활성산소종(reactive oxygen species, ROS)으로 불리는 superoxide anion, hydroxyl radical(·OH), hydrogen peroxide(H₂O₂) 등은 산화력이 강한 산소로 호흡을 통해 체내 유입된 산소가 산화 과정에 이용되면서 여러 대사 과정에서 생성되며, 생체조직을 공격하거나 세포손상을 일으키므로 각종 질병과 관련이 있다(Rhim과 Choi, 2011). 따라서 최근 이러한 ROS를 제거하여 생체내의 산화적 스트레스로 인하여 생성되는 산화물질들을 방어하는 항산화제의 활용이 증가하고 있으며, 여러 부작용을 야기하는 화학 물질보다 안전한 식물계에 널리 분포된 천연 항산화제의 중요성이 대두되고 있다.

차풀(Chamaecrista nomame (Siebold) H. Ohashi)은 한국과 일본 등에 분포하는 콩과 한해살이 식물로 전통지식대상종으로 알려져 있다(Kim 등, 2018). 차풀은 식물의 전체 부위가 사용 가능한 원재료로써 식품의약품안전처에서 제공하는 국내 식품 원재료 database에 등재되어 있다(Choi 등, 2019). Kitanaka와 Takido(1985)에 의하면 차풀의 씨앗에는 physcion, physcion-9-anthrone, emodin-9-anthrone 등, 지상부에는 chrysophanol, physcion, emodin 등의 안트라퀴논(anthraquinone) 화합물을 함유한다고 밝혀졌으며, Kim과 Lee(1996)는 차풀 잎에 protocatechuic acid, vanillic acid, benzoic acid, p-coumaric acid, ferulic acid 등의 페놀성 화합물이 함유되어 있다고 보고하였다. 또한 Kim(2007)은 차풀로부터 luteolin을 분리 및 동정하였다고 보고한 바 있다. 이러한 차풀은 항산화 효과(Lee 등, 2008), 미백효과(Kim 등, 2018), 항염증 효과(Lee 등, 2011) 및 항비만 효과(Heo 등, 2023) 등의 다양한 생리활성이 보고된 바 있다.

나고야 의정서 이후 국내 유전자원 보호를 위해 관련 전통지식을 확보하려는 노력이 필요한 시점이다. 국내 천연물자원 중 식품원재료 database에 등재된 원재료에 관한 기능성 연구를 통한 고부가가치화하는 연구는 시의적절하다고 판단된다(Choi 등, 2017). 따라서 본 연구는 차풀 추출물을 기능성 식품 소재로 활용하기 위한 기초 자료를 제공하고자 추출 용매에 따른 총 페놀 함량과 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능 분석을 통해 추출조건을 확립하고 차풀 추출물의 표준화 및 규격화를 위한 지표성분 분석법 개발 및 검증을 수행하였다.

실험재료

Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, gallic acid, sodium carbonate, DPPH, acetic acid, p-coumaric acid, luteolin 등은 Sigma-Aldrich Co.로부터 구입하였고, HPLC 등급의 용매 acetonitrile은 J.T. Baker에서 구입하였다.

차풀 추출물 제조

본 연구에 사용한 차풀은 강원약초에서 구입하여 40 mesh 이하로 분쇄한 후 4°C에 보관하였다. 차풀 추출물은 Choi 등(2019)의 방법을 변형하여 추출하였다. 실험실 추출장비를 활용하여 50 g의 시료에 500 mL의 열수 및 40% 에탄올(Daejung Chemical Co.)을 첨가하였으며, 80°C에서 2시간 동안 환류냉각 추출하였다. 추출물은 Whatman No.2 filter paper(Whatman Ltd.)로 여과한 후, 회전 진공 농축기(Tokyo Rikakikai Co., Ltd.)를 사용하여 40°C에서 농축하였고, 동결건조(Ilshinbiobase Co., Ltd.)하여 분말화하였다.

총 페놀 함량 측정

총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu의 방법을 변형하여 측정하였다(Sato 등, 1996). 각 시료 1 mL에 2% sodium carbonate 용액 1 mL와 10% Folin-Ciocalteu’s reagent 1 mL를 혼합한 후 암소에서 1시간 방치하였다. 이후 microplate reader(Molecular Devices)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량은 gallic acid를 표준물질로 하여 표준곡선(y=16.901x-0.011, R²=0.9982)을 작성하고 이를 이용하여 총 페놀 함량(mg GAE/g)을 계산하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거능은 시료 내의 항산화 물질이 자유라디칼인 DPPH 시약과 반응하여 자유라디칼이 소거되면서 자색에서 노란색으로 탈색되는 원리를 이용하여 측정한다. DPPH 라디칼 소거능은 Stagos 등(2012)의 방법을 변형하여 측정하였다. 에탄올로 용해한 0.4 mM DPPH 용액 0.8 mL와 시료 0.2 mL를 혼합한 후 암소에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후 microplate reader를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 다음 식을 이용하여 계산하였다.

p-Coumaric acid 및 luteolin 분석

최근 연구에서 차풀 추출물에 bioactive compound로 보고된 p-coumaric acid와 luteolin이 함유되어 있는지 확인하고자 p-coumaric acid는 Kim과 Lee(1996)의 분석법을 변형하여 사용하였고 luteolin은 Shin 등(2016)의 분석법을 변형하여 분석하였다(Table 1). 차풀 추출물은 0.45 μm syringe filter(Whatman)로 여과한 후 HPLC 분석에 사용하였고 분석에 사용한 기기는 Shimadzu LC HPLC system(LC-40B XR, Shimadzu Co., Ltd.)과 Photodiode Array Detector(PDA; SPD-M40, Shimadzu)를 사용하였다.

Table 1 . HPLC conditions of p-coumaric acid and luteolin analysis for extract of Chamaecrista nomame (Siebold) H. Ohashi.

Instrument.	Conditions.
Analytes. Column. Column temperature.	p-Coumaric acid. CapcellPakC18 UG120 (250×4.6 mm, 5 μm). 35°C.	Luteolin. CapcellPakC18 UG120 (250×4.6 mm, 5 μm). 35°C.
Mobile phase.	A: acetonitrile. B: 0.02M sodium acetate buffer. (pH 4.3 with acetic acid)＝2:8.	Time. (min).	A: 0.1% formic. acid in DDW.	B: acetonitrile.
		0. 20. 25. 30. 35.	95. 50. 30. 95. 95.	5. 50. 70. 5. 5.
Detector. Flow rate. Injection volume.	PDA 284 nm. 1.0 mL/min. 10 μL.	PDA 350 nm. 1.0 mL/min. 10 μL.

표준용액 및 시험용액의 조제

p-Coumaric acid와 luteolin 표준물질 각각 10 mg을 10 mL 정용플라스크에 취한 후, 1,000 μg/mL의 농도가 되도록 메탄올(J.T. Baker)로 표선까지 정용하여 이를 stock solution으로 하였다. Working solution은 제조된 stock solution을 이용하여 각각 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL가 되도록 메탄올로 희석하여 사용하였다. 시험용액은 동결건조된 시료를 100 mg을 10 mL 정용플라스크에 취한 후, 10,000 μg/mL의 농도가 되도록 메탄올로 표선까지 정용하고 0.45 μm syringe filter로 여과하여 시험용액으로 하였다.

분석법 유효성 검증

HPLC를 이용한 p-coumaric acid 및 luteolin 분석 방법은 의약품 등 시험방법 밸리데이션 가이드라인(KFDA, 2012)을 근거로 하여 개발된 분석법의 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ)를 이용하여 분석법의 유효성을 검증하였다. 특이성 검증은 표준물질(p-coumaric acid, luteolin) 및 차풀 추출물을 HPLC로 분석하고 chromatogram을 비교하여 p-coumaric acid 및 luteolin이 선택적으로 분리되는지 확인하였으며 PDA spectrum을 이용하여 같은 spectrum을 나타내는지 확인하였다. 직선성에 대한 검증은 표준물질을 각각 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL로 희석하고 각각의 표준물질을 HPLC로 3회 반복 분석하였으며, 피크 면적과 농도의 관계를 나타내는 검량선을 작성하였다. 작성된 검량선으로부터 상관계수(R²) 값을 구하여 직선성을 확인하였다. 정밀성 검증은 HPLC를 이용하여 차풀 추출물을 inter-day(일간)와 intra-day(일내)로 나누어 정밀성 실험을 진행하였다. Inter-day는 1일 1구간으로 3일간 진행하였고, intra-day는 1일 3구간으로 나누어 진행하였다. 각 시험은 구간별로 3회씩 총 9 반복하여 분석하였다. 분석 결과로 얻은 면적 값은 검량선을 이용하여 정량하였으며 정량한 값의 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)는 표준편차를 평균으로 나누어 백분율로 나타내었다. 정확성 검증은 농도를 알고 있는 차풀 추출물에 표준물질 luteolin을 6.25, 25, 100 μg/mL로 각각 첨가하여 HPLC로 분석하였다. 분석한 결과는 다음 식을 사용하여 회수율(recovery)로 계산하였으며, 이를 통해 분석 방법의 정확성을 검증하였다.

C_t: Concentration of test sample added standard solution

C_u: Concentration of test sample

C_a: Concentration of standard solution

지표성분 luteolin의 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)는 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하여 다음 식을 이용하여 나타냈다.

LOD＝3.3σ/S

LOQ＝10σ/S

σ: The standard deviation of the response

S: The slope of the calibration curve

통계 처리

모든 데이터는 평균±표준편차로 표현하였고, 통계 처리는 Statistical Package for Social Science ver. 26(SPSS Inc.)을 이용하여 분석하였으며, 유의성 검정은 Student’s t-test 방법에 따라 검증하였다(P<0.001).

추출조건에 따른 항산화 활성

식물의 2차 대사산물인 페놀성 화합물은 체내에서 산화적 스트레스를 줄이는 데 도움을 주어 만성질환의 위험을 줄이고 항산화, 항암, 항염증, 항고혈압, 항당뇨 등 다양한 생리활성을 갖는다(Van Hung, 2016). 이러한 페놀 화합물을 추출하는 데 사용된 용매의 극성은 페놀성 화합물의 용해도를 높이는 데 중요한 역할을 한다(Naczk와 Shahidi, 2006). 일반적으로 에탄올과 물 혼합물이 식물에서 페놀성 화합물을 추출하는데 사용된다(Bahorun 등, 2004; Durling 등, 2007). 본 연구에서 차풀 추출물의 추출 용매별 총 페놀 함량과 DPPH 라디칼 소거능을 측정하여 항산화 활성을 비교하였다. 그 결과 열수 추출물에서 총 페놀 함량은 29.17±0.12 mg GAE/g으로 나타났으며, 40% 에탄올 추출물에서 80.27±1.11 mg GAE/g으로 나타났다(Fig. 1A). 이러한 결과는 유근피 추출 시 용매의 에탄올 함량이 높을수록 총 페놀 함량이 증가했다는 Kim 등(2015)의 연구 결과와 일치하였다.

Fig 1. Total phenolic contents (A), DPPH radical scavenging activity (B) of Chamaecrista nomame (Siebold) H. Ohashi extract at various concentration. Each value is the mean±SD of samples. Statistically significant differences by Student’s t-test (^***P<0.001).

DPPH 라디칼 소거능의 경우 총 페놀 함량과 마찬가지로 열수 추출물이 20.96~32.36%, 40% 에탄올 추출물이 36.10~79.60%로 열수 추출물보다 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였다(Fig. 1B). Kim 등(2006)은 감초의 용매별 및 시간별 항산화 활성을 연구하였는데, 에탄올 농도가 증가함에 따라 항산화 활성이 증가하여 본 연구 결과와 유사한 경향을 보였다.

차풀 추출물의 luteolin의 분석법 검증

지표성분이란 해당 성분의 농도와 효능 간의 상관관계가 뚜렷하지 않을 경우 원재료를 확인할 수 있고 대표할 수 있는 성분으로, 건강기능식품 개발 시 기능성 원료 인정을 위해서 지표성분을 선정하여 표준화하고 기능성 원료에 대한 기준규격을 설정하고 관리하여야 한다(Jeon 등, 2016). 특이성이란, 분석법이 다른 성분의 간섭 없이 추출물이나 혼합물에서 분석대상물질을 선택적으로 측정할 수 있는 능력을 말한다(Marín 등, 2002). p-Coumaric acid와 luteolin을 각각 변형된 분석법을 통해 표준물질과 차풀 추출물을 분석하였을 때 p-coumaric acid 표준물질의 경우 머무름시간은 6.254분으로 나타났으며(Fig. 2A), 차풀 추출물에서도 비슷한 머무름시간에 피크가 관찰되었다(Fig. 2B). 하지만 두 피크의 PDA spectrum을 확인한 결과, 다른 패턴을 보여 차풀 추출물에는 p-coumaric acid가 함유되어 있지 않다고 판단된다(Fig. 2C, 2D). 다만, 본 연구에서 개발한 p-coumaric acid의 분석법으로 표준검량선을 구했을 때 y=70,310x+9,225(R²=1)로 나타나 직선성은 우수하였다(Fig. 2E). Kim과 Lee(1996)에 따르면 차풀 잎 200 g에 1 L 증류수를 넣고 48시간 동안 80°C에서 추출한 추출물을 HPLC로 분석한 결과 p-coumaric acid가 분석되었다고 보고하였지만, 본 연구에서는 분석이 되지 않았다. 이는 시료의 양, 추출 부위 및 시간 등 변수의 차이라고 사료된다.

Fig 2. HPLC chromatograms of p-coumaric acid standard (A) and Chamaecrista nomame (Siebold) H. Ohashi extract (B), PDA spectrums of p-coumaric acid standard (C) and Chamaecrista nomame (Siebold) H. Ohashi extract (D), calibaration curve of p-coumaric acid standard (E).

반면 luteolin의 경우 표준물질과 차풀 추출물을 분석하였을 때 luetolin의 머무름시간은 17.901분으로 나타났으며(Fig. 3A, 3B), 두 피크의 PDA spectrum을 확인한 결과 유사한 spectrum을 나타내었다(Fig. 3C, 3D). 이를 통하여 본 분석법의 특이성을 확인하였으며, luteolin을 차풀 추출물의 지표성분으로 설정하고 분석법의 검증을 실시하였다.

Fig 3. HPLC chromatograms of luteolin standard (A) and Chamaecrista nomame (Siebold) H. Ohashi extract (B), PDA spectrums of luteolin standard (C) and Chamaecrista nomame (Siebold) H. Ohashi extract (D), calibaration curve of luteolin standard (E).

직선성이란 시료 중 일정 범위 내에서 분석하고자 하는 대상물질의 양에 비례하는 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력을 말하며, y축을 peak 면적, x축을 표준용액의 농도(μg/mL)로 하여 작성된 calibration curve의 R²값으로 직선성을 확인할 수 있다(Choi 등, 2020). Luteolin 표준용액을 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µg/mL 농도로 희석하여 HPLC로 분석한 결과, 표준검량선이 y=46,022x+12,565로 나타났으며 상관계수(R²) 값은 1로 나타나 우수한 직선성을 보였다(Fig. 3E). 정밀성은 균질한 시료로부터 여러 번 채취하여 얻은 시료를 정해진 조건에 따라 측정하였을 때 각각의 측정값들 사이의 근접성을 말한다(Fatariah 등, 2014). 차풀 추출물 중 luteolin 분석법의 정밀성 분석 결과는 Table 2와 같다. Intra-day 정밀도에서 0.09~2.50%를 나타내었고 inter-day 정밀도에서는 0.21~1.44%로 5% 이하의 우수한 정밀도를 보였다. 정확성은 측정값이 이미 알고 있는 참값이나 표준값에 근접한 정도를 말하며 회수율(recovery)로 나타낸다(Bressolle 등, 1996). 정확한 농도의 표준용액(6.25, 25, 100 µg/mL)이 첨가된 차풀 추출물을 HPLC로 분석하였으며 측정된 회수율은 Table 2에 나타내었다. 차풀 추출물 중 luteolin 분석법의 정확성을 측정한 결과, intra-day에서의 정확성은 93.57~98.52%를 나타냈으며, inter-day의 정확성은 97.12~99.11%를 나타내어 80~120% 분석오차를 만족하였다. 검출한계는 시료 중에 존재하는 분석대상물질의 검출 가능한 최소량을 말하며 정량한계는 적절한 정밀성과 정확성을 가진 정량값을 표현할 수 있는 시료 중 분석대상물질의 최소량을 말한다(Vial과 Jardy, 1999). 검출한계 및 정량한계의 분석 결과 luteolin의 검출한계는 0.12 μg/mL로 측정되었으며 정량한계는 0.36 μg/mL로 계산되었다 (Table 2).

Table 2 . Precision, accuracy, limit of detection (LOD), and limit of quantification (LOQ) of luteolin analysis for Chamaecrista nomame (Siebold) H. Ohashi extract.

Matrix.	Analyte.		Concentration. (μg/mL).	Mean±SD. (μg/mL).	RSD (%).	Recovery (%).	LOD. (μg/mL).	LOQ. (μg/mL).
Chamaecrista nomame (Siebold). H. Ohashi extract.	Luteolin.	Intra-day.	6.25. 25. 100.	5.85±0.15. 23.86±0.10. 98.52±0.09.	2.50. 0.41. 0.09.	93.57. 95.44. 98.52.	0.12.	0.36.
		Inter-day.	6.25. 25. 100.	6.19±0.04. 24.28±0.35. 98.32±0.20.	0.71. 1.44. 0.21.	99.11. 97.12. 98.32.

차풀 추출물의 luteolin 함량

유효성이 검증된 분석법을 이용하여 차풀 추출물(추출수율 16.56%, data not shown) 내 luteolin의 함량을 분석한 결과 2.68±0.01 mg/g으로 나타났다(Table 3). 이러한 결과는 검출한계 및 정량한계보다 이상의 값으로 나타나, 본 분석법을 이용하여 차풀 추출물의 luteolin 분석이 가능할 것으로 사료된다. 또한 차풀의 유용성분 및 지표성분으로 luteolin을 선정할 시 본 연구의 분석법을 통한 원료 표준화가 가능할 것으로 사료된다.

Table 3 . Contents of luteolin in Chamaecrista nomame (Siebold) H. Ohashi extract.

Analytes.	Sample.	Mean±SD. (mg/g).	RSD. (%).
Luteolin.	Chamaecrista nomame. (Siebold) H. Ohashi extract.	2.68±0.01.	0.30.

본 연구는 차풀을 항산화 소재로 사용하기 위한 기초 자료를 제공하고자 추출용매(열수 및 40% 에탄올)를 달리하여 추출하였으며, 추출조건 최적화를 위하여 추출물의 총 페놀 함량 및 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다. 또한, 차풀 추출물의 원료 표준화를 위하여 지표성분 분석법 개발 및 검증을 진행하였다. 본 연구에서는 luteolin을 지표성분으로 선정하였으며 HPLC-PDA로 분석하여 특이성, 직전성, 정확성, 정밀성, 검출한계 및 정량한계 측정을 통한 유효성을 검증하였다. 그 결과, 차풀 추출물은 40% 에탄올로 추출하였을 때 높은 총 페놀 함량과 항산화 활성을 보였다. 개발된 분석법을 통하여 luteolin을 분석하였을 때 차풀 추출물 내 다른 물질과의 간섭없이 분리되고 표준물질의 머무름시간이 일치하였으며, PDA-spectrum을 확인한 결과 유사한 형태의 spectrum을 확인하였다. Luteolin의 검량선은 상관계수 1로 나타나 우수한 직전성을 나타내었으며, 6.25, 25, 100 μg/mL의 luteolin을 차풀 추출물에 첨가하여 분석한 luteolin의 일간 및 일내 정밀성은 0.09~2.50% 및 0.21~1.44%로 나타났으며, 일간 및 일내 정확성은 93.57~98.52% 및 97.12~99.11%로 우수한 정밀성 및 정확성을 나타냈다. Luteolin의 검출한계 및 정량한계는 각각 0.12 µg/mL 및 0.36 µg/mL로 나타나 저농도에서도 검출이 가능함을 확인하였다. 검증된 분석법으로 차풀 추출물의 luteolin의 함량을 분석한 결과, 2.68±0.01 mg/g으로 분석되었다. 이를 통하여 차풀 추출물의 luteolin 분석법은 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 검출한계 및 정량한계 측정을 통해 우수한 분석법임이 검증되었으며, 차풀 추출물의 표준화 및 규격화를 위한 기초자료로 활용될 것으로 사료된다.

본 논문은 2023년 중소벤처기업부 재원(RS-2024-00426201)과 한국연구재단의 재원(4299990913942, 2021R1A6A1A03044242 및 2017RID1A3B06028469)으로 수행된 연구로 이에 감사드립니다.