전립선은 주요 남성 생식선으로 정자 활성화 및 수용 능력과 관련이 있으며, 전립선염, 양성 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia, BPH), 전립선암 등 관련 질병의 직접적인 표적이 된다(Verze 등, 2016). 비뇨기과 질환의 유병률은 중년 이후 나이에 따라 함께 증가하는데, 특히 BPH는 50세 이상 남성에게서 발생하는 일반적인 질환 중 하나로 전립선의 크기가 커지는 임상적인 특징을 가지고 있다(Park 등, 2018).

BPH로 인하여 전립선의 부피가 커지게 되면 요도를 막아 요도의 저항성이 증가하고 방광폐쇄의 원인이 될 수 있다(Rho 등, 2019). 특히 BPH로 인한 가장 흔한 증상인 하부요로증상(lower urinary tract symptoms, LUTS)은 배뇨의 빈도 증가, 야간뇨 및 빈뇨 등의 증상을 동반하며 이는 방광목, 요도의 구조적 왜곡 및 기능적 이상으로 발생하여 삶의 질을 저하한다(Priest 등, 2012). BPH에서 주로 전립선 전이 영역 내에서 평활근과 상피 세포의 증식이 일어나게 되는데, 이들 세포의 유의적인 성장과 관련된 조직학적 변화로 LUTS를 유발한다(Minutoli 등, 2013).

BPH의 원인은 아직 명확하게 밝혀지지 않았으나 안드로겐 수준이 BPH의 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 고환에서 생성된 testosterone(T)은 전립선에서 스테로이드 대사에 관여하는 효소인 5-alpha reductase(5AR)에 의해 dihydrotestosterone(DHT)으로 전환된다(Shirakawa 등, 2004). DHT는 T에 비하여 약 2~10배의 친화도로 androgen receptor(AR)에 결합하며 분해에 강한 저항성을 가지는 AR 결합을 형성하는데(Schmidt와 Tindall, 2011), 그 결과로 안드로겐 의존성 유전자의 전사를 증가시키고 세포사멸의 억제와 세포 증식의 유도로 전립선 비대증을 촉진하게 된다(Choi 등, 2019; Youn 등, 2018). 안드로겐 전환효소인 5AR은 세 가지 이성질체가 있는 것으로 알려져 있는데, 그중 type 2형인 5AR2는 전립선비대 조직에서 과발현되는 경향이 있으며 T에서 DHT로의 비가역적인 전환을 유도한다(Schmidt와 Tindall, 2011). 5AR의 발현을 저해하여 T에서 DHT로의 전환을 막아 BPH를 억제하는 약물인 finasteride는(Kim 등, 2018) 전립선의 5AR2의 수준을 80~90% 감소시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 finasteride는 다양한 부작용을 동반하기 때문에 상대적으로 부작용이 적은 천연 물질로부터 BPH를 개선하기 위한 연구가 계속되고 있다.

겨우살이(mistletoe)는 여러 국가에서 민간요법으로 사용되어 왔으며, 그중 한국산 겨우살이(Viscum albim var. coloratum)는 겨우살이과(Loranthaceae)에 속하며 참나무, 팽나무, 밤나무 등에 기생하는 늘푸른떨기나무로 우리나라 전역에 분포하고 있다(Hwang 등, 2003). 겨우살이는 항비만(Jung 등, 2013), 항산화(Lee 등, 2010) 및 항암(Han 등, 2015) 등의 활성이 있는 것으로 알려졌으며, 본 연구에서는 겨우살이 추출물의 BPH 억제 효과를 in vivo 및 in vitro 실험을 통해 검토하였다.

추출물의 제조

겨우살이는 지리산농부마을 협동영농조합법인(Gurye, Korea)에서 구매하였다. 건 겨우살이 줄기와 잎(1 kg)을 푸드믹서(Hyundai gajeonup, Incheon, Korea)로 분쇄하였다. 분쇄된 겨우살이 무게의 4배 분량의 30% 에탄올(w/v) 및 99.9% 에탄올(w/v)을 각각 24시간 간격으로 실온에서 총 3회 추출하여 12 L의 30% 에탄올 추출물과 99.9% 에탄올 추출물을 얻었다. 또한 분쇄된 겨우살이 무게의 10배 분량의 증류수를 100°C에서 30분 동안 가열해 열수 추출물을 얻었다. 모든 추출물을 Whatman No.1(Whatman International Ltd., Maidstone, Kent, UK)에 여과하고 감압농축기(N-1200A, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 60°C에서 농축을 진행하였으며 농축된 추출물은 동결건조기(ilShin BioBase, Dongducheon, Korea)를 이용하여 동결건조한 후에 -80°C에서 냉동 보관하였다. 각 추출물은 다양한 추출법에서 겨우살이의 효능을 평가하기 위해 사용되었다. 최종적으로 본 실험에서는 에탄올 30% 추출물을 사용하였으며, 겨우살이 중량 1 kg에서 약 25.39 g을 수득하였고 이를 VA30E라고 명명하였다.

세포 배양

전립선 비대 세포주인 BPH-1 세포(DSMZ, Braunschweig, Germany)를 사용했다. 세포는 20% FBS, 1% antibiotic antimycotic solution, 20 ng/mL testosterone, 5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL sodium selenite, 5 μg/mL insulin이 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37°C, 5% CO₂의 환경에서 배양되었다.

Cell viability

VA30E이 BPH-1의 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. BPH-1 cell(1×10⁴ cell/well)을 96 well plate에 seeding 하고, 24시간 동안 37°C, 5% CO₂에서 배양했다. 이후 1× PBS로 세척하고 다양한 농도의 VA30E를 포함한 배지를 100 μL씩 분주하여 48시간 동안 배양했다. 이후 2 mg/mL의 MTT solution(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 100 μL 분주하고 2시간 동안 배양하였다. 배지를 모두 제거한 뒤 DMSO를 100 μL씩 분주하여 formazan을 용해시키고 570 nm에서 EPOCH microplate reader(BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)로 흡광도를 측정하였다.

Quantitative real time polymerase-chain reaction(qPCR)

BPH-1 cell에서 VA30E의 처리가 AR에 미치는 영향을 알아보기 위하여 qPCR을 진행하였다. BPH-1 cell(3×10⁵ cell/well)을 6 well plate에 seeding 하고, 24시간 동안 37°C, 5% CO2에서 배양했다. 이후 1× PBS로 세척하고 다양한 농도의 VA30E를 포함한 배지를 1 mL씩 분주하고 48시간 동안 배양했다. 이후 배지를 모두 제거한 뒤 1× PBS로 세척하고 RNAiso(TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japan)를 이용하여 BPH-1에서 RNA를 추출하였고 T100tm Thermal Cycler(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. qPCR 측정은 HiPi Real-Time PCR 2× Master Mix(ELPIS, Daejeon, Korea)를 사용하여 Light Cycler 96(Roche, Basel, Switzerland)로 확인하였다. GAPDH를 internal control로 사용하여 AR을 확인하였다. qPCR 조건은 다음과 같다. 95°C에서 10분간 preincubation 후, 95°C에서 10초, 55°C 10초, 72°C에서 10초 순서로 총 40 cycle의 PCR을 진행 후, 95°C 5초, 65°C 60초의 Melting curve analysis와 37°C 30초의 cooling time을 가졌다. Real-time qPCR 수행을 위한 primer 염기서열로 GAPDH는 forward 5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′, reverse 5′-CGGAGTGAACGGATTTGGTCGTAT-3′, AR은 forward 5′-AGCACCATGCAACTCCTTCAG-3′, reverse 5′-CACCGACACTGCCTTACACAA-3′를 사용하였다.

실험동물

7주령의 수컷 Sprague-Dawley(SD) rats를 라온바이오(Yongin, Korea)에서 구매하였다. 1주일간의 적응 기간을 거친 뒤 실험을 진행하였다. 실험동물은 온도 22±2°C, 상대습도 55±5%, 명암 주기가 12시간인 상태 아래 사육되었다. 물과 멸균된 사료는 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 몸무게는 이틀에 한 번 측정하였으며 식이 효율을 위하여 사흘에 1회 사료 무게를 측정하였다. 본 실험은 수원대학교 동물 실험 윤리위원회의 승인(USW-IACUC-R-2020-005)을 받아 진행하였다.

실험군 분류 및 시료 투여

일주일의 적응 기간을 거친 후 대조군(Control 군)을 제외한 모든 그룹을 대상으로 중성화 수술을 하였다. 중성화 수술을 위하여 음낭을 절개하여 양측 고환을 제거하고 출혈을 막고 회복을 위해 절개 부위의 봉합을 진행하였다. 수술 이후 일주일간의 회복 기간을 두었다.

각 군은 8마리이며 BPH의 유도를 위해 testosterone propionate(TP)(TCI, Tokyo, Japan)를 3 mg/kg의 농도로 corn oil에 녹여 0.1 mL씩 4주간 매일 피하주사하였고 sample 또한 4주간 경구투여를 진행하였다. 실험동물 그룹의 분류는 다음과 같다. (1) Control 군: corn oil을 피하주사하고 식염수를 경구투여한 군, (2) BPH 군: TP(3 mg/kg of BW/d)를 피하주사하고 식염수를 투여한 군, (3) VA30E-50 군: TP(3 mg/kg of BW/d)를 피하주사하고 VA30E(50 mg/kg)를 투여한 군, (4) VA30E-150 군: TP(3 mg/kg of BW/d)를 피하주사하고 VA30E(150 mg/kg)를 투여한 군, (5) Saw palmetto 군: TP(3 mg/kg of BW/d)를 피하주사하고 saw palmetto(100 mg/kg)(Natural Medicinals Inc., Felda, FL, USA)를 투여한 군이다.

Serum의 분리 및 장기 무게 측정

Rat는 희생 전 12시간 동안 절식을 진행하고 CO₂ chamber에서 희생하였다. 혈액 채취 후 간과 전립선을 수집하여 무게를 측정하였다. 채취한 혈액은 serum 분리를 위해 1,911×g에서 20분간 원심분리(MF-80, Hanil Science Industrial, Incheon, Korea)를 진행하였다. 수집된 모든 장기는 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)에서 세척하여 -80°C에 저장하였다.

ALT, AST 측정

Alanine aminotransferase(ALT) 및 aspartate aminotransferase(AST)는 건식 화학 분석기(FUJI DRI CHEM 500i, FUJI Photo Film Co., Ltd, Tokyo, Japan)와 건식 화학 분석기 전용 FUJI DRI-CHEM SLIDE kit(FUJI Photo Film Co., Ltd)을 사용하여 혈청으로부터 측정하였다.

조직학적 분석

전립선 조직은 10% formaldehyde에 고정하고 탈수하여 파라핀에 고정하였다. 파라핀에 고정된 전립선 조직은 2 μm 두께로 절단하여 Hematoxyline & Eosin(H&E)으로 염색했다. 절단한 조직은 커버 글라스로 덮어 광학 현미경으로 100배 확대하여 전립선 조직을 평가하였다.

Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)

전립선 조직 100 mg당 1× PBS(pH 7.4)를 1 mL 가하여 균질화를 진행하고 5,000×g, 4°C에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 채취한 이후 전립선 조직 내 T, DHT, 5AR2의 수준을 측정하기 위하여 T, DHT, 5AR2 ELISA kit(Cusabio, Wuhan, China)을 사용하였으며 450 nm에서 흡광도(BioTek Instruments)를 측정하였다. 측정된 흡광도 값은 Curve Expert 1.3을 사용하여 계산하였고 백분율로 표시하였다. 모든 assay는 manufacturer의 instruction에 따라 수행되었다.

통계분석

진행된 실험의 결과는 mean±standard error(SE) 및 mean±standard deviation(SD)으로 표기하였으며 통계 처리는 통계 프로그램인 SPSS(Ver. 20, IBM Corporation, Armonk, NY, USA)를 사용하여 수행하였다. 또한 실험군 간 차이는 Duncan's multiple range tests로 P<0.05 수준에서 통계적 유의성을 검정하였다.

다양한 조건에서 추출한 겨우살이 추출물의 세포 증식억제 효과

본 연구에서는 겨우살이 추출물을 다양한 조건에서 추출하여 BPH-1 세포주에서 MTT assay를 실시하고 세포 증식억제 효과를 확인하였다(Fig. 1). 겨우살이 99.9% 에탄올 추출물 농도 100 μg/mL 및 200 μg/mL에서 세포 증식을 53.53%, 46.58%로 각각 억제하였으며(Fig. 1A) 겨우살이 30% 에탄올 추출물 농도 200 μg/mL에서 세포 증식을 98.97% 억제하였고(Fig. 1B), 겨우살이 열수 추출물 농도 200 μg/mL에서 세포 증식을 40.95% 억제하였다(Fig. 1C). 위의 결과로 보아 겨우살이 추출물은 전립선비대 세포의 증식을 억제하는 효과가 있을 것으로 예상된다. 따라서 본 실험에서 가장 높은 세포 증식억제 효과를 보여준 겨우살이 30% 에탄올 추출물을 실험에 사용하였다.

Fig 1. Inhibitory effect of Viscum album var. coloratum on cell proliferation in BPH-1 cells. EtOH 99.9% extract of Viscum album (A), EtOH 30% extract of Viscum album (B), and hot water extract of Viscum album (C). All data was expressed as mean±SD. Different letters above the bar are statistically different by Duncan's multiple range test (P<0.05).

In vitro에서 VA30E의 BPH 억제 효과

BPH-1 세포에서 AR의 발현을 확인하기 위하여 VA30E를 다양한 농도(100, 200, 500 μg/mL)로 처리하고 mRNA 변화를 측정하였다(Fig. 2). AR은 핵 호르몬 수용체 상과의 구성원으로 안드로겐과 결합하여 활성화되며 다양한 조직 및 세포 유형에서 유전자 발현에 영향을 미친다(Nicholson과 Ricke, 2011). T와 DHT의 생물학적 활성은 AR과 결합하여 남성의 생리학적 과정에 관여하는 유전자의 전사인자로 작용하며 BPH 발생에 중요한 역할을 한다(Afify 등, 2020; Heinlein과 Chang, 2002). VA30E의 처리로 AR의 발현은 농도 의존적으로 감소하였으며 200 μg/mL와 500 μg/mL에서 유의적으로 가장 낮은 발현 수준을 나타냈다. 이를 통하여 VA30E가 세포 증식억제 효과와 AR의 발현 감소를 통해 BPH를 개선할 수 있는 잠재성을 시사하였다.

Fig 2. Effect of VA30E on mRNA expression of AR in BPH-1 cells. Quantitative real time polymerase-chain reaction (qPCR) was used to detect the level of the AR mRNA. All data was expressed as mean±SD. Different letters above the bar are statistically different by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

In vivo에서 VA30E가 체중에 미치는 영향 및 간 독성 확인

총 4주간 VA30E를 투여한 뒤 rat의 몸무게를 측정하였다. 체중 증가량(BW gain)은 VA30E 투여 시작 시 측정한 무게와 VA30E 투여 종료 후 희생 전 측정한 무게의 차이로 구하였다(Table 1). BW gain은 Control 군(91.47±5.78 g)에서 유의적으로 가장 높았으며 VA30E–150 군(55.41±4.36 g)에서 유의적으로 가장 낮았다. 해당 결과는 BPH 모델에서 BW gain이 유의적으로 감소하였다고 보고한 Adaramoye 등(2019)의 연구와 일치하였다.

Table 1 . Effect of VA30E on body weight gain and food efficiency ratio (FER) (Unit: g).

Group1)	Initial BW	Final BW	BW gain2)
Control	326.37±4.84a	417.84±9.20a	91.47±5.78a
BPH	302.21±4.92b	361.19±7.38c	58.98±4.23bc
VA30E-50	298.73±4.92b	362.22±6.25c	63.50±3.88bc
VA30E-150	303.39±4.19b	358.80±7.13c	55.41±4.36c
Saw palmetto	321.05±2.90a	393.12±5.07b	72.08±6.24b

¹⁾Control: corn oil＋saline solution, BPH: TP (3 mg/kg of BW/d)＋saline solution, VA30E-50: TP (3 mg/kg of BW/d)＋VA30E (50 mg/kg of BW/d), VA30E-150: TP (3 mg/kg of BW/d)＋VA30E (150 mg/kg of BW/d), Saw palmetto: TP (3 mg/kg of BW/d)＋Saw palmetto (100 mg/kg of BW/d). All data was expressed as mean±SE. Different letters are statistically different by Duncan’s multiple range test (P<0.05)..

²⁾Body weight gain (g): final body weight (g)－initial body weight (g)..

간 독성 평가에서 일반적으로 사용되는 지표인 AST와 ALT 수준에 대한 VA30E의 효과를 측정하였다. AST는 간 조직 외에 심장, 골격근 및 적혈구에도 존재하며, ALT는 간에 존재하여 간 손상을 나타내는 가장 명확한 지표이다(Goorden 등, 2013). AST 및 ALT의 농도는 간 또는 장기의 손상 후에 유의하게 증가할 수 있다. 본 연구에서는 Table 2에서 보는 바와 같이 VA30E를 처리한 군에서 AST 및 ALT 활성의 유의한 증가는 관찰되지 않았으며, 이는 VA30E가 간 손상을 유발하지 않았음을 보여준다.

Table 2 . Effect of VA30E on aspartate transaminase (AST) and alanine transaminase (ALT).

Group1)	AST (U/I)	ALT (U/I)
Control	62±3.46a2)	22±1.25a
BPH	63±3.36a	17±1.36a
VA30E-50	64±4.87a	17±1.69a
VA30E-150	68±3.02a	17±1.27a
Saw palmetto	72±6.30a	22±2.73a

¹⁾Control: corn oil＋saline solution, BPH: TP (3 mg/kg of BW/d)＋saline solution, VA30E-50: TP (3 mg/kg of BW/d)＋VA30E (50 mg/kg of BW/d), VA30E-150: TP (3 mg/kg of BW/d)＋VA30E (150 mg/kg of BW/d), Saw palmetto: TP (3 mg/kg of BW/d)＋Saw palmetto (100 mg/kg of BW/d)..

²⁾All data was expressed as mean±SE. Different letters are statistically different by Duncan’s multiple range test (P<0.05)..

In vivo에서 VA30E가 전립선의 무게 및 조직에 미치는 영향

전립선의 크기는 BPH에서 중요한 생체 지표로 사용된다(Shin 등, 2012). 실험동물의 전립선 크기 및 무게를 측정하고 군별 비교를 위해 전립선의 무게를 몸무게와 나누어 prostate ratio로 나타냈다. Prostate ratio는 rat의 몸무게 100 g당 전립선 무게로 나타내어 전립선 비율을 보여준다(Fig. 3).

Fig 3. Effect of VA30E on the prostate weight and prostate ratio in rat with TP-induced BPH. Photographs of the prostate tissues (A). Total prostate tissue weight (B) and Prostate ratio of the rats (B). Prostate ratio: prostate weight/body weight. Control: corn oil+saline solution, BPH: TP (3 mg/kg of BW/d)＋saline solution, VA30E-50: TP (3 mg/kg of BW/d)＋VA30E (50 mg/kg of BW/d), VA30E-150: TP (3 mg/kg of BW/d)＋VA30E (150 mg/kg of BW/d), Saw palmetto: TP (3 mg/kg of BW/d)＋Saw palmetto (100 mg/kg of BW/d). All data was expressed as mean±SE. Different letters above the bar are statistically different by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

Fig. 3A에서 Control 군에 비해 BPH 군의 전립선의 크기가 증가하였으며, VA30E 및 Saw palmetto를 투여한 군은 BPH 군에 비해 전립선의 크기가 감소하였다. Fig. 3B와 3C는 전립선 무게와 몸무게에 대한 전립선 무게 비율인 prostate ratio 결과로, 두 결과에서 모두 Control 군과 비교하여 BPH 군이 유의적으로 증가하였으며, VA30E-150 군에서 유의적인 감소를 나타내었다.

Fig. 4는 전립선의 조직학적 변화를 확인하기 위해 실시한 H&E의 결과이다. Fig. 4A의 Control 군과 Fig. 4B의 BPH 군을 비교했을 때 BPH 군의 전립선 상피조직이 두꺼워지고 내강이 좁아졌다. 대조적으로 Fig. 4C의 VA30E-50 군과 Fig. 4D의 VA30E-150 군은 BPH 군에 비해 상피조직이 얇고 내강이 넓었으며, 양성대조군인 Saw palmetto 군(Fig. 4E)과 유사한 결과를 보였다. Fig. 4F에서 전립선 상피조직의 두께를 정량화하여 그래프로 나타내었다. VA30E-50 및 VA30E-150 군에서 BPH 군에 비해 상피조직의 두께가 유의적으로 감소하였으며, 특히 VA30E-150 군의 경우 positive control인 Saw palmetto 군 및 Control 군과 유사한 수준을 나타냈다. 이를 통해 VA30E가 전립선의 비대와 조직의 비정상적인 성장을 억제하여 BPH를 억제할 수 있음을 시사한다.

Fig 4. Effect of VA30E on prostate tissue H&E histology of rats with TP-induced BPH. Representative photomicrograhps of the H&E-stained prostate tissues are presented (magnification, 100×). Control: corn oil＋saline solution (A), BPH: TP (3 mg/kg of BW/d)＋saline solution (B), VA30E-50: TP (3 mg/kg of BW/d)＋VA30E (50 mg/kg of BW/d) (C), VA30E-150: TP (3 mg/kg of BW/d)＋VA30E (150 mg/kg of BW/d) (D), Saw palmetto: TP (3 mg/kg of BW/d)＋Saw palmetto (100 mg/kg of BW/d) (E), and quantified epidermal thickness (F).

In vivo에서 VA30E가 T, DHT, 5AR2에 미치는 영향

VA30E의 투여를 통해 5AR2가 조절되어 DHT가 감소하였는지 확인하기 위해 전립선 조직을 이용하여 T, DHT, 5AR2를 측정하였다. T는 자연적으로 분비되는 안드로겐 호르몬으로 남성의 2차 성징 및 근육 성장에 중요한 역할을 하며(Vingren 등, 2010), BPH 발달에 중요한 DHT의 전구체이다(Kim 등, 2017). VA30E의 투여가 rat의 T에 미치는 영향을 알아보기 위하여 전립선 조직에서 T를 측정하여 Fig. 5A에 그래프로 나타냈다. BPH 군의 T 수준은 Control 군과 비교했을 때 94.82% 증가로 유의적 차이를 나타냈다. 반면, VA30E-50 군과 VA30E-150 군의 T 수준은 BPH 군과 비교했을 때 각각 43.47%, 46.01% 감소하여 유의적 차이를 나타냈으며 Control 군과 통계적으로 동일한 수준을 보여주었다. Saw palmetto 군의 T 수준은 BPH 군에 비해 유의적으로 감소하여 VA30E 군과 동일한 수준을 보여주었다.

Fig 5. Effect of VA30E on T and DHT level in prostate. ELISA was used to detect the level of T (A), DHT level in prostate (B). Control: corn oil＋saline solution, BPH: TP (3 mg/kg of BW/d)＋saline solution, VA30E-50: TP (3 mg/kg of BW/d)＋VA30E (50 mg/kg of BW/d), VA30E-150: TP (3 mg/kg of BW/d)＋VA30E (150 mg/kg of BW/d), Saw palmetto: TP (3 mg/kg of BW/d)＋Saw palmetto (100 mg/kg of BW/d). All data was expressed as mean±SE. Different letters above the bar are statistically different by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

DHT는 T의 대사물질로 5-alpha reductase에 의해 전립선에서 생성되어 전립선 성장의 중요한 매개체 역할을 한다(Jeon 등, 2017). VA30E의 투여가 rats의 DHT에 미치는 영향을 알아보기 위하여 전립선 조직에서 DHT를 측정하여 Fig. 5B에 그래프로 나타냈다. BPH 군의 DHT 수준은 Control 군과 비교했을 때 109.89% 상승하여 유의적 차이를 나타냈다. 반면, VA30E-50 군과 VA30E-150 군의 DHT 수준은 BPH 군과 비교했을 때 각각 20.58%, 22.26% 감소하여 유의적 차이를 나타냈다. Saw palmetto 군의 DHT 수준은 BPH 군에 비해 유의적으로 감소하여 VA30E 투여군과 동일한 수준을 보여주었다.

5AR2는 전립선에 존재하며 T를 DHT로 전환하는 효소로 일반 전립선에서보다 BPH에서 증가하는 특징이 있다(Schmidt와 Tindall, 2011). VA30E의 투여가 rats 전립선의 5AR2에 미치는 영향을 알아보기 위하여 전립선 조직에서 5AR2를 측정하여 Fig. 6에 그래프로 나타냈다. BPH 군의 5AR2 수준은 Control 군과 비교했을 때 133.05% 상승하여 유의적 차이를 나타냈다. 반면, VA30E-50 군과 VA30E-150 군의 5AR2 수준은 BPH 군과 비교했을 때 각각 30.93 %, 34.75% 감소하여 유의적 차이를 나타냈으며 Saw palmetto 군의 5AR2 수준은 BPH 군과 비교했을 때 유의적으로 감소하여 VA30E 군과 통계적으로 동일한 수준을 보여주었다.

Fig 6. Effect of VA30E on 5-alpha reductase 2 (5AR2) level in prostate. ELISA was used to detect the level of the 5AR2. Control: corn oil＋saline solution, BPH: TP (3 mg/kg of BW/d)＋saline solution, VA30E-50: TP (3 mg/kg of BW/d)＋VA30E (50 mg/kg of BW/d), VA30E-150: TP (3 mg/kg of BW/d)＋VA 30E (150 mg/kg of BW/d), Saw palmetto: TP (3 mg/kg of BW/d)＋Saw palmetto (100 mg/kg of BW/d). All data was expressed as mean±SE. Different letters above the bar are statistically different by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

본 연구에서 겨우살이 30% 추출물 VA30E의 투여는 전립선비대증을 유발한 SD rat에서 농도 의존적으로 T와 DHT 및 5AR2의 발현을 감소시켜 BPH에 대한 억제 효과를 보여주었다. Hwang(2011)에 따르면 겨우살이에는 당단백질인 lectin, flavonoid 배당체인 homoflavoyadorinin B 및triterpenoid인 oleanolic acid 등이 있는 것으로 알려져 있다. 그중 oleanolic acid의 투여는 BPH를 유발한 SD rat에서 혈청 DHT 및 전립선조직 내 5AR2 수준을 감소시켜 BPH 발달을 억제한다는 보고가 있다(Cheon 등, 2020). 본 실험에서 VA30E는 전립선조직 내 T, DHT 및 5AR2의 수준을 감소시켰으며, 이러한 결과는 Cheon 등(2020)의 연구와 일치하였다. 또한 겨우살이 추출물을 이용한 다른 연구에서는 triterpenoid, lectin이 세포사멸을 유도한다고 보고하고 있으며(Delebinski 등, 2015), 이러한 성분의 효과가 전립선 세포의 증식을 억제하는 데 영향을 미쳤을 것으로 생각한다.

안드로겐은 BPH의 발달에 매우 중요하다. 그중 DHT는 AR과 높은 결합능력으로 인해 BPH 발달에 핵심적인 역할을 한다. 전립선조직 내 T는 전립선의 5AR2를 통해 DHT로 전환되고, 이는 BPH의 발달로 이어질 수 있다. 본 연구에서 VA30E의 투여로 5AR2 및 DHT의 수준이 감소하였고, 이는 VA30E에 포함된 oleanolic acid가 중요한 역할을 했을 것으로 예상된다. 그러나 VA30E로 인한 BPH 발달의 정확한 기전을 확립하기 위해서는 VA30E에 존재하는 다양한 성분들의 효능을 비교하는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 따라서 후속연구가 진행된다면 VA30E는 BPH의 개선을 위한 건강기능식품의 소재가 될 수 있을 것으로 생각된다.

본 연구의 결과, 겨우살이 30% 에탄올 추출물 VA30E는 in vivo 및 in vitro BPH 모델에서 BPH의 발달을 억제하는 것으로 확인되었다. VA30E는 전립선비대 세포주인 BPH- 1 cell에서 cell viability를 최대 98.97%까지 감소시켰으며, 안드로겐 수용체 AR의 발현을 mRNA 수준에서 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 BPH를 유발한 SD rat에서 VA30E를 4주간 투여한 결과, TP투여로 인해 증가한 전립선 무게 및 prostate ratio를 농도 의존적으로 감소시켰으며 전립선 상피조직의 두께와 내강의 크기를 Saw palmetto 투여군과 유사한 수준으로 변화시켰다. 이러한 결과들을 바탕으로 VA30E의 BPH 억제기전을 알아보기 위하여 전립선조직 내 T, DHT 및 5AR2 수준을 검토하였다. 4주간의 VA30E 투여는 전립선조직 내 T 수준을 Control 군과 유사하게 감소시켰으며, DHT 수준 또한 50 및 150 mg/kg, 두 농도에서 모두 감소시켰다. 전립선조직 내 5AR2의 경우 VA30E 투여로 인해 발현이 억제되었으며, 이는 Saw palmetto 군과 동일한 수준이었다. 결과적으로 겨우살이 30% 에탄올 추출물 VA30E의 투여는 in vitro 모델에서 세포 증식 및 AR의 발현을 감소시켰으며, in vivo 모델에서 전립선조직 내 T 및 5AR2 수준을 감소시키고 BPH 발달을 억제하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 VA30E가 BPH를 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 생각된다.