비만은 에너지의 섭취와 소비의 불균형으로 초래되는 대사성 질환으로 소비 후 남은 에너지가 중성지방 형태로 체내지방조직에 과도하게 축적된 상태를 말하는데, 유전적･환경적 요인이 복합적으로 작용하여 나타난다(Albu 등, 1997). 지방조직은 잉여에너지를 저장하는 장소일 뿐만 아니라 아디포카인을 합성, 분비함으로써 전신 대사와 염증에도 관여하는 내분비 기관으로 알려져 있다(Furukawa 등, 2004; Park과 Kim, 2002). 비만으로 인한 과도한 지방 축적은 지방조직의 내분비 기능 변형을 초래하여 인슐린 저항성, 당뇨병, 대사증후군, 심혈관 질환 등의 발생을 촉진하는 것으로 보고되고 있다(Gregor와 Hotamisligil, 2011). 우리나라 비만 유병률은 2001년 29.2%, 2010년 30.9%, 2017년 34.1%로 매년 지속해서 증가하고 있으며(KDCA, 2019), 2018년 국민건강보험 공단의 보고에 따르면 비만으로 인한 사회경제적 손실이 연간 11조 원에 달하는 것으로 알려져 있다(NHIS, 2018). 이에 따라 비만의 예방 및 치료를 위해 소재 개발에 관한 연구가 꾸준히 이루어지고 있는데 최근 주목받고 있는 소재가 프로바이오틱스이다.

프로바이오틱스는 적정량을 섭취하였을 때 숙주의 건강에 유익한 효과를 주는 살아있는 미생물을 말하며, 식품 분야에서는 Latobacillus 속, Bifidobacterium 속, Pediococccus 속, Lactococcus 속, Enterococcus 속 균주가 대표적인 상업용 프로바이오틱스로 사용되고 있다(Gaspar 등, 2013; Kang 등, 2017). 일반적으로 프로바이오틱스는 장내 균총의 안정화, 변비 예방, 유해균 생육 억제 등 주로 장 건강과 관련된 기능성을 가지는 것으로 알려져 왔으나(Axelsson 등, 1989; Alander 등, 1999), 2010년 이후 장내 미생물과 질환과의 상관성 연구가 다수 보고되면서(Claesson 등, 2012; Lynch와 Pedersen, 2016; Fan과 Pedersen, 2020) 프로바이오틱스를 이용한 항비만(Lee 등, 2006), 콜레스테롤 저하(Park 등, 2017), 항알레르기(Corthesy 등, 2007), 면역조절(Jounai 등, 2012), 갱년기 증상 완화(Lim 등, 2018), 아토피(Lee 등, 2008) 개선을 위한 소재 개발 연구가 증가하고 있다. 이 중 항비만 활성을 가지는 프로바이오틱스에 대한 연구로 Lee 등(2006)은 L. rhamnosus PL60 균주가 간에서 지방 대사를 촉진하고 지방 생합성을 억제함을 보고하였으며, Kwon 등(2020)은 L. plantarum 균주가 SIRT1과 PCG1-α 발현을 증가시켜 항비만 활성을 가진다고 보고한 바 있다. 또한 P. pentosaceus LP28 균주는 CD36과 stearoyl-CoA desaturase I의 발현 억제를 통해 항비만 효과를 나타내는 것이 보고되었으며(Zhao 등, 2012), L. gasseri BNR17 균주도 고지방식이로 유도한 비만 모델에서 체중증가 억제 활성을 가진다고 보고된 바 있다(Kang 등, 2013). 특히, L. gasseri BNR17 균주는 현재 건강기능식품 개별인정형 균주로 등록되어 체지방 감소에 도움을 줄 수 있는 원료로 상업화되어 이용되고 있다.

한편, 기능성이 밝혀진 프로바이오틱스를 건강기능식품원료로 이용하기 위해서는 안전성에 대한 검증이 필요한데, 식품의약품안전처(식약처)의 고시형 프로바이오틱스 균주나 European Food Safety Authority(EFSA)의 Qualified Presumption of Safety(QPS) 균주들은 오랜 식경험을 바탕으로 안전하다고 분류되어 별도의 안전성 검증이 요구되지 않았으나, 최근 프로바이오틱스의 복용에 따른 부작용사례가 증가하고(KFSI, 2020) 프로바이오틱스 균주를 통한 항생제 내성 유전자의 이동이 문제가 되면서(Huddleston, 2014; Verraes 등, 2013; Kapoor 등, 2017) 각국에서는 안전성과 관련한 규제를 강화하고 있다. EFSA에서는 2012년 Enterococcus 속 유산균의 식품 및 사료용 사용을 금지하거나 항생제 내성 및 병독성 인자가 없음을 추가로 입증한 후 제한적으로 사용하도록 하고 있다(EFSA, 2012). 식약처에서도 건강기능식품공전에 프로바이오틱스로 고시한 5속 19종 균주에 대해서는 별도의 안전성 자료를 요구하지 않았으나 2019년부터 Enterococcus 속 미생물에 대해서는 항생제 내성 및 독성 평가를 통하여 안전성을 입증하도록 의무화 하였다(MFDS, 2017). 또한 건강기능식품 원료로 등록하고자하는 균주가 고시형일 경우에는 항생제 내성, 용혈 활성 등의 기초적인 안전성 자료를 요구하고 있으며, 비고시형 균주일 경우에는 이외에도 독성시험 자료를 추가로 제출하도록 하고 있다(NIFDS, 2020; Kim 등, 2020). 이에 본 연구에서는 건강한 한국인 여성으로부터 분리한 Lactobacillus paracasei AO356 균주의 체중증가 억제 활성과 안전성을 평가하여 체지방 감소에 도움을 줄 수 있는 건강기능식품 원료로의 사용 가능성을 평가하였다.

AO356 균주 준비

AO356 균주(KCCM 12145P)는 (주)코스맥스엔에스(Seoul, Korea)로부터 제공받아 -70°C의 Deep freezer(U725-86, Eppendorf, St Albans, UK)에 보관하며 사용하였다. 항비만 활성 평가 시에는 제공받은 균주 분말을 현탁하여 사용하였으며, 항생제 내성, 용혈성, indole 생성능, urea 분해능, gelatinase 활성 평가 시에서는 제공받은 균주를 활성화한 후 사용하였다. 활성화를 위하여 MRS 고체 배지에 선상도말 평판법으로 37°C, 24시간 동안 배양한 후 단일 colony를 취하여 Lactobacilli MRS broth(BD Difco^TM, Sparks, MD, USA) 배지에 접종하고 호기적인 조건 하에서 37°C, 24시간 배양한 후 실험에 사용하였다.

DIO 동물모델 구축 및 균주 투여

C57BL/6J 마우스(5주령, 수컷)를 (주)지바이오(Gwangju, Korea)에서 구입하여 1주일간 순화시킨 후, 체중에 따라 난괴법에 의해 10마리씩 5군(정상식이군(Normal), 고지방 식이군(HFD), 고지방식이+catechin 162 mg/kg 투여군(catechin), 고지방식이+AO356 1×10⁷ CFU/ head 투여군(AO356 10⁷ CFU), 고지방식이+AO356 1×10⁸ CFU/head 투여군(AO356 10⁸ CFU))으로 분류하였다. 정상식이군에는 일반사료(ND, Teklad 2018S, Envigo Research, Indianapolis, IN, USA)를 공급하였으며, 나머지 실험군에는 60 kcal% fat 사료(D12492, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA)를 공급하였고, positive control인 catechin 및 AO356 시료는 생리식염수에 현탁하여 100 μL씩 주 5일, 10주간 경구 투여하였다. 사육실 온도는 23±2°C, 습도는 50±5%, 명암주기는 12시간 간격으로 설정하고 물과 사료를 자율 급식시켰으며, 동물실험은 한국식품연구원 동물실험위원회에서 승인(KFRI-M-20042)한 절차에 따라 수행하였다. 7일마다 일정한 시간에 체중을 측정하였으며, 식이 섭취량 및 수분 섭취량을 급여량과 잔여량의 차이로 측정하였다. 식이 효율(feed efficiency ratio: FER)은 체중 증가량(g/d)을 식이 섭취량(g/d)으로 나누어 계산하였다.

혈액분석

시료 투여 기간 종료 후 16시간 절식시킨 마우스의 후대 정맥을 통해 채혈한 혈액을 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. Glucose, triglyceride, total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol은 Hitachi automatic analyzer modular analytics(Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. Insulin 함량은 mouse insulin ELISA kit(ALPCO diagnostics, Salem, NH, USA)을 이용하여 측정하였으며, 측정된 혈청 glucose 및 insulin 함량으로부터 HOMA-IR을 구하였다.

HOMA-IR＝{fasting insulin (μU/mL)×fasting glucose (mg/dL)}/ 405

항생제 내성 평가

항생제에 대한 내성은 Sensititre^TM Gram Positive GPALL1F AST plate(Thermo fisher Scientific, Basingstoke, UK) 제품을 이용하여 최소 억제농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다. 실험균주는 Lactobacilli MRS agar(BD Difco) 배지에서 37°C, 24시간 동안 배양하여 활성화하고 순수 배양된 colony를 McFarland standard 0.5로 보정한 후 실험을 진행하였다. 배지는 Iso-Sensitest broth(Oxoid, Basingstoke, UK)와 Lactobacilli MRS broth(BD Difco)를 9:1로 혼합하여 제조 후(Shao 등, 2015; Munoz 등, 2014) 사용하였으며, 제조한 액체 배지에 McFarland standard 0.5로 탁도를 보정한 현탁액을 넣고 50 μL씩 sensititre panel plate에 분주 접종하였다. 접종한 plate는 24시간 동안 37°C에서 배양하였고 배양이 끝난 뒤에는 제조사의 MIC 결과판정 기준에 따라 판독을 진행하였다.

용혈성, gelatinase 활성, β-glucuronidase 생성능, indole 생성능 및 urea 분해능 평가

AO356은 MRS 배지에서 37°C, 24시간 2회 배양하여 활성화된 상태로 준비하였다. 용혈성 확인을 위해 활성화한 균주를 sheep blood agar plate(Asan pharmaceutical, Seoul, Korea)에 획선으로 접종하여 37°C에서 48시간 배양한 후 용혈반응 유형을 확인하였다(Argyri 등, 2013). Gelatinase 활성 측정을 위해 활성화된 균주는 gelatin 사면 배지에 MRS broth+gelatin 1.2%를 접종하여 37°C, 24시간 배양한 후 4°C에서 약 4시간 동안 냉장 방치하여 배지의 응고 여부를 확인하였다(Isenberg, 1992a). AO356 균주의 β-glucuronidase 생성능은 API ZYM test kit(Bio-Merieux, Lyon, France)을 사용하여 평가하였다. 균주를 MRS 고체배지에서 37°C, 24시간 배양한 후 단일 colony를 취하여 API suspension medium에 현탁하고, McFarland standard 5 탁도로 보정한 후 각 큐플에 접종하여 37°C에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 큐플에 ZYM A와 ZYM B를 1방울 첨가하고 5분 뒤 제조사의 프로토콜에 따라 효소 생성능을 평가하였다. β-glucuronidase 생성능 확인을 위해 15번째 큐플의 색 변화를 평가하였으며, 색 변화가 없거나 미색일 때 음성, 파란색으로의 색 변화가 관찰되면 양성으로 판정하였다. AO356 균주의 indole 생성 및 urea 분해능은 indole/urea test kit(MB cell, Los Angeles, CA, USA)을 사용하여 측정하였다. MRS 고체 배지에 활성화한 AO356 균주를 sterile loop를 이용하여 urea/indole test mixture에 현탁시킨 다음 vaseline oil을 2~3방울 첨가한 후 36±1°C에서 4시간 배양하고 Kovac’s-reagent를 2~3방울 첨가한 후 색 변화를 관찰하였다(Mac Faddin, 1980). 혼합액과 혼합액 상단에 생성된 링의 색이 노란색이면 음성으로, 붉은색이면 양성으로 판정하였다.

통계처리

본 실험 결과는 IBM SPSS Statistics(Version 20, IBM, Armonk, NY, USA)를 이용하여 평균과 표준편차를 나타내었다. 실험군 간의 유의성 검증은 P<0.05 수준에서 oneway ANOVA를 시행한 후 Duncan’s multiple range test를 이용하여 분석하였다.

AO356 균주의 마우스 체중 및 지방조직 증가 억제 활성

AO356 균주의 항비만 활성을 평가하기 위해 6주령 C57 BL/6J 마우스에 고지방식이를 공급하며 주차별 체중을 특정한 결과(Fig. 1A), 고지방식이를 공급한 HFD군 마우스의 10주차 평균 체중은 42.42 g으로 0일 대비 20.06 g 증가하여 6.33 g 증가한 정상식이 공급군에 비해 3.16배 증가하였다. 그러나 고지방식이와 함께 AO356 균주를 경구 투여한 군에서는 농도 의존적인 체중증가 억제 활성이 나타났으며, 1×10⁸ CFU 투여군의 경우 10주간의 체중 증가량이 16.39 g으로 HFD군 대비 약 20% 감소하여 positive control인 catechin을 162 mg/kg･BW 농도로 투여한 군과 유사한 수준의 체중증가 억제 활성을 보였다. 식이 섭취량에는 실험군간 유의적인 차이는 없어 체중증가 억제 활성이 식이 섭취량 감소에 기인한 것이 아님을 알 수 있었으며, 식이 섭취 효율도 catechin 및 AO356 섭취군에서 HFD군에 비해 감소한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1C, 1D). 지방조직 특히 백색지방은 체중증가와 더불어 비만의 주요 위험요소로 알려져 있다(Bjorntorp, 1990; Despres, 1993). 지방조직은 백색지방과 갈색지방으로 구분되는데, 체내잉여 에너지를 중성지방의 형태로 저장하는 백색지방 조직의 비정상적인 비대는 지방조직의 아디포카인 분비 조절 장애를 유도하고 포도당과 지질대사를 변화시켜 심각한 대사증후군을 유발하는 것으로 알려져 있다(Asselah 등, 2006; Park과 Kim, 2002). 이에 AO356 섭취가 지방조직 증가에 미치는 영향을 평가하기 위해 주요 지방조직의 무게를 측정하였다. 그 결과, 고지방식이에 의해 부고환 지방, 후복막 지방, 서혜부 지방 등 백색지방 조직의 무게가 정상식이군 대비 각각 2.75, 4.5 및 3.35배 증가하였으나, AO356 투여 시 증가한 지방조직의 무게가 고지방식이군 대비 약 10%, 5% 및 23% 감소한 것으로 나타났다(Fig. 1B). 한편, 갈색지방은 미토콘드리아를 다량 함유하고 있어 에너지 소비 촉진과 관련 있는 지방조직이지만, 고지방식이를 섭취한 동물에서는 비정상적인 지방산의 축적에 의해 그 무게가 증가하는 것으로 보고되고 있다(Llado 등, 1997; Ryu 등, 2011). 본 실험에서도 고지방식이군에서 견갑골 갈색지방의 무게는 증가하였으나, AO356 식이 시 갈색지방의 무게가 감소한 것으로 관찰되었는데, 이는 AO356 균주 투여가 고지방식이에 의해 유도되는 지방산의 축적을 억제하였기 때문으로 생각된다.

Fig 1. The ameliorative effect of Lactobacillus paracasei AO356 on obesity parameters. (A) Body weight was measured weekly and presented as mean±SD (n=8). (B) The tissues were weighted and normalized by the body weight of each mouse. (C) The food efficiency ratio (EFR) of each group was calculated by applying the equation; FER=body weight gain (g/d)/ Food intake (g/d) and showed as mean±SD. (D) The food intake of each group was calculated and shown as mean±SD. Different letters above bars indicate a significant difference at P <0.05 by Duncan’s multiple range test. HFD, High fat diet group; EFT, epididymal white fat tissue; RFT, retroperitoneal white fat tissue; IFR, inguinal white fat tissue; BAT, intrascapular brown adipose tissue.

AO356 균주의 이상지질혈증 및 인슐린 저항성 개선 활성

고지방식이로 인해 증가한 잉여 에너지는 지방으로 전환되어 체내에 축적되고, 축적된 지방의 비정상적인 지질대사는 간 내 유리지방산의 유입을 증가시켜 간에서의 지방합성 및 초저밀도지단백(very low density lipoprotein; VLDL)의 생성 증가와 lipoprotein lipase의 활성 감소를 유도하는데, 이로 인해 혈중 중성지방이 증가하게 된다(Krauss, 2004). 고지방식이 투여군의 경우 중성지방의 함량이 정상식이군 대비 1.66배 증가 하였고, AO356 투여 시 catechin 투여 시와 유사하게 약 32% 감소하였다. 한편, 비만으로 인해 발생하는 이상지질혈증의 다른 지표로는 총 콜레스테롤, LDL 및 HDL 콜레스테롤이 있다. 지질은 세포막, 담즙, 호르몬의 중요 성분이지만 혈중 지질 함량이 높으면 다양한 질병의 위험도를 높이는 것으로 알려져 있고, 특히 LDL 콜레스테롤은 간에서 다른 조직으로 콜레스테롤을 운반하고 체내에 축적하는 것으로 알려져 있다(Kolovou 등, 2005). 반면, HDL 콜레스테롤은 LDL 콜레스테롤의 생성을 억제하거나 혈관에 축적된 콜레스테롤을 감소시켜 동맥 경화 발생을 억제하는 작용을 한다(Imano 등, 2011; Gordon 등, 1977). AO356의 경구 투여는 고지방식이에 의해 증가된 혈청 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤을 유의한 수준으로 감소시켰으며, 총 콜레스테롤 중 HDL-콜레스테롤의 비율을 유의적으로 높게 유지시켰다(Table 1). 또한 고지방식이군에 의해 증가한 동맥경화지수(atherogenic index, AI)와 심혈관 위험지수(cardiac risk factor, CRF)도 감소되어 AO356은 고지방식이로 유도되는 이상지질혈증 개선에 효율적인 소재임을 확인할 수 있었다. 최근 연구에 따르면 AO356과 같은 Lactobacillus 속 균주의 이상 지질 개선 효과는 AMPK, SIRT1 및 PGC-1α 발현 증가를 통한 담즙산의 생성 증가와 간으로의 콜레스테롤 회수 증가에 의한 것으로 보고되고 있는데(Jang 등, 2019; Kwon 등, 2020), AO356 균주도 이와 유사한 기전으로 이상지질혈증 개선에 효과를 보일 것으로 예상되나 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 한편, 혈중 중성지질과 LDL-콜레스테롤의 양이 증가되고 말초 조직과 복부에 중성지질이 축적되면 인슐린 저항성 등과 같은 합병증이 유발되는데(Potter, 1995; Spiegelman, 2001), AO356 투여는 고지방식이에 의한 인슐린 저항성도 개선시키는 것으로 확인되었다(Table 1). 고지방식이군의 공복 혈청 인슐린 농도는 14.50±2.53 μU/mL로 1.41±0.41 μU/mL인 정상식이군 대비 증가한 고인슐린혈증 상태였으며, 공복 혈당 역시 317.86±55.46 mg/dL로 정상군 대비 1.7배 높은 인슐린 저항성이 발생된 상태였다. 그러나 AO356을 1×10⁸ CFU 농도로 투여 시 공복 혈청 인슐린 농도가 약 70% 감소하였으며, 공복 혈당도 244.88~229.00 mg/dL로 고지방식이군 대비 23~28% 감소한 것으로 나타나 AO356 식이를 통해 인슐린 저항성이 개선됨을 확인할 수 있었다. 이는 공복 혈당과 인슐린 농도를 바탕으로 계측하는 인슐린 저항성 지표인 HOMA-IR 결과에서도 확인되었는데, 고지방식이로 인해 약 16배 증가한 HOMA-IR 수치가 AO356 투여 시 55~56% 감소하여 58% 가량 감소한 catechin 투여군과 유사한 수준으로 인슐린 민감도가 향상됨을 확인할 수 있었다.

Table 1 . The effect of Lactobacillus paracasei AO356 on HFD-induced dyslipidemia and insulin resistance in serum isolated from mice.

	Normal	HFD1)	Catechin	AO356 107 CFU	AO356 108 CFU
Triglyceride (mg/dL)	63.71±14.34a	105.86±27.70c	81.29±7.70b	72.38±9.86ab	74.63±10.38ab
Total cholesterol (mg/dL)	103.43±8.92a	180.86±9.97c	158.33±9.18b	161.63±11.19b	165.63±8.96b
LDL2)-cholesterol (mg/dL)	12.14±2.27a	29.14±4.30c	24.83±2.98b	23.75±3.06b	25.00±2.62b
HDL3)-cholesterol (mg/dL)	92.14±5.64a	141.43±7.52c	131.67±5.47b	133.00±6.30b	135.88±6.29bc
Atherogenic index4)	0.12±0.04a	0.28±0.05c	0.20±0.02b	0.21±0.03b	0.22±0.03b
Cardiac risk factor5)	1.12±0.04a	1.28±0.05c	1.20±0.02b	1.21±0.03b	1.22±0.03b
Fasting insulin (μU/mL)	1.41±0.41a	14.50±2.53c	4.81±0.75ab	6.99±2.72b	4.55±1.16ab
Fasting glucose (mg/dL)	186.43±47.99a	317.86±55.46b	233.29±61.72a	244.88±27.28a	229.00±64.85a
HOMA-IR6)	0.32±0.25a	5.48±1.27c	2.30±0.89b	2.46±1.21b	2.41±1.10b

Data are expressed as mean±SD. Means with different letters are significantly different at P <0.05 by Duncan’s multiple range test..

¹⁾HFD: High fat diet group..

²⁾LDL: Low-density lipoprotein..

³⁾HLD: High-density lipoprotein..

⁴⁾Atherogenic index (AI)＝(Total cholesterol－HDL cholesterol)/ HDL cholesterol..

⁵⁾Cardiac risk factor (CRF)＝Total cholesterol/ HDL cholesterol..

⁶⁾HOMA-IR: Homeostatic model assessment of insulin resistance. HOMA-IR＝{fasting insulin (μU/mL)×fasting glucose (mg/dL)}/405..

이상의 결과로부터 AO356 균주는 고지방 식이에 의해 유도되는 체중증가, 지방조직 무게 증가, 이상지질혈증 및 인슐린 저항성을 완화하여 항비만 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 현재 이러한 항비만 활성에 대한 구체적인 기전 연구를 진행 중에 있다.

항생제에 대한 감수성

항생제 내성 균주는 항생제 내성 유전자를 병원성 또는 잠재적인 병원성 미생물에 전달시킬 수 있으며, 이러한 균주의 섭취는 사람에게도 심각한 보건상의 문제를 일으킬 수 있기 때문에(Chon 등, 2020) 식의약품으로 사용하기 위한 프로바이오틱스의 개발에 있어 항생제 내성에 대한 확인은 필수적으로 확인되어야 하는 항목이다(FAO/WHO 2020; EFSA, 2012; KFSI, 2019). AO356 균주와 같은 lactic acid bacteria(LAB)는 대부분이 generally recognized as safe(GRAS)와 QPS 상태를 통해 안전하다고 인정받아 왔으나 최근 발효식품에서 분리된 LAB 균의 일부 변종이 erythromycin, tetracycline, vancomycin 등에 저항성을 가지는 유전자를 보유한 것이 확인되면서 동식물에 공생하는 LAB에 대한 안전성에 의문이 제기되고 있다(Coppola 등, 2005; Dec 등, 2017; EFSA, 2012). 이에 항비만 활성을 가지는 AO356 균주의 주요 항생제 9종에 대한 감수성 정도를 minimum inhibitory concentration(MIC) 측정을 통해 분석하였다(Table 2). 그 결과 MIC 수치가 ampicillin 1 μg/mL, chloramphenicol 4 μg/mL, gentamycin 4 μg/mL, streptomycin 4 μg/mL, tetracycline 2 μg/mL, erythromycin 0.25 μg/mL, clindamycin 0.5 μg/mL 및 kanamycin 16 μg/mL로 EFSA의 L. paracasei 종에 대한 한계치보다 낮거나 같은 값을 보여(EFSA, 2012), AO356 균주는 식품 원료로 사용할 수 있는 안전한 균주임을 확인할 수 있었다.

Table 2 . The antibiotic susceptibility of Lactobacillus paracasei AO356 by MIC test.

	MIC1) (μg/mL)
	MIC-cut off value of EFSA2) (for Lactobacillus paracasei)	AO356
Ampicillin	4	1±0.00
Chloramphenicol	4	4±0.00
Clindamycin	1	0.5±0.00
Erythromycin	1	0.25±0.00
Gentamicin	32	4±0.00
Kanamycin	64	16±0.00
Streptomycin	64	4±0.00
Tetracycline	4	2±0.00
Erythromycin	1	0.25±0.00

Data are mean±SD of three replicates..

¹⁾MIC, Minimum inhibitory concentration..

²⁾EFSA, European Food Safety Authority..

용혈성, gelatinase 활성, β-glucuronidase 생성능, indole 생성능 및 urea 분해능 평가

AO356은 L. paracasei 종에 속하는 균주로 QPS 미생물이며 식약처의 고시형 프로바이오틱스로서 식경험이 풍부하고 안전하다고 알려진 균주이다(EFSA, 2012; MFDS, 2017). 일반적으로 프로바이오틱스의 기능성은 strain 특이적인 것으로 알려져 있는데(Snel 등, 2011), 기능성뿐만 아니라 안전성 또한 strain 특이적인 반응을 보일 수 있으므로 항생제 내성 이외에도 AO356 균주의 안전성을 평가하기 위해 용혈성, gelatinase 활성, β-glucuronidase 생성능, indole 생성능 및 urea 분해능을 확인하였다. 용혈은 적혈구가 파괴되어 헤모글로빈이 혈구 밖으로 용출되는 현상으로 혈액 한천 배지 상에서 나타나는 용혈 유형에 따라 α, β, 및 γ-hemolysis 유형으로 구분할 수 있다. α-hemolysis는 적혈구의 부분적 용해로 헤모글로빈이 메트헤모글로빈으로 환원되어 colony 주변이 녹색으로 변화하며, β-hemolysis는 적혈구가 완전히 용해되어 배양 후 colony 주변이 투명하게 변한다. γ-hemolysis는 용혈이 일어나지 않는 반응으로 colony 주변에 아무런 변화가 없는 것이 특징이다(Isenberg, 1992b). AO356 균주는 혈액 배지를 이용한 용혈반응에서 γ-hemolysis 반응을 보여 용혈성이 없는 균주임을 확인 하였다(Fig. 2A). Gelatinase는 젤라틴을 분해하는 단백질 분해효소로서 병원성 미생물에 의해 분비되어 biofilm 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 생체 내 콜라겐, 피브리노겐 및 보체 등 다양한 종류의 단백질을 분해함으로써 숙주의 면역시스템을 교란시키고, 심내막염을 유발하는 등의 독성과 관련 있는 것으로 알려져 있는데(Thurlow 등, 2010), 본 결과를 통해 AO356 균주는 gelatinase 활성이 없는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 또한 AO356 균주는 tryptophanase에 의해 생성되어 대장암과 방광암 유발에 관여할 수 있는 indole 생성(Chung 등, 1975), 유해 물질인 암모니아 생성과 관련 있는 urea(Ni 등, 2017) 분해능 및 benzopyrene 등의 지용성 독성 물질의 무독화 형태인 glucuronic acid conjugate를 분해하여 발암원을 제공하는 β-glucuronidase(Nanno 등, 1986)의 활성도 없는 것으로 나타났다(Fig. 2C, 2D, 2E). 이상의 실험 결과와 오랜 식경험으로 미루어 볼 때, AO356 균주는 식품 원료로 사용할 수 있는 안전한 균주로 생각되며 현재 전장 유전체 결과를 바탕으로 항생제 내성 및 독성 물질 생성 유전자의 유무를 파악하여 안전성을 확인하는 추가 연구를 진행 중이다.

Fig 2. The hemolytic activity, gelatinase activity, β-glucuronidase activity, urea hydrolysis, and indole producing activity of Lactobacillus paracasei AO356. (A) The hemolytic activity was measured using sheep blood agar plates. (B) The gelatinase activity was measured using gelatin slant medium. (C) The β-glucuronidase activity was measured using 15th cupule on API ZYM kits. (D) The indole producing activity was measured using urea/indole test mixture kits. (E) The urea hydrolysis activity was measured urea/indole test mixture kits. All experiments were performed in triplicate.

고지방식이로 비만을 유도한 6주령 C57BL/6J 마우스에 AO356을 1×10⁷ 및 1×10⁸ 농도로 10주간 투여하여 항비만 활성을 평가하였다. AO356 투여 시 식이 섭취량 변화 없이 고지방식이에 의해 유도되는 체중증가 및 지방조직 무게 증가가 억제되었으며, 이상지질혈증 및 인슐린 저항성이 개선되었다. 특히 1×10⁸ CFU 농도 투여군에서는 catechin 투여군과 유사한 수준의 항비만 활성을 보여 체지방 개선에 도움을 줄 수 있는 건강기능식품으로의 개발 가능성을 확인하였다. 또한 식품 원료 미생물로의 안전성을 확인하기 위해 9종 항생제에 대한 감수성을 평가한 결과, AO356은 L. paracasei 종에 대한 EFSA의 기준을 충족하였으며, 용혈성 평가에서는 γ-hemolysis 반응으로 적혈구 용혈을 일으키지 않았다. 또한 β-glucuronidase, gelatinase, urea 분해능 및 indole 생성능 등의 유효 효소와 유해 물질을 생산하지 않는 것으로 나타나 식품 원료로 사용 가능한 안전한 균주임을 확인할 수 있었다.

이 논문은 과학기술정보통신부의 재원으로 연구개발특구진흥재단-기술이전사업화 사업(No. 2020-JB-RD-0011, 체지방감소능을 갖는 천연 소재인 프로바이오틱스 제품 개발)의 지원을 받아 수행된 연구입니다.