외떡잎식물 벼목 화본과 두해살이 풀에 속하는 보리(Hordeum vulgare)는 세계 각국뿐만 아니라 국내에서도 많이 소비되고 있는 식량 작물이며, 보리새싹(barley sprout)은 보리를 파종하고 약 18 cm 가량 자란 어린잎의 보리를 지칭하는 것이다(Kim 등, 2006; 2012). 보리새싹에는 항산화 성분인 비타민을 포함하여 isorhamnetin, isoorientine, luetolin 등의 다양한 폴리페놀 성분과 quercetin, kaempferol, catechin과 같은 플라보노이드 성분이 함유되어 있으며(Gangopadhyay 등, 2015), 콜레스테롤 저하효과(Kim 등, 2012)와 항산화 활성 및 항염증 효능(Lee 등, 1994; Eun 등, 2016) 등의 생리활성 기능을 가지는 것으로 보고되었으며, 보리새싹의 기능성 원료로서의 관심이 증가하고 있다.

과거부터 오랜 기간 식문화 속에 자리를 잡고 있는 김치, 된장, 발효유 등과 같은 발효식품은 유산균과 같은 미생물이 식품의 제조와 보관과정에서 작용하며 생성된 것으로 고유 식문화의 형성에 영향을 미쳤다(Park 등, 2006). Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. 및 Leuconostoc spp. 등의 유산균은 당원을 이용한 대사경로를 통한 유산을 생성하는 유익한 세균이며(Kang 등, 2009), 생균제로서 숙주에 이로운 영향을 주는 살아있는 유산균으로 지칭되는 probiotics뿐만 아니라 이들에서 유래되는 성분 역시 숙주에 이로운 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Schrezenmeir와 de Vrese, 2001). 유산균은 항균 단백질인 bacteriocin의 분비를 통한 병원균 억제 및 유해균에 대한 길항작용, 숙주의 장내 환경 개선, 항염증 효능 및 면역기능 증진 등의 효능을 나타내는 것으로 보고되고 있다(Yan과 Polk, 2020). 전통 발효 음식인 김치를 포함한 다양한 발효에 활용이 되는 Lactobacillus spp.와 Leuconostoc spp. 중, Lactobacillus plantarum은 포도당을 분해하여 젖산을 생성하는 동형발효를 통하여 발효물의 pH를 낮춤과 동시에 풍미를 증가시키며, Leuconostoc mesenteroids는 포도당을 분해하여 젖산, 초산 등을 생성하는 이형발효를 통하여 발효에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Cho 등, 2007; Jang과 Kim, 2019). 이러한 유산균을 이용한 발효는 원재료에 함유된 성분이 유산균의 대사과정을 거치면서 소화 및 흡수가 용이한 상태로 생물전환될 뿐 아니라, 유산균 생성하는 대사산물을 통하여 관능적인 특징 및 기능성이 증가하여 다양한 식품에 적용하고 있다(Park, 2012). 한국의 전통 발효식품인 발효식초, 막걸리, 청국장 등에서의 항산화 활성, 면역 활성 등의 생리활성 효과는 보고되고 있으나 보리새싹의 발효를 통한 생리활성 기능의 증진에 관한 연구는 아직 미비한 실정이다(Cho 등, 2014; Chung 등, 2010; Kwon 등, 2004).

따라서 본 연구에서는 유산균을 이용한 보리새싹 열수추출 발효물의 생리활성 효능을 평가하기 위하여 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량, 항산화 활성과 면역조절 효과를 확인하였으며, 이를 통하여 유산균 발효 보리새싹의 활용 가능성을 확인하고자 한다.

실험재료

본 연구에 사용된 보리새싹은 충남 예산에서 15~20 cm의 보리새싹을 구매하여 사용하였다. 발효에 사용된 유산균은 본 연구실에서 보관하고 있던 국내 은행외과피에서 분리하고 은행발효물의 항산화 활성을 증가시킨 Lactobacillus plantarum KCL005(P)와 Leuconostoc mesenteroides KCL007(M)을 사용하였으며, Lactobacilli MRS broth 및 agar(BD Difco™, Sparks, MD, USA)를 이용하여 37°C, 48시간 동안 배양하여 사용하였다.

보리새싹 열수추출물 제조

본 연구에 사용된 보리새싹 열수추출물은 건조된 보리새싹 분말 100 g과 증류수 1 L를 혼합하여 100°C에서 3시간동안 추출하였다. 추출이 완료된 추출물을 1,977×g에서 20분간 원심분리한 뒤, 0.45 μm의 필터로 여과 및 고형분 함량 80%까지 감압 농축하여 이후 실험에 사용하였다.

발효 보리새싹 제조 및 유산균 수 확인

준비된 보리새싹을 증류수에 10%(w/v)가 되게끔 첨가 후 121°C에서 15분 동안 고압멸균(Gaon science, Bucheon, Korea)하여 보리새싹 배지(BS)를 제조하였다. 발효 스타터 균주 2종(BSP, BSM)을 10 mL의 MRS broth(BD Difco™)에 37°C, 48시간 전배양한 뒤, 보리새싹 배지에 2%(v/v)로 접종하고 37°C, 48시간 동안 배양하여 사용하였다. 배양에 따른 유산균 수의 변화를 확인하기 위하여 0, 24, 48시간의 시료를 수거하여 십진희석법을 이용하여 희석하였다. 희석된 시료를 MRS agar(BD Difco™)에 도말하여 37°C, 48시간 배양 후 생성된 Colony 계측을 통하여 Colony forming unit(CFU)을 확인하였다. 발효가 완료된 모든 시료는 진공 농축하여 -70°C의 초저온 냉동고(Sanyo, Tokyo, Japan)에 보관하며 실험에 사용하였다.

pH 및 산도

보리새싹의 발효에 따른 pH 변화는 0, 24, 48시간의 시료 3 mL를 수거하여 pH meter(EL20, Mettler toledo, Greifensee, Switzerland)를 이용해 3회 반복 측정하였다. 총 산도는 10 mL의 시료가 pH 8.3이 될 때까지 소비되는 0.1 N NaOH 용액의 소비량을 lactic acid의 함량으로 환산하여 나타내었다.

총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis phenol 방법에 따라 확인하였다(Appel 등, 2001). 시료 1 mL에 1 N Folin Ciocalteu reagent(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 1 mL를 가하고 진탕교반기로 충분히 혼합한 다음 20% sodium carbonate(Sigma-Aldrich Co.) 1 mL를 첨가하여 빛을 차단한 상온에서 30분간 반응시킨 후 분광광도계(Eon, Biotek, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 기록한 표준곡선을 통하여 환산해 나타내었다.

총 플라보노이드 함량은 Atanassova 등(2011)의 방법을 변형하여 확인하였다. 시료 1 mL에 5% sodium nitrite (Sigma-Aldrich Co.) 150 μL를 혼합하여 상온에서 10분간 반응시킨 후 10% aluminium chloride(Sigma-Aldrich Co.) 300 μL를 첨가하고 상온에서 12분간 반응시킨 다음 1 N NaOH(Sigma-Aldrich Co.) 1 mL와 혼합한 뒤 분광광도계(Eon, Biotek)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량은 quercetin(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하여 기록한 표준곡선을 통하여 환산해 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거 활성

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성은 Kim 등(2018a)의 방법에 따라 확인하였다. 0.1 mM DPPH reagent(Sigma-Aldrich Co.) 1 mL에 발효 보리새싹 시료 200 μL를 혼합하고 10초간 진탕교반기로 혼합한 다음 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 200 μL를 96-well plate에 넣고 분광광도계(Eon, Biotek)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 아래의 식을 통하여 계산하였다.

$$DPPHradicalscavengingactivity\left(\%\right)=\left(1-\frac{OD517n{m}_{sample}}{OD517n{m}_{control}}\right)\times 100$$

ABTS 라디칼 소거 활성

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS) 라디칼 소거 활성은 Re 등(1999)의 방법을 변형하여 확인하였다. 7.4 mM ABTS(Sigma-Aldrich Co.)와 2.45 mM potassium persulfate(Sigma-Aldrich Co.)를 혼합하여 빛을 차단한 상온에서 24시간 반응시켜 ABTS reagent를 제조한 후 증류수를 가하여 732 nm에서 흡광도가 0.706±0.003이 되게끔 희석하여 사용하였다. 발효 보리새싹 시료 40 μL와 ABTS reagent 960 μL를 가하여 혼합 후 상온에서 15분간 반응시킨 다음 분광광도계(Eon, Biotek)를 이용하여 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성은 아래의 식을 통하여 계산하였다.

$$ABTSradicalscavengingactivity\left(\%\right)=\left(1-\frac{OD732n{m}_{sample}}{OD732n{m}_{control}}\right)\times 100$$

세포주 배양

마우스 대식세포주인 Raw 264.7 cell은 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 세포의 배양은 1% anti-anti (Gibco, Carlsbad, CA, USA), 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT, USA)이 첨가된 Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM; Hyclone)을 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator(Sanyo)에서 배양하였다.

MTT assay

발효 보리새싹이 세포생존에 미치는 영향은 3-(4,5-dimethylthiazil-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 이용하여 확인하였다(Mosmann, 1983). 96-well plate에 Raw 264.7 cell을 5×10⁵ cells/well이 되게끔 넣고 37°C, 5% CO₂ incubator(Sanyo)에서 24시간 배양 후 시료를 0, 10, 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 처리한 뒤 24시간 배양하였다. 배양 후 MTT(Sigma-Aldrich Co.)를 처리하여 37°C에서 30분간 반응한 뒤, 생성된 MTT formazan dye를 dimethyl sulfoxide(Daejung, Siheung, Korea)로 녹인 뒤, 분광광도계(Eon, Biotek)를 이용하여 흡광도 570 nm를 측정하여 나타내었다.

NO assay

발효 보리새싹의 Raw 264.7 cell에 대한 nitric oxide(NO)의 생성은 Kim 등(2018a)의 방법을 변형하여 실시하였다. 96-well plate에 Raw 264.7 cell을 5×10⁵ cells/well이 되게끔 넣고 37°C, 5% CO₂ incubator(Sanyo)에서 24시간 배양 후 시료를 1, 10, 20, 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 처리한 뒤 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 배양상등액에 포함된 NO를 측정하기 위하여 증류수 65 μL에 상등액 75 μL를 더한 뒤 Griess reagent(Thermo Scientific, Beverly, MA, USA) 10 μL를 넣고 상온에서 30분간 반응시키고 분광광도계(Eon, Biotek)를 이용하여 흡광도 540 nm를 측정하여 나타내었다. NO의 농도는 sodium nitrite(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 기록한 표준곡선을 통하여 환산해 나타내었다.

RNA 추출 및 RT-PCR을 통한 cytokine 발현 확인

발효 보리새싹의 처리에 따른 Raw 264.7 cell에서의 유전자 발현의 변화를 확인하기 위하여 Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)을 수행하였다. 발효 보리새싹을 처리한 세포를 24시간 배양한 후 Trizol reagent(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 total RNA를 분리한 후 분광광도계(Eon, Biotek)를 이용하여 정량하였다. 0.2 μg의 RNA를 cDNA synthesis kit(Thermo Scientific)을 이용하여 cDNA로 역전사시켰다. PCR에 사용된 primer는 Bioneer(Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였으며 각 primer의 염기서열은 Table 1과 같다. PCR은 cDNA 1 μL와 2X Go taq Green master mix(Promega, Madison, WI, USA), 1 pmol의 primer를 혼합 후 95°C에서 5분 및 20초 반응 후, 각 primer에 맞는 온도로 20초, 72°C에서 30초로 30 cycle 반응 후 72°C에서 3분을 끝으로 반응을 종료하였다. PCR 종료 후 이를 1.2% agarose gel에 넣은 뒤 100 V에서 20분간 전기영동(Mupid-exU, Advance, Tokyo, Japan)하였으며, PCR band를 Printgraph CMOS I(ATTO, Tokyo, Japan)을 이용하여 시각화하고 시각화된 band를 Image J(Version 13.0.6, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 분석하였다.

Table 1 . Primers used in polymerase chain reaction.

Gene	Primer sequence
iNOS	Forward	TCTTTGACGCTCGGAACTGT
	Reverse	CCATGATGGTCACATTCTGC
COX-2	Forward	TGGGGTGATGAGCAACTATT
	Reverse	AAGGAGCTCTGGGTCAAACT
TNF-α	Forward	CACAAGATGCTGGGACAGTGA
	Reverse	TCCTTGATGGTGGTGCATGA
IL-6	Forward	AGTTGCCTTCTTGGGACTGA
	Reverse	CAGAATTGCCATTGCACAAC
IL-1β	Forward	GACCTTCCAGGATGAGGACA
	Reverse	AGCTCATATGGGTCCGACAG
β-actin	Forward	CCTGAACCCTAAGGCCAACC
	Reverse	CAGCTGTGGTGGTGAAGCTG

통계처리

모든 실험 결과는 SPSS program(version 25.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 통하여 평균±표준편차로 나타내었으며, 실험군 간의 유의성 여부는 One-way ANOVA test 및 t-test를 통하여 P<0.05인 경우에 유의적인 차이를 보이는 것으로 확인하였다.

생균수, pH 및 산도

2종의 스타터 유산균을 통한 발효 보리새싹에서의 발효시간(0, 24, 48시간)에 따른 생균수, pH 및 산도를 평가하였다(Fig. 1). 유산균 발효 보리새싹의 초기 유산균 수는 BSP 5.49 log CFU/mL와 BSM 5.19 log CFU/mL이며 BSP와 BSM 발효 24시간에서 BSP 9.30 log CFU/mL와 BSM log 8.56 CFU/mL로 두 군 모두 최대 균수를 나타내었으며, 발효 48시간에서는 BSP 8.56 log CFU/mL와 BSM 7.66 CFU/mL로 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 1A). pH의 경우 발효 초기 pH 4.98에서 배양시간이 증가할수록 pH가 감소하였으며, BSP 발효 48시간에서 pH 3.44를 나타내었으며 BSM 발효 48시간에서 pH 4.18을 나타내었다. 산도는 발효 초기 0.60%에서 발효가 진행됨에 따라 BSP 발효 48시간에서 2.53%를 나타내었으며 BSM 발효 48시간에서 1.20%를 나타내었다(Fig. 1B). 이러한 pH의 감소와 산도의 증가는 유산균의 배양에 따라 생성되는 유기산 및 단쇄지방산 등이 생성됨에 따른 결과이며 이렇게 생성된 유기산과 단쇄지방산은 장내의 병원균의 성장을 억제와 장내 환경개선 등의 기능을 할 수 있다(LeBlanc 등, 2017).

Fig 1. LAB cell count (A), pH and total acidity of barely sprout hot water extract according to fermentation time (0∼48 h). All experiments were performed in triplicates, and all values were expressed as the mean±SD.

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

식물의 대사산물로 알려진 총 폴리페놀 계열의 화합물은 수산기의 구조를 통한 수소공여 및 페놀 구조의 공명안정화에 의한 항산화 효능을 나타낼 수 있으며 이들은 다양한 기능을 나타내는 생리활성 물질이다(Ganopadhyay 등, 2015; Ferreres 등, 2009). 보리새싹의 발효 기간에 따른 총 폴리페놀의 함량을 gallic acid를 기준으로 분석한 결과는 Fig. 2A와 같다. 보리새싹 발효 초기의 총 폴리페놀 함량은 2.89±0.11 GAE mg/g에서 발효가 진행됨에 따라 BSP 발효 24시간에서 3.51±0.06 GAE mg/g, BSP 발효 48시간에서 3.85±0.04 GAE mg/g으로 약 1.3배 유의적으로 증가하였다(P<0.05). BSM의 경우 발효 24시간에서 3.22±0.02 GAE mg/g으로 증가하였으나 발효 초기와의 유의적인 차이를 확인할 수 없었으며, 발효 48시간에서 3.54±0.07 GAE mg/g으로 발효 초기에 비하여 1.22배 유의적으로 증가하였다(P<0.05).

Fig 2. Total phenolic content (A) and total flavonoid content (B) of barely sprout hot water extract according to fermentation time (0∼48 h). All experiments were performed in triplicates, and all values were expressed as the mean±SD compared with BS control (*P<0.05).

식물에 주로 분포하고 있는 플라보노이드는 flavonols, flavones, isoflavone 등의 다양한 형태의 화합물 형태로 존재하고 있으며, 화합물의 구조적인 특징에 따라 항암, 항염, 면역 활성 등 다양한 생리활성 효과가 보고되었다(Ferreres 등, 2009; Kumar와 Pandey, 2013). 보리새싹의 발효 기간에 따른 총 플라보노이드 함량을 quercetin을 기준으로 분석한 결과는 Fig. 2B와 같다. 보리새싹 발효 초기의 총 플라보노이드 함량은 1.05±0.04 quercetin mg/g이었으며, 발효가 진행됨에 따라 BSP 발효 24시간에서 1.24±0.06 quercetin mg/g, BSP 발효 48시간에서 1.42±0.01 quercetin mg/g으로 1.35배 증가하였다(P<0.05). BSM의 경우 총 폴리페놀 함량과 같이 발효 24시간에서는 유의적인 차이를 확인할 수 없었으며, 발효 48시간에서 1.21±0.02 quercetin mg/g으로 1.15배 증가하였다(P<0.05). 유산균을 이용한 식물의 발효 시 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 발효에 사용되는 스타터 균주에 따라서 감소할 수 있으나(Doh 등, 2010), 유산균을 이용한 보리 씨앗과 보리의 발효 시 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량이 증가하였으며 보리의 발효 시 quercetin, gallic acid 등의 플라보노이드 및 폴리페놀 성분이 함유되어 있다고 보고되었다(Lee 등, 2018; Zhao 등, 2022). 또한 Park 등(2012)은 유산균을 이용한 발효 시 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량의 변화는 발효가 진행됨에 따라 유산균이 생성하는 protease, amylase, lipase 등의 효소에 의한 대사로 고분자의 화합물이 새로운 화합물의 생성으로 함량이 증가할 수 있다고 보고하였다. 이는 본 연구에서 유산균을 이용하여 보리새싹을 발효할 경우 발효에 따른 대사작용으로 플라보노이드 및 폴리페놀의 성분이 증가하는 결과를 얻을 수 있는 것을 보여준다.

항산화 활성

체내 활성산소의 불균형은 암, 염증성 질환, 노화 등과 관련이 있으며, 활성산소가 지속적으로 세포 내 축적하게 되면 세포의 단백질, 효소, 지질 및 DNA의 산화가 유발되어 세포의 손상이 일어난다(Urso와 Clarkson, 2003). DPPH는 자유라디칼을 포함하고 있어 항산화 활성을 보이는 시료와 반응을 하면 전자는 내어주며 라디칼이 환원되어 색의 변화가 일어나며, ABTS 역시 항산화 활성을 평가하는 가장 대표적인 방법의 하나로 라디칼을 생성하는 ABTS의 경우 양이온 라디칼의 소거를 통하여 항산화 활성을 평가하는 방법이다(Urso와 Clarkson, 2003; Miller 등, 1993). 위의 두 가지의 항산화 시험방법을 통하여 보리새싹의 발효에 따른 배양액의 항산화 활성을 평가한 결과는 Fig. 3과 같다. DPPH 라디칼 소거능의 경우 보리새싹 발효 초기 36.63%를 나타냈으며 발효가 진행됨에 따라서 DPPH 라디칼 소거능이 증가하여 BSP 발효 48시간 52.93%, BSM 발효 48시간 47.09%로 증가하였다(P<0.05)(Fig. 3A). ABTS 라디칼 소거능의 경우에도 초기 44.63%에서 DPPH 라디칼 소거능과 비슷한 양상으로 발효가 진행됨에 따라서 ABTS 라디칼 소거능이 증가하였으며 BSP 발효 48시간 65.70%로 증가하였으나(P<0.05), BSM의 경우 발효 24시간 56.15%와 48시간 57.09%로 차이가 크지 않은 것을 확인하였다(Fig. 3B). 보리새싹의 유산균 발효물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능에 대한 IC50 값을 측정한 결과(Table 2), 발효 초기 2,255.27±14.67 μg/mL 및 1,923.63±44.01 μg/mL에서 BSP 및 BSM 두 가지 발효에서 모두 활성이 높아지는 것을 보여주었고, BSP가 BSM보다 발효 시간이 경과함에 따라 48시간 기준 DPPH 1,608.41±2.96 μg/mL 및 ABTS 1,238.81±32.45 μg/mL로 항산화 활성도가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 항산화 효능을 나타내는 폴리페놀과 플라보노이드의 함량이 증가하면 항산화 활성과 같은 생리활성 효능이 양의 상관관계를 나타내고 있다는 부분을 고려하였을 때(Imai 등, 1994), 유산균을 이용하여 보리 씨앗과 보리를 발효 시 플라보노이드 및 폴리페놀의 성분이 증가함에 따른 항산화 효능이 증가하는 것임을 확인할 수 있으며(Lee 등, 2018; Zhao 등, 2022), 본 연구에서 사용된 유산균을 이용한 발효에 따른 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량 증가에 따라서 항산화 활성이 높아진 것임을 고려할 수 있다.

Table 2 . IC₅₀ values of DPPH and ABTS radical scavenging activities of fermented barely sprout hot water extract.

Sample	DPPH radical scavenging effect	ABTS radical scavenging effect
	IC501) μg/mL
BS	2,255.27±14.67a2)	1,923.63±44.01a
BSP24	1,958.88±55.76b	1,403.79±56.21b
BSP48	1,608.41±2.96d	1,238.81±32.45c
BSM24	2,074.13±74.01b	1,475.21±76.44b
BSM48	1,823.76±29.44c	1,418.83±53.43b

¹⁾IC₅₀ values were expressed as the mean of 50% scavenging effect concentration of triplicate experiment..

²⁾Different small letters within the same column indicate a significant difference (P<0.05)..

Fig 3. DPPH (A) and ABTS (B) radical scavenging activity of barely sprout hot water extract according to fermentation time (0∼48 h). 0.1 mM ascorbic acid (AA) was used positive control. All experiments were performed in triplicates, and all values were expressed as the mean±SD compared with BS control (*P<0.05).

세포독성시험

보리새싹의 유산균 발효물의 세포독성은 MTT assay를 이용하여 확인하였다(Fig. 4). Raw 264.7 cell에 BS, BSP 48, BSM48을 1, 10, 50, 100, 200 μg/mL의 농도별로 24시간 처리한 후 세포생존율을 확인한 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군을 100%로 할 때 모든 실험군의 세포생존율은 모든 농도에서 99.12%~105.13%를 나타내었으며 대조군과의 유의적인 차이를 보이지 않은 것을 확인하였다. 이를 통하여 보리새싹의 유산균 발효물이 Raw 264.7 cell의 성장에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

Fig 4. Effect of barely sprout hot water extract on Raw 264.7 cell viability. All experiments were performed in triplicates, and all values were expressed as the mean±SD.

NO 생성

대식세포는 체내 선천면역반응 및 적응면역반응을 개시하는 항원제시세포와 같은 기능을 하는 아주 중요한 면역세포이며, 식작용을 통하여 체내로 침입한 병원성 세균이나 외부의 이물을 제거하는 역할을 한다. 세포 내의 병원균을 제거하기 위하여 대식세포는 reactive oxygen species의 일종인 hydrogen peroxide, nitric oxide, TNF-α, IL-6와 같은 cytokine을 분비하여 감염에 대응하며, inducible nitric oxide synthase에 의하여 생성되는 NO는 외부의 병원체에 대한 방어에 있어서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Laskin, 2009). 보리새싹 유산균 발효물의 면역 활성 기능을 평가하기 위하여 Raw 264.7 cell에 1, 10, 50, 100, 200 μg/mL로 24시간 처리한 뒤 생성된 NO를 확인한 결과는 Fig. 5와 같다. 아무 처리를 하지 않은 대조군의 경우 1.03 μM의 NO가 생성되었으며 대식세포를 활성화하는 물질인 LPS를 50 ng/mL와 100 ng/mL로 처리했을 때는 30.84 μM과 40.30 μM의 NO가 생성된 것을 확인하였다(P<0.05). 발효하지 않은 BS의 경우 가장 높은 200 μg/mL에서 27.00 μM의 NO를 생성한 반면, BSP48의 경우 37.16 μM, BSM48 30.11 μM로 발효하였을 때 NO의 생성이 더욱 증가한 것을 확인하였다(P<0.05). 또한 실험에 사용된 모든 농도군에서 농도 의존적으로 NO의 생성이 증가하는 것을 확인하였다. β-Glucan과 같은 식물 유래의 다당체들은 대식세포의 pattern recognition receptors(PRRs)를 통하여 면역 활성 효능을 나타내는 것으로 알려져 있으며 Kim 등(2018b)과 Zhang 등(2022)의 보고에 따르면 유산균 발효에 따른 보리의 β-glucan 함량이 증가함에 따라 대식세포에서의 NO의 생성이 증가하는 것이 보고되었다. 또한, Han 등(Han 등, 2020)은 보리새싹의 다당체를 면역억제 마우스 모델을 이용한 동물실험에서 비장세포의 증식 및 자연살해세포와 T 세포의 활성을 증가시킨다고 보고하였다. 본 연구에서 두 가지 균주를 이용한 발효에 따라서 보리새싹 열수추출물의 다당체 성분이 증가하여 NO의 생성이 증가한 것일 수 있을 것으로 판단된다.

Fig 5. Effect of barely sprout hot water extract on nitric oxide production in Raw 264.7 cell. LPS (50 ng/mL and 100 ng/mL) was used as the positive control and media as negative control. All experiments were performed in triplicates, and all values were expressed as the mean±SD. Different small letters indicate a significant difference between group.

Cytokine gene 발현

보리새싹 유산균 발효물의 Raw 264.7 cell에서 면역반응과 관련된 유전자인 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현을 조절하는지를 확인하기 위하여 시료를 Raw 264.7 세포에 24시간 처리한 뒤, total RNA를 추출하여 cDNA로 역전사하였다. 역전사된 cDNA를 각 target gene에 알맞은 primer를 이용하여 PCR을 수행하여 mRNA의 발현량을 분석하였다(Fig. 6). 시험에 사용된 모든 시료에서 농도 의존적으로 발현의 차이를 보여주고 있으며, BS와 BSM48에 비하여 BSP48을 200 μg/mL로 처리하였을 때 양성대조군으로 사용된 LPS와 비슷한 수준의 발현량을 나타내었다(Fig. 6A). IL-6의 mRNA 발현 정도는 다른 유전자의 mRNA의 발현보다 적은 것을 확인하였으며 발효하지 않은 BS의 경우 100 μg/mL 이하의 농도에서는 mRNA의 발현이 거의 나타나지 않았다(Fig. 6A, F). 유산균을 이용한 보리를 발효물에는 식물유래 다당인 β-glucan, arabinoxylan 등의 다당체가 존재하며, 대식세포에서 MAPK 및 NF-κB의 신호전달을 통한 iNOS, IL-6, TNF-α 등의 cytokine 증가가 보고된 바 있다(Kim 등, 2018b; Zhang 등, 2022). 본 연구에서 보리새싹의 유산균 발효에 따른 Raw 264.7 cell의 면역 활성과 연관된 cytokine 생산 및 유전자의 발현을 통해 NO, TNF-α, IL-6 등을 생산하며 생체방어를 담당하는 선천면역의 활성을 조절할 수 있는 것으로 판단된다.

Fig 6. Effect of barely sprout hot water extract on mRNA expression of iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, and IL-6 in Raw 264.7 cell. LPS (100 ng/mL) was used as the postive control and media as negative control. All experiments were performed in triplicates, and all values were expressed as the mean±SD. Different small letters indicate a significant difference between group.

보리는 국내외로 많이 소비되고 있는 식량 작물이며 보리새싹은 기존의 보리보다 영양분이 뛰어나며 생리활성 기능을 가지고 있다. 최근에는 probiotics를 활용한 발효식품에 많은 관심이 있어 본 연구에서는 유산균을 이용한 보리새싹 열수추출물 발효물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량의 변화를 확인하고 항산화 효과 및 면역계에서 중요한 역할을 하는 대식세포의 면역 활성 기능을 규명하여 유산균 발효 보리새싹의 활용 가능성을 확인하고자 진행되었다. 보리새싹 유산균 발효물인 BSP와 BSM의 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량의 변화를 확인한 결과 발효를 진행함에 따라서 그 함량이 증가한 것을 확인하였으며, DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성을 평가한 결과 항산화 효과를 가지는 폴리페놀과 플라보노이드의 함량이 증가한 결과와 동일하게 증가한 것을 확인하였다. Raw 264.7 마우스 대식세포에 보리새싹 유산균 발효물을 처리하였을 때, 외부 병원균에 대한 방어 작용에 있어 중요한 역할을 하는 NO의 생성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였으며, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 mRNA 유전자 발현 역시 보리새싹 유산균 발효물의 처리에 따라서 농도 의존적으로 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 발효에 사용된 2가지의 유산균의 발효물 중 BSP가 BSM에 비하여 면역 활성이 우수한 것을 확인할 수 있었다.

본 연구는 공주대학교 대학혁신지원사업의 연구지원에 의하여 수행된 연구 결과입니다.