Ex) Article Title, Author, Keywords
Online ISSN 2288-5978
Ex) Article Title, Author, Keywords
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(1): 28-37
Published online January 31, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.1.28
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
Hye-Jin Park1 , Hee-Young Jung2
, and Young-Je Cho1
1School of Food science & Biotechnology and
2School of Applied Biosciences, Kyungpook National University
Correspondence to:Young-Je Cho, School of Food Science & Biotechnology, Kyungpook National University, 80, Daehak-ro, Buk-gu, Daegu 41566, Korea, E-mail: yjcho@knu.ac.kr
Author information: Hye-Jin Park (Researcher), Hee-Young Jung (Professor), Young-Je Cho (Professor)
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
This study was designed to investigate the effects of different doses of gamma irradiation on the anti-oxidative activities, sugar degradation enzyme activity, and extraction yields of Ilxeris dentata NAKAI. Physical techniques to identify irradiation, namely photostimulated luminescence, thermoluminescence and electron spin resonance, confirmed that Ilxeris dentata NAKAI was gamma-irradiated. The total phenolics content (TPC) was higher in extracts from irradiated Ilxeris dentata NAKAI than from non-irradiated (0 kGy) samples. The inhibition of DPPH radical scavenging activity by water extracts from 0 kGy and 10 kGy irradiated Ilxeris dentata NAKAI was very high at over 80% each. The inhibition of ABTS radical cation activity by the water extracts from 0 kGy and 10 kGy irradiated Ilxeris dentata NAKAI was also very high at over 99% each, at 200 μg/mL TPC concentration. The antioxidant protection factor (PF) in the water extract from 10 kGy irradiated Ilxeris dentata NAKAI showed a very high level of activity at 1.41∼3.06 PF at 50∼200 μg/mL TPC concentrations. The thiobarbituric acid reactive substances in the water extract from 10 kGy irradiated Ilxeris dentata NAKAI showed high levels of 85.22∼98.57% inhibition at 50∼200 μg/mL TPC concentration. The pancreatin α-amylase inhibitory activities were high at 38.52∼100.00% at 50∼200 μg/mL TPC concentrations of water extract with 10 kGy irradiation doses. These results suggest an enhancement of extraction yields of phenolic compounds and biological activities from Ilxeris dentata NAKAI by gamma ray irradiation at 10 kGy. Also, treatment by gamma-irradiation can be used to amplify the solubility of biologically active compounds in plants.
Keywords: antioxidant, sugar degradation enzyme, Ilxeris dentata NAKAI, extracts, gamma irradiation
최근 건강에 대한 개념이 삶의 질 향상을 위한 방향으로 전개되면서 식품을 이용한 생체면역 증강, 노화방지, 성인병 예방 등 식품의 약리적 역할에 대한 연구로 전환되고 있다(Shim 등, 2005). 특히 천연 약용식물은 체내의 유해 활성산소 발생을 감소시키는 등 생리적 활성을 다양하게 가지고 있는 것으로 보고되고 있어, 약리식물을 이용하여 인체를 질병으로부터 예방하고 노화를 억제하는 생리활성 물질 탐색을 위한 연구가 다양하게 이루어지고 있다(Cho 등, 2008).
씀바귀(
감마선을 식품 및 식품재료에 조사하는 기술은 식품 및 식품소재의 부패방지와 보존성 증가 효과를 위해 식품, 제약, 의학 및 화장품 분야 등에 사용되는 기술이다(Byun, 1994; Lee 등, 2001). 식품에 대한 방사선 조사는 FAO, IAEA 및 WHO에서 10 kGy 이하 방사선량의 조사가 식품에서 독성학적 위해, 영양학적 및 미생물학적 문제를 일으키지 않는다고 규정함에 따라 식품에 방사선을 조사하는 기술에 대한 안전성이 인정되었다(FAO/IAEA/WHO, 1981). 감마선 조사 기술을 천연 약용식물에 적용할 경우 생리활성 물질의 추출수율을 증진시키고 색상을 개선하면서 생리활성을 유지하여 품질개량의 우수한 방법으로도 알려져(Jo 등, 2003), 방사선 조사 기술에 의한 기능성 소재로서의 활용도 향상이 기대된다(Park, 2006).
현재 식품의약품안천처 식품공전에 따르면 식품에 대한 방사선 조사식품을 확인하는 시험으로 유전자코메트 분석법(스크리닝 검사법), 광자극발광법(Photostimulated Luminescence, PSL), 열발광법(Thermoluminescence, TL), 전자스핀공명법(Electron Spin Resonance spectroscopy, ESR), 기체크로마토그래피/질량분석법(Gas chromatography/Mass spectrometry)이 고시되어 있다(MFDS, 2021). 일반적으로 건조 향신료에 대한 물리적 검지법으로서 방사선 조사 여부를 screening 하는 방법으로 PSL, TL, ESR을 적용하는데, 가장 기본적인 PSL 분석은 식품에 혼입된 이물질인 광물질이 가지는 발광 특성을 이용하는 방법이다(MFDS, 2021; European Committee for Standard, 2002). 같은 맥락으로 TL 분석은 식품이나 식품원료에 존재하는 미네랄의 발광 특성을 응용하여 방사선 흡수량에 따라 일정 온도에 노출되면서 에너지를 방출하고 독특한 TL glow curve를 나타내며, glow curve의 적분한 면적값으로 분석하여 방사선 조사 여부를 판별할 수 있다(Lee 등, 2002; European Committee for Standard, 2001). 또한 ESR은 특수한 시료에서만 나타나는 자유라디칼(free radical)을 분광학적으로 측정하는 방법으로, 뼈, 셀룰로오스 및 결정형 당(crystalline sugar)을 함유한 식품에서만 측정이 가능하다(MFDS, 2021; European Committee for Standard, 2000). 식품의약품안전처에서는 건조 향신료 등에 대해서만 PSL과 TL 분석 적용을 고시하고 있고 약용식물에 대한 PSL과 TL 분석 적용은 아직 고시되지 않고 있어, 본 연구에서는 약용식물로 사용되고 있는 씀바귀에 대한 PSL, TL, ESR 분석의 적용 가능성을 검토코자 하였다.
따라서 본 연구에서는 천연 약용식물인 씀바귀에 감마선을 조사 처리한 후 발광분석법(PSL, TL)과 전자스핀공명법(ESR)을 적용하여 방사선 조사 여부를 판별하였으며, 감마선 조사처리가 씀바귀의 추출수율과 생리활성에 어떤 영향을 주는지 비교하여 방사선 조사처리를 통한 씀바귀의 기능성 소재로서의 활용도 향상을 시도하였다.
실험재료
연구에 사용한 씀바귀는 대구 소재의 약령시장에서 유통되는 국내산 한약재를 구입하여 사용하였다. 방사선 조사 여부 판정을 위한 분석은 감마선 조사된 건조 시료를 세절하여 시행하였고, 생리활성평가는 감마선 조사된 시료를 실험실용 분쇄기(RT-04, Mill Powder Tech., Tainan, Taiwan)를 이용하여 40 mesh로 분쇄한 후 저온저장고(4°C)에서 보관하면서 필요에 따라 추출하여 시료로 사용하였다.
시료의 감마선 조사(irradiation) 처리
시료의 감마선 조사처리는 한국원자력연구원 첨단방사선연구소(Korea Atomic Energy Research Institute, Advance Radiation Technology Institute, Jeongeup, Korea)의 감마선(60Co) 조사처리 시설(100 kCi point source, AECL, IR-79, MDS Nordion International Co., Ltd., Ottawa, Canada)에서 실시하였다. 각 시료당 총 흡수선량을 0, 5, 10 kGy로 설정하여 실온에서 시간당 일정한 선량으로 조사하였으며, 흡수선량은 ceric/cerous dosimeter를 사용하여 측정하였다. TL 분석을 위한 재조사(re-irradiation)는 흡수선량을 1 kGy로 설정하여 동일한 시설에서 조사하였다.
시료의 감마선 조사 여부 판정을 위한 광자극발광(PSL) 분석
씀바귀의 PSL 분석은 식품공전의 방법(MFDS, 2021)에 준하여 햇볕이 차광된 조건에서 PSL 측정용 Petri dish(직경 50 mm)에 분쇄한 시료를 골고루 펼쳐 담아서 준비하고, PSL screening system(Serial 0021, Scottish Universities Research and Reactor Center, Glasgow, UK)을 이용하여 60초 동안 방출되는 photon counts(PCs)를 시료별로 각 2회씩 측정하였다. PSL 측정 조건은 cycle 60초, dark count 21, light count 23으로 시행하였으며, 조사 여부 판정을 위한 임계값(threshold value)은 T1은 700 count/60초, T2는 5,000 count/60초였으며, 측정값이 T1 미만일 경우 비조사 시료로 판단하고 T2를 초과할 경우는 조사 시료로 판단하였다. T1과 T2 사이의 값을 나타낼 경우 조사 여부를 판단할 수 없는 시료로 판정하였다(MFDS, 2021; Raffi와 Benzaria, 1994).
시료의 감마선 조사 여부 판정을 위한 열 발광(TL) 분석
씀바귀의 TL 분석은 식품공전의 방법(MFDS, 2021)에 준하여 측정하였다. 우선 시료에 포함된 미네랄을 추출하기 위해 시료 50 g에 증류수 500 mL를 넣고 ultrasonic agitator(Power sonic 420, Whasin Tech, Daegu, Korea)에서 10분 동안 초음파 처리한 다음, nylon sieve를 이용해 세척과 여과를 반복 수행하여 시료 외부에 잔존하는 미네랄을 분리하였다. 분리된 미네랄에 유기물을 제거하기 위해 2.0 g/mL sodium polytungstate 2.5 mL를 넣은 후 이를 제거하고 증류수로 세척한 다음, 1 N HCl 2 mL를 넣어 carbonate를 제거하였다. 1 N NH4OH 2 mL를 첨가하여 1 N HCl을 중화시키고, 중화된 미네랄을 증류수와 아세톤으로 각각 세척과 건조를 반복한 후, TL disc에 담아 50°C dry oven(FO-600M, Jeio Tech, Daejeon, Korea)에서 24시간 동안 예열하였다. TL 측정은 TLD system(Harshaw 4500, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 이용하여 빛을 차단한 조건에서 실시하였으며, 측정 조건은 Table 1과 같이 5°C/초의 속도로 50~400°C까지 온도를 상승시키면서 측정하였다. TL 측정을 통해 얻은 150~250°C 사이의 glow curve의 면적값을 TL1으로 설정하고, 1 kGy의 선량으로 재조사한 시료를 TL을 측정해 얻은 150~250°C 사이의 glow curve의 면적값을 TL2로 설정하여 방사선 조사 식품이 나타내는 TL ratio(TL1/TL2)를 산출하였다(Kwon 등, 2011). 이를 통해 산출된 TL ratio 값이 0.1 이하이면 비조사구로, 0.1 이상이면 조사구로 판단하였으며(Lee 등, 2002), TL 분석 결과는 Origin 8.0 software(Origin Lab. Co., Northampton, MA, USA)를 사용하여 그래프로 나타내었다.
Table 1 . Analyzing condition for thermoluminescence (TL)
Specification | Condition |
---|---|
Flow gas | N2 (99.999%) |
Final temperature | 400°C |
Pre-heat temperature | 50°C |
Heating rate | 5.00/s |
시료의 감마선 조사 여부 판정을 위한 전자스핀공명법(ESR) 분석
ESR 분석법은 방사선 조사 시 입사된 에너지에 의해 발생하는 이온이나 자유라디칼을 측정하는 방법으로, 간편하고 신속한 측정법으로서의 장점이 있다(Stachowicz 등, 1992). 시료의 ESR 분석은 식품공전(MFDS, 2021)을 참고하여 실시하였으며, 시료의 수분과 단수명 ESR center를 제거하기 위해 시료를 50°C dry oven에서 24시간 동안 완전히 건조시킨 후 0.4 g씩 ESR pyrex tube에 충진하여 준비하였다. ESR 분석은 ESR spectrometer(JES-TE 200, Jeol, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였으며, 측정 조건은 microwave power 0.4 mW, microwave frequency 9.10~9.13 GHz, center field 324.0~325.5 mT, sweep width 2.5×10 mT, modulation frequency 100 kHz, modulation width 0.5 mT, amplitude 4.0×10 time, sweep time 30초, time constant 0.03초로 설정하였다. 측정 결과는 방사선 조사에 의해 ESR signal에서 나타나는 peak-to-peak 높이를 ESR signal intensity로 나타내었으며, 내장된 프로그램으로 g- value를 측정하고 ESR signal의 결과는 Origin 8.0 software로 분석하였다.
감마선 조사된 씀바귀 추출물의 제조
비조사구(0 kGy)와 5, 10 kGy 선량으로 조사한 씀바귀에 대한 생리활성 비교를 위해 증류수, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 부탄올을 용매로 사용하여 추출수율을 비교하였다. 증류수를 이용한 열수 추출물의 경우 0, 5, 10 kGy 선량별로 조사한 씀바귀 분말 각각 1 g을 증류수 200 mL에 침지하여 추출물이 100 mL가 될 때까지 가열하고 식힌 후 shaking incubator(KMC-8480SF, Vision Scientific Co., Daejeon, Korea)로 24시간 동안 교반 추출하였으며, 용매별 추출의 경우 씀바귀 분말 1 g에 각 추출용매 100 mL를 첨가하여 1:100(w/v) 비율로 제조한 후 shaking incubator에서 24시간 동안 교반 추출하였다. 각 추출물은 filter paper(No. 1, Whatman Inc., Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 감압 여과하였고, 여과액은 rotary vacuum evaporator(Eyela NE, Tokyo, Japan)를 이용하여 필요에 따라 농도별(50~200 μg/mL TPC 함량)로 농축한 후 시료 보관용 냉장고에서 4°C로 저온 보관하며 실험에 사용하였다.
감마선 조사된 씀바귀 total phenolic content(TPC) 정량
TPC 함량은 Folin과 Denis(1912)의 방법에 준하여 씀바귀 추출물 1 mL에 95% 에탄올 1 mL와 증류수 5 mL를 각각 넣고 1 N Folin-Ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣은 후 voltex로 잘 섞고 5분간 반응시킨 다음 5% Na2CO3 1 mL를 넣고 1시간 동안 빛을 차단하여 암반응시켰다. 이후 반응액을 UV-visible spectrophotometer(Optizen 3220 UV, Mecasys Co., Daejeon, Korea)를 이용하여 725 nm에서 측정하였으며, 그 결과를 gallic acid를 이용한 standard curve에 대입하여 TPC 함량(mg/g)을 환산하였다.
감마선 조사된 씀바귀 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 효과 측정
DPPH 라디칼 소거 효과는 Blois(1958)의 방법에 준하여 측정하였다. 씀바귀 추출물 1 mL에 60 μM DPPH solution 3 mL를 넣고 voltex로 혼합한 후 실온에서 15분간 반응시키고 UV-visible spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 (1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 계산하여 DPPH 라디칼 소거 효과(%)로 나타내었다.
감마선 조사된 씀바귀의 2,2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS) 라디칼 소거 효과 측정
ABTS 라디칼 소거 효과는 Fellegrini 등(1999)의 방법에 따라 측정하였다. ABTS solution을 제조하기 위해 우선 7 mM ABTS 용액 5 mL와 140 mM K2S2O8 88 μL를 혼합하여 암실에서 14~16시간 냉장 반응을 통해 라디칼을 생성시킨 stock solution을 제조하였다. 이후 stock solution과 absolute ethanol을 1:88(v/v)의 비율로 섞은 후 UV-visible spectrophotometer로 734 nm에서 ABTS solution의 흡광도가 0.7±0.002가 되도록 제조하여 사용하였다. 이후 씀바귀 추출물 200 μL에 ABTS solution 4 mL를 넣고 voltex로 잘 혼합한 후 1분 30초간 실온에서 반응시키고 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 (1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 계산하여 ABTS 라디칼 소거 효과(%)로 나타내었다.
감마선 조사된 씀바귀의 antioxidant protection factor (PF) 측정
PF는 Andarwulan과 Shetty(1999)의 방법으로 측정하였다. PF 측정을 위한 emulsion 용액을 제조하기 위해 우선 β-carotene 10 mg을 chloroform 50 mL에 녹인 후, β-carotene/chloroform 용액 1 mL를 evaporator용 수기에 넣어 50°C에서 rotary vacuum evaporator를 이용하여 chloroform을 휘발시켰다. 이후 β-carotene 용액이 담긴 수기에 linoleic acid 20 μL, Tween 40 184 μL를 넣어 잘 섞어 용해시킨 후, H2O2 용액 50 mL를 첨가하여 emulsion 용액을 제조하였다. PF의 측정은 씀바귀 추출물 100 μL에 emulsion 용액 5 mL를 혼합하고, 50°C water bath에서 30분간 반응시킨 후 10분간 냉각시켜 UV-visible spectrophotometer로 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 시료의 흡광도/대조구의 흡광도로 계산하여 PF값(PF)으로 나타내었다.
감마선 조사된 씀바귀의 thiobarbituric acid reactive substances(TBARs) 억제 효과 측정
TBARs는 Buege와 Aust(1978)의 방법에 준하여 측정하였다. TBARs 측정에 사용된 emulsion 용액은 1% linoleic acid 100 mL에 surfactant로 1% Tween 40 100 mL를 넣고 균질화시켜서 제조하였다. TBARs 억제 효과의 측정을 위해 씀바귀 추출물 200 μL의 emulsion 용액 800 μL를 혼합한 후 50°C water bath에서 10시간 이상 반응시켰다. 이후 반응액 1 mL에 15% TCA, 0.375% TBA, 0.25 M HCl 혼합액에 3% BHT 용액을 100:3(v/v) 비율로 제조한 TBA reagent 4 mL를 넣고 voltex로 교반한 후 15분간 끓는 물로 중탕시킨다. 이후 반응액을 10분간 냉각시키고 원심분리기를 이용하여 2,000 rpm으로 15분간 원심분리하고, 이를 실온에서 10분간 방치한 후 상등액을 취해서 UV-visible spectrophotometer로 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 (1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 계산하여 TBARs 억제 효과(%)로 나타내었다.
방사선 조사된 씀바귀의 pancreatin α-amylase 저해 효과 측정
Pancreatin α-amylase 저해 효과 측정은 agar diffusion 방법(Davidson과 Parish, 1989)에 준하여 측정하였다. Agar 5 g과 soluble starch 5 g을 증류수 500 mL에 녹이고 autoclave(121°C, 15분)로 멸균하여 15 mL씩 Petri dish에 분취해 실온에서 굳혀 제작하였다. 효소 반응을 확인하기 위해 plate에 지름 10 mm disc paper를 올린 후, 씀바귀 추출물 800 μL와 효소액 200 μL(1,000 U/mL)를 혼합한 용액을 disc paper에 각각 분주하고 37°C incubator에서 3일간 배양시켰다. 이때 대조구에는 시료 추출물 대신 증류수를 처리하였고, 배양 후 plate에 5 mM I2 용액과 3% KI를 섞어서 제조한 I2/KI 용액 3 mL를 넣어 15분간 발색시킨 뒤 나타나는 clear zone의 area를 측정하였으며, 측정 결과는 (1-시료의 clear zone area/대조구의 clear zone area)×100으로 계산하여 α-amylase 저해 효과(%)로 나타내었다.
통계처리
본 실험의 결과는 3회 이상 반복 측정하여 나타낸 평균값±표준편차로 나타내었으며, 통계처리는 IBM SPSS 7.5 for windows 프로그램(Statistical Package for Social Science, Chicago, IL, USA)을 이용하였다. 시료 간의 유의적인 차이를 검증하기 위해 일원배치 분산분석(one-way ANOVA) 및 Duncan의 다중범위검정법을 실시하였으며, 유의차를 95% 수준에서 비교 분석하였다.
씀바귀 시료의 감마선 조사 여부 확인을 위한 광자극발광(PSL), 열발광(TL), 전자스핀공명(ESR) 특성 판별
감마선 조사 여부를 판별하는 데 이용되는 PSL은 주로 screening을 목적으로 사용되는 대표적인 방법 중 하나이다(Kwon 등, 2011). 본 연구에 이용된 씀바귀의 조사선량에 따른 PSL 측정 결과는 Table 2에서와 같이 조사 처리하지 않은 비조사구(0 kGy)에서는 277.33 PCs로 700 PCs 이하를 나타내어 조사 처리하지 않은 음성 시료로 판정되었으며, 5 kGy에서는 125,962.00 PCs, 10 kGy에서는 103,103.33 PCs로 모두 5,000 PCs 이상을 나타내어 방사선 조사가 확인된 양성 시료로 판별할 수 있었다. 감마선의 조사 여부는 PSL뿐만 아니라 TL에 의해서도 비조사구와 조사구 간의 low curve 형태와 최고 peak intensity가 명확하게 차이를 나타내기 때문에 조사 여부를 확인할 수 있고, TL ratio (TL1/TL2)의 임계값(threshold value)에 의해 정확하게 구분할 수 있다(Kwon 등, 2011). 씀바귀의 방사선 조사에 의한 TL 측정 결과는 Fig. 1A와 같이 5, 10 kGy 감마선 조사구에서 150~250°C 사이의 온도대역에서 비조사구(0 kGy)에서는 나타나지 않는 특징적인 glow curve를 확인할 수 있었고, 조사선량이 높아짐에 따라 TL intensity가 증가하는 것으로 확인되었다. 또한 Table 3과 같이 비조사구(0 kGy)에서 TL ratio는 0.005로 나타났으며, 이는 0.1 이하의 수치를 나타내어 조사 처리되지 않은 것으로 확인할 수 있었다. 반면 조사구(5, 10 kGy)의 경우 TL ratio는 각각 2.405, 4.070으로 0.1 이상의 수치를 나타내어 방사선 조사처리 시 나타나는 특징을 나타내 감마선 조사 여부를 확인할 수 있었다. 식품공전에서는 cellulose를 함유한 식품의 ESR 판정에서 중심부에서 저자장인 왼쪽 신호와 고자장인 오른쪽 신호가 cellulose radical에 의해 6.0 mT의 간격을 두고 한 쌍의 peak가 보이면 방사선 조사된 것으로 판정토록 고시하고 있다(Lee 등, 2002). 감마선 조사 씀바귀의 ESR 측정 결과는 Fig. 1B와 Table 4에서와 같이 감마선을 조사한 실험구에서 ESR 신호가 좌우로 각각 6 mT씩 대칭적인 peak가 나타나는 것을 확인하였다. 또한 Table 4에서 g-value도 감마선 비조사구(0 kGy)에 비해 조사구(5, 10 kGy)에서 더 높은 수치가 확인되었으며, 감마선 조사선량이 높아질수록 증가하는 패턴을 나타내었다. 따라서 이상의 결과를 통해 PSL, TL, ESR 분석을 통한 씀바귀의 감마선 조사 여부를 판단할 수 있음을 확인하였다.
Table 2 . Photo-stimulated luminescence (PSL) determinations of irradiated
Sample | PSL value | ||
---|---|---|---|
Irradiation dose (kGy) | |||
0 | 5 | 10 | |
277.33±57.54a1) (-)2)3) | 125,962.00±6,643.01c (+) | 103,103.33±3,792.16b (+) |
1)Mean±standard deviation (n=3). Means with different superscript letters are significantly different at
2)Threshold value: T1=700, T2=5,000, (-)
3)(+), positive (irradiated); (-), negative (non-irradiated); (M), intermediated.
Table 3 . TL ratios (TL1/TL2) of minerals separated from irradiated
TL glow | TL value | ||
---|---|---|---|
Irradiation dose (kGy) | |||
0 | 5 | 10 | |
TL11) (nC) | 11.162±6.092a | 4,582.000±1,462.297b | 14,543.000±6,783.982c |
TL22) (nC) | 2,331.500±232.638b | 1,880.500±310.420a | 4,020.500±1,238.144c |
TL ratio3) | 0.005±0.002a | 2.405±0.381b | 4.070±2.941c |
1)Integrated TL1 intensity at 150∼250°C.
2)Integrated TL2 intensity at 150∼250°C.
3)TL1/TL2. Mean±standard deviation (n=3). Means with different superscript letters are significantly different at
Table 4 . ESR signal parameter1) of radiation-induced radicals from irradiated
ESR parameter | ESR value | ||
---|---|---|---|
Irradiation dose (kGy) | |||
0 | 5 | 10 | |
g0 | 2.0063±0.0002a | 2.0056±0.0002b | 2.0061±0.0005ab |
g1 | - | 2.0235±0.0051 | 2.0239±0.0003 |
g2 | - | 1.9926±0.0023 | 1.9898±0.0028 |
1)g-value=[71.448×microwave frequency (GHz)]/ Magnetic field (mT).
감마선 조사에 의한 씀바귀의 TPC 추출수율 변화
식물의 방어기작으로 생산되는 2차 대사산물 중 phenolic compounds는 다양한 식물에 다량 분포되어 있으며, 분자구조에 phenolic hydroxyl기를 함유하고 있어 단백질 같은 고분자 화합물과 쉽게 결합하여 항산화, 항균, 항염증 및 항관절염 등 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다(Kang 등, 2010). 본 연구에서는 WHO와 IAEA에서 규정한 대로 식품에 처리 가능한 선량인 0, 5, 10 kGy로 식용식물인 씀바귀에 방사선을 조사하여 씀바귀로부터 생리활성에 관여하는 TPC의 추출수율을 높이고자 시도하였다.
감마선 조사처리에 따른 씀바귀의 용매별 TPC 추출수율의 변화는 Fig. 2A와 같이 열수> 메탄올> 에탄올> 아세톤> 부탄올 순으로 나타났으며, 비조사구와 대비하여 조사처리에 따라 열수 추출물을 비롯하여 메탄올 추출물, 아세톤 추출물에서는 phenolics의 용출량이 증가하는 양상을 나타내었다. 이상의 결과를 바탕으로 식의약 소재로 사용 가능성을 확인하기 위해 인체에 유해하지 않은 것으로 보고되는 물과 에탄올을 최종 추출용매로 선정하여 0, 5, 10 kGy로 감마선 조사 처리한 씀바귀의 에탄올 농도별 TPC 추출수율을 비교해 보았다. 그 결과 Fig. 2B와 같이 열수와 에탄올 추출물에서 비조사구(0 kGy)에 비해 10 kGy 고선량의 조사구에서는 phenolics의 용출량이 많아지는 것을 확인할 수 있었으며, 10 kGy를 조사한 씀바귀 추출물의 TPC 함량은 열수 추출물에서 7.61±0.21 mg/g, 50% 에탄올 추출물에서 4.31±0.15 mg/g으로 최대 추출수율을 나타내었다(Table 5). Lee 등(2011)은 감마선 조사가 외톨개모자반의 TPC 함량 변화에 미치는 영향을 조사하기 위해 외톨개모자반 분말에 감마선을 3, 7, 20 kGy로 처리하고 물로 추출하여 TPC 함량을 측정하였으며, 그 결과 비조사구에 비해 조사 처리한 시료구에서 다소 높은 함량을 보여주었으나 조사선량에 따른 유의적인 차이를 나타내지 않았다고 보고하여 본 연구 결과의 열수 추출물이 phenolics 용출량이 증가하는 것과 유사한 패턴을 보여주었다. 한편, 저선량의 감마선(100~400 Gy)으로 조사한 결명자를 75% 에탄올로 추출하여 TPC 함량을 비교한 Um 등(2017)의 연구 결과에서는 조사선량이 증가할수록 TPC 함량이 감소하는 경향을 나타내었으며, 이는 본 연구 결과의 에탄올 추출물이 보여준 phenolics 용출량이 소폭 감소하는 것과 비슷한 경향임을 확인할 수 있었다. 이러한 방사선 조사처리에 따른 phenolic compounds 함량의 변화는 탄수화물과 같은 고분자 중합체에 결합한 형태로 존재하고 있던 phenolic compound가 방사선 조사에 의해 그 결합이 깨지면서 TPC 함량을 증가시키는 것으로 사료되며, 이는 시료의 type(종류, 건조상태, phenolic 조성 등)과 추출조건(추출용매, 추출과정, 추출온도 등), 감마선 조사선량 등 매우 다양한 요인들에서 기인하는 것으로 사료된다(Khattak 등, 2008; Park 등, 2017). 이상의 결과에 따라 씀바귀의 경우, 물을 용매로 한 열수 추출물에서 에탄올 추출물에 비해 상대적으로 높은 TPC 함량을 나타내는 것으로 확인되었으며, 이는 생리활성을 활용하는 측면에서는 에탄올 추출물보다는 열수 추출물을 활용하는 것이 훨씬 유리할 것이라는 추측을 할 수 있었다.
Table 5 . The content of total phenolic compound from irradiated
Extracts | Total phenolic content (mg/g) | ||
---|---|---|---|
Irradiation dose (kGy) | |||
0 | 5 | 10 | |
Water | 5.87±0.351) | 6.06±0.36 | 7.61±0.21 |
50% Ethanol | 4.36±0.15 | 3.84±0.15 | 4.31±0.15 |
1)Mean±standard deviation (n=6).
따라서 phenolics 용출량이 상대적으로 높고 방사선 처리에 의한 변화가 크게 나타난 씀바귀 열수 추출물을 이용하여 향후 생리활성 실험을 진행하였으며, 추출수율이 가장 높게 나타난 10 kGy의 방사선 처리한 씀바귀의 열수 추출물을 사용하여 비조사구(0 kGy)와 비교 실험을 진행하였다. 본 연구를 통해 방사선 조사에 의해 추출물의 total phenolic의 추출수율이 증가하는 것이 확인됨에 따라 방사선 조사처리가 초미세 분쇄(Cho, 2014), 초음파 처리(Kang, 2016) 등과 같이 천연물의 추출수율을 증대시키기 위한 또 다른 하나의 수단으로 활용이 가능할 것으로 기대되었다.
감마선 조사에 의한 씀바귀의 DPPH 라디칼 소거능의 변화
DPPH 라디칼은 대표적인 자유라디칼로, 이에 대한 환원력이 클수록 높은 활성산소 소거 능력을 기대할 수 있어 대표적인 항산화 활성의 지표로 알려져 있다(Pokorny, 1991). 감마선 비조사구와 10 kGy 조사한 씀바귀 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과는 Fig. 3A와 같이 비조사구 추출물의 TPC 함량 기준을 50~200 μg/mL로 처리했을 때 80.68~89.03%의 높은 저해 효과를 나타내었으며, 10 kGy의 방사선을 조사한 추출물의 경우 80.09~86.39%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내어 대조구로 사용한 BHT의 61.03~87.38%에 비해 저농도에서 라디칼 소거능이 더 우수한 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 Ju 등(2006)이 보고한 감국, 결명자, 당귀, 배초향, 산사육, 엉겅퀴, 오가피 등의 한약재의 열수 추출물 250 μg/mL로 처리 시 DPPH 라디칼 소거 활성이 50% 이하를 나타낸 결과와 비교해봤을 때, 본 연구에서 사용한 씀바귀 열수 추출물이 상대적으로 매우 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 동량의 phenolic 함량을 적용했을 때 방사선 비처리구에 비해 방사선 처리구의 라디칼 소거능 증대 현상은 관찰되지 않았는데, 이는 Table 1의 결과에서 방사선 조사에 의해 phenolic 물질의 용출은 증대하지만 용출되는 phenolic의 profile pattern이 DPPH 라디칼 소거능의 변화에는 영향을 미치지 않는 구성으로 조성된 것이 아닌가 추측하였으며, 향후 이에 관한 연구는 진행되어야 할 것으로 판단되었다.
감마선 조사에 의한 씀바귀의 ABTS 라디칼 탈색의 변화
ABTS 라디칼 탈색은 시료 추출물에 존재하는 항산화 물질에 의해 ABTS 자유라디칼이 제거되는 정도를 측정하여 친수성과 친유성 물질의 항산화 효과를 판별할 수 있으며(Fellegrini 등, 1999), 항산화 메커니즘에서 hydrogen-donating과 chain breaking 모두를 측정할 수 있다. 또한 aqueous 및 organic phase에 적용이 가능하며, 표준물질에 의한 상대 비교가 가능하다는 장점이 있다. 이 반응은 potassium persulfate에 의해 생성된 ABTS 자유라디칼이 추출물 속의 항산화 물질에 의해 제거되면서 청록색 라디칼의 탈색 정도를 측정하게 된다.
씀바귀 열수 추출물의 ABTS 라디칼 저해율을 측정한 결과는 Fig. 3B와 같이 비조사구의 추출물을 TPC 함량 기준 50~200 μg/mL 농도로 처리했을 때 50.01~99.24%의 높은 저해율을 나타내었으며, 10 kGy로 조사한 추출물의 경우 72.22~99.28%의 매우 높은 저해율을 나타내었다. 이 결과는 positive control로 사용한 BHA의 43.35~95.88%보다 높은 수준이었으며, Lee 등(2012)의 와송과 한약재 복합물의 ABTS 라디칼 저해율이 1,000 μg/mL에서 70% 수준이었다는 연구 보고와 비교했을 때 상대적으로 씀바귀 열수 추출물의 저해율이 매우 우수한 것으로 사료되었다. 또한 방사선 처리구의 경우 TPC 함량 기준 100 μg/mL 이하의 저농도에서 비조사구에 비해 상대적으로 높은 ABTS 라디칼 억제 증대 현상이 관찰되었다. 따라서 씀바귀 열수 추출물의 친수성 및 친유성 물질에 대한 항산화 효과가 감마선 조사처리에도 무관하게 상당히 우수한 수준을 나타내는 것을 알 수 있었으며, 저농도의 처리에서는 방사선 처리에 의해 항산화 효과가 월등히 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
감마선 조사에 의한 씀바귀의 PF 변화
지방의 산화로 생성되는 free peroxyl radical은 β-carotene의 이중결합에 작용하여 불활성 물질이 형성되며, 이로 인해 연쇄반응이 중단되는 결과를 나타내어 산화가 발생한다. 산화가 발생함으로써 β-carotene이 지닌 고유의 오렌지색이 탈색되게 되는데, 이러한 탈색 정도를 흡광도로 측정하여 항산화 활성 정도를 측정하는 데 이용한다(Jung, 2010). Fig. 3C와 같이 씀바귀 비조사구의 열수 추출물을 TPC 함량 기준 50~200 μg/mL로 처리했을 때 0.52~1.93 PF를 나타내었으며, 10 kGy의 방사선을 조사한 열수 추출물의 경우 1.41~3.06 PF값을 나타내어 매우 높은 PF 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 positive control인 BHA가 나타낸 1.18~1.40 PF값과 비교했을 때 감마선 조사한 씀바귀 열수 추출물이 BHA보다 매우 높은 항산화력을 가지는 것을 확인할 수 있으며, 비조사구에 비해 더 높은 지용성 항산화력을 가지는 것으로 확인되어 감마선 조사가 추출물의 지용성 물질에 대한 산화 억제 효과에 positive한 결과를 나타내는 것으로 판단되었다.
감마선 조사에 의한 씀바귀의 TBARs 저해능의 변화
지질의 산화과정 중 생성되는 저분자 malondialdehyde와 thiobarbituric acid를 반응시켜 생성된 TBARs를 측정하여 지용성 항산화 효과를 나타내는(Jeong 등, 1998) TBARs에 씀바귀 열수 추출물이 미치는 영향을 확인하였다. 비조사구 씀바귀 열수 추출물의 TBARs 저해능은 Fig. 3D와 같이 TPC 함량 기준 50~200 μg/mL 처리 시 89.16~96.32%의 매우 높은 효과를 나타내었으며, 10 kGy 감마선 조사에 의한 TBARs 저해능은 85.22~98.57%로 감마선 조사처리에 의한 TBARs 억제의 상승은 관찰되지 않았다. Park과 Cho(2014)는 방사선 조사된 약용작물 추출물이 total phenolic 농도가 높아짐에 따라 항산화 효과도 높아지는 농도의존형 상관관계를 나타낸 것으로 보고하였으며, 본 연구 결과도 유사한 양상을 나타내었다. 따라서 이상의 연구 결과를 통해 식물체 원료의 감마선 조사처리는 원료의 추출 제조에 있어서 생리활성에 관여하는 성분의 추출수율을 증가시키는 것으로 확인되었으며, 10 kGy 수준의 조사선량이 추출물의 항산화 활성을 다소 증폭시키는 것으로 사료되었다.
감마선 조사에 의한 씀바귀의 당분해 효소(pancreatin α-amylase)에 대한 저해 효과의 변화
당분해 효소 저해제는 식품으로 섭취하는 polysaccharide인 전분을 소장에서 가수분해하여 glucose를 생성하는 대표적인 효소인 α-amylase 활성을 저해하여 전분 분해를 감소시키는데, 이렇게 소장점막으로 흡수되는 glucose의 양을 줄여줄 뿐만 아니라 분해된 glucose의 체내 흡수를 지연시켜 당뇨병 환자들의 혈당을 조절하는 데 사용된다(Jeong 등, 2010). 본 연구에서는 agar diffusion 방법으로 당분해 효소 중 pancreatin α-amylase에 대한 저해 효과를 확인한 결과 Fig. 4와 같이 조사 처리하지 않은 씀바귀 열수 추출물의 경우 TPC 함량 기준 50~200 μg/mL에서 39.26~69.63%의 저해 효과를 나타내었으며, 이는 positive control로 사용한 acabose를 동량으로 처리 시 21.74~53.91%인 것과 비교했을 때 더 우수한 수준임을 확인할 수 있었다. 또한, 방사선 조사에 의한 α-amylase 저해 증대 효과를 측정한 결과, 10 kGy의 감마선을 조사한 씀바귀 열수 추출물에서 38.52~100.00%의 매우 상승한 저해 효과가 관찰되어 방사선 조사처리로 인한 당분해 효소 억제 증대 효과를 기대할 수 있는 것으로 확인되었다. Park 등(2017)이 보고한 한약재 곽향 물 추출물을 감마선 10 kGy 선량으로 조사했을 때, 비조사구보다 높은 수준의 pancreatin α-amylase 억제 효과를 나타낸 결과와 본 연구 결과는 유사한 양상을 나타내었다. 또한, Yook 등(1997)은 SDS-page를 이용하여 감마선 조사가 분해 효소의 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 α-amylase가 포함된 pancreatin의 패턴을 비교하였는데, 그 결과 10 kGy 조사처리 시 밴드의 굵기 변화가 나타났으며 약 50% 수준의 단백질 peptide 결합이 절단되는 것으로 확인되었다. 따라서 씀바귀의 감마선 조사처리에 따른 α-amylase 효소 활성이 저하되는 원인은 감마선 조사가 효소를 구성하는 단백질을 파괴하거나 결합을 절단하여 저분자화되었을 것으로 예상되었다. 한편, Lim 등(2010)이 보고한 섬오갈피나무, 오가나무, 오갈피나무 등의 추출물에서 4.97~19.97% 수준의 α-amylase 저해율을 나타낸 결과와 비교하면, 씀바귀 열수 추출물은 α-amylase 저해 활성이 매우 우수하였으며, 감마선 조사처리에 의해 추출물의 α-amylase 저해 활성 또한 극대화할 수 있을 것으로 기대되었다.
감마선 조사는 약용식물의 기능성 물질 추출수율 증대 및 색상 개선 등 산업화를 유리하게 하는 처리방법으로 기대되고 있다. 본 연구에서는 감마선 조사가 씀바귀의 phenolic 추출수율 증대와 항산화 및 당분해 효소 억제 효과에 미치는 영향을 검증하였다. 감마선을 0, 5, 10 kGy 선량별로 조사한 씀바귀의 감마선 조사 여부를 확인하고자 광자극발광법(PSL), 열발광법(TL), 전자스핀공명법(ESR)을 활용하여 조사 판별 확인시험을 진행하였다. 그 결과 PSL에서 5, 10 kGy가 각각 9,125,962.00 PCs, 103,103.33 PCs로 5,000 PCs 이상으로 측정되었고, TL ratio는 5, 10 kGy가 각각 2.405, 4.070으로 0.1 이상의 값을 나타내었으며, ESR에서는 좌우 6 mT 간격으로 대칭적인 한 쌍의 peak를 나타내는 것이 관찰되어 실험에 사용한 씀바귀는 감마선을 조사한 양성(positive) 시료로 검증되었다. 감마선 조사한 씀바귀의 total phenolics 함량은 방사선 선량이 높을수록 phenolics 용출량이 많아지는 것을 확인할 수 있었으며, 10 kGy를 조사한 씀바귀의 total phenolics 함량은 열수 추출물 7.61±0.21 mg/g, 50% 에탄올 추출물에서 4.31±0.15 mg/g을 나타내었다. 감마선 조사된 씀바귀의 항산화 효과를 확인한 결과 DPPH 라디칼 소거 효과는 비조사구와 10 kGy 조사구에서 TPC 함량 50 μg/mL에서 모두 80% 이상의 높은 저해 효과를 나타내었다. ABTS 라디칼 저해 효과는 비조사구와 조사구에서 TPC 함량 200 μg/mL에서 모두 99% 이상의 높은 저해 효과를 나타내었다. PF는 10 kGy 처리구에서 TPC 함량 50~200 μg/mL로 처리했을 때 1.41~3.06 PF의 매우 높은 값을 나타내었다. TBARs 저해능 역시 10 kGy 조사구에서 85.22~98.57%의 높은 항산화능을 나타내었다. Pancreatin α-amylase 저해 효과는 10 kGy 조사구에서 38.52~100%의 저해 효과가 관찰되어 감마선 조사가 당분해 효소 억제 효과를 증대시키는 것으로 기대되었다. 따라서 감마선 조사처리가 씀바귀를 비롯한 식물체로부터 생리활성 물질의 용출을 증대시키고 약리성 및 기능성을 증폭시킬 수 있는 수단으로 활용이 가능할 것으로 판단되었으며, 씀바귀는 천연유래 소재로써 항산화 및 항당뇨 관련 기능성 소재로 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대되었다.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2022; 51(1): 28-37
Published online January 31, 2022 https://doi.org/10.3746/jkfn.2022.51.1.28
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
박혜진1․정희영2․조영제1
1경북대학교 식품공학부
2경북대학교 응용생명과학부
Hye-Jin Park1 , Hee-Young Jung2
, and Young-Je Cho1
1School of Food science & Biotechnology and
2School of Applied Biosciences, Kyungpook National University
Correspondence to:Young-Je Cho, School of Food Science & Biotechnology, Kyungpook National University, 80, Daehak-ro, Buk-gu, Daegu 41566, Korea, E-mail: yjcho@knu.ac.kr
Author information: Hye-Jin Park (Researcher), Hee-Young Jung (Professor), Young-Je Cho (Professor)
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This study was designed to investigate the effects of different doses of gamma irradiation on the anti-oxidative activities, sugar degradation enzyme activity, and extraction yields of Ilxeris dentata NAKAI. Physical techniques to identify irradiation, namely photostimulated luminescence, thermoluminescence and electron spin resonance, confirmed that Ilxeris dentata NAKAI was gamma-irradiated. The total phenolics content (TPC) was higher in extracts from irradiated Ilxeris dentata NAKAI than from non-irradiated (0 kGy) samples. The inhibition of DPPH radical scavenging activity by water extracts from 0 kGy and 10 kGy irradiated Ilxeris dentata NAKAI was very high at over 80% each. The inhibition of ABTS radical cation activity by the water extracts from 0 kGy and 10 kGy irradiated Ilxeris dentata NAKAI was also very high at over 99% each, at 200 μg/mL TPC concentration. The antioxidant protection factor (PF) in the water extract from 10 kGy irradiated Ilxeris dentata NAKAI showed a very high level of activity at 1.41∼3.06 PF at 50∼200 μg/mL TPC concentrations. The thiobarbituric acid reactive substances in the water extract from 10 kGy irradiated Ilxeris dentata NAKAI showed high levels of 85.22∼98.57% inhibition at 50∼200 μg/mL TPC concentration. The pancreatin α-amylase inhibitory activities were high at 38.52∼100.00% at 50∼200 μg/mL TPC concentrations of water extract with 10 kGy irradiation doses. These results suggest an enhancement of extraction yields of phenolic compounds and biological activities from Ilxeris dentata NAKAI by gamma ray irradiation at 10 kGy. Also, treatment by gamma-irradiation can be used to amplify the solubility of biologically active compounds in plants.
Keywords: antioxidant, sugar degradation enzyme, Ilxeris dentata NAKAI, extracts, gamma irradiation
최근 건강에 대한 개념이 삶의 질 향상을 위한 방향으로 전개되면서 식품을 이용한 생체면역 증강, 노화방지, 성인병 예방 등 식품의 약리적 역할에 대한 연구로 전환되고 있다(Shim 등, 2005). 특히 천연 약용식물은 체내의 유해 활성산소 발생을 감소시키는 등 생리적 활성을 다양하게 가지고 있는 것으로 보고되고 있어, 약리식물을 이용하여 인체를 질병으로부터 예방하고 노화를 억제하는 생리활성 물질 탐색을 위한 연구가 다양하게 이루어지고 있다(Cho 등, 2008).
씀바귀(
감마선을 식품 및 식품재료에 조사하는 기술은 식품 및 식품소재의 부패방지와 보존성 증가 효과를 위해 식품, 제약, 의학 및 화장품 분야 등에 사용되는 기술이다(Byun, 1994; Lee 등, 2001). 식품에 대한 방사선 조사는 FAO, IAEA 및 WHO에서 10 kGy 이하 방사선량의 조사가 식품에서 독성학적 위해, 영양학적 및 미생물학적 문제를 일으키지 않는다고 규정함에 따라 식품에 방사선을 조사하는 기술에 대한 안전성이 인정되었다(FAO/IAEA/WHO, 1981). 감마선 조사 기술을 천연 약용식물에 적용할 경우 생리활성 물질의 추출수율을 증진시키고 색상을 개선하면서 생리활성을 유지하여 품질개량의 우수한 방법으로도 알려져(Jo 등, 2003), 방사선 조사 기술에 의한 기능성 소재로서의 활용도 향상이 기대된다(Park, 2006).
현재 식품의약품안천처 식품공전에 따르면 식품에 대한 방사선 조사식품을 확인하는 시험으로 유전자코메트 분석법(스크리닝 검사법), 광자극발광법(Photostimulated Luminescence, PSL), 열발광법(Thermoluminescence, TL), 전자스핀공명법(Electron Spin Resonance spectroscopy, ESR), 기체크로마토그래피/질량분석법(Gas chromatography/Mass spectrometry)이 고시되어 있다(MFDS, 2021). 일반적으로 건조 향신료에 대한 물리적 검지법으로서 방사선 조사 여부를 screening 하는 방법으로 PSL, TL, ESR을 적용하는데, 가장 기본적인 PSL 분석은 식품에 혼입된 이물질인 광물질이 가지는 발광 특성을 이용하는 방법이다(MFDS, 2021; European Committee for Standard, 2002). 같은 맥락으로 TL 분석은 식품이나 식품원료에 존재하는 미네랄의 발광 특성을 응용하여 방사선 흡수량에 따라 일정 온도에 노출되면서 에너지를 방출하고 독특한 TL glow curve를 나타내며, glow curve의 적분한 면적값으로 분석하여 방사선 조사 여부를 판별할 수 있다(Lee 등, 2002; European Committee for Standard, 2001). 또한 ESR은 특수한 시료에서만 나타나는 자유라디칼(free radical)을 분광학적으로 측정하는 방법으로, 뼈, 셀룰로오스 및 결정형 당(crystalline sugar)을 함유한 식품에서만 측정이 가능하다(MFDS, 2021; European Committee for Standard, 2000). 식품의약품안전처에서는 건조 향신료 등에 대해서만 PSL과 TL 분석 적용을 고시하고 있고 약용식물에 대한 PSL과 TL 분석 적용은 아직 고시되지 않고 있어, 본 연구에서는 약용식물로 사용되고 있는 씀바귀에 대한 PSL, TL, ESR 분석의 적용 가능성을 검토코자 하였다.
따라서 본 연구에서는 천연 약용식물인 씀바귀에 감마선을 조사 처리한 후 발광분석법(PSL, TL)과 전자스핀공명법(ESR)을 적용하여 방사선 조사 여부를 판별하였으며, 감마선 조사처리가 씀바귀의 추출수율과 생리활성에 어떤 영향을 주는지 비교하여 방사선 조사처리를 통한 씀바귀의 기능성 소재로서의 활용도 향상을 시도하였다.
실험재료
연구에 사용한 씀바귀는 대구 소재의 약령시장에서 유통되는 국내산 한약재를 구입하여 사용하였다. 방사선 조사 여부 판정을 위한 분석은 감마선 조사된 건조 시료를 세절하여 시행하였고, 생리활성평가는 감마선 조사된 시료를 실험실용 분쇄기(RT-04, Mill Powder Tech., Tainan, Taiwan)를 이용하여 40 mesh로 분쇄한 후 저온저장고(4°C)에서 보관하면서 필요에 따라 추출하여 시료로 사용하였다.
시료의 감마선 조사(irradiation) 처리
시료의 감마선 조사처리는 한국원자력연구원 첨단방사선연구소(Korea Atomic Energy Research Institute, Advance Radiation Technology Institute, Jeongeup, Korea)의 감마선(60Co) 조사처리 시설(100 kCi point source, AECL, IR-79, MDS Nordion International Co., Ltd., Ottawa, Canada)에서 실시하였다. 각 시료당 총 흡수선량을 0, 5, 10 kGy로 설정하여 실온에서 시간당 일정한 선량으로 조사하였으며, 흡수선량은 ceric/cerous dosimeter를 사용하여 측정하였다. TL 분석을 위한 재조사(re-irradiation)는 흡수선량을 1 kGy로 설정하여 동일한 시설에서 조사하였다.
시료의 감마선 조사 여부 판정을 위한 광자극발광(PSL) 분석
씀바귀의 PSL 분석은 식품공전의 방법(MFDS, 2021)에 준하여 햇볕이 차광된 조건에서 PSL 측정용 Petri dish(직경 50 mm)에 분쇄한 시료를 골고루 펼쳐 담아서 준비하고, PSL screening system(Serial 0021, Scottish Universities Research and Reactor Center, Glasgow, UK)을 이용하여 60초 동안 방출되는 photon counts(PCs)를 시료별로 각 2회씩 측정하였다. PSL 측정 조건은 cycle 60초, dark count 21, light count 23으로 시행하였으며, 조사 여부 판정을 위한 임계값(threshold value)은 T1은 700 count/60초, T2는 5,000 count/60초였으며, 측정값이 T1 미만일 경우 비조사 시료로 판단하고 T2를 초과할 경우는 조사 시료로 판단하였다. T1과 T2 사이의 값을 나타낼 경우 조사 여부를 판단할 수 없는 시료로 판정하였다(MFDS, 2021; Raffi와 Benzaria, 1994).
시료의 감마선 조사 여부 판정을 위한 열 발광(TL) 분석
씀바귀의 TL 분석은 식품공전의 방법(MFDS, 2021)에 준하여 측정하였다. 우선 시료에 포함된 미네랄을 추출하기 위해 시료 50 g에 증류수 500 mL를 넣고 ultrasonic agitator(Power sonic 420, Whasin Tech, Daegu, Korea)에서 10분 동안 초음파 처리한 다음, nylon sieve를 이용해 세척과 여과를 반복 수행하여 시료 외부에 잔존하는 미네랄을 분리하였다. 분리된 미네랄에 유기물을 제거하기 위해 2.0 g/mL sodium polytungstate 2.5 mL를 넣은 후 이를 제거하고 증류수로 세척한 다음, 1 N HCl 2 mL를 넣어 carbonate를 제거하였다. 1 N NH4OH 2 mL를 첨가하여 1 N HCl을 중화시키고, 중화된 미네랄을 증류수와 아세톤으로 각각 세척과 건조를 반복한 후, TL disc에 담아 50°C dry oven(FO-600M, Jeio Tech, Daejeon, Korea)에서 24시간 동안 예열하였다. TL 측정은 TLD system(Harshaw 4500, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 이용하여 빛을 차단한 조건에서 실시하였으며, 측정 조건은 Table 1과 같이 5°C/초의 속도로 50~400°C까지 온도를 상승시키면서 측정하였다. TL 측정을 통해 얻은 150~250°C 사이의 glow curve의 면적값을 TL1으로 설정하고, 1 kGy의 선량으로 재조사한 시료를 TL을 측정해 얻은 150~250°C 사이의 glow curve의 면적값을 TL2로 설정하여 방사선 조사 식품이 나타내는 TL ratio(TL1/TL2)를 산출하였다(Kwon 등, 2011). 이를 통해 산출된 TL ratio 값이 0.1 이하이면 비조사구로, 0.1 이상이면 조사구로 판단하였으며(Lee 등, 2002), TL 분석 결과는 Origin 8.0 software(Origin Lab. Co., Northampton, MA, USA)를 사용하여 그래프로 나타내었다.
Table 1 . Analyzing condition for thermoluminescence (TL).
Specification | Condition |
---|---|
Flow gas | N2 (99.999%) |
Final temperature | 400°C |
Pre-heat temperature | 50°C |
Heating rate | 5.00/s |
시료의 감마선 조사 여부 판정을 위한 전자스핀공명법(ESR) 분석
ESR 분석법은 방사선 조사 시 입사된 에너지에 의해 발생하는 이온이나 자유라디칼을 측정하는 방법으로, 간편하고 신속한 측정법으로서의 장점이 있다(Stachowicz 등, 1992). 시료의 ESR 분석은 식품공전(MFDS, 2021)을 참고하여 실시하였으며, 시료의 수분과 단수명 ESR center를 제거하기 위해 시료를 50°C dry oven에서 24시간 동안 완전히 건조시킨 후 0.4 g씩 ESR pyrex tube에 충진하여 준비하였다. ESR 분석은 ESR spectrometer(JES-TE 200, Jeol, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였으며, 측정 조건은 microwave power 0.4 mW, microwave frequency 9.10~9.13 GHz, center field 324.0~325.5 mT, sweep width 2.5×10 mT, modulation frequency 100 kHz, modulation width 0.5 mT, amplitude 4.0×10 time, sweep time 30초, time constant 0.03초로 설정하였다. 측정 결과는 방사선 조사에 의해 ESR signal에서 나타나는 peak-to-peak 높이를 ESR signal intensity로 나타내었으며, 내장된 프로그램으로 g- value를 측정하고 ESR signal의 결과는 Origin 8.0 software로 분석하였다.
감마선 조사된 씀바귀 추출물의 제조
비조사구(0 kGy)와 5, 10 kGy 선량으로 조사한 씀바귀에 대한 생리활성 비교를 위해 증류수, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 부탄올을 용매로 사용하여 추출수율을 비교하였다. 증류수를 이용한 열수 추출물의 경우 0, 5, 10 kGy 선량별로 조사한 씀바귀 분말 각각 1 g을 증류수 200 mL에 침지하여 추출물이 100 mL가 될 때까지 가열하고 식힌 후 shaking incubator(KMC-8480SF, Vision Scientific Co., Daejeon, Korea)로 24시간 동안 교반 추출하였으며, 용매별 추출의 경우 씀바귀 분말 1 g에 각 추출용매 100 mL를 첨가하여 1:100(w/v) 비율로 제조한 후 shaking incubator에서 24시간 동안 교반 추출하였다. 각 추출물은 filter paper(No. 1, Whatman Inc., Piscataway, NJ, USA)를 이용하여 감압 여과하였고, 여과액은 rotary vacuum evaporator(Eyela NE, Tokyo, Japan)를 이용하여 필요에 따라 농도별(50~200 μg/mL TPC 함량)로 농축한 후 시료 보관용 냉장고에서 4°C로 저온 보관하며 실험에 사용하였다.
감마선 조사된 씀바귀 total phenolic content(TPC) 정량
TPC 함량은 Folin과 Denis(1912)의 방법에 준하여 씀바귀 추출물 1 mL에 95% 에탄올 1 mL와 증류수 5 mL를 각각 넣고 1 N Folin-Ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣은 후 voltex로 잘 섞고 5분간 반응시킨 다음 5% Na2CO3 1 mL를 넣고 1시간 동안 빛을 차단하여 암반응시켰다. 이후 반응액을 UV-visible spectrophotometer(Optizen 3220 UV, Mecasys Co., Daejeon, Korea)를 이용하여 725 nm에서 측정하였으며, 그 결과를 gallic acid를 이용한 standard curve에 대입하여 TPC 함량(mg/g)을 환산하였다.
감마선 조사된 씀바귀 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 효과 측정
DPPH 라디칼 소거 효과는 Blois(1958)의 방법에 준하여 측정하였다. 씀바귀 추출물 1 mL에 60 μM DPPH solution 3 mL를 넣고 voltex로 혼합한 후 실온에서 15분간 반응시키고 UV-visible spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 (1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 계산하여 DPPH 라디칼 소거 효과(%)로 나타내었다.
감마선 조사된 씀바귀의 2,2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS) 라디칼 소거 효과 측정
ABTS 라디칼 소거 효과는 Fellegrini 등(1999)의 방법에 따라 측정하였다. ABTS solution을 제조하기 위해 우선 7 mM ABTS 용액 5 mL와 140 mM K2S2O8 88 μL를 혼합하여 암실에서 14~16시간 냉장 반응을 통해 라디칼을 생성시킨 stock solution을 제조하였다. 이후 stock solution과 absolute ethanol을 1:88(v/v)의 비율로 섞은 후 UV-visible spectrophotometer로 734 nm에서 ABTS solution의 흡광도가 0.7±0.002가 되도록 제조하여 사용하였다. 이후 씀바귀 추출물 200 μL에 ABTS solution 4 mL를 넣고 voltex로 잘 혼합한 후 1분 30초간 실온에서 반응시키고 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 (1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 계산하여 ABTS 라디칼 소거 효과(%)로 나타내었다.
감마선 조사된 씀바귀의 antioxidant protection factor (PF) 측정
PF는 Andarwulan과 Shetty(1999)의 방법으로 측정하였다. PF 측정을 위한 emulsion 용액을 제조하기 위해 우선 β-carotene 10 mg을 chloroform 50 mL에 녹인 후, β-carotene/chloroform 용액 1 mL를 evaporator용 수기에 넣어 50°C에서 rotary vacuum evaporator를 이용하여 chloroform을 휘발시켰다. 이후 β-carotene 용액이 담긴 수기에 linoleic acid 20 μL, Tween 40 184 μL를 넣어 잘 섞어 용해시킨 후, H2O2 용액 50 mL를 첨가하여 emulsion 용액을 제조하였다. PF의 측정은 씀바귀 추출물 100 μL에 emulsion 용액 5 mL를 혼합하고, 50°C water bath에서 30분간 반응시킨 후 10분간 냉각시켜 UV-visible spectrophotometer로 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 시료의 흡광도/대조구의 흡광도로 계산하여 PF값(PF)으로 나타내었다.
감마선 조사된 씀바귀의 thiobarbituric acid reactive substances(TBARs) 억제 효과 측정
TBARs는 Buege와 Aust(1978)의 방법에 준하여 측정하였다. TBARs 측정에 사용된 emulsion 용액은 1% linoleic acid 100 mL에 surfactant로 1% Tween 40 100 mL를 넣고 균질화시켜서 제조하였다. TBARs 억제 효과의 측정을 위해 씀바귀 추출물 200 μL의 emulsion 용액 800 μL를 혼합한 후 50°C water bath에서 10시간 이상 반응시켰다. 이후 반응액 1 mL에 15% TCA, 0.375% TBA, 0.25 M HCl 혼합액에 3% BHT 용액을 100:3(v/v) 비율로 제조한 TBA reagent 4 mL를 넣고 voltex로 교반한 후 15분간 끓는 물로 중탕시킨다. 이후 반응액을 10분간 냉각시키고 원심분리기를 이용하여 2,000 rpm으로 15분간 원심분리하고, 이를 실온에서 10분간 방치한 후 상등액을 취해서 UV-visible spectrophotometer로 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 (1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 계산하여 TBARs 억제 효과(%)로 나타내었다.
방사선 조사된 씀바귀의 pancreatin α-amylase 저해 효과 측정
Pancreatin α-amylase 저해 효과 측정은 agar diffusion 방법(Davidson과 Parish, 1989)에 준하여 측정하였다. Agar 5 g과 soluble starch 5 g을 증류수 500 mL에 녹이고 autoclave(121°C, 15분)로 멸균하여 15 mL씩 Petri dish에 분취해 실온에서 굳혀 제작하였다. 효소 반응을 확인하기 위해 plate에 지름 10 mm disc paper를 올린 후, 씀바귀 추출물 800 μL와 효소액 200 μL(1,000 U/mL)를 혼합한 용액을 disc paper에 각각 분주하고 37°C incubator에서 3일간 배양시켰다. 이때 대조구에는 시료 추출물 대신 증류수를 처리하였고, 배양 후 plate에 5 mM I2 용액과 3% KI를 섞어서 제조한 I2/KI 용액 3 mL를 넣어 15분간 발색시킨 뒤 나타나는 clear zone의 area를 측정하였으며, 측정 결과는 (1-시료의 clear zone area/대조구의 clear zone area)×100으로 계산하여 α-amylase 저해 효과(%)로 나타내었다.
통계처리
본 실험의 결과는 3회 이상 반복 측정하여 나타낸 평균값±표준편차로 나타내었으며, 통계처리는 IBM SPSS 7.5 for windows 프로그램(Statistical Package for Social Science, Chicago, IL, USA)을 이용하였다. 시료 간의 유의적인 차이를 검증하기 위해 일원배치 분산분석(one-way ANOVA) 및 Duncan의 다중범위검정법을 실시하였으며, 유의차를 95% 수준에서 비교 분석하였다.
씀바귀 시료의 감마선 조사 여부 확인을 위한 광자극발광(PSL), 열발광(TL), 전자스핀공명(ESR) 특성 판별
감마선 조사 여부를 판별하는 데 이용되는 PSL은 주로 screening을 목적으로 사용되는 대표적인 방법 중 하나이다(Kwon 등, 2011). 본 연구에 이용된 씀바귀의 조사선량에 따른 PSL 측정 결과는 Table 2에서와 같이 조사 처리하지 않은 비조사구(0 kGy)에서는 277.33 PCs로 700 PCs 이하를 나타내어 조사 처리하지 않은 음성 시료로 판정되었으며, 5 kGy에서는 125,962.00 PCs, 10 kGy에서는 103,103.33 PCs로 모두 5,000 PCs 이상을 나타내어 방사선 조사가 확인된 양성 시료로 판별할 수 있었다. 감마선의 조사 여부는 PSL뿐만 아니라 TL에 의해서도 비조사구와 조사구 간의 low curve 형태와 최고 peak intensity가 명확하게 차이를 나타내기 때문에 조사 여부를 확인할 수 있고, TL ratio (TL1/TL2)의 임계값(threshold value)에 의해 정확하게 구분할 수 있다(Kwon 등, 2011). 씀바귀의 방사선 조사에 의한 TL 측정 결과는 Fig. 1A와 같이 5, 10 kGy 감마선 조사구에서 150~250°C 사이의 온도대역에서 비조사구(0 kGy)에서는 나타나지 않는 특징적인 glow curve를 확인할 수 있었고, 조사선량이 높아짐에 따라 TL intensity가 증가하는 것으로 확인되었다. 또한 Table 3과 같이 비조사구(0 kGy)에서 TL ratio는 0.005로 나타났으며, 이는 0.1 이하의 수치를 나타내어 조사 처리되지 않은 것으로 확인할 수 있었다. 반면 조사구(5, 10 kGy)의 경우 TL ratio는 각각 2.405, 4.070으로 0.1 이상의 수치를 나타내어 방사선 조사처리 시 나타나는 특징을 나타내 감마선 조사 여부를 확인할 수 있었다. 식품공전에서는 cellulose를 함유한 식품의 ESR 판정에서 중심부에서 저자장인 왼쪽 신호와 고자장인 오른쪽 신호가 cellulose radical에 의해 6.0 mT의 간격을 두고 한 쌍의 peak가 보이면 방사선 조사된 것으로 판정토록 고시하고 있다(Lee 등, 2002). 감마선 조사 씀바귀의 ESR 측정 결과는 Fig. 1B와 Table 4에서와 같이 감마선을 조사한 실험구에서 ESR 신호가 좌우로 각각 6 mT씩 대칭적인 peak가 나타나는 것을 확인하였다. 또한 Table 4에서 g-value도 감마선 비조사구(0 kGy)에 비해 조사구(5, 10 kGy)에서 더 높은 수치가 확인되었으며, 감마선 조사선량이 높아질수록 증가하는 패턴을 나타내었다. 따라서 이상의 결과를 통해 PSL, TL, ESR 분석을 통한 씀바귀의 감마선 조사 여부를 판단할 수 있음을 확인하였다.
Table 2 . Photo-stimulated luminescence (PSL) determinations of irradiated
Sample | PSL value | ||
---|---|---|---|
Irradiation dose (kGy) | |||
0 | 5 | 10 | |
277.33±57.54a1) (-)2)3) | 125,962.00±6,643.01c (+) | 103,103.33±3,792.16b (+) |
1)Mean±standard deviation (n=3). Means with different superscript letters are significantly different at
2)Threshold value: T1=700, T2=5,000, (-)
3)(+), positive (irradiated); (-), negative (non-irradiated); (M), intermediated..
Table 3 . TL ratios (TL1/TL2) of minerals separated from irradiated
TL glow | TL value | ||
---|---|---|---|
Irradiation dose (kGy) | |||
0 | 5 | 10 | |
TL11) (nC) | 11.162±6.092a | 4,582.000±1,462.297b | 14,543.000±6,783.982c |
TL22) (nC) | 2,331.500±232.638b | 1,880.500±310.420a | 4,020.500±1,238.144c |
TL ratio3) | 0.005±0.002a | 2.405±0.381b | 4.070±2.941c |
1)Integrated TL1 intensity at 150∼250°C..
2)Integrated TL2 intensity at 150∼250°C..
3)TL1/TL2. Mean±standard deviation (n=3). Means with different superscript letters are significantly different at
Table 4 . ESR signal parameter1) of radiation-induced radicals from irradiated
ESR parameter | ESR value | ||
---|---|---|---|
Irradiation dose (kGy) | |||
0 | 5 | 10 | |
g0 | 2.0063±0.0002a | 2.0056±0.0002b | 2.0061±0.0005ab |
g1 | - | 2.0235±0.0051 | 2.0239±0.0003 |
g2 | - | 1.9926±0.0023 | 1.9898±0.0028 |
1)g-value=[71.448×microwave frequency (GHz)]/ Magnetic field (mT)..
감마선 조사에 의한 씀바귀의 TPC 추출수율 변화
식물의 방어기작으로 생산되는 2차 대사산물 중 phenolic compounds는 다양한 식물에 다량 분포되어 있으며, 분자구조에 phenolic hydroxyl기를 함유하고 있어 단백질 같은 고분자 화합물과 쉽게 결합하여 항산화, 항균, 항염증 및 항관절염 등 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다(Kang 등, 2010). 본 연구에서는 WHO와 IAEA에서 규정한 대로 식품에 처리 가능한 선량인 0, 5, 10 kGy로 식용식물인 씀바귀에 방사선을 조사하여 씀바귀로부터 생리활성에 관여하는 TPC의 추출수율을 높이고자 시도하였다.
감마선 조사처리에 따른 씀바귀의 용매별 TPC 추출수율의 변화는 Fig. 2A와 같이 열수> 메탄올> 에탄올> 아세톤> 부탄올 순으로 나타났으며, 비조사구와 대비하여 조사처리에 따라 열수 추출물을 비롯하여 메탄올 추출물, 아세톤 추출물에서는 phenolics의 용출량이 증가하는 양상을 나타내었다. 이상의 결과를 바탕으로 식의약 소재로 사용 가능성을 확인하기 위해 인체에 유해하지 않은 것으로 보고되는 물과 에탄올을 최종 추출용매로 선정하여 0, 5, 10 kGy로 감마선 조사 처리한 씀바귀의 에탄올 농도별 TPC 추출수율을 비교해 보았다. 그 결과 Fig. 2B와 같이 열수와 에탄올 추출물에서 비조사구(0 kGy)에 비해 10 kGy 고선량의 조사구에서는 phenolics의 용출량이 많아지는 것을 확인할 수 있었으며, 10 kGy를 조사한 씀바귀 추출물의 TPC 함량은 열수 추출물에서 7.61±0.21 mg/g, 50% 에탄올 추출물에서 4.31±0.15 mg/g으로 최대 추출수율을 나타내었다(Table 5). Lee 등(2011)은 감마선 조사가 외톨개모자반의 TPC 함량 변화에 미치는 영향을 조사하기 위해 외톨개모자반 분말에 감마선을 3, 7, 20 kGy로 처리하고 물로 추출하여 TPC 함량을 측정하였으며, 그 결과 비조사구에 비해 조사 처리한 시료구에서 다소 높은 함량을 보여주었으나 조사선량에 따른 유의적인 차이를 나타내지 않았다고 보고하여 본 연구 결과의 열수 추출물이 phenolics 용출량이 증가하는 것과 유사한 패턴을 보여주었다. 한편, 저선량의 감마선(100~400 Gy)으로 조사한 결명자를 75% 에탄올로 추출하여 TPC 함량을 비교한 Um 등(2017)의 연구 결과에서는 조사선량이 증가할수록 TPC 함량이 감소하는 경향을 나타내었으며, 이는 본 연구 결과의 에탄올 추출물이 보여준 phenolics 용출량이 소폭 감소하는 것과 비슷한 경향임을 확인할 수 있었다. 이러한 방사선 조사처리에 따른 phenolic compounds 함량의 변화는 탄수화물과 같은 고분자 중합체에 결합한 형태로 존재하고 있던 phenolic compound가 방사선 조사에 의해 그 결합이 깨지면서 TPC 함량을 증가시키는 것으로 사료되며, 이는 시료의 type(종류, 건조상태, phenolic 조성 등)과 추출조건(추출용매, 추출과정, 추출온도 등), 감마선 조사선량 등 매우 다양한 요인들에서 기인하는 것으로 사료된다(Khattak 등, 2008; Park 등, 2017). 이상의 결과에 따라 씀바귀의 경우, 물을 용매로 한 열수 추출물에서 에탄올 추출물에 비해 상대적으로 높은 TPC 함량을 나타내는 것으로 확인되었으며, 이는 생리활성을 활용하는 측면에서는 에탄올 추출물보다는 열수 추출물을 활용하는 것이 훨씬 유리할 것이라는 추측을 할 수 있었다.
Table 5 . The content of total phenolic compound from irradiated
Extracts | Total phenolic content (mg/g) | ||
---|---|---|---|
Irradiation dose (kGy) | |||
0 | 5 | 10 | |
Water | 5.87±0.351) | 6.06±0.36 | 7.61±0.21 |
50% Ethanol | 4.36±0.15 | 3.84±0.15 | 4.31±0.15 |
1)Mean±standard deviation (n=6)..
따라서 phenolics 용출량이 상대적으로 높고 방사선 처리에 의한 변화가 크게 나타난 씀바귀 열수 추출물을 이용하여 향후 생리활성 실험을 진행하였으며, 추출수율이 가장 높게 나타난 10 kGy의 방사선 처리한 씀바귀의 열수 추출물을 사용하여 비조사구(0 kGy)와 비교 실험을 진행하였다. 본 연구를 통해 방사선 조사에 의해 추출물의 total phenolic의 추출수율이 증가하는 것이 확인됨에 따라 방사선 조사처리가 초미세 분쇄(Cho, 2014), 초음파 처리(Kang, 2016) 등과 같이 천연물의 추출수율을 증대시키기 위한 또 다른 하나의 수단으로 활용이 가능할 것으로 기대되었다.
감마선 조사에 의한 씀바귀의 DPPH 라디칼 소거능의 변화
DPPH 라디칼은 대표적인 자유라디칼로, 이에 대한 환원력이 클수록 높은 활성산소 소거 능력을 기대할 수 있어 대표적인 항산화 활성의 지표로 알려져 있다(Pokorny, 1991). 감마선 비조사구와 10 kGy 조사한 씀바귀 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과는 Fig. 3A와 같이 비조사구 추출물의 TPC 함량 기준을 50~200 μg/mL로 처리했을 때 80.68~89.03%의 높은 저해 효과를 나타내었으며, 10 kGy의 방사선을 조사한 추출물의 경우 80.09~86.39%의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내어 대조구로 사용한 BHT의 61.03~87.38%에 비해 저농도에서 라디칼 소거능이 더 우수한 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 Ju 등(2006)이 보고한 감국, 결명자, 당귀, 배초향, 산사육, 엉겅퀴, 오가피 등의 한약재의 열수 추출물 250 μg/mL로 처리 시 DPPH 라디칼 소거 활성이 50% 이하를 나타낸 결과와 비교해봤을 때, 본 연구에서 사용한 씀바귀 열수 추출물이 상대적으로 매우 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 동량의 phenolic 함량을 적용했을 때 방사선 비처리구에 비해 방사선 처리구의 라디칼 소거능 증대 현상은 관찰되지 않았는데, 이는 Table 1의 결과에서 방사선 조사에 의해 phenolic 물질의 용출은 증대하지만 용출되는 phenolic의 profile pattern이 DPPH 라디칼 소거능의 변화에는 영향을 미치지 않는 구성으로 조성된 것이 아닌가 추측하였으며, 향후 이에 관한 연구는 진행되어야 할 것으로 판단되었다.
감마선 조사에 의한 씀바귀의 ABTS 라디칼 탈색의 변화
ABTS 라디칼 탈색은 시료 추출물에 존재하는 항산화 물질에 의해 ABTS 자유라디칼이 제거되는 정도를 측정하여 친수성과 친유성 물질의 항산화 효과를 판별할 수 있으며(Fellegrini 등, 1999), 항산화 메커니즘에서 hydrogen-donating과 chain breaking 모두를 측정할 수 있다. 또한 aqueous 및 organic phase에 적용이 가능하며, 표준물질에 의한 상대 비교가 가능하다는 장점이 있다. 이 반응은 potassium persulfate에 의해 생성된 ABTS 자유라디칼이 추출물 속의 항산화 물질에 의해 제거되면서 청록색 라디칼의 탈색 정도를 측정하게 된다.
씀바귀 열수 추출물의 ABTS 라디칼 저해율을 측정한 결과는 Fig. 3B와 같이 비조사구의 추출물을 TPC 함량 기준 50~200 μg/mL 농도로 처리했을 때 50.01~99.24%의 높은 저해율을 나타내었으며, 10 kGy로 조사한 추출물의 경우 72.22~99.28%의 매우 높은 저해율을 나타내었다. 이 결과는 positive control로 사용한 BHA의 43.35~95.88%보다 높은 수준이었으며, Lee 등(2012)의 와송과 한약재 복합물의 ABTS 라디칼 저해율이 1,000 μg/mL에서 70% 수준이었다는 연구 보고와 비교했을 때 상대적으로 씀바귀 열수 추출물의 저해율이 매우 우수한 것으로 사료되었다. 또한 방사선 처리구의 경우 TPC 함량 기준 100 μg/mL 이하의 저농도에서 비조사구에 비해 상대적으로 높은 ABTS 라디칼 억제 증대 현상이 관찰되었다. 따라서 씀바귀 열수 추출물의 친수성 및 친유성 물질에 대한 항산화 효과가 감마선 조사처리에도 무관하게 상당히 우수한 수준을 나타내는 것을 알 수 있었으며, 저농도의 처리에서는 방사선 처리에 의해 항산화 효과가 월등히 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
감마선 조사에 의한 씀바귀의 PF 변화
지방의 산화로 생성되는 free peroxyl radical은 β-carotene의 이중결합에 작용하여 불활성 물질이 형성되며, 이로 인해 연쇄반응이 중단되는 결과를 나타내어 산화가 발생한다. 산화가 발생함으로써 β-carotene이 지닌 고유의 오렌지색이 탈색되게 되는데, 이러한 탈색 정도를 흡광도로 측정하여 항산화 활성 정도를 측정하는 데 이용한다(Jung, 2010). Fig. 3C와 같이 씀바귀 비조사구의 열수 추출물을 TPC 함량 기준 50~200 μg/mL로 처리했을 때 0.52~1.93 PF를 나타내었으며, 10 kGy의 방사선을 조사한 열수 추출물의 경우 1.41~3.06 PF값을 나타내어 매우 높은 PF 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 positive control인 BHA가 나타낸 1.18~1.40 PF값과 비교했을 때 감마선 조사한 씀바귀 열수 추출물이 BHA보다 매우 높은 항산화력을 가지는 것을 확인할 수 있으며, 비조사구에 비해 더 높은 지용성 항산화력을 가지는 것으로 확인되어 감마선 조사가 추출물의 지용성 물질에 대한 산화 억제 효과에 positive한 결과를 나타내는 것으로 판단되었다.
감마선 조사에 의한 씀바귀의 TBARs 저해능의 변화
지질의 산화과정 중 생성되는 저분자 malondialdehyde와 thiobarbituric acid를 반응시켜 생성된 TBARs를 측정하여 지용성 항산화 효과를 나타내는(Jeong 등, 1998) TBARs에 씀바귀 열수 추출물이 미치는 영향을 확인하였다. 비조사구 씀바귀 열수 추출물의 TBARs 저해능은 Fig. 3D와 같이 TPC 함량 기준 50~200 μg/mL 처리 시 89.16~96.32%의 매우 높은 효과를 나타내었으며, 10 kGy 감마선 조사에 의한 TBARs 저해능은 85.22~98.57%로 감마선 조사처리에 의한 TBARs 억제의 상승은 관찰되지 않았다. Park과 Cho(2014)는 방사선 조사된 약용작물 추출물이 total phenolic 농도가 높아짐에 따라 항산화 효과도 높아지는 농도의존형 상관관계를 나타낸 것으로 보고하였으며, 본 연구 결과도 유사한 양상을 나타내었다. 따라서 이상의 연구 결과를 통해 식물체 원료의 감마선 조사처리는 원료의 추출 제조에 있어서 생리활성에 관여하는 성분의 추출수율을 증가시키는 것으로 확인되었으며, 10 kGy 수준의 조사선량이 추출물의 항산화 활성을 다소 증폭시키는 것으로 사료되었다.
감마선 조사에 의한 씀바귀의 당분해 효소(pancreatin α-amylase)에 대한 저해 효과의 변화
당분해 효소 저해제는 식품으로 섭취하는 polysaccharide인 전분을 소장에서 가수분해하여 glucose를 생성하는 대표적인 효소인 α-amylase 활성을 저해하여 전분 분해를 감소시키는데, 이렇게 소장점막으로 흡수되는 glucose의 양을 줄여줄 뿐만 아니라 분해된 glucose의 체내 흡수를 지연시켜 당뇨병 환자들의 혈당을 조절하는 데 사용된다(Jeong 등, 2010). 본 연구에서는 agar diffusion 방법으로 당분해 효소 중 pancreatin α-amylase에 대한 저해 효과를 확인한 결과 Fig. 4와 같이 조사 처리하지 않은 씀바귀 열수 추출물의 경우 TPC 함량 기준 50~200 μg/mL에서 39.26~69.63%의 저해 효과를 나타내었으며, 이는 positive control로 사용한 acabose를 동량으로 처리 시 21.74~53.91%인 것과 비교했을 때 더 우수한 수준임을 확인할 수 있었다. 또한, 방사선 조사에 의한 α-amylase 저해 증대 효과를 측정한 결과, 10 kGy의 감마선을 조사한 씀바귀 열수 추출물에서 38.52~100.00%의 매우 상승한 저해 효과가 관찰되어 방사선 조사처리로 인한 당분해 효소 억제 증대 효과를 기대할 수 있는 것으로 확인되었다. Park 등(2017)이 보고한 한약재 곽향 물 추출물을 감마선 10 kGy 선량으로 조사했을 때, 비조사구보다 높은 수준의 pancreatin α-amylase 억제 효과를 나타낸 결과와 본 연구 결과는 유사한 양상을 나타내었다. 또한, Yook 등(1997)은 SDS-page를 이용하여 감마선 조사가 분해 효소의 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 α-amylase가 포함된 pancreatin의 패턴을 비교하였는데, 그 결과 10 kGy 조사처리 시 밴드의 굵기 변화가 나타났으며 약 50% 수준의 단백질 peptide 결합이 절단되는 것으로 확인되었다. 따라서 씀바귀의 감마선 조사처리에 따른 α-amylase 효소 활성이 저하되는 원인은 감마선 조사가 효소를 구성하는 단백질을 파괴하거나 결합을 절단하여 저분자화되었을 것으로 예상되었다. 한편, Lim 등(2010)이 보고한 섬오갈피나무, 오가나무, 오갈피나무 등의 추출물에서 4.97~19.97% 수준의 α-amylase 저해율을 나타낸 결과와 비교하면, 씀바귀 열수 추출물은 α-amylase 저해 활성이 매우 우수하였으며, 감마선 조사처리에 의해 추출물의 α-amylase 저해 활성 또한 극대화할 수 있을 것으로 기대되었다.
감마선 조사는 약용식물의 기능성 물질 추출수율 증대 및 색상 개선 등 산업화를 유리하게 하는 처리방법으로 기대되고 있다. 본 연구에서는 감마선 조사가 씀바귀의 phenolic 추출수율 증대와 항산화 및 당분해 효소 억제 효과에 미치는 영향을 검증하였다. 감마선을 0, 5, 10 kGy 선량별로 조사한 씀바귀의 감마선 조사 여부를 확인하고자 광자극발광법(PSL), 열발광법(TL), 전자스핀공명법(ESR)을 활용하여 조사 판별 확인시험을 진행하였다. 그 결과 PSL에서 5, 10 kGy가 각각 9,125,962.00 PCs, 103,103.33 PCs로 5,000 PCs 이상으로 측정되었고, TL ratio는 5, 10 kGy가 각각 2.405, 4.070으로 0.1 이상의 값을 나타내었으며, ESR에서는 좌우 6 mT 간격으로 대칭적인 한 쌍의 peak를 나타내는 것이 관찰되어 실험에 사용한 씀바귀는 감마선을 조사한 양성(positive) 시료로 검증되었다. 감마선 조사한 씀바귀의 total phenolics 함량은 방사선 선량이 높을수록 phenolics 용출량이 많아지는 것을 확인할 수 있었으며, 10 kGy를 조사한 씀바귀의 total phenolics 함량은 열수 추출물 7.61±0.21 mg/g, 50% 에탄올 추출물에서 4.31±0.15 mg/g을 나타내었다. 감마선 조사된 씀바귀의 항산화 효과를 확인한 결과 DPPH 라디칼 소거 효과는 비조사구와 10 kGy 조사구에서 TPC 함량 50 μg/mL에서 모두 80% 이상의 높은 저해 효과를 나타내었다. ABTS 라디칼 저해 효과는 비조사구와 조사구에서 TPC 함량 200 μg/mL에서 모두 99% 이상의 높은 저해 효과를 나타내었다. PF는 10 kGy 처리구에서 TPC 함량 50~200 μg/mL로 처리했을 때 1.41~3.06 PF의 매우 높은 값을 나타내었다. TBARs 저해능 역시 10 kGy 조사구에서 85.22~98.57%의 높은 항산화능을 나타내었다. Pancreatin α-amylase 저해 효과는 10 kGy 조사구에서 38.52~100%의 저해 효과가 관찰되어 감마선 조사가 당분해 효소 억제 효과를 증대시키는 것으로 기대되었다. 따라서 감마선 조사처리가 씀바귀를 비롯한 식물체로부터 생리활성 물질의 용출을 증대시키고 약리성 및 기능성을 증폭시킬 수 있는 수단으로 활용이 가능할 것으로 판단되었으며, 씀바귀는 천연유래 소재로써 항산화 및 항당뇨 관련 기능성 소재로 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대되었다.
Table 1 . Analyzing condition for thermoluminescence (TL).
Specification | Condition |
---|---|
Flow gas | N2 (99.999%) |
Final temperature | 400°C |
Pre-heat temperature | 50°C |
Heating rate | 5.00/s |
Table 2 . Photo-stimulated luminescence (PSL) determinations of irradiated
Sample | PSL value | ||
---|---|---|---|
Irradiation dose (kGy) | |||
0 | 5 | 10 | |
277.33±57.54a1) (-)2)3) | 125,962.00±6,643.01c (+) | 103,103.33±3,792.16b (+) |
1)Mean±standard deviation (n=3). Means with different superscript letters are significantly different at
2)Threshold value: T1=700, T2=5,000, (-)
3)(+), positive (irradiated); (-), negative (non-irradiated); (M), intermediated..
Table 3 . TL ratios (TL1/TL2) of minerals separated from irradiated
TL glow | TL value | ||
---|---|---|---|
Irradiation dose (kGy) | |||
0 | 5 | 10 | |
TL11) (nC) | 11.162±6.092a | 4,582.000±1,462.297b | 14,543.000±6,783.982c |
TL22) (nC) | 2,331.500±232.638b | 1,880.500±310.420a | 4,020.500±1,238.144c |
TL ratio3) | 0.005±0.002a | 2.405±0.381b | 4.070±2.941c |
1)Integrated TL1 intensity at 150∼250°C..
2)Integrated TL2 intensity at 150∼250°C..
3)TL1/TL2. Mean±standard deviation (n=3). Means with different superscript letters are significantly different at
Table 4 . ESR signal parameter1) of radiation-induced radicals from irradiated
ESR parameter | ESR value | ||
---|---|---|---|
Irradiation dose (kGy) | |||
0 | 5 | 10 | |
g0 | 2.0063±0.0002a | 2.0056±0.0002b | 2.0061±0.0005ab |
g1 | - | 2.0235±0.0051 | 2.0239±0.0003 |
g2 | - | 1.9926±0.0023 | 1.9898±0.0028 |
1)g-value=[71.448×microwave frequency (GHz)]/ Magnetic field (mT)..
Table 5 . The content of total phenolic compound from irradiated
Extracts | Total phenolic content (mg/g) | ||
---|---|---|---|
Irradiation dose (kGy) | |||
0 | 5 | 10 | |
Water | 5.87±0.351) | 6.06±0.36 | 7.61±0.21 |
50% Ethanol | 4.36±0.15 | 3.84±0.15 | 4.31±0.15 |
1)Mean±standard deviation (n=6)..
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