청국장(Cheonggukjang)은 콩을 원료로 단기간 발효하여 완성되는 영양학적으로 우수성이 뛰어난 발효식품이다. 탄수화물 위주의 우리나라 식단 구성에서 청국장은 부족하기 쉬운 단백질과 지방의 중요한 공급원으로, 제조과정에서 종균(starter)을 인위적으로 첨가하거나 볏짚과 함께 40~42°C에서 2~3일간 발효 시 Bacillus속 등의 미생물에 의해 제조된다(Choe 등, 1996).

청국장의 주요 생리활성 물질로는 항산화 물질, 식이섬유, 이소플라본류, 콩 올리고당, 사포닌 등이 포함되며, 청국장 섭취에 따른 건강상 효능에 관한 연구들이 다수 소개되었다. 예를 들면, 청국장은 혈압상승 억제 효과(Yang 등, 2003), 면역증강(Kwon 등, 2004), 항돌연변이(Hong 등, 1996), 항암 효과(Zheng 등, 2011), 항산화 효과(Hong 등, 1996), 혈전용해능(Kim 등, 2009; Kim과 Lee, 1995) 등의 효능이 있다고 보고되었다.

된장 발효와 달리 청국장 발효에서는 끈끈한 점성을 가진 실처럼 보이는 물질이 생성된다. 1766년 유중림이 저술한 증보산림경제에는 세척한 콩을 증자한 후 볏짚과 함께 따뜻한 방에 사흘간 두면 실이 만들어진다고 청국장 만드는 법을 기술하여 수백 년 전부터 청국장이 한국인의 주요 음식 소재임을 보여준다(Chung, 2018). 선행연구에 따르면 청국장 점질물은 과당 중합체인 레반(levan)과 γ-poly gamma glutamate(γ-PGA)의 혼합체로, 이들의 구성비율은 약 6:4(w/w)로 구성되어 있다(Jang 등, 2007; Lee와 Hahm, 2005; Son과 Lee, 2011).

청국장 점질물은 청국장 중량의 2~6%를 차지하는 주요 물질임에도 불구하고 섭취 시 건강상 효능에 관한 연구는 매우 미비한 실정이다(Lee 등, 1991; Yang과 Kim, 2013). Lee 등(1991)은 청국장 점질물의 질소화합물과 무기질 함량, 점도, pH에 따른 용해도, fibrinolytic activity 효능에 대한 분석을 실시하였다. Yang과 Kim(2013)은 청국장 점질물을 활용한 in vitro 실험에서 청국장 점질물이 glucose 및 bile acid 흡수지연 효과와 fibrinolytic activity 효능이 있음을 보고하였다. Youn 등(2001)은 청국장 점질물의 항미생물 활성에 관한 연구 결과를 보고하였다. 이와 같이 청국장 점질물에 대한 선행연구들은 매우 제한적으로 in vitro 분석연구에 집중되어 있고 in vivo 연구는 전무한 실정이다.

본 연구에서는 청국장 점질물의 기능성 평가 연구를 위하여 자체 제조한 청국장에서 청국장 점질물을 회수한 후 레반과 γ-PGA를 각각 분리하였다. 또한, 청국장에서 분리한 레반과 γ-PGA를 청국장에 존재하는 점질물의 비율로 혼합한 후 3T3-L1 전지방 세포주에 처리하여 지방세포 분화 억제 효과를 확인함으로써 청국장 점질물의 항비만 효능을 in vitro 시스템에서 구명하고자 하였다.

실험재료 및 시약

본 연구에 사용된 종균은 Bacillus subtilis NB-NUC1으로 NUC사(Daegu, Korea) 제품을 사용하였으며, 강원도 삼척에서 수확한 콩[Glycine max (L.) Merr.]의 품종은 태광을 사용하였다. 지방세포 분화 억제 효과를 위해 사용된 3T3-L1 전지방 세포주는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 분양받아 사용하였다. 세포의 분화를 위하여 fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin, DMEM 배지는 HyClone Laboratories Inc.(Logan, UT, USA)에서 구입하여 사용하였다. Bovine serum albumin(BSA), 인슐린(insulin), dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), 배양기, 3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), dimethyl sulfoxide(DMSO), Oil Red O 시약, 이소프로판올(isopropanol)은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. Western blot 단백질 분석 실험에 이용된 Tris-buffered saline과 Tween 20 detergent는 각각 T&I Co.(Gwangju, Korea), Bio-Rad Laboratories Inc.(Hercules, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 또한 단백질 분석의 1차 antibody는 peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ), CCAAT-enhancer-binding protein α(C/EBPα), sterol-regulatory element binding protein-1c(SREBP-1c), adipocyte protein 2(AP2), fatty acid synthase(FAS), stearoyl-CoA desaturase 1(SCD1), β-actin으로 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(Dallas, TX, USA)에서 구입하여 사용하였다.

청국장 발효 및 청국장 점질물 제조

원료인 콩에 3배의 물을 가하여 상온에서 24시간 침지시킨 후, 121°C에서 40분 동안 증자하였다. B. subtilis NB-NUC1을 tryptic soy broth(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 액체배지로 37°C에서 24시간 2회 계대배양한 후 대수기(log phase)에 해당하는 시기에 해당하는 균을 회수하여 종균으로 사용하였다. 상온으로 식힌 증자된 콩에 중량비 1% 수준의 액체 배양한 종균을 접종하여 40°C에서 72시간 동안 배양하였다. 제조한 청국장으로부터 점질물 회수과정은 Lee 등(1991)의 방법에 따라 다음과 같이 실시하였다. 제조한 청국장 100 g에 600 mL의 증류수를 가하여 1시간 동안 혼합하고(SI-4000R, Jeio Tech, Daejeon, Korea) 여과한 후 10,000×g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상징액을 회수하여 레반과 γ-PGA 분리에 사용하였다.

레반과 γ-PGA 추출

상층액 160 mL에 0.5 M sodium acetate buffer(pH 7.0) 40 mL를 혼합한 후 flavourzyme(Novozyme Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)을 0.2 mL 첨가하여 50°C에서 24시간 효소 반응하여 γ-PGA 분해를 유도하였다. 반응 후 10,000×g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 취하고 동결건조하여 레반 시료를 얻었다. 한편 상징액에서 γ-PGA를 추출하기 위해서는 상징액 160 mL에 oxalic acid를 가하여 최종농도 1%로 조정한 후 90°C에서 30분 동안 가열하여 레반의 산가수분해를 유도하였다. 산가수분해 후 0.5 N NaOH를 가하여 반응액을 pH 7로 조정한 후 3배의 에탄올을 가하여 침전된 γ-PGA를 회수하였다. 추출된 γ-PGA를 증류수에 재용해한 후 동결건조하여 최종 γ-PGA 시료를 얻었다. 본 연구에서 분석한 시료는 CVS, PL64로 다음과 같다. 청국장 점질물(Cheonggukjang viscous substance, CVS) 시료는 청국장 발효 후 추출한 점질물, PL64 시료는 CVS에서 γ-PGA와 레반을 분리한 후 이를 6:4의 비율로 혼합하여 사용하였다.

청국장 점질물의 분자량 측정

동결건조된 상태의 3종 시료인 CVS, 레반, γ-PGA 시료를 각각 2차 증류수에 용해시킨 후 여과막(0.45 μm, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)을 통과시켜 여액을 회수한 다음 high performance size exclusion chromatography(HPSEC) 장치에 장착된 컬럼에 주입하여 분자량을 측정하였고 표준물질로 BSA를 사용하였다. HPSEC 장치는 UV, multi-angle laser light scattering, refractive index detection system(HPSEC-UV-MALLS-RI) 검출장치가 구비되었다. 이외에도 HPSEC-UV-MALLS-RI system은 pump(model 321, Gilson, Middleton, WI, USA), injector valve with 100 μL sample loop, SEC columns(TSK G5000PW, G2500 PWX1, TosoBiosep, Mongomeryville, PA, USA)로 구성되었다. 이동상으로는 0.15 M NaNO₃와 0.02% NaN₃를 포함하는 증류수를 사용하였고 유량은 0.4 mL/min이었다.

3T3-L1 전지방 세포주 배양 및 분화유도

Kim 등(2021)의 방법에 따라 실험에 사용한 마우스 배아에서 유래한 3T3-L1 전지방 세포주는 융합된(confluent) 상태가 되면 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 5 μg/mL 인슐린, 1 μM dexamethasone, 0.5 mM IBMX가 함유된 분화배지를 처리하여 시료들의 분화를 유도한 후, 지방세포로의 분화를 촉진하기 위해 다시 10% FBS-DMEM에 인슐린이 5 μg/mL 포함된 배지로 2일에 한 번씩 3번 처리하였다.

MTT 방법을 이용한 시료의 세포독성 검사

본 실험에 사용한 시료가 3T3-L1 지방세포에 독성 영향이 있는지를 판단하기 위하여 Sogo 등(2021)의 방법으로 3T3-L1 전지방 세포주를 24시간 동안 96-well plate에 분주하고 배양한 후, 시료들을 각각의 농도별(12.5~1,000 μg/mL)로 처리하여 24시간 배양하였다. 연속적으로 각각의 well에 5 mg/mL MTT 용액을 well volume의 10%를 주입하여 4시간 동안 반응시켰다. 각각의 well에서 배지를 제거하고 DMSO 100 μL를 가하여 10분 동안 균질화한 후 ELISA microplate reader(EON, BioTeck, Winooski, VT, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Oil Red O 염색

Kim 등(2021)의 방법을 변형하여 분화시킨 3T3-L1 세포 내 지방 축적량을 정량하고자 배지를 제거하고 phosphate-buffered saline(PBS)(SPL life sciences, Pocheon, Korea)으로 세척한 세포에 10% 포르말린(formalin)으로 20분 동안 세포를 고정하였다. 반응시킨 plate의 고정액을 제거하고 PBS(pH 7.0~7.2)로 plate를 세척한 후 Oil Red O 염색 시약을 처리하여 30분 동안 중성지방구를 염색하여 지방분화 정도를 광학현미경으로 관찰하였다. 그 후 100% 이소프로판올을 이용하여 염색된 Oil Red O 시약을 제거하고, 96-well plate에 100 μL씩 옮겨 ELISA plate reader로 파장을 510 nm로 맞춰 흡광도를 측정하였다.

지방축적 관련 real time PCR 유전자 분석

지방세포의 전체 RNA는 추출을 위하여 지방세포에 트리졸(TRIzol)(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) 처리를 실시하였다. Yeon 등(2021)의 방법을 변형하여 분화 및 샘플처리가 완료된 세포(1×10⁷)에서 배지를 제거한 후, PBS로 세척하고 1 mL의 트리졸을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 교반하였다. Chloroform 200 μL를 첨가하여 교반한 후 15분간 방치하여 14,000×g로 15분간 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 이소프로판올을 첨가한 후 15분간 방치하였다. 동일한 조건으로 원심분리하여 침전물을 회수한 후, 75% 에탄올로 2번 세척하여 전체 RNA를 추출하였다. 그 후 추출된 mRNA와 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(Toyobo Co., Ltd., Osaka, Japan)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA 2 μL, forward primer 0.5 μL, reverse primer 0.5 μL, SYBR Green PCR Master mix(Toyobo Co., Ltd.) 5 μL, 증류수 2 μL를 넣고 real-time PCR 기기(QuantStudio3, Applied Biosystem, Foster, CA, USA)를 이용하여 PCR을 40회 반응하였고 3회 반복하였다. 분석한 유전자는 pparγ, c/ebpα, srebp-1c, ap2, fas, acetyl-CoA carboxylase 1(acc1), cluster of differentiation 36(cd36)이었으며, 이 유전자들의 특이적 primer 정보는 Table 1에 나타내었다. House keeping 유전자로는 β-actin을 사용하였으며, ΔCT값은 각 샘플의 CT값과 β-actin 간의 차이에 대하여 계산하였다. ΔCT＝CT(target)－CT(β-actin), 상대적인 발현 수준은 2^-ΔCT으로 계산하였다.

Table 1 . Oligonucleotide sequence of mouse primer.

	Forward primer	Reverse primer
pparγ	5′-CCATTCTGGCCCACCAAC-3′	5′-AATGCGAGTGGTCTTCCATCA-3′
c/ebpα	5′-GCGGGCAAAGCCAAGAA-3′	5′-GCGTTCCCGCCGTACC-3′
srebp-1c	5′-TGACGGAGACAGGGAGTTCT-3′	5′-GAGAAACTGCAAGCAGGAGC-3′
ap2	5′-AGCTGGTGGTGGAATGTGTTATGA-3′	5′-ATTTCCATCCAGGCCTCTTCCT-3′
fas	5′-TGGGTGTGGAAGTTCGTCAG-3′	5′-GTCGTGTCAGTAGCCGAGTC-3′
acc1	5′-ATGGGCTGCTTCTGTGACTC-3′	5′-GTTCATCCCTGGGGACCTTG-3′
cd36	5′-GATTAATGGCACAGACGCAGC-3′	5′-CAGATCCGAACACAGCGTAGA-3′
β-actin	5′-CTAGGCACCAGGGTGTGATG-3′	5′-GTCCCAGTTGGTAACAATGCC-3′

Western blot 단백질 분석

Seo 등(2018)의 방법을 변형하여 준비된 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 1× RIPA buffer(Thermo Fisher Scientific Inc.) 200 μL를 첨가하여 얼음 위에서 cell lysis 한 후 4°C, 14,000×g로 15분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 상층액의 단백질 농도의 동량으로 정량된 단백질을 sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide(SDS-PAGE) gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, acrylamide gel을 PVDF membrane(Thermo Fisher Scientific Inc.)으로 transfer 시켰다. 5% skim milk(Bioshop Canada Inc., Burlington, ON, Canada)를 함유한 Tris-buffered saline with 0.2% Tween 20 detergent(TBST)로 상온에서 2시간 동안 블로킹(blocking)하고 블로킹 버퍼(blocking buffer)로 1차 antibody를 처리하여 4°C에서 overnight 시켰 다. 이후 TBST로 5분마다 6번 세척하였다. 2차 antibody(1:5,000, Thermo Fisher Scientific Inc.)를 블로킹 버퍼에 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TBST로 5분마다 6번 세척하였다.

TBST로 세척하고 ECL solution(SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrat, Thermo Fisher Scientific Inc.) 기질로 반응시킨 후 암실에서 X-ray film(CP-BU, Agfa-Gevaert, Mortsel, Belgium)에 감광시켜 단백질의 발현을 확인하였다.

통계처리

실험 결과는 평균±표준편차로 표시하였으며, 통계적 유의성은 SPSS(version 26.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 t-test로 처리하였고 P<0.05 수준에서 평균값에 대한 유의성을 검증하였다.

청국장 점질물 시료 제조

점질물의 정량을 위하여 청국장에서 점질물을 회수하는 공정을 분석하였다. 청국장 점질물은 70% 에탄올에서 침전되는 특성을 보였으며, 점질물 중에서 레반은 γ-PGA보다 산가수분해에 더 빨리 분해되었고, flavourzyme 처리에 의해 γ-PGA는 점질물에서 선택적으로 제거되는 특성을 보였다. 선행연구에서 점질물의 레반은 inulinase 또는 invertase 처리 시 분해되었다(Kang 등, 2006). 이러한 분석조건을 γ-PGA 회수 실험에 적용하였다. 청국장에서 회수한 점질물, 점질물에 효소처리로 γ-PGA를 제거한 시료, 점질물을 산가수분해 하여 레반을 제거한 시료 등 3종 시료들의 분자량을 측정하였다(Table 2). 청국장 점질물의 분자량은 8.0×10⁴으로 나타났고 γ-PGA는 4.7×10⁴이었으며 레반의 분자량은 3.0×10³이었다. γ-PGA와 레반을 구성하는 글루탐산과 과당의 분자량이 각각 147과 180임을 고려할 때, γ-PGA와 레반의 중합도는 약 319와 169에 해당한다. 이러한 분자량은 다른 연구자의 결과와 유사하였다(Jang 등, 2007).

Table 2 . Molecular weight of γ-PGA/levan, γ-PGA, and levan obtained from the Cheonggukjang fermented by Bacillus subtilis NB-NUC1.

Samples	Molecular weight (Da)
γ-PGA/levan	8.04×104±3.37
γ-PGA	3.04×104±6.53
Levan	4.69×104±9.46

청국장 점질물의 3T3-L1 전지방 세포주에 세포 독성

Fig. 1에 나타난 바와 같이 대조군의 세포 생존율을 100%로 계산하였을 때, CVS 시료군의 경우 12.5, 25, 50, 100, 1,000 μg/mL 농도에서 각각 100.1, 103.3, 105.3, 107.4, 109.5% 생존율을 보였다. PL64군의 경우 동일한 농도에서 94.9, 103.2, 101.1, 97.9, 96.8% 생존율을 나타내었다. 이와 같이 본 연구에 사용되는 시료들은 12.5~1,000 μg/mL 농도에서 약 90% 이상의 세포 생존율을 보여 세포 독성이 없는 것으로 판단된다. 이러한 결과로 CVS와 PL64군의 경우에는 1,000 μg/mL 고농도 처리에서 3T3-L1 세포 생존율이 높게 나타나, 청국장 점질물의 낮은 세포 독성으로 높은 안전성을 갖는 소재임을 알 수 있었다.

Fig 1. Effect of mucoid substance on cell viability in 3T3-L1 preadipocytes. CVS, Cheonggukjang viscous substance; PL64, γ-PGA:levan=6:4, from Cheonggukjang viscous substance.

청국장 점질물의 3T3-L1 지방세포 분화 억제

청국장 유래 점질물 처리에 따른 3T3-L1 전지방 세포주로부터 지방세포로의 분화 억제능을 살펴본 결과는 Fig. 2에 나타내었다. Fig. 2A는 현미경으로 지방세포로의 분화를 관찰한 것으로 시료를 처리하지 않은 지방세포군의 경우 분화되면서 세포 모양이 원형으로 변화되며 그 속에 중성지방구가 생성되는 모습을 관찰할 수 있었고, 중성지방구는 Oil Red O 염색법에 의해 붉게 염색된 것을 확인할 수 있었다. 그러나 CVS와 PL64를 처리한 군은 지방세포군에 비해 현저하게 염색도가 감소함을 관찰할 수 있었고, 특히 PL64 처리가 더 효과적으로 지방세포 내 중성지방 염색을 낮추는 것으로 관찰되었다. 이를 확인하기 위해 염색된 지방세포 내 Oil Red O 염색도를 측정한 결과는 Fig. 2B에 나타난 것과 같이 시료를 처리하지 않은 지방세포 분화군에 비해 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL CVS 처리군은 각각 78.0, 89.8, 91.5, 93.5, 95.7%로 지방축적이 나타났고, PL64 처리군은 각각 85.6, 83.2, 86.2, 83.2, 76.3%로 지방축적을 나타내었다. 특히 200 μg/mL 농도 PL64 처리군은 지방세포군에 비해 23.7% 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다(P<0.05).

Fig 2. Effect of mucoid substance on lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes. (A) Morphology of Oil Red O strained adipocytes (B) Lipid accumulation of extracted Oil Red O dye. Magnification, ×200. Pre, 3T3-L1 preadipocytes; AD, 3T3- L1 adipocytes; CVS, Cheonggukjang viscous substance; PL64, γ-PGA:levan=6:4, from Cheonggukjang viscous substance. Significant at ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared to AD.

Kim(2017)의 연구에서 고지방식이 섭취 비만 동물모델에서 청국장 섭취에 의해 지방조직의 지방세포 크기 감소와 고지방식이로 인한 지방간 소견을 감소시키는 것을 확인하였고, 청국장이 면역 시스템과 지방생성 전사 인자들의 발현에 관여함으로써 adipogenesis를 조절함과 동시에 염증 억 제 효과를 가진다고 보고하였다. 청국장에서 유래된 사포닌을 3T3-L1 지방세포 분화과정에 처리한 결과 중성지방 축적이 25% 감소하였는데, 이는 에너지 평형과 지방대사과정에 중요한 AMP-activated protein kinase 유전자 활성화에 의한 것으로

보고하였다(Kim 등, 2014). 또한 다양한 Bacillus균 중 B. amyloliquefaciens SRCN100731으로 발효한 청국장에 점질 물질인 γ-PGA가 가장 풍부하였으며, 3T3-L1 지방세포 분화 억제에도 효과적이었고 인슐린 민감성도 높이는 것으로 나타났다(Jeong 등, 2018). 이와 같이 청국장 자체로써의 항비만성도 우수하지만, 이들에서 분리한 다양한 물질들이 생리활성 기능을 보이는 것을 확인할 수 있었는데, 본 연구에서도 청국장의 대표적인 점질 물질인 PL64군의 경우 200 μg/mL 농도에서 23.7% 지방세포 분화 억제를 관찰할 수 있어 청국장 점질 물질의 또 다른 기능성을 제시할 수 있었다.

청국장 점질물의 지방축적 관련 유전자 및 단백질 발현 억제 효과

청국장 점질물인 CVS군과 PL64군을 각각 25, 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리하여 지방세포 분화 시 처리하여 지방축적 억제 효과가 유전자 발현과 관계가 있는지 살펴보기 위해 지방축적 관련 유전자 발현량을 real-time PCR을 이용하여 확인하였다. pparγ, c/ebpα, srebp-1c, ap2, fas, acc1, cd36는 대표적으로 잘 알려진 지방축적과 관련된 유전자로 발현량 측정 결과는 Fig. 3과 같다. 지방세포군에 비해 지방축적 관련 유전자의 감소가 전반적으로 PL64군이 CVS군에 비해 우수하였다. pparγ 유전자의 경우 PL64 25, 200 μg/mL 처리군에서 각각 75%와 76% 유의적으로 감소하였고, c/ebpα 유전자는 PL64 25, 200 μg/mL 처리군에서 각각 85%와 75% 유의적으로 감소하였으며, srebp-1c 유전자는 PL64 25, 200 μg/mL 처리군에서 각각 59%와 50% 유의적으로 감소하였다(P<0.05). 또한 ap2 유전자의 경우는 PL64 25, 200 μg/mL 처리군에서 각각 79%와 75% 유의적으로 감소하였고, fas 유전자는 PL64 25, 200 μg/mL 처리군에서 각각 82%와 66% 유의적으로 감소하였으며, acc1 유전자는 PL64 25, 200 μg/mL 처리군에서 각각 66%와 46%, cd36 유전자는 각각 61%와 43% 유의적인 감소를 나타내었다(P<0.05). 이와 같은 결과로 PL64 처리에 있어 농도 의존적으로 지방세포축적 관련 유전자의 감소를 나타내지 않았으나, 처리한 농도 중에서도 모든 지방축적 관련 유전자가 지방세포군과 비교하였을 때 가장 유의적으로 유전자 감소를 나타낸 유효농도는 25와 200 μg/mL였다. 일반적으로 지방세포 분화과정에서 PPARγ는 지방세포 분화과정 2일에 전자인자로 작용하고 3~4일 차에 지방세포 분화과정을 최고로 증가시키는데, 이러한 PPARγ 유전자 발현을 증가시키는 인자는 C/EBPβ와 δ 유전자인 것으로 알려져 있다(Clarke 등, 1997; Wu 등, 1995). 또한 C/EBPβ 및 δ는 C/EBPα의 발현을 조절하는데 C/EBPα는 지방세포 분화과정 2일 차에 급격하게 증가하여 5일 차까지 지방세포 분화 촉진을 하여 PPARγ와 함께 다른 지방세포 분화 관련 유전자와 이에 관련되는 단백질 AP2, CD36, glycerol-3-phosphate dehydrogenase의 전사과정을 유도한다(Gregoire 등, 1998).

Fig 3. Effect of mucoid substance on the mRNA expression of adipogenesis-related genes in 3T3-L1 adipocytes. AD, 3T3-L1 adipocytes; CVS, Cheonggukjang viscous substance; PL64, γ-PGA:levan=6:4, from Cheonggukjang viscous substance. Significant at ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared to AD.

이러한 지방축적 관련 단백질 중 AP2는 지방세포 분화과정 중 최종 단계에 작용하여 지방축적을 유도하고(Gregoire 등, 1998), CD36는 긴사슬지방산이 지방세포로의 유입을 용이하게 하는 긴사슬지방산 운반체로써 작용하는 것으로 알려져 있다(Ibrahimi 등, 1996). SREBP-1C는 지방합성과 관련되는 효소인 FAS, ACC의 과발현을 통해 지방축적을 촉진하는 전사인자로써 중요한 역할을 하고 있다(Shimano 등, 1999).

13주간 고지방식이와 10% 청국장을 섭취한 실험동물의 다양한 비만 관련 바이오마커를 관찰하였는데, 부고환지방조직에서 지방축적과 관련 있는 PPARγ와 SREBP-1C 유전자 발현이 청국장 섭취군에서 37% 감소함을 보고하였다(Kim, 2017). Bacillus균 중 B. amyloliquefaciens SRCN 100731균 발효로 만들어진 청국장의 점질 물질인 γ-PGA가 풍부한 청국장을 3T3-L1 지방세포에 처리하였더니 FAS 유전자 감소를 통해 지방축적을 억제하는 것을 관찰하였다(Jeong 등, 2018). Kim 등(2010)은 고지방식이로 비만을 유도한 흰쥐에 청국장을 급여한 동물실험연구에서 청국장 첨가에 따른 체중감소 및 콜레스테롤 저하 효과가 있음을 보고하였다. 지방축적 관련 유전자뿐만 아니라 이에 따른 단백질 분석 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 청국장 점질물인 PL64를 처리하였을 때 지방축적 관련 PPARγ, C/EBPα, SREBP-1C, AP2, FAS, SCD1의 발현이 200 μg/mL 농도에서 현저하게 감소하였음을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 결과로 청국장의 점질물이 지방세포 분화 관련 전사인자와 이로 인해 발현되는 유전자 및 단백질을 억제함으로써 항비만 효과가 있는 것으로 생각된다.

Fig 4. Effect of mucoid substance on the protein expression of adipogenesis-related genes in 3T3-L1 adipocytes. (A) Band of protein expression through western blot, (B) Quantification of protein expression. AD, 3T3-L1 adipocytes; CVS, Cheonggukjang viscous substance; PL64, γ-PGA:levan=6:4, from Cheonggukjang viscous substance. Significant at ^*P<0.05, ^**P< 0.01, ^***P<0.001 compared to AD.

청국장의 점질물은 일반적으로 레반과 γ-PGA로 구성되어 있다. 본 연구는 청국장으로부터 분리된 레반과 γ-PGA가 3T3-L1 전지방 세포주의 지방세포 분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 수행되었다. 청국장 점질물 유래 γ-PGA와 레반을 점질물 구성 비율인 6:4로 혼합한 점질물(PL64)을 200 μg/mL 농도로 처리할 경우 대조군에 비해 23.7% 유의적으로 지방축적이 감소함을 확인할 수 있었다. 그뿐만 아니라 PL64의 처리는 pparγ, c/ebpα, srebp-1c, ap2, fas, acc1, cd36를 포함한 지방축적 관련 유전자의 발현을 감소시켰다. 또한 PPARγ, C/EBPα, SREBP-1C, AP2, FAS, SCD1의 지방축적 관련 단백질 발현이 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 청국장 점질물인 PL64는 3T3-L1 전지방 세포주의 지방세포 분화와 관련된 유전자와 단백질의 발현을 감소시킴으로써 지방축적을 억제하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과로 청국장 점질물은 지방축적 관련 유전자와 단백질을 하향 조절함으로써 항비만 기능성 물질로 활용 가능함을 확인할 수 있었다.

본 연구는 2017년도 한국연구재단의 기초연구사업을 받아 수행한 연구 결과입니다(No. NRF-2017R1D1A3B03034313).