Ex) Article Title, Author, Keywords
Online ISSN 2288-5978
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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2025; 54(2): 140-148
Published online February 28, 2025 https://doi.org/10.3746/jkfn.2025.54.2.140
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
Tae-Woong Song1 , Geun-Hee Cho2
, Da-Hyun Ko1
, Aram Song3
, Sung Phil Kim4
, Ok-Hwan Lee1
, and Sun-Il Choi1
,2
1Department of Food Science and Biotechnology, 2Department of Food Biotechnology, and 3Department of Food and Nurtrition, Kangwon National University 4STR Biotech Co., Ltd.
Correspondence to:Sun-Il Choi, Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, 1, Kangwondaehak-gil, Chuncheon-si, Gangwon 24341, Korea, E-mail: csi23@kangwon.ac.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Muscle atrophy caused by aging, obesity, and inflammation has become a prominent global concern, prompting increased interest in developing functional food ingredients to address this issue. This study investigated the efficacy of bioprocessed black rice bran extract, a by-product of black rice processing, on enhancing muscle strength by treating a dexamethasone-induced muscle atrophy model during the differentiation of C2C12 myotubes with bioprocessed black rice bran (BRB-F-S). To evaluate the cytotoxicity of BRB-F-S, cell viability was measured using the 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulphenyl)-(2H)-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) assay. Additionally, the cytoprotective effects of BRB-F-S against dexamethasone-induced muscle atrophy were quantitatively assessed via relative cell viability and myotube formation. The study results indicated that the BRB-F-S-treated group not only provided statistically significant protection against dexamethasone-induced cytotoxicity but also improved myotube formation. Furthermore, to investigate the mechanisms underlying the effects of BRB-F-S on myotube formation, an analysis of protein expression was carried out which revealed a significant increase in the levels of sirtuin 1, AMP-activated protein kinase alpha, protein kinase B, and mammalian target of rapamycin, which are proteins associated with mitochondrial biogenesis and protein synthesis, while expression levels of forkhead box class O 3a, atrogin1, and muscle RING-finger protein-1, related to protein degradation and the ubiquitin-proteasome system, were significantly reduced. These findings suggest that BRB-F-S could serve as a potential ingredient for health functional foods aimed at improving muscle atrophy.
Keywords: bioprocessed black rice bran extract, sarcopenia, muscle atrophy, C2C12, myotube
최근 현대사회에서 국민소득이 증가하고 1인 가구 및 노령인구가 증가함에 따라 건강한 삶에 대한 국민들의 수요는 점차 증가하고 있다(Kim 등, 2021). 특히, 노화 및 비만 등과 같은 복합적인 원인으로 인해 발생하는 근감소증은 근육량 감소와 근력의 저하를 수반하는 진행성 골격근 질환으로 낙상, 근력기능 저하, 사망률 증가 등의 부작용을 포함하여 일상생활의 기능 저하와 다양한 대사 질환의 위험성을 높이는 요인으로 작용한다(Cruz-Jentoft와 Sayer, 2019; Jang, 2011). 근감소증의 심각성이 부각되면서 세계보건기구(WHO)는 2016년에 근감소증을 질병 개체로 분류했으며, 2021년에는 한국질병분류 개정에 따라 국내에서도 공식 진단 코드에 포함되었다(Anker와 Morley, 2016; Yoo 등, 2022b). 또한, 국내 국민건강영양조사 자료에 따르면 2022년 기준 65세 이상 인구 중 근감소증 유병률은 남성 6.6%, 여성 9.2%로 나타나, 고령 인구에서 근감소증이 주요 건강 문제로 대두되고 있음을 보여준다(Kim과 Oh, 2024). 이러한 근감소증의 예방 및 증상 개선을 위해 다양한 기능성 소재에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 생체에 대한 안전성이 높고 부작용이 적은 천연물 유래 성분을 이용한 건강기능성 소재 개발에 관한 관심이 높아지고 있다(Kim 등, 2023a).
흑미강은 흑미를 도정하는 과정 중 발생하는 부산물로 일반적인 백미강에 비해 페놀 화합물과 플라보노이드 등의 생리활성 물질 함량이 높아 우수한 항산화 활성 및 라디칼 소거능을 나타내는 것으로 알려져 있다(Zhang 등, 2010). 이러한 이점을 이용해 흑미강은 다양한 소재와의 시너지 효과로 과도한 지질 축적을 예방하여 항비만 및 간 보호 기능에 관한 연구들이 보고되고 있다(Han 등, 2023; Im 등, 2023). 이처럼 흑미강의 다양한 기능성이 밝혀지면서 건강기능식품 소재로의 활용 방안이 요구되고 있지만, 흑미강 발효 소재를 이용한 근감소증 개선에 관한 연구는 전무하며 해당 소재가 근감소증 관련 작용기전에 미치는 영향에 관한 연구도 부족한 상황이다. 또한 Zulfafamy 등(2018)의 연구에 의하면, 발효를 통하여 흑미강이 함유한 생리활성 성분의 생체이용률이 증가하고 새로운 기능성 물질이 생성되어 항염증 및 항산화 효과가 증대된다고 보고되고 있다. 이러한 발효 공정의 이점을 바탕으로, 본 연구에서는 마우스 유래 세포주인 C2C12 근육세포에 근위축 모델을 유도한 동시에 흑미강 발효 추출물(bioprocessed black rice bran, BRB-F-S)을 처리하여 근감소증에 대한 효능평가 및 작용기전을 구명하고자 하였다.
근위축을 유도하기 위해 사용된 dexamethasone(DEX)은 글루코코르티코이드의 일종으로 항염제 및 항암제로 임상 환경에서 널리 사용되고 있지만, 만성 치료 시 단백질 분해 속도를 증가시키는 유비퀴틴 프로테아좀 시스템을 활성화해 골격근 단백질 합성 속도를 저해하는 것으로 보고되고 있다(Chen 등, 2020; Massaccesi 등, 2016; Menconi 등, 2008). 따라서 DEX로 유도된 근위축 C2C12 myotube에서 세포 보호 효과 및 myotube diameter와 fusion index의 측정을 통해 BRB-F-S의 근력감소 개선 효능을 평가하였으며, 세포 내의 근육 형성 및 분해와 관련된 작용기전을 구명하여 근감소증을 개선할 수 있는 건강기능식품의 소재로 활용될 수 있는 가능성을 제시하였다.
본 연구에 사용한 흑미강 발효 추출물과 양성대조군으로 사용한 오미자 추출물(
C2C12 세포 배양 및 분화 배지 제조를 위한 DMEM, fetal bovine serum(FBS), horse serum(HS) 및 penicillin-streptomycin(P/S)과 세포주 계대배양과 세척을 위한 phosphate-buffered saline(PBS)과 trypsin-EDTA는 Gibco에서 구입하였고, 세포 생존율 측정을 위한 WelCount Cell Proliferation Assay Kit은 Welgene에서 구매하였다. 작용기전 구명을 위한 Western blot 분석에 사용한 antibody의 경우 β-actin(#4967), sirtuin(SIRT)1(#2028s), AMP-activated protein kinase(AMPK)α(#2532), p-AMPKα(#2535), protein kinase B(Akt)(#4685), p-Akt(#9271), forkhead box O3(FoxO3)a(#2497), mammalian target of rapamycin(mTOR)(#2972) 및 p-mTOR(Ser2448, #2971)은 Cell Signaling Technology에서 구입하였다. Muscle-specific RING finger protein(MuRF)1(C-11)과 atrogin1(AP2041)은 각각 Santa Cruz Biotechnology와 ECM Biosciences에서 구매하여 사용하였다.
C2C12 근모세포(myoblast)는 1% P/S, 10% FBS 및 3.7 g/L sodium bicarbonate를 함유한 10% FBS 배지에서 실험 목적에 따라 각각 96-well plate, 24-well plate에 배양시켰다. C2C12는 각 well당 2.5×105의 농도로 seeding 하여 세포 밀도가 80~90%가 될 때까지 37°C의 5% CO2의 조건에서 배양하였다. 그 후 1% P/S, 2% HS 및 3.7 g/L의 sodium bicarbonate를 함유한 2% HS 배지로 교체하여 37°C의 5% CO2의 조건에서 myotube로의 분화를 유도하였다. 배지는 2일마다 교체해 주었고, 총분화유도 기간은 6일 동안 진행하였다. 소재 처리는 분화 5일 차에 진행하였고 BRB-F-S는 저(5 µg/mL), 중(10 µg/mL), 고(20 µg/mL)농도로 처리하며, 양성대조군으로 사용된 SE는 일일 섭취량(1,582 mg/d)과 지표성분인 schizandrin 함량(3.16 mg/g)을 고려하여 16 µg/mL로 처리하였다. 세포 보호 효과, 근관 형성능, 단백질 발현 평가의 경우 양성대조군 및 농도별 BRB-F-S와 함께 DEX를 200 µM 농도로 동시에 처리하여 후속 실험을 진행하였다. DEX의 농도 및 반응 시간 등은 근위축 모델링 선행 연구(Oh 등, 2023)를 참고하였다.
세포 생존율의 변화측정은 BRB-F-S의 세포 독성 및 세포 보호 효과를 평가하기 위해 진행하였다. 각 소재를 처리한 96-well plate를 24시간 배양한 후, 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide(XTT) 분석을 통해 세포 생존율을 측정하였다. XTT reagent와 N-methyl dibenzopyrazine methyl sulfate reagent를 50:1 비율로 혼합하여 96-well plate의 각 well에 첨가한 후, 37°C, 5% CO2 조건의 incubator에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후 microplate reader(Spectramax i3, Molecular Devices)를 사용하여 각 well의 450 nm 및 690 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, 두 값을 뺀 결괏값을 세포 생존율로 하여 control 군에 대한 상대적 세포 생존율을 도출하였다.
각 소재를 처리한 24-well plate를 24시간 배양한 후, 세포를 Jenner-Giemsa 염색하여 myotube의 직경과 핵의 융합 지수를 측정하였다. 각 well의 배지를 제거하고 1× PBS로 두 번 세척한 후, 100% 메탄올로 10분간 세포를 고정한 뒤 10분간 자연 건조하였다. 건조된 세포는 Jenner solution을 1 mM sodium phosphate buffer(pH 5.6)와 1:3 비율로 혼합한 용액으로 염색하여 37°C, 5% CO2 조건의 incubator에서 5분간 반응시키고 증류수로 세척하였다. 그 후 Giemsa solution을 1 mM sodium phosphate buffer(pH 5.6)와 1:20 비율로 혼합하여 염색한 후 10분간 상온에서 반응시키고 증류수로 세척하였다. 직경 및 융합 지수 측정을 위해 염색된 세포들을 광학 현미경(CKX41, Olympus)을 이용하여 ×200배율로 각 well당 무작위로 세 번 이상 촬영한 후 근관의 직경을 측정하였다. 융합 지수는 전체 핵 수에 대한 근관 내 핵 수의 비율을 백분율 값으로 나타내어 계산하였다.
100 mm cell culture dish에서 배양한 C2C12 myotube에 200 μM DEX와 함께 BRB-F-S 10 μg/mL, 20 μg/mL 및 SE 16 μg/mL를 처리하였다. 그 후 lysis buffer로 세포를 용해하고 4°C에서 12,000×
모든 실험 결과는 3 반복 이상으로 진행하였으며 평균과 표준 편차로 나타내었다. 각 시험군에 대한 통계 분석은 IBM SPSS Statistics software ver. 26(IBM SPSS)을 사용하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA)과
BRB-F-S 및 SE가 C2C12 myotube에 독성을 미치지 않는 농도를 설정하기 위해 C2C12 myotube에 5, 10, 20 µg/mL의 BRB-F-S 및 16 µg/mL의 SE를 처리하여 아무것도 처리하지 않은 control 군 대비 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, control 군과 비교하여 모든 BRB-F-S 및 SE 처리군에서 세포 형태학적 변화 및 세포 생존율 차이가 나타나지 않아, 동일한 농도로 BRB-F-S 및 SE의 세포 보호 효과 및 근관 형성능을 측정하였다(Fig. 1A).
Control 군과 비교하여 DEX를 처리한 음성대조군은 유의적으로 세포 생존율이 감소하였다. 골격근 내 세포 생존율의 감소는 근감소증의 주요 지표이며, DEX는 세포 사멸에 관여하는 Bcl-2-associated death promoter(BAD) 단백질의 활성화를 통해 세포 사멸 과정을 유도하는 것으로 보고되고 있다(Bonnefoy-Berard 등, 2004). 따라서 DEX로부터 유도된 세포 사멸에 대한 세포 보호 효과를 관찰하기 위해 DEX와 함께 농도별 BRB-F-S와 SE를 각각 처리한 결과 DEX 단독 처리군에 비해 유의적으로 세포 생존율이 증가하였다(Fig. 1B). 양성대조군으로 사용된 SE의 경우 DEX로 근위축을 유도한 근력감소 개선 연구에서 효능이 보고되었으며(Yeon 등, 2020; Yoo 등, 2022a), SE의 대표 생리활성 물질인 schisandrin은 활성산소종을 감소시키고 염증반응의 주요 경로인 NF-κB signaling을 억제하며, 자가포식 관련 분자의 발현을 촉진함으로써 산화적 스트레스로 인한 세포 손상을 완화하여 세포 사멸을 예방하는 효과가 보고되었다(Kim과 Yi, 2018). BRB-F-S 처리군의 경우 세포 생존율이 농도 의존적으로 증가하였으며, 양성대조군인 SE 처리군과 통계적으로 유의적인 세포 생존율 차이가 없는 것을 확인하였다. 따라서 BRB-F-S는 DEX로 유도된 세포 사멸 모델에서 세포 보호 효과가 있음을 확인하였으며, 이는 DEX로 유도된 근위축의 개선 가능성을 나타낸다.
근육세포의 경우 배양 시 세포 밀도가 80~90%에 도달하면 증식이 감소하면서 myoblast가 융합하기 시작해 관상형의 myocyte를 지나 3개 이상의 다핵 섬유 네트워크인 myotube를 형성한다. 따라서 myotube diameter 및 fusion index는 C2C12가 분화하면서 근관을 형성하는 능력을 평가하기 위한 지표이다(Burattini 등, 2004; Noë 등, 2022; Yaffe와 Saxel, 1977). DEX를 처리한 음성대조군에서 control 군과 비교하여 myotube diameter가 유의적으로 감소하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 Lee 등(2018)의 결과와 일치하였다. 하지만 BRB-F-S 처리군에서 음성대조군에 비해 농도 유의적으로 myotube diameter가 증가하는 것을 확인하였으며, 특히 20 μg/mL의 BRB-F-S 처리군에서는 SE 처리군과 유사한 것으로 나타났다(Fig. 2A, 2B). 또한 fusion index의 경우 음성대조군에 비하여 BRB-F-S 처리군에서 농도 의존적으로 다핵의 myotube가 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 2C). 이는 천연물 소재 및 생리활성 물질이 단백질 합성경로 활성화 및 분해 작용 억제를 통해 근관의 분화를 유도하여 myotube diameter 및 fusion index를 증가시키는 연구 결과와 유사하였다(Kim 등, 2023b; Son 등, 2024). 따라서 BRB-F-S는 DEX로 유도된 근위축 모델에서 myotube 형성 효능이 있음을 확인하였다.
Myoblast가 myotube로 분화하려면 수축성 근육의 에너지 수요 증가를 지원하기 위한 대사 전환이 필요하며, 이를 위해 골격근 세포 내 미토콘드리아 생합성 활성화가 중요하다(Stotland와 Gottlieb, 2015). SIRT1은 NAD⁺ 의존적 탈아세틸화 효소로 에너지 결핍 상태에서 활성화되며, 미토콘드리아 생합성과 산화 능력을 촉진하여 골격근 내 미토콘드리아의 기능 저하를 예방하는 데 중요한 역할을 한다. AMPKα는 ATP/AMP 비율이 낮아질 때 활성화되며, 에너지 균형 유지와 함께 미토콘드리아 생합성의 주요 조절 인자인 PGC-1α를 활성화하거나 SIRT1의 NAD⁺ 생성 경로를 통해 간접적으로 활성화하여 미토콘드리아 생합성을 조절한다(Fernandez-Marcos와 Auwerx, 2011; Liang 등, 2014). 또한 근육 단백질 합성에 관하여 다양한 세포외 및 세포내 신호를 통합하여 성장과 증식을 촉진하는 Akt/mTOR signaling이 골격근 성장 및 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(Hayashi와 Proud, 2007; Morita 등, 2015). Akt는 IGF-1과 같은 성장인자의 신호를, 수용체를 통해 전달받아 활성화되며 mTOR의 활성을 촉진한다. mTOR은 리보솜 합성을 촉진하고 세포 성장 및 단백질 합성 과정을 강화하여 효율적인 세포의 성장 및 재생을 가능하게 하는 것으로 보고되고 있다(Laplante와 Sabatini, 2012). 따라서 BRB-F-S가 C2C12 세포의 근육 합성 및 재생에 미치는 영향을 평가하고자, 미토콘드리아 생합성과 관련된 SIRT1 및 AMPKα와 단백질 합성과 관련된 Akt 및 mTOR의 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, SIRT1 및 AMPKα의 단백질 발현량은 음성대조군에 비해 모든 처리군에서 증가를 나타내었다(Fig. 3). 또한 Akt와 mTOR의 단백질 발현량 경우에도 DEX 처리로 인해 감소한 발현량이 BRB-F-S 처리군에서 증가하여 BRB-F-S가 근육 합성을 촉진하는 효과를 확인하였다(Fig. 4). γ-Oryzanol과 polysaccharides는 흑미강의 유효 생리활성 성분으로 알려져 있다(Chen 등, 2021; Shin 등, 2017). 해당 성분들은 항산화 및 항염증 효능을 통해 AMPKα와 SIRT1 pathway 및 Akt/mTOR 경로를 상향 조절하는 것으로 보고되고 있다(Li 등, 2022; Taengthong 등, 2022). 따라서 BRB-F-S는 C2C12 세포 내 미토콘드리아 생합성 및 단백질 합성 관련 인자들의 발현을 유의미하게 향상시켜 근육 합성에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단된다.
근위축은 근원섬유 수 감소에 따라 골격근 질량이 시간에 따라 지수적으로 감소하는 현상을 뜻하며, 주로 단백질 합성 감소와 분해 증가로 인해 발생한다(Hwangbo 등, 2023). 골격근 내 단백질 분해는 근위축 발병에 중요한 역할을 하며, 이를 조절하는 주요 경로로 유비퀴틴-프로테아솜 시스템(ubiquitin-proteasome system, UPS)이 알려져 있다. UPS는 세포 내 불필요하거나 손상된 단백질을 제거하는 중추적 역할을 수행하며, 단백질 유비퀴틴화를 통해 표적 단백질을 선택적으로 분해한다. 이 과정에서 유비퀴틴화된 단백질은 26S 프로테아솜으로 전달되어 분해되며, 이를 통해 근육 내 단백질 구성 요소의 소실이 가속화된다. 특히 UPS는 근위축 상태에서 활성이 증가하여 근육 단백질 분해를 촉진하며, 이로 인해 근육의 기능 및 구조적 무결성이 손상된다(Gomes 등, 2001). 근위축 과정에서 FoxO3a는 핵심 전사 인자로 작용하여 활성화되면 MuRF1과 atrogin1의 발현을 유도한다. 이로 인해 UPS를 통해 근육 내 단백질 분해가 촉진되고 단백질 합성은 저해되어 근위축의 주요 경로가 형성되는 것이 보고되고 있다(Sartori 등, 2021). 이를 바탕으로 본 연구에서는 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1의 발현 정도를 측정하였다. Fig. 5에 제시한 바와 같이 DEX만 처리한 음성대조군에서는 control군과 대비하여 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1의 단백질 발현이 유의하게 증가하였으나 BRB-F-S 및 SE 처리군에서 이러한 발현 증가가 유의하게 감소하는 결과를 확인하였다. 결과적으로 BRB-F-S는 DEX로 활성화된 UPS를 억제하여 근육 단백질의 분해 및 합성 억제를 개선하는 효능이 있는 것으로 사료된다. 또한, 선행 연구에서 생물전환 공정을 통해 BRB-F-S에서 새롭게 생성되는 유효성분이 다당체임이 확인되었으며(Kwon 등, 2023), 다양한 다당체가 근위축을 억제할 수 있음이 보고되어 있음을 고려할때(Li 등, 2025; Lu 등, 2013; She 등, 2024), BRB-F-S의 다당체가 근위축을 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 판단된다.
최근 노인인구의 비율이 증가하면서 근감소증에 대한 우려가 커지고 있음에 따라 이와 관련된 기능성식품 소재 개발에 대한 필요성이 증진되고 있다. 따라서 본 연구에서는 BRB-F-S의 근감소증 개선 효능을 평가하고자 DEX로 유도된 근위축 시험관 모델에서 myotube 형성능을 평가하였으며, BRB-F-S 처리군에서 세포 생존율, 근관 직경 및 융합 지수가 농도 의존적으로 증가하였다. 또한 미토콘드리아 생합성에 관여하는 SIRT1과 AMPKα, 근육 단백질 합성에 관련된 Akt와 mTOR의 상대적 발현량이 DEX 처리군에 비해 BRB-F-S 및 SE 처리군에서 모두 유의적으로 증가하였으며, UPS의 핵심 전사 인자인 FoxO3a와 그 하위 인자인 MuRF1 및 atrogin1의 발현량은 BRB-F-S 및 SE 처리군에서 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 이러한 결과들을 통해 BRB-F-S가 시험관 모델에서의 근력감소 개선에 효과적인 건강기능식품 소재로서의 가능성을 제시하였다.
본 연구는 2024년도 중소벤처기업부의 “지역특화산업육성+(S3400865)”사업 연구 지원과 강원대학교 대학회계 학술연구조성비로 이루어졌으며 이에 감사드립니다.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2025; 54(2): 140-148
Published online February 28, 2025 https://doi.org/10.3746/jkfn.2025.54.2.140
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
송태웅1∙조근희2∙고다현1∙송아람3∙김성필4∙이옥환1∙최선일1,2
1강원대학교 식품생명공학과, 2강원대학교 푸드바이오텍학과3강원대학교 식품영양학과, 4에스티알바이오텍
Tae-Woong Song1 , Geun-Hee Cho2
, Da-Hyun Ko1
, Aram Song3
, Sung Phil Kim4
, Ok-Hwan Lee1
, and Sun-Il Choi1,2
1Department of Food Science and Biotechnology, 2Department of Food Biotechnology, and 3Department of Food and Nurtrition, Kangwon National University 4STR Biotech Co., Ltd.
Correspondence to:Sun-Il Choi, Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, 1, Kangwondaehak-gil, Chuncheon-si, Gangwon 24341, Korea, E-mail: csi23@kangwon.ac.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Muscle atrophy caused by aging, obesity, and inflammation has become a prominent global concern, prompting increased interest in developing functional food ingredients to address this issue. This study investigated the efficacy of bioprocessed black rice bran extract, a by-product of black rice processing, on enhancing muscle strength by treating a dexamethasone-induced muscle atrophy model during the differentiation of C2C12 myotubes with bioprocessed black rice bran (BRB-F-S). To evaluate the cytotoxicity of BRB-F-S, cell viability was measured using the 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulphenyl)-(2H)-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) assay. Additionally, the cytoprotective effects of BRB-F-S against dexamethasone-induced muscle atrophy were quantitatively assessed via relative cell viability and myotube formation. The study results indicated that the BRB-F-S-treated group not only provided statistically significant protection against dexamethasone-induced cytotoxicity but also improved myotube formation. Furthermore, to investigate the mechanisms underlying the effects of BRB-F-S on myotube formation, an analysis of protein expression was carried out which revealed a significant increase in the levels of sirtuin 1, AMP-activated protein kinase alpha, protein kinase B, and mammalian target of rapamycin, which are proteins associated with mitochondrial biogenesis and protein synthesis, while expression levels of forkhead box class O 3a, atrogin1, and muscle RING-finger protein-1, related to protein degradation and the ubiquitin-proteasome system, were significantly reduced. These findings suggest that BRB-F-S could serve as a potential ingredient for health functional foods aimed at improving muscle atrophy.
Keywords: bioprocessed black rice bran extract, sarcopenia, muscle atrophy, C2C12, myotube
최근 현대사회에서 국민소득이 증가하고 1인 가구 및 노령인구가 증가함에 따라 건강한 삶에 대한 국민들의 수요는 점차 증가하고 있다(Kim 등, 2021). 특히, 노화 및 비만 등과 같은 복합적인 원인으로 인해 발생하는 근감소증은 근육량 감소와 근력의 저하를 수반하는 진행성 골격근 질환으로 낙상, 근력기능 저하, 사망률 증가 등의 부작용을 포함하여 일상생활의 기능 저하와 다양한 대사 질환의 위험성을 높이는 요인으로 작용한다(Cruz-Jentoft와 Sayer, 2019; Jang, 2011). 근감소증의 심각성이 부각되면서 세계보건기구(WHO)는 2016년에 근감소증을 질병 개체로 분류했으며, 2021년에는 한국질병분류 개정에 따라 국내에서도 공식 진단 코드에 포함되었다(Anker와 Morley, 2016; Yoo 등, 2022b). 또한, 국내 국민건강영양조사 자료에 따르면 2022년 기준 65세 이상 인구 중 근감소증 유병률은 남성 6.6%, 여성 9.2%로 나타나, 고령 인구에서 근감소증이 주요 건강 문제로 대두되고 있음을 보여준다(Kim과 Oh, 2024). 이러한 근감소증의 예방 및 증상 개선을 위해 다양한 기능성 소재에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 생체에 대한 안전성이 높고 부작용이 적은 천연물 유래 성분을 이용한 건강기능성 소재 개발에 관한 관심이 높아지고 있다(Kim 등, 2023a).
흑미강은 흑미를 도정하는 과정 중 발생하는 부산물로 일반적인 백미강에 비해 페놀 화합물과 플라보노이드 등의 생리활성 물질 함량이 높아 우수한 항산화 활성 및 라디칼 소거능을 나타내는 것으로 알려져 있다(Zhang 등, 2010). 이러한 이점을 이용해 흑미강은 다양한 소재와의 시너지 효과로 과도한 지질 축적을 예방하여 항비만 및 간 보호 기능에 관한 연구들이 보고되고 있다(Han 등, 2023; Im 등, 2023). 이처럼 흑미강의 다양한 기능성이 밝혀지면서 건강기능식품 소재로의 활용 방안이 요구되고 있지만, 흑미강 발효 소재를 이용한 근감소증 개선에 관한 연구는 전무하며 해당 소재가 근감소증 관련 작용기전에 미치는 영향에 관한 연구도 부족한 상황이다. 또한 Zulfafamy 등(2018)의 연구에 의하면, 발효를 통하여 흑미강이 함유한 생리활성 성분의 생체이용률이 증가하고 새로운 기능성 물질이 생성되어 항염증 및 항산화 효과가 증대된다고 보고되고 있다. 이러한 발효 공정의 이점을 바탕으로, 본 연구에서는 마우스 유래 세포주인 C2C12 근육세포에 근위축 모델을 유도한 동시에 흑미강 발효 추출물(bioprocessed black rice bran, BRB-F-S)을 처리하여 근감소증에 대한 효능평가 및 작용기전을 구명하고자 하였다.
근위축을 유도하기 위해 사용된 dexamethasone(DEX)은 글루코코르티코이드의 일종으로 항염제 및 항암제로 임상 환경에서 널리 사용되고 있지만, 만성 치료 시 단백질 분해 속도를 증가시키는 유비퀴틴 프로테아좀 시스템을 활성화해 골격근 단백질 합성 속도를 저해하는 것으로 보고되고 있다(Chen 등, 2020; Massaccesi 등, 2016; Menconi 등, 2008). 따라서 DEX로 유도된 근위축 C2C12 myotube에서 세포 보호 효과 및 myotube diameter와 fusion index의 측정을 통해 BRB-F-S의 근력감소 개선 효능을 평가하였으며, 세포 내의 근육 형성 및 분해와 관련된 작용기전을 구명하여 근감소증을 개선할 수 있는 건강기능식품의 소재로 활용될 수 있는 가능성을 제시하였다.
본 연구에 사용한 흑미강 발효 추출물과 양성대조군으로 사용한 오미자 추출물(
C2C12 세포 배양 및 분화 배지 제조를 위한 DMEM, fetal bovine serum(FBS), horse serum(HS) 및 penicillin-streptomycin(P/S)과 세포주 계대배양과 세척을 위한 phosphate-buffered saline(PBS)과 trypsin-EDTA는 Gibco에서 구입하였고, 세포 생존율 측정을 위한 WelCount Cell Proliferation Assay Kit은 Welgene에서 구매하였다. 작용기전 구명을 위한 Western blot 분석에 사용한 antibody의 경우 β-actin(#4967), sirtuin(SIRT)1(#2028s), AMP-activated protein kinase(AMPK)α(#2532), p-AMPKα(#2535), protein kinase B(Akt)(#4685), p-Akt(#9271), forkhead box O3(FoxO3)a(#2497), mammalian target of rapamycin(mTOR)(#2972) 및 p-mTOR(Ser2448, #2971)은 Cell Signaling Technology에서 구입하였다. Muscle-specific RING finger protein(MuRF)1(C-11)과 atrogin1(AP2041)은 각각 Santa Cruz Biotechnology와 ECM Biosciences에서 구매하여 사용하였다.
C2C12 근모세포(myoblast)는 1% P/S, 10% FBS 및 3.7 g/L sodium bicarbonate를 함유한 10% FBS 배지에서 실험 목적에 따라 각각 96-well plate, 24-well plate에 배양시켰다. C2C12는 각 well당 2.5×105의 농도로 seeding 하여 세포 밀도가 80~90%가 될 때까지 37°C의 5% CO2의 조건에서 배양하였다. 그 후 1% P/S, 2% HS 및 3.7 g/L의 sodium bicarbonate를 함유한 2% HS 배지로 교체하여 37°C의 5% CO2의 조건에서 myotube로의 분화를 유도하였다. 배지는 2일마다 교체해 주었고, 총분화유도 기간은 6일 동안 진행하였다. 소재 처리는 분화 5일 차에 진행하였고 BRB-F-S는 저(5 µg/mL), 중(10 µg/mL), 고(20 µg/mL)농도로 처리하며, 양성대조군으로 사용된 SE는 일일 섭취량(1,582 mg/d)과 지표성분인 schizandrin 함량(3.16 mg/g)을 고려하여 16 µg/mL로 처리하였다. 세포 보호 효과, 근관 형성능, 단백질 발현 평가의 경우 양성대조군 및 농도별 BRB-F-S와 함께 DEX를 200 µM 농도로 동시에 처리하여 후속 실험을 진행하였다. DEX의 농도 및 반응 시간 등은 근위축 모델링 선행 연구(Oh 등, 2023)를 참고하였다.
세포 생존율의 변화측정은 BRB-F-S의 세포 독성 및 세포 보호 효과를 평가하기 위해 진행하였다. 각 소재를 처리한 96-well plate를 24시간 배양한 후, 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide(XTT) 분석을 통해 세포 생존율을 측정하였다. XTT reagent와 N-methyl dibenzopyrazine methyl sulfate reagent를 50:1 비율로 혼합하여 96-well plate의 각 well에 첨가한 후, 37°C, 5% CO2 조건의 incubator에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후 microplate reader(Spectramax i3, Molecular Devices)를 사용하여 각 well의 450 nm 및 690 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, 두 값을 뺀 결괏값을 세포 생존율로 하여 control 군에 대한 상대적 세포 생존율을 도출하였다.
각 소재를 처리한 24-well plate를 24시간 배양한 후, 세포를 Jenner-Giemsa 염색하여 myotube의 직경과 핵의 융합 지수를 측정하였다. 각 well의 배지를 제거하고 1× PBS로 두 번 세척한 후, 100% 메탄올로 10분간 세포를 고정한 뒤 10분간 자연 건조하였다. 건조된 세포는 Jenner solution을 1 mM sodium phosphate buffer(pH 5.6)와 1:3 비율로 혼합한 용액으로 염색하여 37°C, 5% CO2 조건의 incubator에서 5분간 반응시키고 증류수로 세척하였다. 그 후 Giemsa solution을 1 mM sodium phosphate buffer(pH 5.6)와 1:20 비율로 혼합하여 염색한 후 10분간 상온에서 반응시키고 증류수로 세척하였다. 직경 및 융합 지수 측정을 위해 염색된 세포들을 광학 현미경(CKX41, Olympus)을 이용하여 ×200배율로 각 well당 무작위로 세 번 이상 촬영한 후 근관의 직경을 측정하였다. 융합 지수는 전체 핵 수에 대한 근관 내 핵 수의 비율을 백분율 값으로 나타내어 계산하였다.
100 mm cell culture dish에서 배양한 C2C12 myotube에 200 μM DEX와 함께 BRB-F-S 10 μg/mL, 20 μg/mL 및 SE 16 μg/mL를 처리하였다. 그 후 lysis buffer로 세포를 용해하고 4°C에서 12,000×
모든 실험 결과는 3 반복 이상으로 진행하였으며 평균과 표준 편차로 나타내었다. 각 시험군에 대한 통계 분석은 IBM SPSS Statistics software ver. 26(IBM SPSS)을 사용하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA)과
BRB-F-S 및 SE가 C2C12 myotube에 독성을 미치지 않는 농도를 설정하기 위해 C2C12 myotube에 5, 10, 20 µg/mL의 BRB-F-S 및 16 µg/mL의 SE를 처리하여 아무것도 처리하지 않은 control 군 대비 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, control 군과 비교하여 모든 BRB-F-S 및 SE 처리군에서 세포 형태학적 변화 및 세포 생존율 차이가 나타나지 않아, 동일한 농도로 BRB-F-S 및 SE의 세포 보호 효과 및 근관 형성능을 측정하였다(Fig. 1A).
Control 군과 비교하여 DEX를 처리한 음성대조군은 유의적으로 세포 생존율이 감소하였다. 골격근 내 세포 생존율의 감소는 근감소증의 주요 지표이며, DEX는 세포 사멸에 관여하는 Bcl-2-associated death promoter(BAD) 단백질의 활성화를 통해 세포 사멸 과정을 유도하는 것으로 보고되고 있다(Bonnefoy-Berard 등, 2004). 따라서 DEX로부터 유도된 세포 사멸에 대한 세포 보호 효과를 관찰하기 위해 DEX와 함께 농도별 BRB-F-S와 SE를 각각 처리한 결과 DEX 단독 처리군에 비해 유의적으로 세포 생존율이 증가하였다(Fig. 1B). 양성대조군으로 사용된 SE의 경우 DEX로 근위축을 유도한 근력감소 개선 연구에서 효능이 보고되었으며(Yeon 등, 2020; Yoo 등, 2022a), SE의 대표 생리활성 물질인 schisandrin은 활성산소종을 감소시키고 염증반응의 주요 경로인 NF-κB signaling을 억제하며, 자가포식 관련 분자의 발현을 촉진함으로써 산화적 스트레스로 인한 세포 손상을 완화하여 세포 사멸을 예방하는 효과가 보고되었다(Kim과 Yi, 2018). BRB-F-S 처리군의 경우 세포 생존율이 농도 의존적으로 증가하였으며, 양성대조군인 SE 처리군과 통계적으로 유의적인 세포 생존율 차이가 없는 것을 확인하였다. 따라서 BRB-F-S는 DEX로 유도된 세포 사멸 모델에서 세포 보호 효과가 있음을 확인하였으며, 이는 DEX로 유도된 근위축의 개선 가능성을 나타낸다.
근육세포의 경우 배양 시 세포 밀도가 80~90%에 도달하면 증식이 감소하면서 myoblast가 융합하기 시작해 관상형의 myocyte를 지나 3개 이상의 다핵 섬유 네트워크인 myotube를 형성한다. 따라서 myotube diameter 및 fusion index는 C2C12가 분화하면서 근관을 형성하는 능력을 평가하기 위한 지표이다(Burattini 등, 2004; Noë 등, 2022; Yaffe와 Saxel, 1977). DEX를 처리한 음성대조군에서 control 군과 비교하여 myotube diameter가 유의적으로 감소하는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 Lee 등(2018)의 결과와 일치하였다. 하지만 BRB-F-S 처리군에서 음성대조군에 비해 농도 유의적으로 myotube diameter가 증가하는 것을 확인하였으며, 특히 20 μg/mL의 BRB-F-S 처리군에서는 SE 처리군과 유사한 것으로 나타났다(Fig. 2A, 2B). 또한 fusion index의 경우 음성대조군에 비하여 BRB-F-S 처리군에서 농도 의존적으로 다핵의 myotube가 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 2C). 이는 천연물 소재 및 생리활성 물질이 단백질 합성경로 활성화 및 분해 작용 억제를 통해 근관의 분화를 유도하여 myotube diameter 및 fusion index를 증가시키는 연구 결과와 유사하였다(Kim 등, 2023b; Son 등, 2024). 따라서 BRB-F-S는 DEX로 유도된 근위축 모델에서 myotube 형성 효능이 있음을 확인하였다.
Myoblast가 myotube로 분화하려면 수축성 근육의 에너지 수요 증가를 지원하기 위한 대사 전환이 필요하며, 이를 위해 골격근 세포 내 미토콘드리아 생합성 활성화가 중요하다(Stotland와 Gottlieb, 2015). SIRT1은 NAD⁺ 의존적 탈아세틸화 효소로 에너지 결핍 상태에서 활성화되며, 미토콘드리아 생합성과 산화 능력을 촉진하여 골격근 내 미토콘드리아의 기능 저하를 예방하는 데 중요한 역할을 한다. AMPKα는 ATP/AMP 비율이 낮아질 때 활성화되며, 에너지 균형 유지와 함께 미토콘드리아 생합성의 주요 조절 인자인 PGC-1α를 활성화하거나 SIRT1의 NAD⁺ 생성 경로를 통해 간접적으로 활성화하여 미토콘드리아 생합성을 조절한다(Fernandez-Marcos와 Auwerx, 2011; Liang 등, 2014). 또한 근육 단백질 합성에 관하여 다양한 세포외 및 세포내 신호를 통합하여 성장과 증식을 촉진하는 Akt/mTOR signaling이 골격근 성장 및 재생에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(Hayashi와 Proud, 2007; Morita 등, 2015). Akt는 IGF-1과 같은 성장인자의 신호를, 수용체를 통해 전달받아 활성화되며 mTOR의 활성을 촉진한다. mTOR은 리보솜 합성을 촉진하고 세포 성장 및 단백질 합성 과정을 강화하여 효율적인 세포의 성장 및 재생을 가능하게 하는 것으로 보고되고 있다(Laplante와 Sabatini, 2012). 따라서 BRB-F-S가 C2C12 세포의 근육 합성 및 재생에 미치는 영향을 평가하고자, 미토콘드리아 생합성과 관련된 SIRT1 및 AMPKα와 단백질 합성과 관련된 Akt 및 mTOR의 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, SIRT1 및 AMPKα의 단백질 발현량은 음성대조군에 비해 모든 처리군에서 증가를 나타내었다(Fig. 3). 또한 Akt와 mTOR의 단백질 발현량 경우에도 DEX 처리로 인해 감소한 발현량이 BRB-F-S 처리군에서 증가하여 BRB-F-S가 근육 합성을 촉진하는 효과를 확인하였다(Fig. 4). γ-Oryzanol과 polysaccharides는 흑미강의 유효 생리활성 성분으로 알려져 있다(Chen 등, 2021; Shin 등, 2017). 해당 성분들은 항산화 및 항염증 효능을 통해 AMPKα와 SIRT1 pathway 및 Akt/mTOR 경로를 상향 조절하는 것으로 보고되고 있다(Li 등, 2022; Taengthong 등, 2022). 따라서 BRB-F-S는 C2C12 세포 내 미토콘드리아 생합성 및 단백질 합성 관련 인자들의 발현을 유의미하게 향상시켜 근육 합성에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 판단된다.
근위축은 근원섬유 수 감소에 따라 골격근 질량이 시간에 따라 지수적으로 감소하는 현상을 뜻하며, 주로 단백질 합성 감소와 분해 증가로 인해 발생한다(Hwangbo 등, 2023). 골격근 내 단백질 분해는 근위축 발병에 중요한 역할을 하며, 이를 조절하는 주요 경로로 유비퀴틴-프로테아솜 시스템(ubiquitin-proteasome system, UPS)이 알려져 있다. UPS는 세포 내 불필요하거나 손상된 단백질을 제거하는 중추적 역할을 수행하며, 단백질 유비퀴틴화를 통해 표적 단백질을 선택적으로 분해한다. 이 과정에서 유비퀴틴화된 단백질은 26S 프로테아솜으로 전달되어 분해되며, 이를 통해 근육 내 단백질 구성 요소의 소실이 가속화된다. 특히 UPS는 근위축 상태에서 활성이 증가하여 근육 단백질 분해를 촉진하며, 이로 인해 근육의 기능 및 구조적 무결성이 손상된다(Gomes 등, 2001). 근위축 과정에서 FoxO3a는 핵심 전사 인자로 작용하여 활성화되면 MuRF1과 atrogin1의 발현을 유도한다. 이로 인해 UPS를 통해 근육 내 단백질 분해가 촉진되고 단백질 합성은 저해되어 근위축의 주요 경로가 형성되는 것이 보고되고 있다(Sartori 등, 2021). 이를 바탕으로 본 연구에서는 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1의 발현 정도를 측정하였다. Fig. 5에 제시한 바와 같이 DEX만 처리한 음성대조군에서는 control군과 대비하여 FoxO3a, MuRF1 및 atrogin1의 단백질 발현이 유의하게 증가하였으나 BRB-F-S 및 SE 처리군에서 이러한 발현 증가가 유의하게 감소하는 결과를 확인하였다. 결과적으로 BRB-F-S는 DEX로 활성화된 UPS를 억제하여 근육 단백질의 분해 및 합성 억제를 개선하는 효능이 있는 것으로 사료된다. 또한, 선행 연구에서 생물전환 공정을 통해 BRB-F-S에서 새롭게 생성되는 유효성분이 다당체임이 확인되었으며(Kwon 등, 2023), 다양한 다당체가 근위축을 억제할 수 있음이 보고되어 있음을 고려할때(Li 등, 2025; Lu 등, 2013; She 등, 2024), BRB-F-S의 다당체가 근위축을 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 판단된다.
최근 노인인구의 비율이 증가하면서 근감소증에 대한 우려가 커지고 있음에 따라 이와 관련된 기능성식품 소재 개발에 대한 필요성이 증진되고 있다. 따라서 본 연구에서는 BRB-F-S의 근감소증 개선 효능을 평가하고자 DEX로 유도된 근위축 시험관 모델에서 myotube 형성능을 평가하였으며, BRB-F-S 처리군에서 세포 생존율, 근관 직경 및 융합 지수가 농도 의존적으로 증가하였다. 또한 미토콘드리아 생합성에 관여하는 SIRT1과 AMPKα, 근육 단백질 합성에 관련된 Akt와 mTOR의 상대적 발현량이 DEX 처리군에 비해 BRB-F-S 및 SE 처리군에서 모두 유의적으로 증가하였으며, UPS의 핵심 전사 인자인 FoxO3a와 그 하위 인자인 MuRF1 및 atrogin1의 발현량은 BRB-F-S 및 SE 처리군에서 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 이러한 결과들을 통해 BRB-F-S가 시험관 모델에서의 근력감소 개선에 효과적인 건강기능식품 소재로서의 가능성을 제시하였다.
본 연구는 2024년도 중소벤처기업부의 “지역특화산업육성+(S3400865)”사업 연구 지원과 강원대학교 대학회계 학술연구조성비로 이루어졌으며 이에 감사드립니다.
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