오랫동안 완벽히 정복하지 못한 질병인 암을 치료하는 데 가장 널리 사용되는 방법은 화학 항암치료 요법이다(Cho, 2007). 화학 항암제 중 하나인 cisplatin은 1845년 Peyrone에 의해 합성된 백금 화합물로, 고환암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 폐암 등의 치료에 효과적이다(Rybak과 Whitworth, 2005). Cisplatin은 DNA와 결합해 DNA의 복제 및 전사를 차단하거나 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하여 p38 매개 MAPK 경로를 통해 암세포를 사멸하는 두 가지의 작용기전을 가지고 있다(Bragado 등, 2007; Prestayko 등, 1979; Wu 등, 2005). 암세포 사멸에 효과적인 cisplatin이지만 처리 시 약물 내성, 알레르기 반응, 위장 장애, 강한 독성과 암세포에 대한 비선택성으로 인한 면역세포 사멸 같은 부작용이 나타날 수 있다(Dasari와 Tchounwou, 2014; Byun 등, 2021). 또한, cisplatin이 신장으로 배설되면 주위 혈관으로부터 염증세포인 호중구를 유도하여 자극하며 이 과정에서 분비되는 ROS가 신장의 근위세뇨관에 독성을 나타낼 수 있다(Kim 등, 2003). 이때 cisplatin에 의해 유도되는 ROS 생성이 주변 정상조직의 세포에 독성을 유도하는 주요 원인으로 알려져 있다(Marullo 등, 2013).

외부 인자에 대한 생체방어반응인 면역반응에서 중요한 세포 중 하나인 대식세포(macrophage)는 외부 항원을 포식하고, 면역조절 인자를 분비하여 살균 활성을 향상시킨다. 또한, 호중구, 호산구 및 호염기구를 모집하여 자연살해세포, 수지상세포 등의 활성화를 통해 선천 면역의 활성을 유도하며, 외부 항원을 인식한 후 T세포에 전달하여 세포의 활성화와 분화를 조절함으로써 적응 면역의 활성에도 기여하는 것으로 알려져 있다(Munegowda 등, 2012; Kim 등, 2018). 또한, 대식세포는 신체 조직 전체에 전략적으로 위치하며 이물질, 죽은 세포를 섭취하고 처리함으로써 건강한 조직을 유지하는 중요한 세포다(Murray와 Wynn, 2011). 정상조직의 항상성을 성공적으로 유지하기 위해서는 세포사멸 과정이 필요하지만, 세포사멸 조절의 이상은 암, 자가면역, 퇴행성 질환과 같은 다양한 질병의 원인이 될 수 있어(Danial과 Korsmeyer, 2004; Kerr 등, 1972) 정상조직을 비정상적인 사멸로부터 보호하는 물질에 관한 연구는 꾸준히 진행되어왔다.

곤충은 일반적으로 단백질과 지방이 풍부하고 비타민과 미네랄의 중요한 공급원이 될 수 있어 식품 및 사료에서 대체 단백질 공급원으로 떠오르고 있으며, 일부 곤충의 경우 민간요법으로 사용되어 왔기 때문에 생리활성을 가진 곤충에 관한 연구의 필요성은 계속해서 제기되어 왔다(Rumpold와 Schlüter, 2013; Lee 등, 2015). 풍부한 영양소를 함유한 식용곤충이 양질의 단백질 보충이 필요한 환자들에게 영양식으로써 회복에 도움을 준다는 연구가 발표되었으며(Kim 등, 2016), 더 나아가 쌍별귀뚜라미(Gryllus bimaculatus)추출물의 급성 알코올 노출에 의한 쥐의 간 손상에 대한 보호 효과(Hwang 등, 2019)나 흰점박이꽃무지 유충 물 추출물의 trimethyltin 유발 발작 및 해마 신경 변성을 개선하는 효과(Lee 등, 2021), 흰점박이꽃무지 추출물의 사염화탄소에 의해 유발된 간독성에 대한 간 보호 효과(Chon 등, 2012), 메뚜기 추출물의 H2O2로 유도된 세포독성에 대한 보호 효과(Park 등, 2006) 등 식용곤충의 독성 완화 효과에 대한 연구개발이 활발히 이루어지고 있다.

딱정벌레목 꽃무지과 곤충인 흰점박이꽃무지(Protaetia brevitarsis seulensis) 유충의 경우 2014년에 식품의약품안전처로부터 식용곤충으로 인정됨에 따라(Kwon 등, 2013), 항산화 활성 효과(Lee 등, 2017), 면역 활성 효과(Yoo 등, 2022), LPS로 자극한 세포에서의 항염증 효과(Myung 등, 2020)와 같이 흰점박이꽃무지 유충을 기능성 식품의 원료로 활용하기 위한 다양한 연구들이 진행되고 있다.

따라서 본 연구에서는 흰점박이꽃무지 유충 열수 추출물(P. brevitarsis seulensis larvae hot-water extract, PLW)이 cisplatin에 의해 유도되는 면역세포의 독성을 완화하는 항암 보조제로 이용될 수 있는지를 평가하기 위하여 대식세포주 RAW264.7 세포를 이용하여 세포 보호 효능을 알아보고자 하였다.

PLW 추출

본 연구에 사용한 흰점박이꽃무지 유충은 (주)퓨처푸드랩(Busan, Korea)에서 2021년 4월에 구매하였고, 추출 조건은 Lee 등(2021)이 발표한 흰점박이꽃무지 유충 물 추출물의 조건을 참고하였다. 흰점박이꽃무지 유충을 실험실용 분쇄기(NSG-1002SS, Hanil, Seoul, Korea)로 분쇄하여 얻은 분말 30 g에 증류수 600 mL를 가하여 70°C에서 3시간 동안 500 rpm에서 열수 추출하였다. 추출물을 filter paper(No. 4, Whatman, Kent, UK)로 여과한 후 원심분리(2,250×g, 20 min)하여 상등액을 획득하였다. 상등액을 회전증발 농축기로 농축한 후 동결 건조하여 본 실험에서 사용하였다.

대식세포 배양

본 연구에 사용한 마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포 배양을 위한 배지는 10% fetal bovine serum(Gibco, Carlsbad, CA, USA), 1% antibiotics(100 unit/mL penicillin and 100 unit/mL streptomycin)가 포함된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640 배지(Life Technology, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였고, 37°C, 5% CO₂ incubator(Thermo, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다.

대식세포 생존율 평가

PLW와 cisplatin이 RAW264.7 대식세포 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 96-well plate에 1×10⁴ cells/well의 농도로 RAW264.7 세포를 분주한 후 37°C, 5% CO₂ incubator에서 15시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착하였다. PLW를 농도별(50, 100 및 200 μg/mL)로 처리하고 4시간 후에 cisplatin을 15 μM 처리한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 5 mg/mL의 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 용액을 well당 20 μL를 첨가하여 2시간 동안 반응시키고, formazan을 녹이기 위해서 dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co.)를 100 μL씩 첨가하였다. Microplate reader(BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였고, control의 흡광도 값을 기준으로 세포 생존율을 확인하였다.

세포독성 평가

PLW와 cisplatin이 대식세포의 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위해 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD Biosciences, San Diego, CA, USA)을 사용하여 Annexin V/PI staining analysis를 진행하였다. PLW 및 cisplatin을 처리한 RAW264.7 세포를 phosphate-buffered saline(PBS)으로 세척한 후 Annexin V binding buffer(1,000 μL)를 이용하여 1×10⁶ cells/mL 농도로 현탁했다. 이 용액에서 1×10⁵ cells(100 μL)의 세포를 채취한 뒤 Annexin V-FITC(5 μL)와 PI-PE(5 μL)를 첨가하고 20분 동안 상온에서 염색하였다. 염색된 혼합액에 400 μL Annexin V binding buffer를 첨가한 후 flow cytometer(BD FACSVerse, Becton, Dickinson and Company, East Rutherford, NJ, USA) 분석을 실시하였다. 분석 후에 나온 데이터는 FlowJo software(V10, Tree Star, Ashland, OR, USA)를 사용해 평가하였다.

Western blot

RAW264.7 세포를 6-well plate에 1×10⁶ cells/well의 농도로 분주하여 15시간 동안 완전히 부착시키고, 100, 200 μg/mL 농도의 PLW와 15 μM 농도의 cisplatin을 처리한 후 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 배양이 끝난 세포를 수집하여 PBS로 2회 세척한 후 NP40 cell lysis buffer(Life Technology)를 첨가한 다음 16,000×g(15 min)에서 원심분리하여 cell lysate를 분리하였다. 분리된 cell lysate는 BCA protein detection kit(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)을 사용하여 정량하였고, well당 10 μg의 cell lysate를 10% SDS-polyacrylamide gel에 각각 loading 하여 변성 분리하였다. 분리 후 이를 polyvinylidene difluoride membrane(Millipore Merck KGaA, Darmstadt, Germany)으로 transfer 하였고, blocking solution(5% skim milk) 20 mL에서 1시간 상온 방치하였다. TBST(20 nM tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.5)로 10분씩 3회 세척한 후 cleaved-caspase 3, Bax 및 β-actin의 발현량을 측정하기 위해 1차 항체(Cell Signaling, Danvers, MN, USA)를 1:2,000으로 희석하여 4°C에서 15시간 동안 반응시키고, TBST로 10분간 3회 세척하였다. 이후 2차 항체(goat-anti rabbit lgG, Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 1:4,000으로 희석하여 1시간 동안 반응시키고, 현상을 위하여 electrochemiluminescence(Millipore Merck KGaA) 시약을 사용해 인화하였다.

ROS 측정

RAW264.7 세포 내 ROS는 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate(H₂DCFDA; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)로 세포를 염색하여 확인하였다. PLW 및 cisplatin을 처리하고 24시간이 지난 RAW264.7 세포에 10 μM H2DCFDA를 37°C에서 30분간 염색한 후 PBS로 세척한 다음 flow cytometer 분석을 실시하였다. 분석 후에 나온 데이터는 FlowJo software를 사용하여 평가하였다.

통계처리

실험에서 얻은 결과는 GraphPad Prism 8.0 프로그램(GraphPad Prism Software, San Diego, CA, USA)을 이용하여 일원배치 분산분석(one-way ANOVA test)으로 분석하였다. 시료 간의 유의성은 Tukey’s multiple comparisons test로 P<0.05, P<0.01, P<0.001 수준에서 비교하였다.

PLW의 대식세포 세포 생존율 및 세포독성 완화에 미치는 영향

PLW와 cisplatin이 대식세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7 세포에서 MTT assay를 진행하였다. PLW를 농도별(1, 10, 25, 50, 100, 200, 500 및 1,000 μg/mL)로 처리했을 때, 모든 농도에서 RAW264.7 세포에 세포독성이 나타나지 않은 것을 확인하였다(Fig. 1A). 이어서 cisplatin을 농도별(0.5, 1, 2.5, 5, 10, 15, 20 및 50 μM)로 처리했을 때, RAW 264.7 세포에서 농도 의존적으로 세포독성이 나타나는 것을 확인하였다(Fig. 1B). 15 μM 농도의 cisplatin 처리로 약 50%의 세포 생존율이 나타났기 때문에, 이후의 실험에서는 cisplatin의 농도를 15 μM로 고정하여 평가하였다. Cisplatin에 의한 대식세포 사멸을 PLW가 완화할 수 있는지를 확인하기 위해 RAW264.7 세포에 PLW를 농도별(50, 100 및 200 μg/mL)로 전처리한 후 화학 항암제인 cisplatin을 15 μM 농도로 처리하여 MTT assay를 통해 대식세포의 생존율을 평가하였다(Fig. 1C). 그 결과 50, 100 및 200 μg/mL의 농도에서 PLW가 cisplatin에 의한 세포독성을 유의적으로 완화하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, PLW의 cisplatin 유도 대식세포 세포사멸 완화 효과를 Annexin V/PI staining analysis를 통해 평가했을 때, 50, 100 및 200 μg/mL 농도로 PLW를 처리할 경우 cisplatin 처리에 의한 대식세포의 세포독성이 PLW에 의해 유의적으로 완화되었다(Fig. 2). 결론적으로 MTT assay와 Annexin V/PI staining analysis를 통해 확인한 결과, PLW는 cisplatin에 의한 대식세포의 세포사멸을 완화하는 효과를 가지고 있다.

Fig 1. Effect of PLW and cisplatin on cell viability in RAW264.7 cells. (A) PLW were treated at the concentration of 1, 10, 25, 50, 100, 200, 500, and 1,000 µg/mL. (B) Cisplatin were treated at the concentration of 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 15, 20, and 50 µM. (C) RAW264.7 cells were pretreated with PLW (50, 100, and 200 µg/mL) for 4 h and then treated with 15 µM cisplatin for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. The results are expressed as mean±standard deviation (n=3). Statistical analysis was performed using Tukey’s multiple comparisons test. **P<0.01, ***P<0.001 compared to control (CON) group. ^##P<0.01, ^###P<0.001 compared to cisplatin group. PLW, Protaetia brevitarsis seulensis larvae hot-water extract; Cisp, cisplatin; MTT, 3-(4,5-dimethyl- 2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide; n.s, not significant.

Fig 2. Inhibitory effect of PLW on cisplatin-induced cell apoptosis in RAW264.7 cell. PLW treatment decreases the Cisp-induced macrophage apoptosis. RAW264.7 cells were pretreated with PLW (50, 100, and 200 µg/mL) for 4 h and then treated with 15 µM cisplatin for 24 h. Cell death was determined using Annexin V/PI staining and detected by flow cytometry. The results are expressed as mean±standard deviation (n=3). Statistical analysis was performed using Tukey’s multiple comparisons test. ***P<0.001 compared to control (CON) group. ^#P<0.05, ^##P<0.01 compared to cisplatin group. PLW, Protaetia brevitarsis seulensis larvae hot-water extract; Cisp, cisplatin; PI, propidium iodide.

PLW의 ROS 생성에 미치는 영향

ROS는 세포 내에서 생성되며 세포 분화, 유전자 발현과 같은 생물학적 과정과 연관되어 있어 세포의 성장과 생존을 위해 ROS의 항상성을 유지하는 것은 중요하다(Kang, 2013). 하지만 ROS가 과다하게 생성되거나 ROS에 대한 세포 내 방어 기전에 문제가 생기면 염증과 노화 관련 변성 같은 세포 또는 조직의 손상이 나타날 수 있다(Kim과 Son, 2008). 따라서 본 연구에서는 PLW가 대식세포에서 cisplatin 처리로 생성된 ROS에 미치는 영향을 평가하였다. PLW를 50, 100 및 200 μg/mL의 농도로 전처리한 후 cisplatin을 15 μM 농도로 처리하였다. 24시간 뒤 세포에 H2DCFDA를 염색하여 RAW264.7 세포에서 생성된 ROS를 측정하였다(Fig. 3). 확인 결과, cisplatin 단독 처리군에서 ROS가 가장 높게 증가하였고, PLW 및 cisplatin 병용 처리군에서 ROS가 유의적으로 감소하였다. 이러한 결과는 PLW가 대식세포에서 cisplatin 처리에 의한 산화적 스트레스를 감소함으로써 대식세포를 보호한다는 것을 의미한다.

Fig 3. Inhibitory effect of PLW on cisplatin-induced ROS production in RAW264.7 cells. PLW (50, 100, and 200 μg/mL) was pretreated in RAW264.7 cells for 4 h and then treated with 15 μM cisplatin. After 24 h, the ROS level was measured by H₂DCFDA. The cells were analyzed via flow cytometry. The results are expressed as mean±standard deviation (n=3). Statistical analysis was performed using Tukey’s multiple comparisons test. ***P<0.001 compared to control (CON) group. ^#P<0.05 compared to cisplatin group. PLW, Protaetia brevitarsis seulensis larvae hot-water extract; Cisp, cisplatin; H2DCFDA, 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate.

PLW의 세포사멸 신호 활성에 미치는 영향

본 연구에서는 western blot analysis를 통해 PLW가 cisplatin의 caspase 의존 세포사멸에 미치는 영향을 확인하였다. RAW264.7 대식세포에 100, 200 μg/mL의 농도의 PLW를 처리하고 15 μM 농도의 cisplatin을 처리한 뒤, cleaved caspase-3, Bax의 발현량을 측정하였다(Fig. 4). 그 결과 cisplatin 단독 처리군에서 cleaved caspase-3와 Bax의 발현량이 높게 나타났지만, PLW와 cisplatin 병용 처리군에서는 cleaved caspase-3와 Bax의 발현량이 감소하는 경향을 보였다. PLW와 cisplatin의 병용 처리로 세포사멸 신호전달과 연관된 단백질 발현이 감소하는 것은 cisplatin에 의해 유도되는 caspase 의존 세포사멸을 PLW가 억제한다는 것을 의미하고, 이는 PLW가 대식세포 보호에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.

Fig 4. Effect of PLW on protein expression of cleaved caspase 3 and Bax activation in RAW264.7 cells. PLW protects RAW264.7 cells from cytotoxicity by cisplatin treatment. After pretreatment with PLW (100, 200 µg/mL) for 4 h, 15 μM cisplatin was treated on PLW-treated RAW264.7 cells. After 24 h, cells were lysed to extract proteins. Proteins in the cell lysate were evaluated via western blot. Protein expression of Bax and cleaved caspase-3 in cell lysate. β-Actin was used as the loading control for cytosolic fractions. The results are expressed as mean±standard deviation (n=3). Statistical analysis was performed using Tukey’s multiple comparisons test. *P<0.05, **P<0.01 compared to control (CON) group. PLW, Protaetia brevitarsis seulensis larvae hot-water extract; Cisp, cisplatin.

본 연구에서는 흰점박이꽃무지 유충 열수 추출물이 cisplatin 처리에 의한 대식세포 사멸을 완화하는 보호 효과를 가졌는지 평가하였다.

세포는 DNA 손상 세포독성, 돌연변이 등의 세포사멸과 관련된 지속적인 위협을 받고 있다(Norbury와 Hickson, 2001). 세포사멸 중 apoptosis의 신호전달은 세포 내외에서 개시되는 여러 개의 독립적인 경로를 통해 발생하는데, 아스파르트산 잔기에서 단백질을 절단하는 caspase라고 불리는 시스테인 프로테아제 계열에 의해 활성화되는 것이 일반적인 시스템이다(Strasser 등, 2000; Elmore, 2007). Caspase는 apoptosis 과정에서 매우 중요한 기전으로 알려져 있으며(Monack 등, 2001), 특히 caspase-3는 내인성 및 외인성 사멸 경로 모두에서 세포사멸을 위한 DNA 단편화에 필수적인 역할을 한다고 알려졌다(Porter와 Jänicke, 1999; O’Donovan 등, 2003; D’Amelio 등, 2010). 또한, Bcl-2 계열에 속한 Bax는 BH3-only 단백질 또는 p53에 의해 활성화되면 세포사멸 신호전달 경로의 활성화를 유도한다고 알려져 있다(Choi, 2007).

PLW와 cisplatin을 RAW264.7 세포에 처리한 결과, cisplatin에 의해 유도되는 세포사멸이 감소하였고, cisplatin에 의해 생성되는 ROS의 분비가 감소하였다. 또한 PLW와 cisplatin을 병용 처리한 뒤 RAW264.7 대식세포에서 단백질 발현량을 측정한 결과, 세포사멸과 연관된 단백질인 caspase-3와 Bax의 활성화가 cisplatin 단독 처리군보다 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 PLW가 cisplatin이 분비하는 ROS의 생성을 억제하여 대식세포의 세포사멸을 완화한다는 것을 나타낸다.

흰점박이꽃무지 물 추출물에서 분리된 주요 화합물(adenine, hypoxanthine, uridine, adenosine, inosine, benzoic acid) 중 inosine과 benzoic acid는 항산화 활성 효과가 있는 성분이고, 이러한 흰점박이꽃무지 물 추출물이 항산화 효과를 통해 해마 뉴런의 trimethyltin 유도 세포독성을 완화한 결과가 보고되었다(Lee 등, 2021). 또한, 감마선에 조사된 흰쥐에서 자유라디칼 및 활성산소 소거를 통한 방사선 방호 효과(Jeong 등, 2021)와 흰점박이꽃무지를 함유한 음료에서 H₂O₂ 처리로 증가한 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상을 억제하는 항산화 효과(Park 등, 2012)도 보고되었다.

이러한 선행연구를 바탕으로 곤충의 외부 외표피층에 존재하는 다가 페놀층(Boo, 2005)과 항산화 성분인 inosine과 benzoic acid 등이 흰점박이꽃무지 유충에 함유되어 있을 것으로 추측되며, 이로 인해 PLW에 항산화 작용을 통한 ROS 억제 효과가 있는 것으로 사료된다. 하지만 본 연구에서 사용한 흰점박이꽃무지 열수 추출물의 정확한 생리활성 성분을 규명할 수 없어 이에 관한 추가 연구가 필요하다.

본 연구에서는 흰점박이꽃무지 유충 열수 추출물(PLW)이 세포 보호 효과를 함유하는지를 ROS와 세포사멸 신호전달 활성 측정을 통해 연구하였다. 먼저 RAW264.7 대식세포에 PLW를 처리하고 cisplatin을 처리하여 PLW의 세포 보호 효과를 확인한 결과, PLW가 cisplatin 처리에 의한 세포독성을 완화하는 것을 관찰하였다. 또한, PLW가 cisplatin 처리에 의한 ROS의 생성을 감소시키며, 세포사멸과 관련이 있는 cleaved caspase-3와 Bax의 활성을 억제하는 효과가 있다는 것을 확인하였다. 결론적으로 PLW는 화학 항암제인 cisplatin으로 인한 ROS를 감소시키고 caspase 활성을 억제함으로써 대식세포인 RAW264.7 세포를 보호하는 효과를 나타낸다. 이러한 결과는 흰점박이꽃무지 유충 열수 추출물을 화학 항암요법의 면역세포 부작용 완화를 위한 보조제로 개발하기 위한 기초자료로 활용될 가능성을 보여준다.

본 연구는 2022년도 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기본연구사업(No. NRF-2022R1F1A1063850)으로 수행되었으며, 그 지원에 감사드립니다.