 6890, Agilent Technology, Palo Alto, CA, USA)를 이용해 휘발성 물질을 분리하였다. SPME fiber는 65 μm polydimethylsiloxane/divinylbenzene(Supelco, Bellefonte, PA, USA)을 사용하였고, 고정상으로는 HP-5(30 m×0.32 m ID, 0.25 mm film, Agilent Technology) 칼럼을 이용하였다. 기기의 온도 조건은 초기에 50°C에서 2분간 방치한 뒤 120°C로 상승시켰으며, 주입기와 검출기의 온도는 각각 220°C, 300°C로 고정하였다.

휘발성 물질 분석

GC-mass spectrometry(5971A, Agilent Technology)를 사용하여 휘발성 물질을 동정하였으며, 이동상으로는 헬륨가스를 이용하여 0.8 mL/min 속도로 흘려주었다. 추출 조건은 GC-FID와 동일한 조건으로 사용하였고, MS 분석 조건은 70 ev, 220 ionsource 온도를 이용하였다. 질량 스펙트럼 라이브러리(mass spectrum library)와 머무름시간(retention time)을 사용하여 휘발성 물질을 분석하였다.

통계처리

모든 실험은 3회 반복하여 진행하였다. 실험을 통해 얻은 결과는 SPSS(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 mean±SD로 나타내었다. One-way ANOVA로 유의성 검정을 실시하였고, Duncan’s multiple range test를 통해 P˂0.05 수준에서 사후 검증하였다.

훼누그릭 종자 분획물의 DPPH 라디칼 및 ABTS 양이온 라디칼 소거 활성

훼누그릭 종자 분획물의 DPPH 라디칼 및 ABTS 양이온 라디칼 소거 활성의 결과는 Fig. 1과 같다. 훼누그릭 종자 80% 에탄올, 헥세인, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수 분획물 모두 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였으며, 부탄올, 에틸아세테이트, 80% 에탄올, 증류수, 헥세인 순서로 각각 47.6, 25.7, 23.3, 9.3, 2.6%의 유의적인 차이를 보였다(P<0.05). 특히 분획물 중 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 47.6%로 유의적으로 가장 높은 소거 활성을 보였고(P<0.05), 훼누그릭 종자 헥세인 분획물이 2.6%로 유의적으로 가장 낮은 소거능을 보였다(P<0.05).

Fig 1. DPPH (A) and ABTS (B) cation radical scavenging activity of fenugreek seed fractions. Samples were fractionated with different solvents using 80% ethanol extract. Significant differences were indicated using different letters (P˂0.05).

ABTS 양이온 라디칼 소거 활성 결과로는 훼누그릭 종자 80% 에탄올, 헥세인, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수 분획물 모두 ABTS 양이온 라디칼 소거 활성이 나타났으며, 부탄올, 에틸아세테이트, 80% 에탄올, 증류수, 헥세인 순으로 각각 43.6, 23.7, 20.6, 17.0, 11.3%의 유의적인 차이가 나타났다(P<0.05). 그중에서도 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 43.6%로 유의적으로 가장 큰 활성을 보였고, 훼누그릭 종자 헥세인 분획물이 11.3%로 유의적으로 가장 낮은 활성을 나타내었다(P<0.05). Lee 등(2021)은 오레가노 종자를 에탄올, 헥세인, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수로 분획하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 에틸아세테이트 분획물이 다른 용매 분획물에 비해 유의적으로 가장 높은 활성을 나타내었다고 보고하였다(P<0.05). Yu 등(2011)은 로즈마리를 메탄올, 헥세인, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수 순으로 분획물을 제작하여 ABTS 양이온 라디칼 소거 활성을 평가한 결과 에틸아세테이트 분획물이 유의적으로 가장 높은 활성을 가진다고 보고하였다. 앞서 보고된 연구와는 달리 본 연구는 부탄올 분획물의 DPPH 및 ABTS 양이온 라디칼 소거 활성 모두 가장 우수하였다. 에틸아세테이트 혹은 부탄올을 사용하여 분획할 경우 항산화 활성이 크게 증가하였는데, 이는 에틸아세테이트와 부탄올 분획물의 활성 차이가 발생하는 것은 향신료가 가지고 있는 성분이 용매마다 용해도 차이가 있어 발생한 것으로 사료된다(Matkowski 등, 2008).

훼누그릭 종자 분획물의 FRAP 환원력과 총 페놀 함량

훼누그릭 종자 분획물의 FRAP 환원력과 총 페놀 함량은 Table 1에 나타내었다. FRAP 환원력 결과로 훼누그릭 종자 80% 에탄올, 헥세인, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수 분획물을 비교했을 때, 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 148.52 μmol ascorbic acid equivalent/g extract로 가장 높은 FRAP 환원력을 보였으며, 훼누그릭 종자 80% 에탄올, 헥세인, 에틸아세테이트, 증류수 분획물에 비해 약 2.72, 1.10, 1.04, 7.56배 높게 관찰되었다. 총 페놀 함량 결과도 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 32.15 μmol tannic acid equivalent/g extract로 유의적으로 가장 높은 총 페놀 함량을 보였으며(P<0.05), 훼누그릭 종자 80% 에탄올, 헥세인, 에틸아세테이트, 증류수 분획물에 비해 1.82, 3.06, 1.38, 2.62배 높게 관찰되었다. Jeon 등(2012)은 참취 분말을 70% 에탄올, 헥세인, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수 순서로 분획하였는데 총 폴리페놀 함량에서 에틸아세테이트 분획물이 가장 높았지만, 그다음으로 함량이 많았던 부탄올 분획물과 유의적인 차이는 보이지 않았다. 또한 FRAP 환원력 결과 500 μg/mL 농도에서 부탄올 분획물이 가장 높았다고 보고하였다. Zhang 등(2022)은 중국의 5개 지역에서 자라는 셀러리 종자들을 분말화하여 에탄올로 추출한 뒤에 디클로로메탄, 부탄올, 물의 순서로 분획하였는데, 5개 지역의 셀러리 종자 분획물 모두 부탄올 분획물의 총 폴리페놀 함량이 높았으며, FRAP 환원력도 마찬가지로 가장 우수하였다고 보고하였다. 이러한 결과는 폴리페놀 화합물이 자유라디칼을 소거하는 데 기여하고 금속 이온 킬레이트 능력에 영향을 주었다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 훼누그릭 종자 부탄올 분획물의 항산화 활성이 우수한 것은 높은 총 페놀 함량이 영향을 준 것으로 생각된다.

Table 1 . FRAP values and TPC of fenugreek seed fractions.

Fenugreek seed fractions	FRAP1) (µmol ascorbic acid equivalent/g extract)	TPC2) (µmol tannic acid equivalent/g extract)
80% Ethanol	54.54±6.58b	17.62±0.79c
n-Hexane	135.47±57.02a	10.51±0.31e
Ethyl acetate	142.59±2.18a	23.29±0.58b
n-Butanol	148.52±6.62a	32.15±1.22a
Water	19.65±0.41b	12.25±0.26d

¹⁾FRAP: ferric reducing antioxidant power..

²⁾TPC: total phenolic contents..

Samples were fractionated with different solvents using 80% ethanol extract..

Significant differences were indicated using different letters (P<0.05)..

훼누그릭 종자 분획물의 ORAC가

훼누그릭 종자 분획물의 ORAC가의 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 각각의 훼누그릭 종자 분획물을 50 μg/mL 농도로 처리했을 때 훼누그릭 종자 분획물을 넣지 않은 대조군에 비해 훼누그릭 종자 80% 에탄올, 헥세인, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수 분획물은 약 2.10, 1.61, 2.36, 2.88, 1.74배의 항산화력을 보였다(P<0.05). 그중에서도 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 유의적으로 높은 항산화 활성을 나타내었다(P<0.05). Eom 등(2020)의 연구에서는 소리쟁이 뿌리를 이용해 에탄올 추출물을 얻은 후 헥세인, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 층으로 분획하여 ORAC를 측정한 결과 에틸아세테이트 분획물, 디클로로메탄 분획물, 에탄올 추출물, 헥세인 분획물, 물 분획물 순서로 높은 활성을 보였다고 보고하였다. Kim 등(2010)의 연구에서 더덕 분말을 70% 에탄올, 헥세인, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 순서로 분획을 하여 ORAC를 측정한 결과, peroxyl radical 소거 활성의 경우에 에틸아세테이트 분획물이 가장 높은 활성을 나타내었고 부탄올과 클로로포름 분획물이 다음으로 높은 활성을 나타내었으며, hydroxyl radical 소거 활성의 경우는 부탄올 분획물이 가장 높은 활성을 나타내었다고 보고하였다(P<0.05). Peroxyl radical, hydroxyl radical 소거 활성 결과로 부탄올 분획물이 높은 활성을 보이므로 본 연구의 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 높은 활성을 나타낸 결과와 유사하였다. Shahidi와 Ambigaipalan(2015)은 항산화 능력이 총 페놀 함량 및 폴라보노이드 함량과 연관되어 있으며 페놀 수산기의 전자공여 능력에 관여한다고 보고하였다. 본 연구에서는 ORAC가가 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 가장 높았으며, 이는 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 가장 높은 총 페놀 함량을 나타내어 그로 인한 것으로 생각된다.

Fig 2. Effect of fenugreek seed fractions on fluorescein elimination induced by 2,2′-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride. (A) Fluorescein curve of ORAC values, (B) Relative ORAC values. Samples were fractionated with different solvents using 80% ethanol extract. Significant differences were indicated using different letters (P˂0.05).

훼누그릭 종자 분획물의 CDA가, p-AV 및 TBA가

유지 산화 과정 중 초기에 발생하는 공액 이중결합을 측정하는 CDA가와 이차 산화물 함량을 측정하는 p-AV 및 TBA가 결과는 Fig. 3에 나타내었다. CDA가의 결과로 훼누그릭 종자 분획물 0.1%를 유지 시료에 첨가하여 180°C에서 0, 30, 60, 90분 동안 산화시킨 결과, 90분 산화 조건에서 훼누그릭 종자 80% 에탄올, 헥세인, 부탄올 분획물을 0.1% 첨가한 유지 시료의 CDA가 훼누그릭 종자 분획물을 첨가하지 않은 대조군과 비교했을 때 감소하였고, 그중 훼누그릭 종자 80% 에탄올 분획물이 대조군에 비해 1.06배 감소한 결과를 보였다. p-AV는 CDA와 동일한 방법으로 180°C에서 0, 30, 60, 90분 산화시킨 결과, 90분 산화 조건에서 대조군과 비교했을 때 훼누그릭 종자 80% 에탄올, 헥세인, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수 분획물을 0.1% 첨가한 유지 시료 모두 유의적으로 적게 나타났다(P<0.05). 특히 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 대조군에 비해 이차 산화물이 1.80배 유의적으로 감소한 것으로 관찰되었다(P<0.05). 또한 TBA가도 180°C에서 0, 30, 60, 90분 산화시킨 경우 90분 산화 조건에서 대조군과 비교한 결과로, 0.1% 농도로 훼누그릭 종자 80% 에탄올, 헥세인, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수 분획물을 첨가한 유지 시료 모두 유의적으로 적게 나타났으며(P<0.05), 그중에서도 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 대조군에 비해 1.37배 유의적으로 감소한 것으로 관찰되었다(P<0.05). Kim 등(2003)의 연구에서는 뽕잎을 이용하여 메탄올 추출물을 얻은 후 헥세인, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 분획하여 CDA가를 측정한 결과, 대두유에 추출물과 분획물을 0.1% 첨가하여 60°C에서 10일 동안 보관했을 때 부탄올 분획물이 대조군, 다른 추출물과 분획물을 첨가한 것보다 CDA가가 낮게 나타났다고 보고하였다. 본 연구에서 부탄올을 대조군과 비교했을 때 낮은 CDA가가 나타난 것과 유사한 결과를 확인할 수 있었다. Kim 등(2018)의 연구에 의하면 메밀, 둥굴레, 의인, 당귀, 구기자, 천마, 마테를 각각 발효하여 혼합한 혼합물을 80% 에탄올로 추출하여 유지에 첨가해 0, 3, 6, 9시간 산화시킨 뒤 CDA가와 p-AV를 측정한 결과, 초기 산화 정도를 측정하는 CDA가의 경우 6시간 산화 조건에서만 CDA가가 유의적으로 감소하였고(P<0.05), 이차 산화물을 측정하는 p-AV는 3, 6, 9시간 산화 조건에서 모두 유의적인 감소가 나타나(P<0.05) 7종 발효 혼합물 에탄올 추출물은 초기 산화물보다 2차 산화물을 억제한다고 보고하였다. 본 연구에서도 CDA가를 측정한 결과로 훼누그릭 종자 80% 에탄올, 헥세인, 부탄올 분획물의 경우에는 대조군과 비교하여 초기 산화물을 억제하지만 훼누그릭 종자 에틸아세테이트, 증류수 분획물은 초기 산화물을 억제 못 하였던 반면, p-AV에서는 대조군과 비교하여 모든 훼누그릭 종자 분획물이 이차 산화물을 억제하는 것으로 나타났다. p-AV와 TBA가 두 가지 모두 유지의 이차 산화물을 측정하지만, p-AV는 주로 α, β-불포화 알데하이드를 측정하고 TBA가는 말론 알데하이드를 측정하는 방법이며(Li 등, 2016), 따라서 본 연구에서 p-AV와 TBA가 분석을 통해 모든 훼누그릭 종자 분획물이 대조군과 비교하여 유지의 이차 산화물인 알데하이드와 말론 알데하이드 생성을 억제하는 것을 알 수 있었다.

Fig 3. Oxidative stability in corn oil oxidized at 180°C for 90 min with fenugreek seed fractions. (A) Conjugated diene, (B) p-Anicidine value, (C) TBA value. Samples were fractionated with different solvents using 80% ethanol extract. Significant differences were indicated using different letters (P˂0.05).

훼누그릭 종자 부탄올 분획물 휘발 성분 분석 비교

GC-MS를 이용하여 훼누그릭 부탄올 분획물의 휘발 성분을 분석한 결과는 Table 2에 나타내었다. 훼누그릭 종자 부탄올 분획물은 캄펜(camphene), 네롤리돌(nerolidol), 게라니을(geraniol) 등 성분이 분석되었다. 그중에서도 캄펜의 함량이 39.71%, 네롤리돌이 16.35%, 게라니올이 14.00 %, 리모넨이 8.60%, 게라닐 아세테이트가 6.53%로 많이 검출되었다. Tiwari와 Kakkar(2009)는 게라니올과 캄펜이 t-BHP 유발 산화 스트레스를 받은 쥐의 폐포 대식세포의 지질 과산화를 유의적으로 감속시키고, NO 산화를 유의하게 감소시키며 NO 방출과 ROS 생성을 억제하는 것으로 보고하였다. Sabir 등(2022)의 연구에서는 네롤리돌은 비알콜성 지방간 동물 모델에서 간의 지질 축적을 유의하게 감소시켰고, 고칼로리 식이에 의해 유발된 질병을 중단시켰다고 보고하였다. 또한 산화 스트레스 마커, 섬유증 및 사이토카인은 감소시켰고, 항산화 효소는 유의하게 증가시켰다고 보고하였다. Hazrati 등(2019)의 연구에서는 앙굴라타(Ferulago angulata)의 줄기, 잎, 꽃, 익은 종자, 안 익은 종자를 수소 증류 방법으로 에센셜오일을 추출하여 GC로 에센셜오일의 성분을 분석했을 때, 리모넨 함량이 익은 종자, 안 익은 종자 각각 33.07%, 31.13%로 잎 다음으로 높은 함량이 나타났다고 보고하였다. Abbassi 등(2018)의 연구에서는 고수풀의 종자를 효소처리 전과 효소처리 후 에센셜오일을 각각 제조하여 성분을 분석했는데 제조한 에센셜오일에서 리나롤, 캠퍼, 게라닐 아세테이트가 주요 화합물이었으며, 이러한 화합물이 효소 처리 후에 양이 증가하였고 항산화 활성도 증가하였다고 보고하였다. 본 연구에서도 이와 같은 휘발 성분에 의해 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 항산화 활성과 유지 산화 안정성에 영향을 미친 것으로 생각된다.

Table 2 . Volatile analysis of fenugreek seed 80% ethanol and butanol fraction by GC-MS.

RT (min)1)	Volatile compounds	Peak area (×105) (%)2)	Biological activities	Reference
13.56	Limonene	96.28±4.96(8.60)	Anticancer activity, anti-inflammatory activity, antioxidant activity, etc.	Vieira et al., 2018
13.69	2-Ethyl hexanol	50.63±3.29(4.52)	－	－
18.03	Linalool	63.06±1.44(5.63)	Anti-inflammatory activity, anxiolytic activity, antioxidant activity, etc.	Aprotosoaie et al., 2014
28.01	Geraniol	156.75±6.44(14.00)	Anti-inflammatory activity, antimicrobial activity, antioxidant activity, etc.	Chen and Viljoen, 2010
34.07	Camphene	444.69±16.36(39.71)	Antibacterial activity, anti-inflammatory activity, antioxidant activity, etc.	Hachlafi et al., 2021
36.23	Geranyl acetate	73.08±2.36(6.53)	Antifungal activity, anti-inflammatory activity	Goncalves et al., 2012
38.66	β-Farnesene	23.14±0.83(2.07)	－	－
39.2	(Z,E)-α-Farnesene	15.34±1.79(1.37)	－	－
39.36	α-Farnesene	13.79±2.55(1.23)	－	－
39.95	Nerolidol	183.10±8.05(16.35)	Anticancer activity, anti-inflammatory activity, antioxidant activity, etc.	Chan et al., 2016
Total volatiles		1,119.89±48.08(100)

¹⁾RT: retention time..

²⁾The number in parenthesis was the percentage of each volatile divided by the total volatiles..

Samples were fractionated with different solvents using 80% ethanol extract..

본 연구는 훼누그릭 종자를 80% 에탄올, 헥세인, 에틸아세테이트, 부탄올, 증류수 순서로 분획하여 용매에 따른 항산화 능력을 평가하고, 각 시료를 첨가한 유지를 180°C로 산화시켰을 때의 유지 산화 안정성을 평가하였다. DPPH 라디칼 소거 활성 평가 결과 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 47.6%로 가장 높게 나타났으며, ABTS 양이온 라디칼 소거 활성 평가에서도 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 43.6%로 가장 높은 소거 활성을 보였다. FRAP 환원력을 평가한 결과 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 148.52 μmol ascorbic acid equivalent/g extract로 가장 높았으며, 총 페놀 함량의 경우 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 32.15 μmol tannic acid equivalent/g extract로 가장 높은 함량을 나타내었다. ORAC의 결과로는 훼누그릭 종자 분획물을 첨가하지 않은 대조군과 비교했을 때 2.88배 높은 결과를 나타내었다. 유지의 초기 산화물을 측정한 CDA가의 결과는 90분 산화 조건에서 훼누그릭 종자 분획물을 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 훼누그릭 종자 80% 에탄올, 헥세인, 부탄올 분획물이 초기 산화물 생성을 억제함을 관찰할 수 있었다. 이차 산화물을 측정한 p-AV 및 TBA가의 결과로는 모든 훼누그릭 종자 분획물이 대조군에 비해 이차 생성물의 생성을 억제하였으며, 그중 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 가장 우수한 것으로 관찰되었다. 그뿐만 아니라 항산화 활성과 유지 산화 안정성에서 결과가 우수하였던 훼누그릭 종자 부탄올 분획물에서 캄펜, 네롤리돌, 게라니올, 리모넨, 게라닐 아세테이트 등이 주요 휘발 성분으로 검출되었다. 이러한 결과로 훼누그릭 종자 부탄올 분획물이 다른 용매 분획물보다 우수한 항산화 활성을 갖는 것으로 나타나 식품 산업적으로 천연 항산화제로서의 이용가능성을 확인할 수 있었다.

본 연구는 2021년도 교육부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업(NRF-2021R1F1A1060533)의 일환으로 수행하였음.