현재까지 보고된 바에 따르면 장내 미생물 변화와 뼈 건강은 중요한 연관성이 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 측면에서 프로바이오틱스 섭취가 뼈 건강을 효과적으로 개선할 수 있음이 많은 연구를 통해 입증되어 왔다(Collins 등, 2017; Lyu 등, 2023). 프로바이오틱스의 이러한 효과를 설명하는 작용기전이 현재까지 명확하게 입증되지는 않았으나 보고된 바에 따르면 프로바이오틱스 섭취를 통한 장내 미생물 균총의 변화와 함께 장내 pH의 변화, 기능성 peptide의 분비, 장벽 기능 강화, 면역기능 조절 등이 뼈 건강과 관련이 있을 것으로 추정되고 있다(Broekaert 등, 2007; Matsuguchi 등, 2003; Nishimura, 2014; Sougioultzis 등, 2006). 이러한 프로바이오틱스 균주 중 Lacticaseibacillus reuteri를 이용한 연구 결과들에 따르면 수컷 및 암컷 난소적출 설치류 모델에서 프로바이오틱스 투여가 뼈의 재흡수를 억제하고 뼈 손실을 예방할 수 있음을 보여준다(Britton 등, 2014; Chen 등, 2023; Collins 등, 2019). 최근 본 연구팀은 난소적출 마우스 모델을 이용한 연구에서 9주 동안 L. reuteri MG5463의 경구투여를 통해 골밀도 손실의 유의미한 개선을 관찰하였으며, 또한 MG5463 처리가 조골세포에서 OPG/RANKL 비율의 증가와 함께 골 석회화를 촉진함을 확인한 바 있다(Yun 등, 2024). 하지만 L. reuteri 유산균의 뼈 건강 개선에 대한 보다 세부적인 작용기전 확인을 위해서는 추가적인 연구가 필요한 상황이다.

뼈의 항상성은 골 형성과 파골세포(osteoclasts) 생성 사이의 균형적인 조절에 의해 유지된다. 파골세포는 조혈 줄기세포의 단핵구 및 대식세포 계통에서 유래하는 다핵세포로 골격 발달, 뼈의 재형성 및 골절 치유 과정에 근본적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Hayashi 등, 1998). 파골세포 전구체는 특정 cytokine의 자극에 의해 세포증식, 이동, 세포 간 접합 및 융합 과정을 거쳐 성숙한 파골세포로 분화된다. 파골세포 분화를 유도하는 두 가지 핵심 cytokine 중 macrophage-colony stimulating factor는 전구세포의 증식과 이동을 유도하고, receptor activator of nuclear factor κB ligand(RANKL)는 전구세포에 존재하는 RANK에 결합하여 파골세포의 형성을 자극하고 세포 활성을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Zito 등, 2016). RANKL 신호전달은 세포 내에서 adapter 단백질의 모집을 시작으로 phosphoinositide 3-kinase(PI3K)/protein kinase B(Akt), mitogen-activated protein kinase(MAPK) 및 nuclear factor kappa B(NF-κB) 신호전달경로를 활성화함으로써 파골세포 특이 유전자 발현을 유도하는 것으로 보고되어 왔다(Hua 등, 2020; Lampiasi 등, 2021). 따라서 RANKL 신호전달경로는 파골세포 분화와 골 흡수를 억제하기 위한 매우 중요한 표적으로 연구되어 왔다.

본 연구에서는 유산균 L. reuteri MG5463의 뼈 건강 개선 작용기전에 대한 추가적인 검증을 위해 파골세포 분화 억제 활성을 평가하였다. 이를 위해 RAW 264.7 마우스 대식세포를 이용하여 RANKL 처리를 통해 파골세포 분화를 유도하였으며, 유산균 처리에 의한 세포 내 주요 신호전달경로에 관여하는 인자들의 변화를 유전자 및 단백질 발현 수준에서 분석하였다.

유산균 시험물질 준비

본 실험에 사용된 L. reuteri MG5463 유산균 시료는 (주)메디오젠에서 공급받은 것으로, 다음과 같은 방법으로 준비되었다. 균주는 de Man Rogosa Sharp(MRS; Difco) 평판배지에 획선도말 하였으며, 37°C에서 48시간 배양하여 균주의 단일집락을 수득하였다. 단일집락을 MRS 액체배지 10 mL에 접종하고 37°C에서 24시간 정치배양 하였으며, 이 중 2%(2×10^6~7 CFU)를 새로운 MRS 10 mL에 접종하여 37°C에서 18시간 정치배양 하였다. 배양액은 원심분리(6,000×g, 5분) 후 상등액을 제거하고 인산 완충용액으로 세척하였다. 이후 다시 원심분리를 진행하고 상등액을 제거하여 잔여 배양배지를 제거하였으며, 인산 완충용액을 첨가하여 균체를 1×10⁹ CFU/mL 수준으로 현탁하고 균을 파쇄하고 세포 오염을 방지하기 위해 sonication 하여 균체를 수득 및 동결건조하여 세포실험에 사용하였다.

세포 배양

RAW 264.7 세포주는 American Type Culture Collection에서 분양받아 사용하였으며, 10% fetal bovine serum(Gibco), 1% penicillin 및 1% streptomycin(Gibco)을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle medium 배지를 사용하여 37°C, 5% CO₂ 배양기(EYELA)에서 배양하였다. 파골세포 분화를 위해 96-well plate에 1×10⁴ cells/well 밀도로 seeding 하여 24시간 후 50 ng/mL RANKL 및 시험물질이 첨가된 α-MEM으로 교체하였으며, 이틀마다 새로운 배지로 교체하며 5일간 분화를 유도하였다.

세포독성 평가

시험물질에 대한 세포독성 평가는 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay를 이용하여 측정하였다. 세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/well 수준으로 seeding하고 24시간 후 유산균 시험물질과 17β-estradiol(E2)을 농도별로 처리하여 24시간 및 48시간 동안 배양하였다. 이후 Dulbecco’s phosphate- buffered saline에 녹인 1.0 mg/mL MTT(Sigma) 시약을 20 μL씩 각 well에 처리한 후 1시간 동안 같은 조건에서 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 후 dimethyl sulfoxide 100 μL를 첨가하고 microplate reader(infinite M nano, TECAN)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군에 대한 백분율(% of control)로 나타내었다.

Tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) 염색 및 활성 측정

파골세포의 형성을 확인하기 위해 파골세포의 발현 지표인 TRAP을 염색하여 TRAP-positive 세포를 확인하였다. 5일간의 분화 유도 후 배지를 모두 제거하고 세포를 phosphate-buffered saline으로 세척하였으며, 3.7% formaldehyde-citrate-acetone 용액으로 10분간 고정한 후 증류수로 3회 세척하였다. Chromogenic substrate에 tartrate buffer(Cosmo Bio)를 첨가한 용액을 50 μL/well씩 분주하고 빛을 차단한 상태에서 37°C에서 1시간 반응시켰다. 이후 증류수로 세척한 후 건조하여 현미경으로 분화된 파골세포를 확인하였다. 세포 내 TRAP 활성 측정은 TRAP & ALP assay kit(TaKaRa)을 이용하여 사용자 매뉴얼에 따라 분석하였다.

Real-time PCR

분화된 파골세포로부터 total RNA 분리를 위해 TRIzol (Thermo Fisher Scientific)을 첨가하여 세포를 떼어낸 후 chloroform 200 μL를 첨가하고 5분간 반응시킨 후 원심분리 하여 상등액을 수집하였다. 상등액 400 μL에 isopropanol 500 μL를 첨가하여 교반한 후 원심분리 하여 상등액을 제거하였으며, 70% 에탄올로 RNA pellet을 세척하였다. 분리된 RNA pellet은 건조 후 DEPC water에 녹여 Nano Drop(Nanodrop Lite Spectrophotometer; Thermo Fisher Scientific)을 이용해 농도 및 순도를 측정하였다. Total RNA로부터 cDNA 합성은 high-capacity cDNA reverse transcription kit(Thermo Fisher Scientific)을 이용하였다. 합성된 cDNA는 멸균된 3차 증류수로 50 ng/μL 농도로 희석하여 mRNA 분석에 사용하였다. PCR 분석은 pre-designed Taqman probe(IDT Korea) 및 Taqman® fast advanced master mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 7500 Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 이용하여 분석하였으며, 반응 조건은 95°C 1분, 95°C 15초, 60°C 30초로 설정하여 45 cycle을 실시하였다. 상대적 mRNA 정량은 β-actin housekeeping gene을 사용하여 delta delta CT 방법으로 계산하였다.

Western blot

분화된 파골세포를 RIPA buffer(Thermo Fisher Scientific), protease/phosphatase inhibitor cocktail(Thermo Fisher Scientific) 및 50 mM phenylmethylsulfonyl fluoride를 혼합하여 제조한 lysis buffer와 함께 균질화시킨 후 4°C에서 1시간 incubation을 실시하고 원심분리 하여 상등액을 수거하였으며, 추출된 단백질의 농도는 Bradford protein assay(Bio-Rad) 방법으로 정량하였다. 정량한 단백질은 25~30 μg으로 SDS-polyaclylamide gel에 크기별로 분리한 후 0.45 μm polyvinylidene difluoride membrane (Bio-Rad)으로 이동시켰다. Membrane은 3% bovine serum albumin과 0.1% Tween-20을 포함한 TBST buffer에서 1시간 동안 blocking 시킨 후 1차 항체를 1/2,000의 농도로 희석하여 4°C에서 overnight 반응시켰다. 이후 TBST buffer로 3회 세척 후, 2차 항체 rabbit anti-mouse(Abcam) 및 goat anti-rabbit(Abcam) IgG antibody를 1/10,000 농도로 희석하여 1시간 상온에서 반응시켰다. 그다음 membrane을 TBST buffer로 3회 세척 후, Clarity Western ECL Substrate(Bio-Rad)로 1~2분 반응시키고 FUSION Solo 6S ChemiDoc System(Vilber fusion Fx)을 이용하여 단백질 밴드를 확인하였다. 모든 밴드는 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 상댓값을 사용하였고 단백질 밴드 정량은 ImageJ software(National Institute of Health)를 이용하였으며, GAPDH로 보정하여 상대 정량하였다.

통계분석

모든 실험 결과는 평균±표준오차로 표시하였고, 실험군 간의 통계적 유의성은 R program을 이용하여 one-way ANOVA 분석 후 Duncan’s multiple range test 방법으로 사후 검정하여 P값이 0.05 미만일 때를 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

파골세포 분화 억제 활성 평가

파골세포 분화 유도에 앞서 RAW 264.7 세포에 대한 L. reuteri MG5463 시험물질과 positive control로 사용된 E2의 세포독성 평가를 진행하였다. 시험물질을 1×10⁵~1×10⁸ CFU/mL 농도 범위에서 24시간과 48시간 처리하였을 때, 대조군 대비 유의미한 세포 생존율의 변화가 관찰되지 않았다(Fig. 1A). E2는 에탄올에 녹여 최종 에탄올 농도가 0.1%가 되도록 세포에 처리하였으며 1~100 nM 수준에서 E2를 처리하였을 때 1 nM 농도에서 24시간 처리 후 세포 생존율의 유의미한 증가가 확인되었다(Fig. 1B). 따라서 파골세포 분화 억제능을 평가하기 위한 실험에서 시험물질은 1×10⁸ CFU/mL 농도에서 처리하고 E2는 10 nM에서 처리하였다.

Fig 1. Effects of Lacticaseibacillus reuteri MG5463 and 17β-estradiol on the viability of RAW 264.7 cells. After treatment with MG5463 (A) or 17β-estradiol (B) at indicated concentrations for 24 and 48 h, cell viability was evaluated by MTT assay. E2, 17β-estradiol. Data are shown as mean±standard error of the mean (n=6). ^*P<0.05 compared to the control group.

RAW 264.7 세포는 RANKL 자극에 의해 파골세포로 분화되며, TRAP은 파골세포로의 분화 과정 중 발현되는 골 흡수 효소로, TRAP 양성 세포는 파골세포의 분화를 판단하는 기준으로 사용되어 왔다(Ballanti 등, 1997; Hayman, 2008). 파골세포 분화 유도 후 TRAP 염색을 하여 현미경으로 관찰한 결과, RANKL 단독 처리군에서는 TRAP 양성 다핵세포가 다수 형성되었으며 RANKL과 함께 E2 또는 유산균 시험물질을 처리한 그룹에서는 다핵세포 형성의 현저한 저하가 확인되었다(Fig. 2A). 또한 세포 내 TRAP 활성을 측정한 결과에서도 RANKL 단독 처리군에서 현저히 증가한 효소 활성이 E2와 시험물질 처리군에서는 각각 유의적으로 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 따라서 이러한 결과는 L. reuteri MG5463 유산균이 대식세포의 파골세포 분화를 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다. 이러한 결과와 유사하게 유산균의 파골세포 분화 억제 활성에 관한 이전 연구에 따르면 Ligilactobacillus salivarius, Lactobacillus acidophilus, Lacticaseibacillus rhamnosus와 같은 유산균 배양액의 처리가 대식세포의 파골세포 분화와 TRAP 활성을 효과적으로 억제함이 보고된 바 있으며(Chen 등, 2020; Jung 등, 2021), 따라서 L. reuteri 배양액을 이용한 추가 연구 또한 필요할 것으로 판단된다.

Fig 2. Inhibitory effects of Lacticaseibacillus reuteri MG5463 on RANKL-induced osteoclast differentiation in RAW 264.7 cells. (A) RAW 264.7 cells were treated with E2 (10 nM) or MG5463 (1×10⁸ CFU/mL) followed by RANKL (50 ng/mL) stimulation for 6 days and then stained for TRAP. (B) TRAP enzymatic activity in the culture medium was measured. RANKL, receptor activator of nuclear factor κB ligand; E2, 17β-estradiol. Data are shown as mean±standard error of the mean (n=3). ^*P<0.05, ^***P<0.001 compared to the RANKL control group.

파골세포 분화 신호전달 조절 인자 분석

파골세포 분화 과정에서 RANKL은 세포 내에서 TRAF6 단백질을 결집하고 MAPK, Akt 및 NFATc1과 같은 단백질의 활성화를 통해 파골세포 분화를 촉진하는 것으로 알려져 있다(Kim과 Kim, 2016). Extracellular signal-regulated kinase(ERK), c-Jun N-terminal kinase(JNK) 및 p38을 포함한 MAPK의 활성화는 파골세포 전구세포의 증식과 파골세포 분화 조절에 모두 관여하는 것으로 보고되고 있으며(Lee 등, 2018), PI3K/Akt 신호전달은 NFATc1 단백질 발현 유도를 통해 파골세포 분화에 기여하는 것으로 확인된 바 있다(Moon 등, 2012). 따라서 본 연구에서는 파골세포 분화 신호전달 과정에 대한 유산균 시험물질의 영향을 확인하기 위해 분화된 파골세포에서 관련 단백질의 발현량 변화를 분석하였다(Fig. 3). 이전 연구들에서 보고된 바와 동일하게 RAW 264.7 세포에서 RANKL 처리는 ERK, JNK, p38과 함께 PI3K 및 Akt 단백질의 인산화를 증가시켰으며, positive control로 사용된 E2는 이러한 단백질의 인산화를 유의적으로 저해하였다. 또한 유산균 시험물질 처리군에서도 E2 처리군과 유사한 수준에서 RANKL 단독 처리군 대비 모든 단백질 인산화의 유의적인 억제가 확인되었다.

Fig 3. Regulatory effects of Lacticaseibacillus reuteri MG5463 on the activation of proteins involved in RANK signaling pathways. Protein expression levels of phosphorylated extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), p-38, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), and protein kinase B (Akt) were measured at day 6 of cell differentiation. RANKL, receptor activator of nuclear factor κB ligand; E2, 17β-estradiol. Data are shown as mean±standard error of the mean (n=5). ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared to the RANKL control group.

RANKL에 의해 활성화된 MAPK와 Akt 단백질은 NFATc1을 비롯한 다양한 전사인자 단백질을 활성화하고, 이는 파골세포 특이 유전자 발현의 증가로 이어진다(Jiang 등, 2023). 따라서 본 연구에서는 유산균 시험물질이 이러한 유전자 발현에도 영향을 미치는지를 확인하고자 파골세포 특이 유전자로 알려진 matrix metalloproteinase-9, cathepsin K 및 TRAP mRNA 발현량을 분석하였다(Fig. 4). 세 가지 유전자 모두 대조군 대비 RANKL 단독 처리군에서 mRNA 발현량이 현저히 증가하였다. 하지만 RANKL과 함께 E2 또는 유산균 시험물질을 처리하였을 때 이러한 유전자 발현의 유의미한 억제가 확인되었다. 따라서 이러한 결과로부터 본 연구에 사용된 L. reuteri MG5463 유산균이 파골세포 분화 과정 중 RALKL에 의해 유도되는 MAPK와 Akt 활성화 및 파골세포 특이 유전자 발현을 효과적으로 억제함으로써 대식세포의 파골세포 분화를 저해할 수 있음을 확인하였다.

Fig 4. Inhibitory effects of Lacticaseibacillus reuteri MG5463 on the mRNA expression of osteoclast-specific genes. mRNA expression levels of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), cathepsin K, and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) were measured at day 6 of cell differentiation. RANKL, receptor activator of nuclear factor κB ligand; E2, 17β-estradiol. Data are shown as mean±standard error of the mean (n=6). ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared to the RANKL control group.

L. reuteri의 골 형성 증진 효능에 관한 이전 연구 결과에 따르면 L. reuteri 배양액의 처리가 RANKL에 의해 유도된 대식세포의 파골세포 분화 및 MAPK 활성화를 농도 의존적으로 억제함이 확인되었으며, 해당 연구에서는 활성 후보물질로 L. reuteri에 의해 생산된 lactobacillic acid를 제안한 바 있다(Quach 등, 2019). 실제로 lactobacillic acid를 생산하지 못하는 L. reuteri 변종은 파골세포 분화에 대한 상대적으로 낮은 억제 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 또한 난소적출 동물모델을 이용한 연구에서 4주 동안의 L. reuteri 경구투여를 통해 장내 균총의 변화와 함께 estrogen 결핍에 의한 골 손실의 억제가 확인되었으며(Britton 등, 2014), L. reuteri를 포함한 5종의 유산균 상등액의 처리가 우수한 골밀도 개선 효과를 나타냄이 입증된 바 있다(Montazeri-Najafabady 등, 2021). 이러한 연구들과 유사하게 최근 본 연구팀은 estrogen 결핍 마우스 모델에서 9주 동안의 L. reuteri MG5463 투여를 통해 골밀도 손실의 유의미한 개선과 함께 조골세포의 골 석회화 촉진 효과를 확인하였다(Yun 등, 2024). 따라서 본 연구와 이전 연구 결과들을 종합해 볼 때, L. reuteri 유산균이 파골세포 분화와 골 흡수를 억제하고 estrogen 결핍에 의한 골 손실을 개선할 수 있는 효과적인 기능성 소재로 사용될 수 있을 것으로 판단된다. 하지만 현재까지 인체 적용 시험에서 L. reuteri의 골 형성 증진 효과에 대한 정보는 극히 제한적이며, 따라서 향후 이의 임상적 검증과 기능성 소재화를 위한 체계적인 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.

본 연구에서는 L. reuteri MG5463 유산균의 파골세포 분화 억제 활성에 대한 평가를 위해 RAW 264.7 마우스 대식세포주를 이용하여 RANKL 처리와 함께 시험물질의 파골세포 분화와 관련 신호전달 체계에 대한 영향을 분석하였다. 유산균 시험물질은 RANKL에 의해 증가한 다핵세포 형성과 TRAP 활성을 유의적으로 억제했으며, 파골세포 분화의 핵심 조절인자인 MAPK, PI3K 및 Akt 단백질의 인산화와 파골세포 특이 유전자 발현을 감소시킴을 확인하였다. 이러한 결과는 L. reuteri MG5463 유산균이 대식세포의 파골세포 분화 핵심 신호전달 체계의 조절을 통해 세포분화를 효과적으로 저해할 수 있음을 보여주며, 향후 동물모델에서의 세부적인 작용기전 검증과 기능성식품 소재화를 위한 연구가 필요하다고 판단된다.

본 과제는 교육부와 한국연구재단의 재원으로 지원을 받아 수행된 국립안동대학교-경북도립대학교 글로컬대학사업단의 연구결과입니다.