피부의 활성을 가진 식품 유래 성분에 관한 연구는 최근 더 안전한 제품을 찾는 소비자들의 선호가 증가하면서 관심이 증가하고 있다. DeFelice(1995)의 연구 등을 통해 처음 nutricosmetics가 언급되면서 식품 성분의 이점과 각 활성 성분이 인체의 노화 방지 및 피부를 보호하는 데 핵심 요소로 간주되고 있다. 기능성 식품 소재를 이용하여 항산화, 항염, 항노화 등의 활성을 가진 기능성 화장품 소재 연구가 확장되고 있다(Faria-silva 등, 2020). 특히 제주지역은 아열대성 기후로 망고, 바나나 등의 아열대 과수의 국내 주산지가 되고 있어 아열대 소재를 이용한 연구를 통해 기존 합성 소재를 대체할 기회로 작용되고 있다(Hyun과 Hyun, 2020).

망고(Mangifera indica L.)는 옻나무 과(Anacardiaceae)의 망고 속(Mangifera)에 속하는 다년생 열대 및 아열대 과수로 보편적으로 필리핀 등에서 수입하고 있는 노란색 망고의 품종인 카라바오 망고(Carabao mango)가 대표적인 망고 품종이다(Alwala 등, 2010). 국내에서 제주도를 중심으로 재배되고 있는 망고는 어윈(Irwin, Mangifera indica L. var. Irwin) 품종으로 과실 종경은 11.5~13 cm, 횡경은 8~9 cm로 난형이며 과피색은 사과와 비슷한 색깔을 띠고 있다(Lim 등, 2016). 그중 망고 씨앗은 내과피(29%), 속씨(68%), 외종피(3%)로 구성되어 있으며 속씨 내에 mangiferin, anthocyanins, kaempferol, quercetin 등의 폴리페놀 화합물과 플라보노이드계 화합물 등이 함유되어 있다(Oliver-Simancas 등, 2021; Mwaurah 등, 2020). 또한, 망고에는 다양한 생리활성 물질들이 포함되어 있어 항산화, 항염 및 항암 효과 등의 효능이 보고되고 있으며, 특히 애플망고(apple mango)라 불리는 어윈 품종은 테르펜류와 그 유도체의 주요 화합물 당도가 높고 강한 향기를 지니고 있다고 보고되었다(Tacias-Pascacio 등, 2022; An 등, 2015).

인체에 유해한 요소로 작용하는 활성산소종(reactive oxygen species)이 과도하게 생성되면 조직을 손상해 단백질 및 DNA 손상, 노화 촉진, 염증 등을 유도하기에 이를 조절하는 것은 세포 성장에 필수적이다(Quan과 Fisher, 2015; Han 등, 2021). 이런 활성산소종은 주로 자유라디칼로서 불안정할 때 나타나며 생체분자와 강한 산화반응을 통해 멜라닌 합성을 유도한다고 보고되었다(Kim, 2018). 멜라닌은 사람의 피부색을 결정하는 데 주요 인자로 단백질의 복합체 형태로 구성된 페놀계 고분자 물질이다(Costin과 Hearing, 2007). 자외선 등의 노출을 통해 멜라닌이 과도하게 생성되면 피부는 티로시나아제(tyrosinase) 효소가 멜라노사이트 안에 있는 단백질인 티로신(tyrosine)을 산화시켜 멜라닌을 생성해 피부 내 색소침착이 일어난다(An 등, 2020; Burger 등, 2016). 이로 인해 피부에 주름과 광노화를 촉진해 피부염증을 유발하고 더 나아가 피부암을 일으키는 요인으로 작용하게 된다(Thiyagarasaiyar 등, 2020). 이런 과도한 활성산소종의 축적을 억제하기 위해 외부로부터 항산화제의 필요성이 대두되고 있으며, 멜라닌 생성억제 효능을 가진 소재 개발을 통해 미백 관련 기능성 화장품 소재로 활용하기 위한 자료가 요구되고 있다.

따라서 본 연구에서는 제주지역 내 어윈 품종 망고의 속씨를 이용하여 에탄올 추출물을 제조하였고, 기능성 소재로 활용하기 위해 항산화 및 멜라닌 생성 저해 효능을 평가하였으며 인체 피부일차자극시험을 통해 화장품 소재로서의 활용 가능성을 평가하였다.

제주 망고 속씨 추출물 제조

제주 망고 속씨 추출물을 제조하기 위해 사용된 제주 망고 씨는 제주영농조합법인에서 구입 후 사용하였다. 건조된 애플망고 씨의 속씨 부위를 분리하여 추출을 진행하였다. 시료를 파쇄한 후 70% 에탄올에 24시간 상온에서 교반기를 이용하여 에탄올 추출을 진행하였다. 추출 후 여과지(Whatman No. 2; Cytiva, Marlborough, MA, USA)를 이용하여 여과한 후 감압 농축(Rotary evaporator, EYELA, Tokyo, Japan)하여 용매를 제거하였다. 이후 동결 건조하여 얻은 추출물을 실험에 사용하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)은 Blois(1958)의 방법을 변형하여 측정하였다. 96-well immunoplate에 DPPH 60 μL와 농도별 추출물을 120 μL씩 넣고 혼합한 후 15분간 방치한 다음 microplate reader(SpectraMax^®, San Jose, CA, USA)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ABTS 라디칼 소거능 측정

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 라디칼 소거능은 Re 등(1999)의 방법을 변형하여 측정하였다. 7 mM ABTS 5 mL와 140 mM, K₂S₂O₈ 88 μL를 섞어 암실에 14~16시간 반응시켰다. 이를 에탄올과 1:88 비율로 섞어 734 nm에서 흡광도 값이 0.7±0.002가 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다. 시료 용액 150 μL와 ABTS solution 3 mL를 혼합하여 30초간 vortex 한 후 3분간 상온에서 반응시키고 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Tyrosinase 저해 활성 측정

Tyrosinase 저해 활성 측정은 Yagi 등(1987)의 방법을 변형하여 측정하였다. 반응구는 67 mM sodium phosphate buffer(pH 6.8) 80 μL에 10 mM L-DOPA(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 녹인 기질액 0.2 mL 및 시료 용액 0.1 mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase(110 U/mL, Sigma-Aldrich) 0.2 mL를 첨가하여 25°C에서 10분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475 nm에서 측정하였다. Tyrosinase 저해 활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타낸다.

세포배양

Murine melanoma인 B16F10은 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 분양받아 사용했으며, penicillin(100 IU/mL), streptomycin(100 μg/mL), 10% fetal bovine serum(FBS)을 함유하는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2를 포함하는 배양기(Thermo Scienticfic, Tewksbury, MA, USA)에서 배양하였다.

세포독성

96-well plate에 B16F10 세포를 1×10⁵ cells/well씩 분주한 후, 24시간 동안 세포가 plate에 잘 붙도록 37°C, 5% CO₂ 세포 배양기에 배양하였다. 24시간 후 배양액을 버리고 PBS로 세척한 다음 FBS를 포함하지 않은 DMEM 배지를 사용하여 세포를 기아 상태로 만들어 주었다. 배양 후 well에 2.5 mg/mL 농도로 제조된 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide(MTT) 용액 40 μL를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich) 150 μL를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 세포독성 측정은 시료 용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

멜라닌 생합성 저해능 측정

멜라닌 생성량 측정은 Hosoi 등(1985)의 방법을 변형하여 측정하였다. B16F10 세포를 100 mm tissue culture plate에 1×10⁶ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양해준 후, 자극제인 α-MSH를 1 μg/mL 농도로 2시간 처리하였다. 그 후 시료를 농도별로 희석하여 접종한 다음 24시간 동안 배양하였다. α-MSH는 단독 처리군 및 시료 구간에 처리하였으며, α-MSH를 처리하지 않은 구간은 무처리군으로 나타내었다. 배양이 완료된 plate를 PBS로 2회 세척해준 뒤, lysis buffer(67 mM sodium phosphatebuffer, 1% triton X-100, 0.1 mM phenylmethyl sulfonyfluoride) 80 µL를 첨가하고 pellet을 수집하여 13,000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 상층액을 수거한 후 bovine serum albumin kit을 이용해 단백질량을 측정하여 standard curve로 사용했으며, 원심분리 후 얻은 pellet에 10% DMSO가 포함된 1 N NaOH 용액을 첨가하여 용해시켰다. 용해가 완료된 후 90°C에서 1시간 반응시킨 용액을 ELISA reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

일차피부자극시험

본 시험에서 시험대상자 기준에 적합한 연구대상자 20~60세의 남성과 여성 30명 이상을 대상으로 IRB 심의 진행 후 수행하였다(HBABN01-211101-HR-SF0021-01). 시험 부위를 70% 에탄올로 소독한 후 patch test units(IQ Ultra^TM, Chemotechnique Diagnostics AB, Vellinge, Sweden)에 시험물질 20 μL를 적하 후 시험 부위에 부착하였다. 피부일차자극 기준은 PCPC 가이드라인에 따라 평가하였다(Table 1). 시험물질에 대한 피부 반응 결과를 공식에 따라 평균 반응도를 계산하였다(Table 2).

Table 1 . Guideline on grade for skin primary irritation test.

Grade	Criteria
0 (−)	No signs of inflammation, normal skin
0.5 (±)	Doubtful or slight reaction
1 (＋)	Slight erythema
2 (＋)	Moderate erythema with or without papules
3 (＋)	Moderate erythema with diffuse edema

Table 2 . Criteria for skin primary irritation.

Range of response	Criteria
0.00≤R<0.87	None to slight
0.87≤R<2.42	Mild
2.42≤R<3.44	Moderate
3.44≤R	Severe

Response=∑Grade×No. of responders4Maximum grade×nTotal subjects×100×12.

통계처리

본 실험에서 얻은 결괏값은 평균(mean)과 표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었다. 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 Student’s t-test로 비교하였으며 P-value가 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의한 것으로 평가하였다.

제주 망고 속씨 추출물의 항산화 효과

제주 망고 속씨 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 라디칼 소거 활성을 측정하였다. DPPH는 보라색을 띠는 수용성 자유라디칼로 항산화 물질과 반응하면 환원되어 탈색되는 원리를 이용하여 측정하며, ABTS는 양이온을 이용하여 734 nm의 높은 파장에서 최대의 흡광도를 가져 추출물 고유의 색소에 의한 영향이 최소한으로 작용하여 확인할 수 있다(Hyun 등, 2020; Lee와 Moon, 2019). 제주 망고 속씨를 이용하여 에탄올 추출물을 제조한 후 농도별로 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 50 μg/mL의 농도에서 약 92.02±0.05%의 활성을 확인하였다(Fig. 1A). 이는 대조군인 비타민 C(85.29±0.13%)의 활성보다 약 7% 이상 증가한 것을 확인하였다. 또한, ABTS 라디칼 소거 활성을 확인한 결과 최소 농도인 50 μg/mL에서부터 약 99.55±0.02%의 활성을 확인하였으며, 대조군과 비교했을 때 유사한 항산화 활성을 가진 것으로 확인하였다(Fig. 1B). Bai 등(2018)의 연구에서 식품 부산물인 망고 껍질에 존재하는 chlorogenic acid에 의해 항산화 활성을 가진 것으로 보고되었다. 비타민 C는 대표적인 수용성 항산화제로 산소가 활성산소와 반응하는 것을 방지하여 손상된 DNA 회복을 통해 피부 내 진피의 콜라겐 합성 및 탄력 유지 및 멜라닌 색소 침착을 억제하는 등의 피부 미백에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다(Kim, 2005). 본 연구에서 제주 망고 속씨 추출물의 우수한 항산화력을 확인했으며 비타민 C와 유사한 활성을 가진 것으로 확인되어 유용한 기능성 소재로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Fig 1. Antioxidant activities in Jeju mango kernel extracts (JMKE). (A) DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical scavenging activities from JMKE. (B) ABTS (2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) radical scavenging activities from JMKE. Vitamin C was used as positive control. The results were expressed as the mean±SD of data obtained from three independent experiments.

제주 망고 속씨 추출물의 tyrosinase 활성 억제

제주 망고 속씨 추출물의 멜라닌 생합성을 조절하는 효소인 tyrosinase의 직접적인 영향을 확인하기 위해 mushroom tyrosinase의 활성을 측정한 결과 저해 활성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 2). 비록 대조군인 비타민 C의 50 μg/mL의 농도와 비교했을 때는 효과가 높진 않았으나 최대 1,000 μg/mL의 농도에서 약 56.22±0.24%의 활성을 통해 효소에 의한 멜라닌 생성억제의 가능성을 확인하였다. Tyrosinase는 멜라닌 합성 메커니즘의 초기에 관여하는 촉매로써 멜라닌을 생합성 하기 위한 주 효소로 작용한다(Shin 등, 2017). 즉, 제주 망고 속씨 추출물이 tyrosinase 활성을 억제하는 것을 확인함으로써 멜라닌 활성에 관여하는 것을 유추할 수 있었다.

Fig 2. Effects of Mangifera indica L. seed extracts on mushroom tyrosinase activity. Purified tyrosinase was mixed with JMKE and incubated with 0.3 mg/mL L-tyrosine of 2 mg/mL L-DOPA for 30 min at 37°C. Results are mean±SD derived from three independent experiments. ^*P<0.05 indicates statistical significance. JMKE: Jeju mango kernel extracts.

제주 망고 속씨 추출물의 세포독성

제주 망고 속씨 추출물에 대한 세포독성을 확인하고자 B16F10 멜라닌 생성 세포에서 최대 1,000 μg/mL까지의 농도별로 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과 100 μg/mL 이하의 농도에서 약 90% 이상의 세포 생존율을 확인하였다(Fig. 3). 이에 본 실험에서 제주 망고 속씨 추출물은 100 μg/mL 이하의 범위인 5, 10, 50, 100 μg/mL의 농도에서 실험을 진행하였다.

Fig 3. Cytotoxicity on the effect of Mangifera indica L. seed extracts in mouse melanoma cell (B16F10). B16F10 cells was treated with JMKE in a dose-dependent manner. Samples were measured using ELISA at 650 nm. ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay. JMKE: Jeju mango kernel extracts.

제주 망고 속씨 추출물의 멜라닌 생성 억제

α-MSH 자극은 세포막 수용체에 반응하여 멜라닌 발현을 유도하고 색소 흑화 반응을 야기하는 것으로 보고되었다(D’Mello 등, 2016). 본 연구에서는 α-MSH에 의해 증가한 멜라닌 생성 세포에 제주 망고 속씨 추출물 처리하여 멜라닌 생합성 저해능을 측정하였다. 그 결과 제주 망고 속씨 추출물이 증가한 멜라닌을 농도 의존적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 최대 100 μg/mL 농도에서 약 26.08%의 저해능을 확인하였다(Fig. 4). Kulkarni과 Rathod(2018)는 망고 잎 추출물의 mangiferin 등의 물질을 통해 항산화 효과가 증가한다고 보고하였다. 또한, 망고 씨앗에 phenolic compound가 존재한다고 보고되고 있으며 항산화, 항염, 항균 등의 다양한 생리활성을 언급하였다(Tacias-Pascacio 등, 2022). 결국 제주 망고 속씨 추출물 내 항산화 효과로 인해 멜라닌 생성 저해 활성에 영향을 미치는 것으로 추측되며, 추출물 내 존재하는 phenolic compound의 영향에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Fig 4. Effects of Mangifera indica L. seed extracts on melanin contents in mouse melanoma cell (B16F10). Cells were treated with various concentrations (5∼100 μg/mL) of JMKE. Kojic acid was used as positive control. Each bar represents the mean±SD derived from three independent experiments. ^*P<0.05 indicates statistical significance. JMKE: Jeju mango kernel extracts, α-MSH: α-melanocyte stimulating hormone.

일차피부자극시험

제주 망고 속씨 추출물의 일차피부자극시험을 통해 기능성 소재로 활용 가능성을 확인하였다. 농도 100 μg/mL의 추출물을 24시간 patch test 첩포한 다음, 첩포 제거 후 30분, 24시간 경과 후 각각 평가를 진행하였다(Table 3). 총 30명의 피험자를 대상으로 제주 망고 속씨 추출물의 자극을 확인한 결과 자극반응이 관찰되지 않았다. 따라서 본 연구에 사용된 추출물은 저자극 범위의 물질로 판단되었다.

Table 3 . Results of human skin primary irritation test of JMKE (n=30).

Sample	No. of responder	30 min after removing patch				24 h after removing patch				Reaction grade
		0.5 (±)	1 (+)	2 (+)	3 (+)	0.5 (±)	1 (+)	2 (+)	3 (+)
JMKE	0	－	－	－	－	－	－	－	－	0.0

JMKE: Jeju mango kernel extracts.

본 연구에서는 제주 망고 어윈(Mangifera indica L. var. Irwin) 품종의 씨앗 안에 있는 속씨를 이용하여 에탄올 추출물을 제조하였고, 기능성 소재로 활용하기 위해 항산화 및 미백 효능을 확인하였다. 추출물의 라디칼 소거능을 확인한 결과, DPPH 라디칼 소거능은 50 μg/mL의 농도에서 약 92.02±0.05%의 소거능을 확인하였으며, ABTS 소거 활성은 최소 농도인 50 μg/mL에서부터 약 99.55±0.02%의 활성을 통해 항산화 효능을 확인하였다. 제주 망고 속씨 추출물의 미백 활성을 확인하고자 mushroom tyrosinase 활성을 확인한 결과 농도 의존적으로 저해 활성이 증가하였으며, 멜라닌 생성 세포에서도 세포독성이 없는 최대 농도 100 μg/mL에서 약 26.08%의 저해능을 확인하였다. 또한, 일차피부자극시험을 통해 저자극 물질임을 확인하여 본 연구에서 사용된 제주 망고 속씨 추출물이 미백 관련 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성을 확인하였다.