고령화 및 건강지향의 열풍으로 천연물은 식의약품, 한방화장품, 향료 및 색소 등 다양한 용도의 산업 소재로 이용되고 있으며 관련 산업이 급성장하고 있다. 하지만 대부분의 소재가 값싼 중국산을 사용하고 있어 국내 천연물 자원을 활용한 소재 개발 등이 시급한 과제로 대두되고 있다(Park과 Park, 2009).

청가시덩굴(Smilax sieboldii)은 백합과(Liliaceae) 청미래덩굴속(Smilax)에 속하는 낙엽 덩굴성 목본으로 국내에 분포하는 청미래덩굴속 식물은 밀나물(S. riparia), 선밀나물(S. nipponica), 청미래덩굴(S. china)이 자생하며, 종 수준 이하로는 민청가시덩굴(S. sieboldii var. inermis), 좁은잎밀나물(S. riparia var. ussuriensis f. stenophylla)을 구분하기도 한다. 청가시덩굴은 예로부터 한의학에서 청가시덩굴의 뿌리와 줄기는 철사영선(鐵絲靈仙)이라는 생약명으로 사용하였으며, 풍사와 습사가 체내에 머물러 있다가 통증이 옮겨 다니는 증상 및 류마티스성 관절염에 이용하였다(Ahn, 1998).

청가시덩굴에서 분리된 성분으로는 spirostanol glycosides(Woo 등, 1992), steroidal saponins(Kubo 등, 1992)이 있고, 같은 속의 청미래덩굴에서는 flavanoid glycosides(Li 등, 2007), polysaccarides(Zhang 등, 2019), stilbenes, flavonoids(Shao 등, 2007b)가 보고되었으며, 이들 화합물 중 청가시덩굴에 함유된 steroideal saponins은 항염, 항균, 항바이러스 등이 보고된 바 있다(Sparg 등, 2004; Shao 등, 2007a). 특히 함유된 성분 중 resveratrol(Lagouge 등, 2006; Kim 등, 2011; Cho 등, 2012; Brasnyó 등, 2011; Bhatt 등, 2012)과 trans-scirpusin A(Majeed 등, 2022)는 항비만 활성을 나타내는 화합물로 보고되어있다.

따라서 본 연구에서는 청가시덩굴 추출물을 활용한 이상지질혈증 건강기능식품 원료로 개발하기 위해 활성 성분인 resveratrol과 trans-scirpusin A를 지표성분으로 선정하고, 원료 또는 제품의 지속적인 품질관리를 위한 HPLC 분석법 확립을 위해 validation을 실시하였다.

재료 및 시약

본 실험에 사용한 청가시덩굴 추출물은 2021년 6월 경기도 연천군 일대에서 채집한 전초를 채취하여 분쇄한 후 70% 에탄올을 이용해 상온에서 48시간 동안 침지하여 2회 추출하였다. 추출물은 여과 및 감압 농축한 후 동결 건조하여 분말로 제조한 것을 사용하였다. 표준물질은 resveratrol(Sigma-Aldrich Co., Ltd., St. Louis, MO, USA)과 trans-scirpusin A(Nagara Science Co., Ltd., Gifu, Japan)(Fig. 1)를 사용하였고 0.05% trifluoroacetic acid, acetonitrile 및 메탄올 등의 용매와 시약은 HPLC grade로 Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd.(Siheung, Korea)와 Burdick&Jackson Laboratories, Inc.(Muskegon, MI, USA)에서 구입하여 사용하였다.

Fig 1. Chemical structures of (A) resveratrol and (B) trans-scirpusin A.

시료 조제

Resveratrol 표준물질 25 mg과 trans-scirpusin A 표준물질 10 mg을 정밀하게 취하여 메탄올 50 mL에 용해하여 500 μg/mL와 200 μg/mL의 표준원액(stock solution)을 조제한 후 메탄올로 희석하여 10~100 μg/mL와 4~40 μg/mL 범위의 표준용액(working solution)을 조제하고 이를 HPLC로 분석하여 표준검량선을 작성하였다. 청가시덩굴 추출물은 메탄올을 가하여 30분 동안 초음파 추출한 다음 0.45 μm RC membrane syringe filter(Sartorius, Goettingen, Germany)로 여과한 것을 시험용액으로 사용하였다.

HPLC 분석

Resveratrol과 trans-scirpusin A를 분리 분석하기 위해 다중파장 검출기(photodiode array detector, PDA)가 장착된 HPLC 1100 및 HPLC 1200(Agilent Technolgies, Palo Alto, CA, USA) 시스템을 사용하였다. 분석에 사용된 컬럼은 Kromasil C₁₈(4.6×250 mm, 5 μm, Eka Chemicals, Bohus, Sweden)을 사용하였고, 이동상은 0.05% trifluoroacetic acid가 포함된 증류수(A)와 acetonitrile(B)을 사용하여 1 mL/min의 유량으로 하고 컬럼온도는 25°C를 유지하였다. 검출파장은 320 nm로 설정하였으며 기울기 용리 방법(gradient elution mode)으로 시료 10 μL를 주입하여 Table 1과 같은 조건으로 분석하였다.

Table 1 . HPLC conditions for the quantitative analysis of resveratrol and trans-scirpusin A.

Items	Conditions
Instrument	HPLC 1100 & 1200 series
	(Agilent Technolgies)
Mobile phase	A: Water (0.05% trifluoroacetic acid)
	B: Acetonitrile
	Gradient	Time (min)	% A	% B
		0	78	22
		25	78	22
		40	72	28
		50	71	29
		51	0	100
		60	0	100
	Post time: 10 min
Column	Kromasil 100-5-C18 (4.6×250 mm, 5 μm)
Column temperature	25°C
Flow rate	1.0 mL/min
Injection volume	10 μL
Detector	320 nm

분석법 검증

분석법의 유효성 검증(method validation)은 ‘건강기능식품 기능성 원료 인정을 위한 제출자료 작성 가이드(NIFDS, 2021)’를 근거로 하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정밀도(precision), 정확도(accuracy)를 조사하고 직선성 검증으로 구한 기울기(slope)와 표준편차(standard deviation)를 통해 검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantitation, LOQ)를 산출하였다. 이를 바탕으로 청가시덩굴 추출물 중 지표성분인 resveratrol과 trans-scirpusin A의 분석법 검증을 시행하였다.

특이성:특이성은 불순물, 분해물, 배합성분 등이 혼재된 상태에서 분석대상물질을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력을 말하는 것으로 다른 물질과의 간섭 없이 표준용액과 시험용액을 HPLC로 분리하여 peak의 선택적 분리 여부 및 peak 간 간섭 정도 등을 확인하였으며, PDA에 의한 UV spectrum을 비교 분석하였다.

직선성:직선성은 분석대상물질의 농도에 대해 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력을 말하는 것으로 농도별로 조제된 표준용액에 대해 HPLC로 3회 반복 측정한 후 검출성분의 peak 면적과 각 조제 농도 간의 검량선을 작성하여 기울기, y-절편(y-intercept) 및 상관계수(correlation coefficient, R²)를 통해 직선성을 확인하였다.

정밀도: 정밀도는 균질한 검체를 여러 번 채취하여 정해진 조건에 따라 측정하였을 때 각각의 측정값들 사이의 근접성(분산 정도)을 의미하는 것으로, 일정 농도로 조제한 시험용액에 대해 HPLC로 5회 반복 측정하여 재현성(repeatability)을 확인하였다. 실험실 내 정밀성(intermediate precision)은 일내(intra-day) 및 일간(inter-day) 정밀성으로 3일간 반복하여 측정하고 그에 대한 상대표준편차(relative standard deviation, RSD%)로 정밀도를 판단하였다.

정확도: 정확도는 이미 알고 있는 분석값에 근접한 정도를 의미하며, 직선성에 의해 구해진 기지 농도를 산출한 다음 50, 100, 150% 농도에 해당하는 표준용액을 시험용액에 첨가하여 HPLC로 농도별 5회 반복 측정한 후 각 검액에 첨가된 실측값과 이론값에 대한 회수율(recovery %)을 구하여 정확도를 확인하였다.

검출한계 및 정량한계: 검출한계는 시료 중에 존재하는 분석대상 성분(analyte)의 검출 가능한 최소량 또는 최저농도를 뜻하고 정량한계는 정밀도와 정확도를 담보하는 분석대상 성분의 정량 가능한 최소량 또는 최저농도를 의미한다. 검출한계와 정량한계는 직선성을 통해 산출된 검량선의 기울기와 y-절편의 표준편차에 근거하는 방법으로 다음 식을 이용하여 계산하였다.

$$LOD=\frac{3.3\times \sigma }{S}LOQ=\frac{10\times \sigma }{S}$$

σ: the standard deviation of the response

S: the slope of the calibration curve

분석조건의 확립

청가시덩굴 추출물의 확인을 위한 지표성분인 resveratrol과 trans-scirpusin A에 대한 분석법 확립을 위해 HPLC 분석에 필요한 컬럼, 이동상의 조성 및 UV 검출파장을 최적화하고 이에 대한 분석법 검증을 실시하였다.

특이성 확인

본 연구에서 기확립된 HPLC 조건으로 표준용액과 청가시덩굴 추출물의 시험용액 크로마토그램을 비교하여 peak 분리 여부를 확인한 결과, 다른 성분과 명확하게 분리되어 다른 물질과의 간섭 없이 단일 peak로 검출되었고 표준용액의 피크 유지시간(retention time, RT)과 시험용액의 피크 RT가 resveratrol 24.1분대, trans-scirpusin A 40.4분대로 일치하였으며, 전처리 용매인 메탄올의 바탕용액(blank solution)과 비교 시 용매 peak에 대한 간섭 영향도 없는 것을 확인하였다(Fig. 2). 또한 표준용액과 청가시덩굴 추출 물의 시험용액의 HPLC 분석 결과인 PDA spectrum에서도 200~400 nm 범위에서 동일한 spectrum을 나타내는 것을 확인하였다(Fig. 3). 이러한 결과를 토대로 본 시험법은 특이성이 있음을 확인하였다.

Fig 2. HPLC chromatograms of (A) blank (MeOH), (B) standard solution, and (C) S. sieboldii extract.

Fig 3. Photo diode array spectrums of (A) resveratrol standard solution, (B) trans-scirpusin A standard solution, (C) resveratrol in S. sieboldii extract, and (D) trans-scirpusin A in S. sieboldii extract.

직선성 확인

시험방법이 일정 농도 범위에 있는 검체 중 분석대상물질의 양(또는 농도)에 대하여 직선적인 측정값에 대한 확보 여부를 확인하기 위해 resveratrol과 trans-scirpusin A 표준용액 각각의 농도 대비 크로마토그램의 peak 면적을 변수로 검량선을 작성하고 검량선의 상관계수(R²)를 통해 직선성을 확인하였다. 10.08, 20.16, 30.24, 40.32, 50.40, 100.80 μg/mL resveratrol 표준용액과 3.96, 7.91, 11.87, 15.82, 19.78, 39.56 μg/mL trans-scirpusin A 표준용액을 조제하여 3회 반복으로 HPLC를 분석하여 resveratrol과 trans-scirpusin A의 검량선을 작성하였다(Fig. 4). 검량선의 상관계수(R²)는 resveratrol과 trans-scirpusin A 모두 0.9999로 매우 우수한 직선성을 나타내었다.

Fig 4. Calibration curves of (A) resveratrol standard solution and (B) trans-scirpusin A standard solution.

정밀도 확인

반복성: 반복성은 균질한 검체부터 다수의 시료를 취해 동일 실험자, 장치와 실험조건 등의 시험환경에서 반복적으로 시험을 할 때 각 시험 결과의 일치 정도를 나타내는 것으로 청가시덩굴 추출물 2.2, 4.4 및 6.6 mg/mL로 3개 농도를 조제하여 동일 HPLC 조건으로 5회 반복 분석하고 RSD는 함량을 고려하여 3%를 기준으로 하였다(AOAC, 2002). RSD는 resveratrol 0.99~1.22%, trans-scirpusin A 1.12~1.32%로 나타나 RSD 3% 이하로서 반복성이 있음을 확인하였다(Table 2).

Table 2 . Repeatability of analytical method for resveratrol and trans-scirpusin A in Smilax sieboldii extract.

Sample concentration (mg/mL)	Resveratrol		trans-Scirpusin A
	Mean±SD	RSD2) (%)	Mean±SD	RSD (%)
2.2	6.91±0.071)	0.99	2.74±0.04	1.32
4.4	6.90±0.08	1.2	2.71±0.03	1.12
6.6	6.92±0.09	1.22	2.72±0.03	1.13

¹⁾Values are mean±SD (standard deviation) in quintuplicate (n=5)..

²⁾Relative standard deviation.

실험실 내 정밀성: 동일 실험실 내에서 각각 서로 다른 실험일, 시험자, 기구 또는 장비 등을 이용하여 분석 실험하여 얻은 측정값들 사이의 근접성을 확인하는 것으로 본 연구에서는 실험일을 변동요인으로 실험실 내 정밀성을 확인하였다. 반복성 확인과 동일한 조건의 시험용액에 대해 일내 및 일간 정밀성으로 구분하여 3일간 반복하여 HPLC로 분석한 결과, 일내 정밀성은 resveratrol 0.67~0.87%, trans-scirpusin A 1.18~1.33%로 나타났고 일간 정밀성은 resveratrol 0.93~1.22%, trans-scirpusin A 1.33~2.27%로 확인되었다(Table 3).

Table 3 . Intermediate precision of analytical method for resveratrol and trans-scirpusin A in S. sieboldii extract.

	Concentration (mg/mL)	Resveratrol		trans-Scirpusin A
		Mean±SD	RSD2) (%)	Mean±SD	RSD (%)
Intra-day	2.2	6.87±0.061)	0.87	2.64±0.04	1.33
	4.4	7.01±0.05	0.67	2.67±0.03	1.18
	6.6	7.00±0.05	0.73	2.66±0.03	1.22
Inter-day	2.2	6.89±0.06	0.93	2.69±0.06	2.27
	4.4	6.96±0.09	1.22	2.69±0.04	1.33
	6.6	6.96±0.08	1.09	2.69±0.04	1.57

¹⁾Values are mean±SD (standard deviation) in quintuplicate (n=5)..

²⁾Relative standard deviation..

회수율을 이용한 정확도 확인

정확도는 측정값이 이미 알고 있는 분석값에 근접한 정도를 뜻하는 것으로 시료에 표준용액을 넣은 후 분석에 의해 회수되는 회수율을 측정한 것이다. 청가시덩굴 추출물을 기준농도의 50, 100, 150%에 해당하는 표준용액을 첨가하여 회수율 시험용액을 조제하고 HPLC를 이용하여 농도별로 5회 반복 분석하고 회수율은 기준농도를 고려하여 90~108%를 기준으로 하였다(AOAC, 2002). 회수율 시험용액에 대한 표준값을 산출하고 동일 전처리 및 HPLC로 분석한 결괏값을 이용하여 회수율을 계산하였다(Table 4). 각 시험용액에 대한 3개 농도의 resveratrol 회수율은 98.77~99.24%, trans-scirpusin A의 회수율은 98.45~99.45%로 각각 확인하였으며, 본 시험법의 정확도를 확보하였다.

Table 4 . Recovery of analytical method for resveratrol and trans-scirpusin A in S. sieboldii extract.

Analyte	Level	Concentration of the standard sample (μg/mL)		Recovery (%)
		Added	Recovered	Mean±SD
Resveratrol	Low (50%)	15.12	14.93±0.111)	98.77±0.73
	Medium (100%)	30.24	29.90±0.25	98.89±0.83
	High (150%)	45.36	45.02±0.67	99.24±1.47
trans-scirpusin A	Low (50%)	5.93	5.84±0.07	98.45±1.18
	Medium (100%)	11.87	11.74±0.11	98.93±0.96
	High (150%)	17.8	17.70±0.30	99.45±1.66

¹⁾Values are recovered & mean±SD (standard deviation) in quintuplicate (n=5)..

검출한계 및 정량한계 확인

검출한계는 균질화된 검체 중 존재하는 분석대상물질의 최소한의 검출 가능한 양을 뜻하며, 정량한계는 적절한 정밀 성과 정확성을 가진 검체 중 정량값으로 표현할 수 있는 분석대상물질의 최소량을 나타낸다. 직선성 확인 표준용액 3그룹을 HPLC로 분석하고, 그 결과로 검량선을 작성하여 검량선의 기울기와 y-절편을 산출하고 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법(standard deviation of the response of y-intercepts and the slope)으로 검출한계와 정량한계를 계산하였다(Table 5). 직선상의 검출한계는 resveratrol 0.98 μg/mL, trans-scirpusin A 0.49 μg/mL였으며 정량한계는 resveratrol 2.98 μg/mL, trans-scirpusin A 1.48 μg/mL로 나타났다.

Table 5 . Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of resveratrol and trans-scirpusin A.

Analyte	Concentration range (μg/mL)	S1)	σ2)	LOD (μg/mL)	LOQ (μg/mL)
Resveratrol	10.08∼100.80	71.58398	21.36479	0.98	2.98
trans-scirpusin A	3.96∼39.56	29.88381	4.4208	0.49	1.48

¹⁾The slope of the calibration curve..

²⁾The standard deviation of the response..

본 연구는 HPLC를 이용하여 청가시덩굴 추출물을 개별인정형 건강기능식품의 기능성 원료로 개발하기 위한 원료 표준화의 일환으로, 청가시덩굴 추출물의 지표성분을 resveratrol과 trans-scirpusin A로 설정하고 이에 대한 HPLC 분석법을 확립하여 유효성의 검증을 실시하였다. 분석법 유효성 검증은 특이성, 직선성, 정확도, 정밀도, 검출한계 및 정량한계 등을 통해 분석법의 신뢰성을 검증하였으며, 그 결과 표준용액과 청가시덩굴 추출물 간의 HPLC 크로마토그램 및 UV spectrum의 일치 여부 등의 비교를 통해 다른 물질과 간섭 없이 피크가 분리된 것으로 특이성을 확인하였다. 또한 표준용액 검량선의 상관계수(R²)는 0.9999로 매우 우수한 직선성으로 관찰되어 분석에 적합한 것으로 확인되었으며, 검량선의 기울기 및 표준편차를 이용한 검출한계는 resveratrol이 0.98 μg/mL, trans-scirpusin A는 0.49 μg/mL였고 정량한계는 resveratrol이 2.98 μg/mL, trans-scirpusin A는 1.48 μg/mL로 각각 확인되었다. 청가시덩굴 추출물에 표준물질을 3개 농도 첨가하고 분석한 회수율은 resveratrol이 98.77~99.24%, trans-scirpusin A는 98.45~99.45%로 나타나 정확성이 있는 것을 확인할 수 있었다. 청가시덩굴 추출물의 조제 농도 2.2, 4.4 및 6.6 mg/mL에서 반복성은 resveratrol이 0.99~1.22%, trans-scirpusin A는 1.12~1.32%를, 실험실 내 정밀성에서는 일내 정밀성은 resveratrol이 0.67~0.87%, trans-scirpusin A는 1.18~1.33%로 나타났고 일간 정밀성은 resveratrol이 0.93~1.22%, trans-scirpusin A는 1.33~2.27%로 확인되어 본 분석법은 정밀성이 있음을 확인할 수 있었다. 이상의 분석 결과를 통해 확립된 청가시덩굴 추출물의 지표성분인 resveratrol과 trans-scirpusin A의 HPLC 분석법은 적합한 시험법으로 검증되었으며, 본 시험법은 향후 청가시덩굴 추출물의 건강기능식품 기능성 원료 개발과 표준화를 위한 기초자료로 활용될 것으로 사료된다.

본 논문은 산림청(한국임업진흥원)　산림과학기술 연구개발사업(2021371C10-2223-BD02)의 지원에 의하여 이루어진 것입니다.