콩은 기름 및 단백질 공급원으로서의 가치뿐만 아니라 isoflavone, saponin, phytosterols, phenolic acid와 같은 여러 2차 대사산물의 공급원으로서 전 세계적으로 가장 중요한 작물 중 하나로 알려져 있다(Luthria 등, 2007; Kim 등, 2014). 식품 시장에서 콩은 두유(soymilk), 오카라(Okara), 두부(Tofu), 유바(Yuba), 수푸(Sufu), 나토(Natto), 된장(soy paste) 등 국가 또는 지역에 따라 다양한 방법으로 가공되어 소비되고 있으며(Hu 등, 2019), 콩 가공식품을 많이 섭취하는 지역일수록 노인 여성의 인지 장애 위험성이 낮고 아시아인들의 과체중 혹은 비만율을 개선할 수 있다는 연구 결과가 보고된 바 있다(Nakamoto 등, 2018; Mu 등, 2019). 이러한 결과들은 콩 가공 제품에 함유된 isoflavone에 기인한 것으로 알려져 있는데, isoflavone은 식물성 estrogen의 공급원으로 건강 기능성 식품의 주요 후보군 중 하나이며 식품 산업에서는 isoflavone의 함량과 조성을 개선하는 폭넓은 연구가 수행되고 있다(Nakamoto 등, 2018; Hu 등, 2019; Jędrusek-Golińska 등, 2020; Mu 등, 2019).

콩의 품종 및 가공 방법에 따라 차이는 있으나 가공 처리를 하는 경우 isoflavone 함량이 높은 콩을 원료로 사용하는 것이 가공품에서의 isoflavone 함량 및 조성을 우수하게 하였으므로(Jeong 등, 2019a), 건강 기능성 측면에서 isoflavone 고함유 우량 콩 품종의 육성 및 이용은 매우 중요할 것이다. 콩에 함유된 isoflavone 함량 및 조성은 전통 육종 및 생물공학 기술에 의해 크게 개선되었으나(Yu 등, 2003; Sun 등, 2015) 전통적인 육종을 통한 콩 신품종 육성은 부족한 유전자원의 기반으로 인해 제한될 수 있으며, 소수의 엘리트 유전자원의 남용은 기존 유전자원의 기반을 더욱 제한시키는 결과를 초래할 수 있다(Qiu 등, 2009). 따라서 기존의 전통 육종을 통한 콩 품종의 biofortification을 위해서는 콩 신규 유전자원에 함유된 생리활성물질의 다양성에 대한 총체적 평가를 통해 우수한 엘리트 유전자원 발굴에 대한 체계적 연구가 필요할 것이다(Azam 등, 2020). 현재 콩 유전자원 함유 isoflavone의 유전적 다양성에 대한 국제적 연구가 수행된 바 있으며(Wang 등, 2010; Azam 등, 2020), 국내에서도 유전자원의 isoflavone 함량 변이에 관한 연구가 수행된 바 있다(Choung 등, 2006; Kim 등, 2014). 그러나 과거 수행된 대다수의 유전자원 연구는 가수분해를 통한 isoflavone aglycone 분석의 결과였으며, isoflavone isomer의 프로파일 및 조성에 대한 구체적 정보를 얻기 위하여 비가수분해법을 통한 정량분석이 요구되고 있다(Shao 등, 2011). 또한 시료 집단의 크기는 접근성 및 유용성과 반비례하는데 국내 종자은행에 보존되고 있는 콩의 모집단이 매우 거대하기 때문에 효율적인 유전자원 선발 연구를 위해서는 핵심집단의 구축이 필요하며, 우리나라 농촌진흥청은 콩, 벼, 밀, 목화, 후추 등의 작물 유전자원에서 고도의 유전적 다양성을 나타내는 최소 집단으로 핵심집단을 구축하여 신속, 유용 및 효율적인 연구를 수행할 수 있는 기반을 구축하고 있다(Jeong 등, 2019b).

따라서 본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 종자은행에 증식 보관되고 있는 콩 유전자원 핵심집단을 대상으로 high performance liquid chromatography/diode array detector(HPLC/DAD) 법을 사용한 비가수분해 isoflavone 분석을 수행하여 유용 콩 유전자원 발굴 및 신품종 육성, 고기능성 콩 가공식품 개발의 기초자료를 제공하여 대국민 식생활 증진에 기여하고자 한다.

실험재료

본 연구에 이용된 콩 시료는 농촌진흥청 국립농업과학원 종자은행에 증식, 보존되고 있는 콩 유전자원 핵심집단 356 계통(검정콩 75 계통 및 노란콩 281 계통)을 분양받아 분석 시료로 사용하였다.

시료 전처리 및 분석에 이용된 시약 중 ethanol, methanol, 초순수 증류수 및 acetonitrile은 J.T. Baker Co. (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구매하여 사용하였으며, acetic acid는 Daejung Chemicals & Metals Co.(Siheung, Korea)에서 구매하여 사용하였고 실험에 사용되었던 표준시약인 6′′-O-malonyldaidzin(MDA), 6′′-O-malonylglycitin(MGL), 6′′-O-malonylgenistin(MGE), 6′′-O-acetyldaidzin(ADA), 6′′-O-acetylglycitin(AGL), 6′′-O-acetylgenistin(AGE), daidzin(DA), glycitin(GL), genistin(GE), daidzein(DAE), glycitein(GLE) 및 genistein(GEE)은 Carbosynth company(Compton, Berkshire, UK)에서 구매하였다.

Isoflavone 추출 및 전처리

콩 유전자원 핵심집단에 함유된 isoflavone은 교반추출법을 이용하여 추출하였다. 즉, 콩 종실을 미세 분말로 분쇄한 후 70%(v/v) ethanol 40 mL를 첨가하고 24시간 동안 교반한 뒤 Whatman No. 6(Whatman Inc., Maidstone, UK)로 여과하였다. 이후 추출 여과액 20 mL를 100 mL 둥근 플라스크에 옮겨 담고 40°C 조건의 회전감압농축기(N-1001S-W, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 완전 농축하였으며, 80%(v/v) methanol 5 mL를 첨가한 뒤 초음파 추출기(JAC 4020, KODO Technical Research Co., Ltd., Hwaseong, Korea)를 사용하여 용해 후 전량 회수하였고 0.45 μm 실린지 필터(Whatman Inc.)로 여과하여 HPLC 분석의 시료 용액으로 사용하였다.

HPLC를 이용한 콩 함유 isoflavone 분석

콩 유전자원 핵심집단에 함유된 isoflavone을 정량 분석하기 위하여 Sun 등(2011)의 분석조건을 변형하여 이용하였다. 분석기기는 Agilent 사(Wilmington, DE, USA)의 1260 series를 사용하였으며, diode array detector를 검출기로 사용하여 260 nm에서 검출하였다. 분석에 사용된 column은 Venusil C18 Plus(250 mm×4.6 mm, 5 μm, Agela Technologies, Torrance, CA, USA)였으며, column oven을 이용하여 30°C로 유지하였다. Mobile phase의 경우 1% acetic acid in water(solvent A)와 acetonitrile(solvent B)을 사용하여 gradient elution system을 통해 1 mL/min의 속도로 용출하였으며, gradient profile은 solvent A 기준으로 0분: 85%, 60분: 70%, 65분: 60%, 66분: 85%, 75분: 85%로 설정하였다.

분석법 검증

본 연구에 사용된 isoflavone 분석법을 검증하기 위하여 sensitivity, selectivity 및 linearity를 검토하였다. Sensitivity를 확인하기 위해 limit of detection(LOD) 및 limit of quanification(LOQ)을 측정하였으며, LOD는 signal/noise(s/n)의 비가 3:1이 될 때의 농도로 설정하였고, LOQ는 s/n의 비가 10:1이 될 때의 농도로 설정하였다(Jeon 등, 2020). 분석법의 selectivity를 검토하기 위해 표준용액 및 콩 시료 추출물의 chromatogram 분리양상을 검토하였으며, 이론단수(number of theoretical plate), 이론단의 높이(height equivalent to theoretical plate), peak 분리능(peak resolution) 및 peak 대칭성(peak symmetry)을 확인하였다. 또한 linearity를 검토하기 위하여 각 isoflavone 성분별로 0~20 μg/mL 범위의 표준 검량선을 작성하고 결정계수를 평가하였다.

한편, 본 분석법의 정확성 및 정밀성을 평가하기 위하여 표준인증물질 SRM-3234(soy flour, National Institute of Standards and Technology; NIST, Gaithersburg, MD, USA)를 본 연구에 적용된 추출 및 분석법으로 정량 분석하여 검증된 표준 인증값과 본 분석법의 측정값을 상호 비교하여 정확성을 검토하였고, 상대표준편차(RSD%)를 통해 정밀성을 측정하였다.

통계처리

본 연구의 isoflavone 함량 평가는 3 반복으로 수행되었으며, 기초 통계(처리 간 평균, 표준편차 및 변이계수)는 SAS 9.4(Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 사용하여 분석하였다. 또한 PAST 4.02(Paleontological Statistics 4.02, University of Oslo, Oslo, Norway) 소프트웨어를 사용하여 주성분 분석 및 피어슨 상관분석을 수행하였으며 Heatmapper Program(University of Alberta, Edmonton, Canada)을 사용하여 유전자원 핵심집단의 변이 및 군집 특성을 검토하였다.

분석법 검증

Isoflavone 분석법의 sensitivity, selectivity 및 linearity를 검토하여 Table 1에 나타내었다. 각 isoflavone의 LOD는 0.066~0.226 μg/mL였는데, 이는 선행 연구의 분석 감도와 유사한 수준으로 충분한 분석 감도임을 알 수 있다(Aresta 등, 2017; Chen 등, 2020). 또한 분석법의 selectivity를 검토하기 위하여 표준용액 및 대표 시료의 크로마토그램을 검토한 결과(Fig. 1), 12종의 isoflavone isomer peak 모두 우수한 분리 양상을 나타내었으며, 이론단수, 이론단의 높이, peak의 분리능 및 peak의 대칭성도 매우 우수하였다. 또한 0~20 μg/mL 범위의 표준 검량선을 작성하여 linearity를 검토한 결과, 모든 isoflavone isomer의 결정계수가 0.999** 이상으로 고도의 직선성을 나타내었다.

Table 1 . Comparison of the sensitivity, selectivity, and linearity of the HPLC analysis method.

Isoflavone1)	Sensitivity		Selectivity				Linearity
	LOD2)	LOQ3)	N4)	HEPT5)	S6)	Rs7)	Calibration curve	R2
	(μg/mL)
DA	0.084	0.279	16,311.65	0.001533	1.111	－	y=6,332.62x+98.10	0.999
GL	0.084	0.279	16,530.08	0.001512	1.119	3.21	y=6,511.99x+23.48	0.999
GE	0.066	0.22	31,883.37	0.000784	1.087	17.76	y=9,731.08x+33.61	0.999
MDA	0.225	0.749	43,619.17	0.000573	1.037	4.93	y=2,696.16x－5.09	0.999
MGL	0.226	0.754	53,254.05	0.000469	1.1	2.62	y=2,516.94x+25.22	0.999
ADA	0.128	0.425	65,986.97	0.000379	1.101	14.47	y=4,795.84x+0.16	0.999
AGL	0.125	0.415	88,538.02	0.000282	1.048	4.6	y=4,793.68x+2.15	0.999
MGE	0.189	0.631	77,707.43	0.000322	1.063	2.05	y=3,352.03x+19.15	0.999
DAE	0.135	0.451	66,670.17	0.000375	0.958	9.41	y=5,936.82x+7.88	0.999
GLE	0.146	0.486	73,187.79	0.000342	0.967	5.55	y=5,637.48x+17.80	0.999
AGE	0.105	0.35	111,962.90	0.000223	1.061	3.18	y=6,718.02x+4.73	0.999
GEE	0.132	0.44	90,932.53	0.000275	0.935	19.81	y=7,745.86x+3.29	0.999

¹⁾DA: daidzin, GL: glycitin, GE: genistin, MDA: 6′′-O-malonyldaidzin, MGL: 6′′-O-malonylglycitin, ADA: 6′′-O-acetyldaidzin, AGL: 6′′-O-acetylglycitin, MGE: 6′′-O-malonylgenistin, DAE: daidzein, GLE: glycitein, AGE: 6′′-O-acetylgenistin, GEE: genistein..

²⁾Limit of detection. ³⁾Limit of quantitation. ⁴⁾Number of theoretical plate. ⁵⁾Height equivalent to theoretical plate..

⁶⁾Peak symmetry. ⁷⁾Peak resolution..

Fig 1. HPLC chromatograms for 12 kinds of isoflavones contained in a prime core set of Korean soybean germplasms.

한편, 본 분석법의 정확성 및 정밀성을 검토하기 위하여 표준인증물질 SRM-3234를 3회 반복 분석하였으며, 평균 측정값이 NIST에서 제시한 표준함량 범위 내에 위치하여(Phillips 등, 2017) 본 연구에 사용된 비가수분해 isoflavone 분석법의 정확성을 검증하였고, 반복 간의 상대표준편차(RSD%) 또한 0.52~3.75%임을 확인하여 정밀성이 우수함을 확인하였다(Table 2).

Table 2 . Recovery and relative standard deviation values of isoflavone contents in SRM 3234.

Isoflavone		Reference value	Analysis value	Recovery (%)	RSD1) (%)
		(mg/kg)
Aglycone	Daidzein	14.0±3.02)	14.5±0.5	103.6	3.75
	Genistein	15.49±0.30	15.59±0.08	100.6	0.52
Glycoside	Daidzin	1,680±530	1,573±51	93.6	3.22
	Genistin	2,080±520	1,902±11	91.5	0.56
	Glycitin	245±46	227±2	92.8	0.66

¹⁾Relative standard deviation..

²⁾The values are mean±SD of 3 replications..

Isoflavone 함량 평가

국내 콩 유전자원 핵심집단 함유 isoflavone 함량 분석 결과를 Table 3에 나타내었다. 콩 유전자원 핵심집단을 분석한 결과 isoflavone isomer 중에 가장 큰 비중을 차지한 것은 MGE(47.53%)였으며, MDA(30.92%), GE(5.86%), MGL(5.50%), DA(5.12%), ADA(2.80%), GL(1.37%), GEE(0.39%), DAE(0.25%), AGE(0.21%), AGL(0.03%) 및 GLE(0.02%) 순으로, 이는 선행 연구들과 유사한 양상임을 확인하였다(Ho 등, 2002; Sun 등, 2011; Azam 등, 2020). 또한 콩 종피색에 따른 isoflavone 함량 차이를 비교해본 결과 95% 유의수준에서 통계적 유의성이 없었으며, 이는 선행연구의 결과와 일치하는 양상이었다(Lee 등, 2010).

Table 3 . Isoflavone contents in a prime core set of Korean yellow and black soybean germplasms..

Soybean		Content1) (μg/g)
		DA	GL	GE	MDA	MGL	ADA	AGL	MGE	DAE	GLE	AGE	GEE	TIF
Yellow	MIN2)	20.14	3.59	44.34	147.55	8.83	23.95	0	462.35	0.08	0	0.69	1.84	958.91
	MAX3)	459.98	131.94	529.1	3231.85	533.07	197.07	15.61	3437.88	38.37	3.64	97.34	38.75	6707.23
	AV4)	161.58	43.19	182.53	990.3	175.04	89.06	0.73	1506.04	7.96	0.35	6.25	12.35	3175.38
	SD5)	80.59	21.15	80.23	468.48	81.46	33.5	1.96	559.62	4.99	0.65	8.15	6.18	1172.28
	CV(%)6)	49.88	48.96	43.95	47.31	46.54	37.61	267.9	37.16	62.69	184.96	130.38	50.02	36.92
	Ratio(%)	5.09	1.36	5.75	31.19	5.51	2.8	0.02	47.43	0.25	0.01	0.2	0.39	100
Black	MIN	5.89	0	11.92	97.78	1.76	4.86	0	129.8	0.5	0	0.13	1.98	255.29
	MAX	505.67	169.37	430.77	2487.77	501.13	172.32	17.3	2758.43	20.24	27.96	20.08	36.78	6034.81
	AV	159.05	43.11	190.42	905.38	164.56	84.8	1.46	1452.35	7.79	0.97	8.12	12.32	3030.33
	SD	98.27	31.52	84.6	461.95	98.04	34.72	3.27	566.69	4.56	3.61	4.77	6.4	1204.94
	CV(%)	61.79	73.11	44.43	51.02	59.58	40.94	223.51	39.02	58.45	372.56	58.76	51.94	39.76
	Ratio(%)	5.25	1.42	6.28	29.88	5.43	2.8	0.05	47.93	0.26	0.03	0.27	0.41	100
Total	MIN	5.89	0	11.92	97.78	1.76	4.86	0	129.8	0.08	0	0.13	1.84	255.29
	MAX	505.67	169.37	529.1	3231.85	533.07	197.07	17.3	3437.88	38.37	27.96	97.34	38.75	6707.23
	AV	161.05	43.18	184.19	972.41	172.83	88.17	0.89	1494.73	7.93	0.48	6.64	12.34	3144.82
	SD	84.48	23.66	81.11	467.75	85.18	33.76	2.31	560.74	4.9	1.76	7.59	6.21	1179.01
	CV(%)	52.46	54.8	44.04	48.1	49.29	38.29	261.05	37.51	61.78	366.97	114.31	50.35	37.49
	Ratio(%)	5.12	1.37	5.86	30.92	5.5	2.8	0.03	47.53	0.25	0.02	0.21	0.39	100

¹⁾ DA : daidzin, GL : glycitin, GE : genistin, MDA : 6"-O-malonyldaidzin, MGL : 6"-O-malonylglycitin, ADA : 6"-O-acetyldaidzin, AGL : 6"-O-acetylglycitin, MGE : 6"-O-malonylgenistin, DAE : daidzein, GLE : glycitein, AGE : 6"-O-acetylgenistin, GEE : genistein, TIF : total isoflavone.

²⁾ MIN : minimum.

³⁾ MAX : maximum.

⁴⁾ AV : average.

⁵⁾ SD : standard deviation.

⁶⁾ CV(%) : coefficient of variation(%).

콩 유전자원 핵심집단 356 계통의 isoflavone 함량 범위를 검토한 결과, DA는 5.89~505.67 μg/g, GL은 0.00~169.37 μg/g, GE는 11.92~529.10 μg/g, MDA는 97.78~3,231.85 μg/g, MGL은 1.76~533.07 μg/g, ADA는 4.86~197.07 μg/g, AGL은 0.00~17.30 μg/g, MGE는 129.80~3,437.88 μg/g, DAE는 0.08~38.37 μg/g, GLE는 0.00~27.96 μg/g, AGE는 0.13~97.34 μg/g 및 GEE는 1.84~38.75 μg/g이었으며 총 isoflavone은 255.29~6,707.23 μg/g이었다. Azam 등(2020)의 연구 결과에 의하면 콩 1,168 계통을 대상으로 isoflavone의 함량 변이를 검토한 결과 745~5,253.98 μg/g의 범위였다고 보고하였으며, Choung 등(2006)은 국내 보존된 콩 유전자원 648 계통에 함유된 isoflavone을 분석한 결과 82.6~3,479.2 μg/g 수준이라고 보고하였는데, 본 연구에 사용된 콩 유전자원 핵심집단은 선행연구와 비교하여 더 작은 계통수와 최소화된 환경변이에도 불구하고 함량적 측면의 유전적 다양성이 더욱 우수함을 알 수 있다.

한편, 국내 콩 유전자원 핵심집단 356 계통에 함유된 총 isoflavone의 평균 함량은 3,144.82±1,179.01 μg/g이었는데, Tepavčević 등(2010)에 따르면 Serbia의 Institute of Field and Vegetable Crops에서 분양받은 세계 각 지역의 콩 20품종(유럽 5품종, 미국 5품종, 러시아 5품종 및 중국 5품종)에 함유된 isoflavone의 평균 함량은 3.25 mg/g이었으며, Zhang 등(2014)의 경우 중국 북부지역(3종), Huang Huai Hai 계곡지역(20종), 남부지역(15종), 미국(1종) 및 일본(1종)에서 수집된 중국 보유 콩 핵심집단의 isoflavone은 평균 2,972.64 μg/g 수준으로 보고하여 평균적 함량 면에서는 본 연구의 결과와 유사한 수준임을 확인하였다. 반면에 Choung 등(2006)은 한국 콩 유전자원 648 계통의 총 isoflavone 함량을 분석한 결과 722.1±324.8 μg/g이라고 보고한 바 있으며, Lee 등(2002)은 노란콩 41품종과 검정콩 5품종에 함유된 isoflavone 함량은 평균 809 μg/g이었다고 보고하여 본 연구의 결과와 차이를 나타내었다. 이러한 결과는 콩의 재배 환경 및 유전적 특성 혹은 분석 방법에 의한 차이로 인해 isoflavone 함량 변이가 발생할 수 있음을 추측할 수 있다(Wang과 Murphy, 1994; Lee 등, 2003; Hong 등, 2010; Wang 등, 2010; Azam 등, 2020).

콩 유전자원 핵심집단의 isoflavone 함량 변이

국내 콩 유전자원 핵심집단의 isoflavone 함량 변이를 총괄적으로 검토하기 위하여 주성분 분석을 수행하였다(Fig. 2). Biplot의 component 1은 49.0%이며 component 2의 경우 12.7%였고 GL, MGL 및 GLE는 component 1 및 2 모두 양의 값을 나타내어 서로 밀접한 관계가 있음을 확인하였다. AGL의 경우 component 1 및 2 모두 음의 값을 나타내었으나 각 component 값이 0에 근접하여 다른 isoflavone과 유의적인 상관성이 없는 것으로 확인되었다. 그 외의 isoflavone 및 총 isoflavone 함량의 경우 component 1의 값은 양의 값을 나타내지만, component 2의 값은 음의 값을 나타내어 AGL, GL, MGL 및 GLE와 구별되는 것을 관찰하였다. 콩 유전자원 핵심집단의 각 계통은 isoflavone 함량 및 조성에 따라 넓은 분포 특성을 나타내었는데, 95%의 유의수준에서 isoflavone을 특이적으로 함유한 22 계통이 outlier에 위치하여 높은 가치를 가지는 유용 유전자원으로 이용될 수 있음을 시사하였다. Outlier에 위치한 콩 유전자원 계통 중 CMJ17105, CMJ17407 및 CMJ17359는 본 시료군 중에서 총 isoflavone 함량이 매우 높은 우수 유전자원이었으며, CMJ17329, CMJ17371 및 CMJ17319는 GL, MGL 및 GLE의 함량이 특이적으로 높은 유전자원이었다. 특히 CMJ17410의 경우 검은콩 중 총 isoflavone 함량이 가장 높은 유전자원이었고 GL, MGL 및 GLE 함량이 높아 isoflavone 조성면에서 다른 유전자원들과 분명히 구분되었다. 한편, CMJ17389 계통의 경우 GL, AGL 및 GLE이 전혀 검출되지 않았으며, 국내 콩 유전자원 핵심집단 중 isoflavone 함량이 가장 낮은 계통이었다.

Fig 2. Biplot according to the isoflavone contents in black and yellow soybeans. Yellow dot: yellow soybean, Black dot: black soybean.

콩 유전자원 핵심집단 함유 isoflavone의 상관 및 군집 특성

국내 콩 유전자원 핵심집단에 함유된 isoflavone isomer의 상관성을 평가하기 위하여 피어슨 상관분석(Fig. 3)을 수행하였다. 그 결과, AGL의 경우 다른 isoflavone과 상관성이 없는 것으로 확인되었으며, 총 isoflavone은 AGL을 제외한 다른 모든 isoflavone과 정의 상관관계를 나타내어 주성분 분석의 결과와 일치하였다. 특히, MDA(r=0.919***), ADA(r=0.923***) 및 MGE(r=0.943***)는 총 isoflavone 함량과 고도의 정의 유의상관을 나타내어 콩 isoflavone의 핵심 성분임을 확인하였으며, 특정 isoflavone을 제외한 대부분의 isoflavone은 서로 유의한 정의 상관관계를 나타내었다. 한편, DA(r=0.882***), GL(r=0.862***) 및 GE(r= 0.823***)는 malonyl계 isoflavone과 고도의 유의상관을 나타내었으며, 이는 Azam(2020)의 연구 결과와 유사한 양상이었다.

Fig 3. Pearson’s correlation analysis for 12 kinds of isoflavone and total isoflavone in a prime core set of Korean soybean germplasms. DA: daidzin, GL: glycitin, GE: genistin, MDA: 6′′-O-malonyldaidzin, MGL: 6′′-O-malonylglycitin, ADA: 6′′-O- acetyldaidzin, AGL: 6′′-O-acetylglycitin, MGE: 6′′-O-malonylgenistin, DAE: daidzein, GLE: glycitein, AGE: 6′′-O-acetylgenistin, GEE: genistein, TIF: total isoflavone.

국내 콩 유전자원 핵심집단의 계통 및 12종의 isoflavone isomer의 함량 특성을 총괄적으로 검토하기 위하여 군집분석을(cluster analysis) 포함하는 heatmap을 Fig. 4에 나타내었다. 군집분석 결과, GL 계열(AGL, GLE, GL 및 MGL)의 isoflavone이 서로 밀접한 연관성을 나타내어 하나의 군집(GL군집)을 형성하였으며, DA 계열(DAE, DA 및 MDA)이 하나의 군집(DA군집)을 형성하여 유사한 화학적 특성에 따라 군집이 형성되는 것을 확인하였고, 총 isoflavone과 밀접한 상관관계를 나타내는 GEE, GE, ADA 및 MGE가 다른 하나의 군집(TIF군집)을 나타내어 isoflavone 조성을 중심으로 총 3개의 군집으로 구분됨을 확인하였다. 또한, 국내 콩 유전자원 핵심집단 356 계통 간의 군집분석을 수행하였을 때, GL 및 MGL의 함량이 높고 DA 계열의 isoflavone 함량이 낮은 그룹(Ⅰ그룹), AGL 및 GLE의 함량이 높고 총 isoflavone 함량이 낮은 그룹(Ⅱ그룹), aglycone 형태의 DAE 및 GEE의 함량이 높은 그룹(Ⅲ그룹), 총 isoflavone 함량이 높았던 그룹(Ⅳ그룹) 그리고 DA 계열의 isoflavone 함량이 높았던 그룹(Ⅴ그룹)으로 구분되어 국내 콩 유전자원 핵심집단은 isoflavone의 조성 및 함량에 따라 다양한 군집으로 구분됨을 알 수 있다. 이들 중 Ⅳ그룹은 총 isoflavone 함량이 높은 그룹이었으며, Ⅲ그룹은 체내 흡수가 빠르고 많은 양이 흡수될 수 있는 isoflavone aglycone의 함량이 높은 유전자원 그룹이었는데(Izumi 등, 2000), 특히 GEE는 기타 isoflavone isomer와 비교하여 우수한 bioavailability를 나타낸다고 보고된 바 있어 건강 기능성 식품의 원료로서 이용 가치가 높은 우수 유전자원 그룹으로 구분할 수 있다(Larkin 등, 2008). 또한, Kikuta(2020)는 GEE가 곡물을 먹고사는 Tribolium castaneum으로 불리는 딱정벌레에 대한 강력한 독성을 나타내어 경구 생물농약으로 활용 가능하다는 연구 결과를 보고하여 Ⅲ그룹 유전자원 계통의 다양한 활용성을 기대할 수 있다. 한편 isoflavone은 두유의 식미에 영향을 미칠 수 있는데 glycitein 계열의 isoflavone 함량이 높을수록 두유의 식감, 단맛, 색상 및 외관에 부정적인 영향을 나타내어 전반적인 기호도가 낮았다는 연구 결과가 보고된 바 있어 glycitein 계열의 isoflavone 함량이 낮으면서 총 isoflavone 함량이 높은 Ⅳ그룹 유전자원이 두유 가공용으로 유리할 수 있음을 알 수 있다(Ma 등, 2015). 다만 Lee 등(2018)의 연구에서는 isoflavone과 두유 식미의 상관관계가 분명히 규명되지 않아 추가적인 검토가 필요할 것이다.

Fig 4. Heatmap including cluster analysis according to isoflavone contents and composition in a core set of Korean soybean germplasms. DA: daidzin, GL: glycitin, GE: genistin, MDA: 6′′-O-malonyldaidzin, MGL: 6′′-O-malonylglycitin, ADA: 6′′-O-acetyldaidzin, AGL: 6′′-O-acetylglycitin, MGE: 6′′-O-malonylgenistin, DAE: daidzein, GLE: glycitein, AGE: 6′′-O-acetylgenistin, GEE: genistein, TIF: total isoflavone.

이상으로 본 연구는 국내 콩 유전자원 핵심집단 356 계통에 함유된 12종의 isoflavone isomer의 함량을 정량 분석하여 핵심 유전자원 집단의 isoflavone 함량, 조성 및 유용 유전자원 선발에 대한 기초자료를 제공하였고, 향후 유용 유전자원 활용을 통한 국제 경쟁력 있는 콩 신품종 육성 및 이를 이용한 콩 가공식품 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

본 연구는 국내 콩 유전자원 핵심집단 356 계통에 함유된 12종의 isoflavone을 HPLC/DAD로 분석하였다. 콩 유전자원 핵심집단에 함유된 isoflavone 중 MGE가 129.80~3,437.88 μg/g으로 가장 높은 비율을 차지하였으며, MDA는 97.78~3,231.85 μg/g, 총 isoflavone 함량은 255.29~6,707.23 μg/g이었다. Isoflavone 함량을 대상으로 주성분 분석을 수행하여 CMJ17105, CMJ17407 및 CMJ17359의 isoflavone 함량이 우수하였음을 확인하였다. 피어슨 상관분석 결과, MDA(r=0.919***), ADA(r=0.923***) 및 MGE(r=0.943***)는 총 isoflavone과 고도의 유의성을 나타내었다. 군집분석을 포함하는 heatmap을 작성하여 isoflavone 함량 및 조성에 따라 국내 콩 유전자원 핵심집단을 총 5 그룹으로 구분할 수 있었다. 본 연구는 국내 콩 핵심 유전자원 중 isoflavone 함량 및 조성이 우수한 유전자원 정보를 제공하여 유용 유전자원 활용을 통한 국제적 경쟁력 있는 콩 신품종 육성 및 이를 이용한 콩 가공식품 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.