최근 미세먼지, COVID-19와 같은 환경변화로 현대인들은 건강수명 연장 등 건강관리를 위한 생활환경 개선, 기능성 식품 소비 등 건강 증진에 힘쓰고 있으며, 식품 관련 업계에서는 일상에서 쉽게 접근할 수 있는 다양한 기능성 원료를 발굴하기 위한 관련 연구도 활발히 진행되고 있다. 특히, 현대인들은 환경 및 식생활 변화 등 외부 요인으로 인한 과도한 산화스트레스 상태에 놓여있으며 산화스트레스는 질병 유병률을 높이는 주요 원인으로 보고되고 있다(Im 등, 2021; Choi 등, 2021). 생체 내 정상세포의 생화학 반응이나 화학물질 및 운동, 과도한 스트레스 같은 환경요인에 노출되어 산화스트레스가 과도하게 발생하면 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이라는 물질이 생성되며 활성산소종에는 peroxide, superoxide, hydroxyl radical 등과 같은 여러 종류의 화합물이 존재한다(Lee 등, 2017). 활성산소 화합물이 체내에 생성되면 이를 제거하기 위해 superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GPx), catalase 같은 항산화계 효소를 생성시킴으로써 항산화 시스템이 작동되어 체내를 보호한다. 그러나 항산화 방어 시스템으로도 제거할 수 없을 만큼 활성산소종이 과도하게 생성되면 산화스트레스 상태로 전환되고 지속적인 산화스트레스는 단백질 분해, 세포막 및 DNA 손상으로 염증이 유발되어 암, 관절염, 파킨슨병, 심장병 등 각종 질환 발생의 원인이 된다(Park 등, 2010; Jiang, 2005).

무(Raphanus sativus L.)는 십자화과에 속하는 뿌리채소로 국내 과채류 생산의 60%를 차지하는 채소류 중 하나이다(Jung 등, 2008). 무는 생육 기간이 짧으며 수분 및 섬유질이 풍부하고 비타민 A, C의 함량이 높아 영양학적으로도 우수하여 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 재배되고 널리 소비되는 농산물이다(Oh 등, 2019; Huh 등, 2003). 또한, 무는 소화 작용을 촉진하고 항염, 항산화, 지혈 작용 등 다양한 생리활성을 지닌 것으로 알려져 있다(Jung 등, 2004). 무는 파종 및 수확시기에 따라 봄무, 여름무, 가을무, 겨울무(월동무)로 나뉘며 항균, 항암, 항비만 등의 작용에 탁월한 글루코시놀레이트(glucosinolates) 기능 성분이 가장 풍부한 것으로 보고되고 있으며(Yi 등, 2016), 이 중 가을무에서 글루코시놀레이트 함량이 제일 높은 것으로 알려져 있다. 하지만 가을무 외에 제주 월동무에 대한 연구는 재배법에 따른 제주 월동무 생육에 미치는 영향(Moon 등, 2017), 세척 시기 및 수확 후 처리에 따른 저장 품질 변화(Kim 등, 2015)가 존재하며 강화 순무는 키토산 첨가 순무 피클 이화학 및 관능적 특성(Son 등, 2003), 강화 순무의 화학적 특성 및 효소 활성(Kim 등, 2007), 순무잎의 플라보노이드 성분 분석(Hertog 등, 1992) 등 이화학적 및 성분 분석에 관한 연구가 대부분이며, 기능성에 관한 연구와 서로 다른 지역의 특산 무의 기능성을 비교한 연구는 거의 없는 실정이다.

따라서, 본 연구에서는 최근 현대인들의 건강에 관한 관심의 증대로 질병 예방 및 건강 지향적으로 변화하고 있는 사회적 트렌드에 발맞춰 국민의 소비 및 섭취량이 많은 국산 농산물 월동무와 순무의 항산화 효능에 대해 평가하고, 향후 기능성 식품소재 개발을 위한 기초자료로 활용 및 제공하고자 한다.

재료 및 시약

본 연구에서 사용된 순무와 월동무는 각각 강화도(영농조합법인 영인팜)와 제주도(농업회사법인 제주 한스에코팜)에서 재배된 것을 구입하였다. 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS), potassium peroxodisulfate, hydrochloric acid(HCl), 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ), sodium acetate anhydrous, acetic acid, iron(Ⅲ) chloride hexahydrate(FeCl₃･6H₂O), iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate(FeSO₄･7H₂O), lipopolysaccharide(LPS), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT), dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, Dulbecco’s modified eagle medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin(P/S), phosphate buffed saline(PBS)은 Gibco(Waltham, MA, USA) 제품을 사용하였으며, 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFDA)는 Abcam(Cambridge, MA, USA) 제품을 구입하여 사용하였다.

추출물 제조

실험에 사용된 순무와 월동무는 이물질을 물로 깨끗이 수세하고 세절하여 60°C에서 24시간 열풍건조(DS-240BC, Doo Sung Co., Ltd., Gwangju, Korea) 후 분쇄기로 분쇄하여 추출물 제조에 사용하였다. 분쇄된 순무 및 월동무 중량의 20배수 70% 에탄올을 넣고 상온에서 24시간 교반(SMHS-6, DAIHAN Co., Wonju, Korea)하여 1차 추출 후 잔량의 동량 용매를 넣어 1차 추출과 동일한 조건으로 2차 추출을 진행하였다. 추출물은 여과지(No.1, Whatman International Ltd., Maidstone, UK)로 거른 후 여과액을 감압 농축(EYELA CCA-1110, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)하여 동결건조 후 -20°C에서 냉동 보관하며 실험에 사용하였다. 추출물의 수율은 순무는 12%, 월동무는 26%였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거능 측정은 Blois(1958) 방법에 따라 측정하였다. DPPH 시약은 에탄올에 희석하여 0.15 mM로 만들어 사용하였고 순무와 월동무 추출물은 70% 에탄올에 농도별(50, 100, 200 μg/mL)로 희석하여 사용하였다. 이후 DPPH 용액과 시료를 혼합하여 암실에서 30분간 반응시킨 다음 분광광도계(SpectraMax M2e, Molecular Devices, LLC, San Jose, CA, USA)를 이용하여 518 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 70% 에탄올을 사용하였고, 라디칼 소거능은 백분율(%)로 나타내었다.

$$DPPHradicalscavengingactivity(\%)=(1-\frac{AB{S}_{sample}}{AB{S}_{control}})\times 100$$

ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS 라디칼 소거능 측정은 Re 등(1999)의 방법에 따라 수행하였다. 7 mM ABTS 시약과 2.45 mM potassium persulfate는 각각 1:1로 혼합한 후 상온의 암실에서 12시간 동안 방치시켜 ABTS 라디칼을 생성시켰다. ABTS 라디칼이 생성된 용액은 732 nm에서 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 에탄올로 희석하여 사용하였으며, 시료는 70% 에탄올에 농도별(50, 100, 200 μg/mL)로 희석하여 사용하였다. 농도가 조정된 ABTS 용액과 농도별로 희석한 시료를 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 분광광도계(Spectra Max M2e, Molecular Devices, LLC)를 이용하여 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료 대신 70% 에탄올을 처리하였고, 라디칼 소거능은 백분율(%)로 나타내었다.

$$ABTSradicalscavengingactivity(\%)=(1-\frac{AB{S}_{sample}}{AB{S}_{control}})\times 100$$

세포배양

마우스 대식세포인 RAW 264.7세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 실험에 사용하였다. RAW 264.7세포는 10% FBS, 1% P/S를 포함하고 있는 DMEM을 이용하여 37°C, 5% CO₂ 환경의 배양기에서 배양하였다. 배양액은 2일 간격으로 교체해주고 세포 밀도가 80~90% 상태일 때 계대하여 유지배양 및 실험에 사용하였다.

세포독성 측정

시료의 세포에 대한 생존율은 MTT 방법을 사용하였다. RAW 264.7세포를 96-well plate에 분주하여 2시간 안정화 후 순무 및 월동무 추출물을 농도별(50, 100, 200 μg/mL)로 처리하여 incubator(37°C, 5% CO₂)에서 24시간 배양하였다. 또한, LPS를 처리한 염증 유발 세포에 시료를 처리하였을 때 세포 보호 효능을 확인하기 위해 세포를 부착시킨 96-well plate에 시료를 처리하고 1시간 후 LPS(1 μg/mL)를 처리해 incubator(37°C, 5% CO₂)에서 24시간 배양하였다. 배양 완료 후 5 mg/mL의 MTT를 첨가하여 4시간 재배양하고 생성된 formazan dye를 DMSO로 용해시켜 흡광도(450 nm)를 측정하였다.

Nitric oxide(NO) 생성량 측정

RAW 264.7세포를 96-well plate에 분주하여 2시간 배양 후 순무 및 월동무 추출물을 농도별로 처리하고 1시간 후 LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 완료 후 상등액은 griess reagent(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 다음과 같은 방법을 이용해 NO 생성량을 측정하였다. 세포배양 상등액 50 μL에 sulfanilamide 시약 50 μL를 첨가한 후 10분 동안 상온에서 암반응 시키고, 반응시킨 상등액에 추가로 NED 용액 50 μL를 첨가하여 10분간 암반응 후 흡광도(540 nm)를 측정하였다. Sodium nitrite를 표준물질로 사용하여 표준곡선을 나타내었고 이를 통해 NO 생성량을 계산하였다.

Intracellular ROS 억제 활성 측정

RAW 264.7세포를 6-well plate에 분주하여 2시간 동안 배양한 후 순무 및 월동무 추출물을 농도별로 처리하였으며, 산화스트레스 유발을 위해 추출물 처리 1시간 뒤에 LPS(1 μg/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 완료 후 1×buffer로 세척하고 20 μM DCFDA를 각 well에 분주하여 빛을 차단한 상태에서 37°C에서 30분 반응하였다. 반응 후 1×buffer로 세척한 뒤 형광현미경(Leica, Microsystems, Wetzlar, Germany)을 이용하여 측정하였다.

항산화 효소 mRNA 발현량 측정

RAW 264.7세포는 12-well plate에 분주하여 2시간 동안 배양한 후 순무 및 월동무를 농도별(50, 100, 200 μg/mL)로 처리하고 1시간 뒤 LPS를 각 well에 분주하여 24시간 배양하였다. 배양한 세포의 total RNA는 RNeasy mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하였고, cDNA는 reverse transcription system kit(Promega)을 사용하여 합성하였다. 합성한 cDNA는 SYBR Green mix(Gendepot, Katy, TX, USA)를 사용하여 항산화 효소인 Cu/Zn-SOD, Mn-SOD, GPx, catalase mRNA 발현정도를 real-time PCR detection system(CFX96TM, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 분석하였다. 모든 실험결과는 GAPDH를 internal control로 사용하여 보정하였으며 실험에 사용된 유전자의 염기서열은 Table 1과 같다.

Table 1 . Sequence of primers used for real time PCR.

Target gene	Primer	Sequence (5′→3′)
Mn-SOD	Forward	GGGTTGGCTTGGTTTCAATAAGGAA
	Reverse	AGGTAGTAAGCGTGCTCCCACACAT
Cu/Zn-SOD	Forward	CAGCATGGGTTCCACGTCCA
	Reverse	CACATTGGCCACACCGTCCT
Catalase	Forward	AAGACAATGTCACTCAGGTGCGGA
	Reverse	GGCAATGTTCTCACACAGGCGTTT
Glutathione peroxidase	Forward	CTCGGTTTCCCGTGCAATCAG
	Reverse	GTGCAGCCAGTAATCACCAAG
GAPDH	Forward	GAGCCAAAAGGGTCATCATC
	Reverse	TAAGCAGTTGGTGGTGCAGG

통계 분석

모든 실험은 3회 이상 실시하여 얻은 결과를 평균±평균오차(Mean±SEM)로 나타내어 통계 프로그램 SPSS(25.0.0, IBM Co., Armonk, NY, USA)로 분석하였다. 실험군 간의 유의적 차이는 one-way analysis of variance(ANOVA)로 분석되었으며 P<0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하여 Duncan’s multiple range 사후 분석을 수행하였다.

무 추출물의 라디칼 소거능

자유라디칼 DPPH와 양이온 라디칼 ABTS는 항산화 활성을 측정하는 데 가장 기본적인 연구 방법으로 두 라디칼은 각각 결합도가 다르고 전자공여도가 달라 항산화능의 차이를 비교 분석할 수 있다. 따라서 순무와 월동무의 DPPH, ABTS를 측정한 결과, DPPH 라디칼 소거 활성은 순무 200 μg/mL에서 31.717%, 월동무 200 μg/mL에서 28.341%로 나타났으며 이는 두 추출물의 고농도에서 가장 높은 라디칼 소거 활성을 나타낸 것으로 확인할 수 있었다. 또한 ABTS 라디칼 소거능을 평가한 결과, 농도 의존적으로 라디칼 소거 활성이 증가한 것을 확인하였고 고농도에서 순무 31.439%, 월동무 26.894%로 ABTS 라디칼을 소거하였다(Table 2). DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성은 모든 농도에서 월동무보다 순무의 소거능이 더 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이는 Park 등(1999)이 순무의 전자공여 작용을 평가한 결과 순무가 높은 전자공여 작용을 통해 DPPH 라디칼을 소거함으로써 산화를 억제한다는 결과와 유사한 결과이다.

Table 2 . DPPH and ABTS radical scavenging activity of RG and RJ extracts.

Sample	Concentration (μg/mL)	DPPH radical scavenging activity (%)	ABTS radical scavenging activity (%)
Ganghwa turnip (RG)	50	11.164±0.206e	17.946±3.461bc
	100	19.486±0.726c	21.932±2.166abc
	200	31.717±0.135a	31.439±0.677a
Jeju winter radish (RJ)	50	10.236±1.018f	13.910±1.812c
	100	18.133±0.677d	17.538±3.682bc
	200	28.341±1.022b	26.894±3.369ab

무 추출물의 세포독성 평가

RAW 264.7세포에서 순무 및 월동무의 세포독성 여부를 확인하기 위해 각 추출물을 50, 100, 200 μg/mL 농도별로 처리하여 세포 생존율을 측정한 결과 대조군 생존율 대비 모든 시료의 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 확인하였다(Fig. 1A). 또한, LPS 처리로 산화스트레스가 유도된 세포에 시료를 처리하였을 때 LPS 처리군과 시료 처리군 모두 세포독성을 나타내지 않았다(Fig. 1B). 따라서 이후 실험에서 순무 및 월동무 추출물은 50, 100, 200 μg/mL 농도로 실험을 수행하였다.

Fig 1. Effects of RG and RJ extracts on cell viability treatment (A) with or (B) without LPS in RAW 264.7 cells. The data shown are representative of triplicate experiments. Values are expressed as mean±SEM. Different letters represent groups that are significantly different from each other by ANOVA at P<0.05. RG, Ganghwa turnip; RJ, Jeju winter radish; ANOVA, analysis of variance.

무 추출물의 NO 생성량 억제 평가

활성산소 중 하나인 NO는 L-arginine이 NO 합성효소(NOS; nitric oxide synthase)에 의해 생성되는 물질로 정상적인 상태에서 혈관 확장, 혈소판 응집 등 생리적인 기능을 조절하는 주요한 역할을 하지만, 그 생성량이 정상 범위를 벗어나게 되면 염증 유발 및 세포독성 등을 발생시켜 질병을 초래하는 것으로 보고되고 있다(Kim 등, 2004; Jeong 등, 2012). 따라서 순무 및 월동무 추출물이 NO 생성량에 미치는 영향을 평가한 결과, LPS 처리에 의해 NO가 29 μM 생성되었고 순무와 월동무 농도에 따라 NO 생성량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 순무의 200 μg/mL에서 NO 생성률이 LPS 처리군 대비 55% 감소함에 따라 시료 중 가장 높은 NO 억제 활성을 나타내었고 대조군보다 더 낮은 수준으로 NO 생성량이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 2). 이 같은 연구결과는 Lee 등(2009)이 보고한 무 추출물의 열처리에 따른 총 폴리페놀 함량 증가 및 항산화 활성 증진에 대한 연구결과와 유사하게 무 추출물이 항산화 성분을 함유함에 따라 NO 생성량 억제에 효능이 있어 산화스트레스 및 염증을 개선시켜줄 수 있는 것으로 생각된다.

Fig 2. Effects of RG and RJ extracts on nitric oxide production in LPS induced RAW 264.7 cells. The data shown are representative of triplicate experiments. Values are expressed as mean ±SEM. Different letters represent groups that are significantly different from each other by ANOVA at P<0.05. RG, Ganghwa turnip; RJ, Jeju winter radish; ANOVA, analysis of variance.

무 추출물의 ROS 억제 활성능

산화스트레스의 주요 인자인 ROS는 생체 내 조직에 손상을 주어 신체 대사 과정 및 생화학 반응에 변화를 일으켜 생체 시스템을 교란시키는 물질로 우리 체내에서는 ROS를 제거하기 위한 항산화 방어시스템을 통해 체내 항상성을 유지한다. 즉, 항산화 연구에서는 ROS를 주요 지표로 사용하며 순무와 월동무의 ROS 억제 활성능을 DCFDA로 염색하여 형광현미경으로 관찰한 결과, LPS에 의해 ROS가 대조군보다 다량 생성된 것을 확인할 수 있었고 각 시료의 농도에 따라 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 이후 ROS의 생성량을 형광광도계로 측정하여 나타낸 결과, LPS 처리군의 ROS 생성량이 100%일 때, 200 μg/mL의 순무는 14%, 월동무 고농도군(200 μg/mL)은 19%의 ROS 생성량을 나타내어 전반적인 감소세를 확인할 수 있었다. 또한, ROS 생성량 억제 효능에 있어 두 시료 간에 유의적인 차이가 확인되었고 월동무보다 순무가 ROS 생성량을 감소시키는 데 효과적인 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 무 추출물이 세포 내 ROS 생성량을 현저히 감소시켜 산화스트레스를 억제시킴으로써 질병을 예방 및 개선시킬 수 있을 것으로 생각된다(Fig. 3B).

Fig 3. Effects of RG and RJ extracts on intracellular ROS in LPS induced RAW 264.7 cells. (A)　The ROS detection was performed using a fluorescence microscopy. (B) ROS production was analyzed by flowcytometry. The data shown are representative of triplicate experiments. Values are expressed as mean±SEM. Different letters represent groups that are significantly different from each other by ANOVA at P<0.05. RG, Ganghwa turnip; RJ, Jeju winter radish; ANOVA, analysis of variance.

무 추출물의 항산화 효소 유전자 발현

순무 및 월동무의 산화스트레스 억제 기전을 확인하기 위해 항산화 효소 mRNA 발현량을 측정한 결과, LPS 처리군은 대조군 대비 항산화 효소 Cu/Zn-SOD와 Mn-SOD의 발현량이 40%, 30% 감소하였다. 이러한 결과는 산화･환원 반응의 불균형으로 산화스트레스가 발생되어 과도한 ROS의 생성으로 항산화 효소 활성이 억제되고 항산화 시스템은 불활성화되었다는 보고(Payabvash 등, 2006)와 유사하며, LPS를 경구 투여한 쥐의 간조직 내 항산화 효소 활성이 감소된 연구결과(Balkan 등, 2005)와 일치한다. 산화스트레스 유발에 의해 발현량이 감소한 Cu/Zn-SOD의 mRNA 발현은 순무 75% 및 월동무 50% 증가하였고, Mn-SOD의 mRNA 발현은 순무 67%, 월동무 33%로 시료 처리에 의해 항산화 효소 발현량이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다. 또한, GPx와 catalase mRNA 발현 역시 각 시료의 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이처럼 항산화 효소인 SOD, GPx, catalase는 세포 내 산화스트레스를 억제시켜 항산화 효능을 지니는 효소로 이 효소들의 활성을 증진하기 위한 연구는 활발하게 진행되고 있다. 특히, 염증, 질병 등 염증 상태에서 다량 생산되는 superoxide는 SOD에 의해 제거되어야 하지만 SOD의 활성이 저하되며 조직의 손상을 초래한다. 또한, GPx와 catalase는 superoxide가 SOD에 의해 전환된 물질인 과산화수소를 물과 산소로 분해시켜 활성산소로부터 생체를 보호하는 역할을 하는 효소이다(Asimakis 등, 2002; Imai와 Nakagawa, 2003; Deisseroth와 Dounce, 1970). 결론적으로 무 추출물은 라디칼 소거, ROS 생성 억제, 항산화 효소 유전자 발현 증진으로 항산화 효능을 나타냈으며 이는 무가 함유하고 있는 유효성분 중 십자화과 채소에 많이 함유된 글루코시놀레이트 화합물에 의한 것으로 이 성분은 항산화, 항암 등의 생리활성을 지닌 것으로 알려져 있다(Vicas 등, 2013; Becker와 Juvik, 2016). 또한, 순무는 적색무로 안토시아닌 성분을 다량 함유하고 있어 월동무보다 더 높은 항산화 효능을 나타내는 것으로 확인된다(Park 등, 1999; Tena 등, 2020). 따라서 순무 및 월동무는 ROS 생성 억제 및 항산화 효소의 활성을 증가시켜 산화스트레스와 세포 손상을 억제할 수 있을 것으로 생각되며 주요 기능 성분의 차이에 따른 순무의 항산화 활성이 더 좋은 것을 확인하였다.

Fig 4. Effects of RG and RJ extracts on expression of antioxidant mRNA in LPS induced RAW 264.7 cells. The data shown are representative of triplicate experiments. Values are expressed as mean±SEM. Different letters represent groups that are significantly different from each other by ANOVA at P<0.05. RG, Ganghwa turnip; RJ, Jeju winter radish; ANOVA, analysis of variance.

본 연구에서는 순무와 월동무의 항산화 효능을 비교 분석하였다. DPPH와 ABTS의 라디칼 소거능 측정 결과, 순무와 월동무 모두 200 μg/mL에서 항산화 활성이 가장 우수한 것으로 분석되었다. 그리고 산화 및 염증 유발의 원인인 NO 생성량이 시료 농도 의존적으로 감소하였으며 특히, 순무의 200 μg/mL에서 가장 높은 NO 생성 억제율을 나타내었다. 또한, 산화스트레스의 주요 지표 intracelluar ROS와 항산화 효소 유전자 발현 역시 순무 및 월동무 추출물에 의해 조절됨으로써 두 무 추출물이 항산화 활성에 효능이 우수한 것으로 판단된다. 본 연구 결과를 통해 순무 및 월동무 추출물이 항산화 활성이 우수하다는 것을 확인함으로써 이후 항산화 관련 기능성 원료로 활용될 수 있을 것으로 기대되며 항산화 관련 작용기전 규명을 위한 동물실험 등 추가적인 연구를 계속 수행할 예정이다.

본 연구는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업과학기술 연구개발사업(과제번호: PJ01514401)의 지원에 의해 이루어진 것임.