인체의 면역 시스템은 내부 또는 외부 감염물질로부터 인체를 보호하기 위한 가장 일차적인 방어 시스템이다. 지난 70여 년 동안 질병 치료를 목적으로 항생제에 크게 의존해 온 결과 항생제 내성 박테리아가 발생하였다(Khan 등, 2021; Khatua 등, 2022). 이후 인체의 방어 기전을 증진하는 것으로 치료 전략이 전환되었으며, 면역 증강제 투여는 인체의 방어 기전을 증진하는 핵심 전략이다(Khatua 등, 2022; Pezzanite 등, 2021). 면역 증강제는 새로운 병원균에 대한 방어 능력을 키우고 약물에 대한 내성 출현을 예방할 수 있으며, 최근에는 항암 치료를 받는 면역 저하 환자를 위한 치료 옵션 중 하나로 확장되었다. 2020년 3월 세계보건기구(WHO)는 코로나바이러스를 세계적인 대유행으로 선언하였으며, 이 질환은 면역력이 약한 사람들에게 특히 높은 치사율을 보였다(Das, 2020; Kim 등, 2024). 과학자를 비롯하여 의료진들은 이러한 감염성 질환에는 면역력을 높이는 것이 적절한 치료법이라고 밝혔으나, 백신 접종 후 비정상적인 면역 활성화로 인해 사이토카인이 대량 생산되면서 사망 또는 자가면역 질환 환자가 급증하게 된 원인이 되었다(Behrens, 2024; Khatua 등, 2022; Lee와 Choi, 2021). 따라서 1상에서는 면역력 증진을 통해 질병을 예방하는 것이 매우 적절한 치료법이지만 2상에서는 과도한 면역 체계를 억제할 수 있는 항염증제 투여를 통해 질환의 발병을 예방해야 한다(Mrityunjaya 등, 2020). 그러므로 유효한 면역 조절제 개발을 위해 수 세기 동안 면역 조절제(면역증진 또는 억제)로 사용되어 온 식이 보충제 또는 한방 재료와 같은 천연 화합물에서 그 기능성 소재를 탐색하는 연구가 지속되고 있다.

해양자원은 황산염 다당류, 테르페노이드, 락톤 등 다양한 성분을 함유하고 있으며, 이중 황산염 다당류는 해조류에 특히 다량 함유된 성분으로 항암, 항염, 항응고 등 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다(Echave 등, 2021; Lomartire와 Goncalves, 2022). 청각(Codium fragile)은 식용할 수 있는 녹조류로 아시아, 유럽 연안에 널리 분포하고 있으며, 예로부터 야뇨증, 장내세균증 및 부종을 치료하기 위해 사용해 온 해양자원이다(Monmai 등, 2020). 대한민국 일부 지역에서는 김치 양념의 속 재료로 사용하거나 나물로 섭취하고 있다. 방사무늬김(Pyropia yezoensis)은 식용할 수 있는 홍조류로 번식과 성장이 빠르고 양식이 용이하여 대한민국에서 가장 많이 양식되고 있는 종이며 김밥용 김으로 주로 사용되고 있다. 방사무늬김의 항염증 효과는 염증성 사이토카인의 발현을 효과적으로 억제함으로써 근관 위축(myotube atrophy), 패혈성 쇼크(septic shock) 및 간 지방 축적을 개선하는 것으로 보고되어 있다(Lee 등, 2021; Wang 등, 2020; Yanagita 등, 2020). 그러나 이들의 면역 활성에 대해서는 아직 보고된 바가 없으므로, 본 연구에서는 면역 조절제로 이들의 기능을 연구하였다.

비장은 면역 반응을 담당하는 신체 기관으로, 비장세포 활성을 통해 항체 생산을 촉진함으로써 면역세포들의 식세포 활동을 유도한다(Brendolan 등, 2007). 비장세포는 주로 대식세포, 림프구 및 natural killer(NK) 세포로 구성되어 있으며, 특히 대식세포는 선천적 면역 반응에 관여하는 세포로 nitric oxide(NO), inducible nitric oxide synthesis(iNOS), interluekin(IL)-6와 같은 염증성 사이토카인을 분비하여 직접 식세포 작용을 통해 항원을 제거한다(Wu 등, 2022). 분비된 염증성 사이토카인은 NK 세포를 활성화하며, 활성화된 NK 세포는 세포독성 과립을 분비하여 암세포와 항원을 직접 살해하거나 interferon-γ를 분비하여 면역세포를 활성화한다. 또한, 대식세포는 항원을 T 세포에 전달하고 적응 면역을 개시함으로써 선천 면역과 적응 면역을 연결하는 중요한 역할을 하므로 면역 반응에서 대식세포의 역할은 매우 중요하다(Wu 등, 2022). 따라서 마우스 대식세포 RAW 264.7과 cyclophosphamide(CPA)로 면역 억제된 실험동물을 이용하여 청각과 방사무늬김 열수 추출물의 단독 또는 혼합 사용하였을 때의 면역증진 효과를 연구하였다.

청각과 방사무늬김 추출물 제조

청각은 2023년에 전라남도 완도에서 채취한 것을 구매하였으며, 방사무늬김은 2023년에 전라남도 진도에서 채취한 것을 구매하였다. 각 원물은 담수로 가볍게 수세하고 청각은 20배수, 방사무늬김은 32배수의 물을 이용하여 90~95°C에서 4시간 동안 추출하였다. 추출물은 농축 후 분무 건조하여 추출 분말을 수확하였으며, 각 추출 분말은 단독 또는 1:1로 혼합한 뒤 성장 배지에 녹여 실험에 이용하였다. 청각 열수 추출물(aqueous extract of Codium fragile) 또는 방사무늬김 열수 추출물(aqueous extract of Pyropia yezoensis)은 CF 또는 PY로 학명으로만 표기하였고, CF와 PY의 1:1 혼합물은 청각과 방사무늬김 학명으로 하여 CFPY로 표기하였다.

세포배양

마우스 대식세포 RAW264.7은 한국생명공학연구소에서 제공받았다. 배양에는 10% fetal bovine serum(FBS, Atlas Biologicals)과 1% 항생제(Welgene)가 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Welgene)을 이용하였으며, 배양 조건은 5% CO₂, 37°C를 유지하였다.

세포독성 분석

RAW264.7 세포를 12-well plate에 2×10⁵ cells/well로 분주하고 15시간 배양하였다. 이후 CF와 PY를 각각 0.125, 0.25, 0.5 및 1 mg/mL로 처리하였으며, CFPY는 0.075, 0.15 및 0.3 mg/mL로 처리한 뒤 24시간 추가 배양하였다. RAW264.7 세포에 대한 추출물의 독성은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 기법을 이용하여 분석하였다. MTT 용액(5 mg/mL)을 첨가하고 3시간 뒤 생성된 formazan 염을 dimethyl sulfoxide에 녹여낸 뒤 microplate reader(Epoch, BioTek Instruments)를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아무것도 처리되지 않는 대조군의 흡광도를 100%로 설정한 뒤 추출물이 처리된 군의 흡광도를 대조군과 비교하여 백분율(%)로 나타내었다.

질산염(nitric oxide) 생성 분석

RAW264.7 세포를 12-well plate에 2×10⁵ cells/well로 분주하고 15시간 배양한 뒤 lipopolysaccharide(LPS, 1 μg/mL), CF(0.15 mg/mL), PY(0.15 mg/mL)와 CFPY(0.15 및 0.3 mg/mL)를 각각 처리한 후 24시간 동안 반응하였다. 반응 후, 배양 상층액 100 μL와 동량의 Griess 시약과 혼합한 뒤 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 질산염에 대한 표준 곡선은 NaNO₂를 이용하여 나타내었으며, 각 실험군의 흡광도를 대입하여 생성된 질산염을 계산하였다.

염증성 사이토카인 분비능 분석

RAW264.7 세포를 12-well plate에 2×10⁵ cells/well로 분주하고 15시간 배양한 뒤 LPS(1 μg/mL), CF(0.15 mg/mL), PY(0.15 mg/mL)와 CFPY(0.15 mg/mL)를 각각 처리한 후 24시간 동안 반응하였다. 배양액으로 분비되어 축적된 염증성 사이토카인 함량을 분석하기 위해 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)를 이용하여 분석하였다. 마우스 tumor necrosis factor(TNF)-α(MTA00B), IL-1β(MLB00C) 및 IL-6(M6000B) ELISA kit은 R&D Systems에서 구매하였으며 각각의 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다.

단백질 발현 분석

RAW264.7 세포를 12-well plate에 2×10⁵ cells/well로 분주하고 15시간 배양한 뒤 LPS(1 μg/mL), CF(0.15 mg/mL), PY(0.15 mg/mL)와 CFPY(0.15 mg/mL)를 각각 처리한 후 24시간 동안 반응하였다. 총단백질은 protein lysis buffer(iNtRON Biotechnology)를 이용하여 추출하였으며, 핵과 세포질 단백질은 NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction(Thermo Fisher Scientific) 시약을 이용하여 제조사 프로토콜에 따라 추출하였다. 각각의 단백질 정량은 Pierce BCA protein kit(Thermo Fisher Scientific)을 이용하였으며, 표준 곡선은 bovine serum albumin(BSA)을 이용하여 검량하였다. 10 μg 단백질을 취하여 5× sample buffer와 혼합한 뒤 95°C에서 5분간 변성시켰다. 8~12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide 겔을 이용하여 단백질을 크기별로 분리한 후 polyvinylidene difluoride membrane으로 단백질을 이동시켰다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 5% BSA에서 20분간 반응한 뒤, 1차 항체 희석액에서 15시간 반응하였다. 0.1% tween-20이 함유된 tris-buffered saline(TBST)을 이용하여 membrane을 5분씩 3회 세척한 후 chemiluminescence kit(Milipore)을 이용하여 단백질 발광을 유도한 후 MicroChemi 4.2 imager(DNR Bioimaging System)를 이용하여 가시화하였다.

실험동물

6주령 수컷 마우스(C57BL/6) 35마리는 다물사이언스에서 구매하였으며, 실험동물 사육, 실험 방법, 희생 조건과 방법은 National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals를 준수하였다. 본 동물실험은 조선대학교 동물실험윤리위원회의 심의를 거쳐 승인받았다(CIACUC2022-A0003). 실험동물은 무작위로 5마리씩 7개 군으로 나누었으며, 나뉜 그룹은 다음과 같다. 그룹 1: Control, 그룹 2: CPA+Normal saline, 그룹 3~5: CPA+MIX 25, 50, 100 mg/kg, 그룹 6, 7: CPA+β-glucan 10, 25 mg/kg. 면역 억제를 위해 CPA를 경구투여 3일 전에 150 mg/kg으로 복강투여하고 경구투여 1일 전에 110 mg/kg으로 총 2회 투여하였다. 마지막 CPA 투여 후 2주간 매일 같은 시간에 경구투여하였으며 2주 후 실험동물을 희생한 후 비장조직과 혈액을 채취한 뒤 실험을 종료하였다.

비장세포 증식능 분석

채취한 비장조직을 주사기 plunger를 이용하여 으깬 후 RBC lysis buffer(Invitrogen)를 이용하여 적혈구를 제거하였다. 이후 cell strainer(0.45 μm)를 이용하여 여과한 뒤 원심 분리하여 비장세포를 얻었다. 분리한 비장세포는 12-well plate에 1×10⁶ cells/well로 분주하고 Con A(1 μg/mL)와 LPS(0.2 μg/mL)를 처리한 뒤 48시간 배양하였다. 48시간 뒤 MTT 기법을 이용하여 분석하였으며, 흡광도는 590 nm에서 측정하였다.

NK 활성 분석

비장세포의 NK 활성을 분석하기 위해 분리한 비장세포와 YAC-1 세포를 1:10 비율로 혼합하고 48시간 배양 후 MTT 기법을 이용하여 NK 활성을 분석하였다. 혈액에서의 NK 활성은 NK activity kit(ATGBF001, 셀투바이오)을 이용하여 분석하였으며 분석 방법은 제조사의 프로토콜대로 수행하였다.

통계적 유의성

모든 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, Graph Pad Prism 5.0 software(GraphPad Software Inc.)를 이용하여 Dunnett test 및 one-way analysis of variance(ANOVA)를 통해 유의성 검증을 하였다. 통계적 유의성은 P-value가 0.05 미만일 경우에 유의한 것으로 간주하였으며, P<0.05, P<0.01, P<0.001로 표기하였다.

CF, PY 및 CFPY가 RAW264.7 세포의 세포 생존율에 미치는 영향

CF, PY 및 CFPY 제조 방법은 도식화하여 나타내었다(Fig. 1A). CF와 PY 그리고 이 두 추출물을 1:1로 혼합한 CFPY가 세포독성을 유발하는지 MTT 기법을 이용하여 분석한 결과, CF와 PY는 1 mg/mL까지 독성을 나타내지 않았으며, CFPY는 0.3 mg/mL까지 독성을 나타내지 않았다(Fig. 1B~D).

Fig 1. Effects of extracts on RAW264.7 cells viability. (A) Extract manufacturing process. The cells were treated with CF (B), PY (C), and CF+PY mixture (D) for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. The data were presented as the mean±standard deviation of three independent experiments (n=3 or more in each group). CF, Codium fragile; PY, Porphyra yezoensis; CFPY, C. fragile＋P. yezoensis.

CFPY가 RAW264.7 세포에서 면역 인자의 발현에 미치는 영향

면역 인자 중 NO, TNF-α, IL-1β 및 IL-6는 대식세포, 암세포 등 다양한 세포에서 면역증진, 항염증, 항암과 같은 생리활성에 직접적으로 관여하는 대표적인 물질이다(Smyth 등, 2004). 그러나 이들은 환경에 따라 다른 발현 양상을 나타내는 물질로, 염증 완화를 위해서는 이들의 발현이 감소해야 하고 면역력을 높이기 위해서는 이들의 발현이 증가해야 한다(Sahebnasagh 등, 2022; Smyth 등, 2004). 종양발생에서 NO-based 치료는 효과적인 전략 또는 종양발생 가속화로 ‘양날의 검’으로 표현되어 있다(Sahebnasagh 등, 2022). 따라서 본 연구에서는 정상적인 조건과 염증 조건에서 CFPY가 NO의 발현을 적절하게 조절하는지 분석하였다. 그 결과, 정상적인 조건에서 CFPY는 NO의 발현을 농도 의존적으로 증가시켰으며 염증 조건에서 CFPY는 NO 발현을 유의적으로 억제하였다(Fig. 2A, 2B). 이는 CFPY가 환경에 따라 NO 발현을 적절하게 조절할 수 있음을 시사한다. 염증 유도 인자들의 과발현은 염증으로 인한 질환 발병의 원인이 되기도 하며, 과도한 항염증 반응은 면역 체계를 망가뜨린다. 특히나 항암 치료에서 면역증진은 항암 치료 효과를 높이는 매우 중요한 요소 중 하나이다. 항암 치료로 인해 면역력이 저하된 환자에게 사이토카인의 국소 투여는 항종양 반응 활성화에 도움을 주는 것으로 나타났다(Pan 등, 2024; Smyth 등, 2004). 따라서 이들의 발현을 효과적으로 조절하는 CFPY는 질병 예방을 위한 기능 소재로써 개발 가치가 높음을 보여준다. 또 괄목할 결과로는, CF와 PY의 단독 처리 농도에서 나타나지 않았던 효과가 같은 농도의 CFPY에서 유의적인 효과가 나타났으며, CF(3.14±0.27 μM)와 PY(3.66±0.27 μM)의 단독 처리 효과를 합한 것보다 CFPY(21.91±0.46 μM)에서 더 높은 활성이 유도되었다(Fig. 2A). 또한, 배양액으로 분비된 TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현을 분석한 결과에서도 NO 결과와 유사한 결과를 확인하였으며, 모두 단독 처리보다 CFPY에서 그 발현이 유의적으로 증가하였다(Fig. 2C~E). 위의 결과는 이들의 단백질 발현을 분석한 결과와 일치하였으며, 단독 처리에 비해 CFPY에서 확연히 단백질 발현이 증가하였다(Fig. 2F). 이러한 결과는 CFPY가 NO, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 발현 증가를 통해 면역증진 효과가 있으며 단독 사용보다 복합으로 사용하였을 때 소량으로 유의미한 효과를 기대할 수 있음을 시사한다. 약물의 상승효과는 주로 종양학에서 사용되는 치료 전략으로, 두 가지 이상의 항암제를 동시에 또는 순차적으로 사용하여 효과를 높이거나 약물 내성을 최소화하기 위한 전략으로 사용된다(Torricelli 등, 2011). 약물의 상승효과를 예측하는 알고리즘, 배합표 등 다양한 연구가 보고되어 있으나, 실제 상승효과를 나타내는 약물은 소수로 약물은 복합으로 사용하면 오히려 서로 상쇄하는 효과가 더 크다. 우리는 이전 연구에서 해조류의 몇 가지 추출물을 혼합 처리해 봤으나 CFPY처럼 소량으로 유의미한 효과를 나타내는 추출물은 없었다. 따라서 면역증진에서 이 둘의 시너지 효과의 발견은 큰 성과라고 사료된다.

Fig 2. Effects of extracts on nitric oxide, iNOS, TNF-α, IL-1β, and IL-6 in RAW264.7 cells. The cells were treated with LPS (0.2 μg/mL) and extracts (CF, PY, and CFPY) for 24 h. Nitric oxide (A), TNF-α (C), IL-1β (D), and IL-6 (E) accumulated in the culture medium was measured by Griess reagent and ELISA assay. (B) For anti-inflammatory evaluation, the cells were treated with LPS 1 h after extract treatment and nitric oxide analyzed by Griess reagent after 24 h. (F) Protein expression of iNOS, TNF-α, IL-1β, and IL-6 was determined by Western blot analysis. The data were presented as the mean±standard deviation of three independent experiments (n=3 or more in each group). ^***P<0.001 vs. Control group, ^##P<0.01 and ^###P<0.001 vs. LPS group. CF, Codium fragile; PY, Porphyra yezoensis; CFPY, C. fragile＋P. yezoensis; LPS, lipopolyssaccharide.

CFPY가 RAW264.7 세포에서 MAPK와 NF-κB 신호전달 경로에 미치는 영향

MAPK와 NF-κB는 분화, 사멸, 재생 등 다양한 세포 생리에 매우 깊이 관여하고 있는 신호전달 경로이며, 면역, 항염증, 항산화와 같은 생리활성도 매개하는 것으로 알려져 있다(Liu 등, 2007; Sun, 2017). 진행 생물에서 MAPK는 JNK, ERK 및 p38로 구성되며, 핵으로 세포외 자극을 전달한다(Jung 등, 2023). NF-κB는 정상 조건일 때 세포질에 존재하며 IκB-α와 결합하여 불활성화되어 있으나, 외부 자극에 오면 IκB-α는 인산화되어 분해되고 p65는 핵 내로 이동하여 iNOS, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 전사를 조절하여 생성을 유도한다(Sun, 2017). MAPK와 NF-κB는 서로 협력하는 메커니즘으로 ERK와 p38의 인산화 억제는 p65의 전사활성에 영향을 주며 면역 반응을 조절한다(Liu 등, 2007). 따라서 CFPY의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 발현 유도를 통한 면역증진 기전을 분석하기 위해 MAPK와 NF-κB 신호전달에 미치는 영향을 Western blot 기법을 이용하여 평가하였다. 그 결과, CFPY는 JNK, ERK 및 p38의 인산화를 유의적으로 유도하였으며, 총 단백 발현량에는 영향을 미치지 않았다(Fig. 3A). 또한, CFPY는 IκB-α의 인산화를 유도하여 분해하였으며 이에 따라 p65가 핵 내로 이동됨을 확인하였다(Fig. 3B). 이러한 결과는 참당귀 열수 추출물과 효모추출물의 면역증진 기전과 유사한 결과로, 참당귀 열수 추출물과 효모추출물은 ERK 및 p38의 인산화를 유도하였으며 IκB-α의 인산화 및 p65의 핵 내 이동을 유도하였다(Jeong 등, 2023). 접시꽃 추출물은 RAW264.7에서 iNOS, COX-2, IL-6 및 TNF-α의 발현 증가를 통해 면역증진 효과를 확인하였으며, 그 기전으로 MAPK(JNK, ERK, p38)의 인산화 및 p65의 핵 내 이동을 보고하였다(Kim 등, 2017).

Fig 3. Effects of extracts on MAPKs and NF-κB signaling in RAW264.7 cells. The cells were treated with LPS (0.2 μg/mL) and extracts (CF, PY, and CFPY) for 4 h. (A) Left panel: protein expression level of phosphorylation of MAPKs (ERK, JNK, and p38) were determined by Western blot analysis. Right panel: quantitative data of (left panel) were analyzed using ImageJ software. (B) Left panel: protein expression of p65 and IκB-α in the nucleus and cytoplasm was determined by Western blot analysis. Right panel: quantitative data of (left panel) were analyzed using ImageJ software. Each experiment was performed at least three times, with n=3 or more for each group. ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001 vs. Control group. CF, Codium fragile; PY, Porphyra yezoensis; CFPY, C. fragile＋P. yezoensis; AECF, aqueous extract of C. fragile; AEPY, aqueous extract of P. yezoensis.

CFPY의 면역증진에 대한 생체 내(in vivo) 효과

CPA는 DNA 복제와 세포 증식을 억제하므로 항암제로 주로 사용됐으나 면역력 억제 부작용으로 인해 현재는 면역 억제 실험동물 모델 구축을 위해 널리 사용되고 있다(Lee 등, 2019). CPA의 복강투여는 혈류를 따라 전달되며 bone marrow 세포, leukocyte, B 세포 및 T 세포와 같은 면역 관련 세포들의 사멸을 유도하고 IL-1β, IL-6 및 TNF-α와 같은 전 염증성 사이토카인의 분비를 유도함으로써 면역력을 억제한다(Xun 등, 1994; Yoo 등, 2020). 비장은 인체에서 면역을 담당하는 가장 중요한 기관으로 B 세포, T 세포 및 NK 세포와 같은 다양한 면역세포들이 군집해 있다(Brendolan 등, 2007; Wu 등, 2022). 외부 항원이 침입하여 면역 반응이 유도되면 면역세포의 증식이 유도되어 비장의 크기가 커지게 되므로 비장의 크기와 무게는 면역력을 평가하는 중요한 지표이다(Park과 Lee, 2018; Sty와 Conway, 1985). 본 연구에서 생체 내에서도 CFPY가 면역증진 효과가 있는지 평가하기 위해 마우스에 CPA 복강 투여하여 면역력을 억제한 후 2주간 매일 경구투여하여 비장의 크기, 무게를 측정하였으며, 비장세포를 분리하여 증식능과 NK 활성을 분석하였다. 경구투여 2주 후 실험동물을 희생하고 비장조직과 혈액을 채취하였으며, 채취한 비장은 바로 무게와 크기를 측정하였다. 실험동물의 몸무게는 군 간 유의적인 차이는 없었으나, 대조군(0.09±0.002 g)과 비교하여 CPA 투여군(0.071±0.003 g)에서 비장의 크기와 무게가 확연히 작아짐을 확인하였다(Fig. 4).

Fig 4. Effects of extracts on spleen in CPA-treated mice. CPA was administered via i.p. at 150 mg/kg 3 days before extract administration, and 110 mg/kg 1 day before extract administration. The extract was orally administered daily to CPA-immunosuppressed mice for 2 weeks. After 2 weeks, the body weight of the mice and the weight and size of the spleen tissue were measured and analyzed by substituting them into the spleen index calculation formula; Spleen index (mg/g)＝(spleen weight/mice body weight)×10. (A) Spleen. (B) Spleen index. Each experiment was performed two times, with n=3 or more for each group. ^*P<0.05 vs. CPA-treated group. CPA, cyclophosphamide; CFPY, Codium fragile＋Porphyra yezoensis.

그러나 CFPY 투여군(25 mg/kg, 0.082±0.005; 50 mg/kg, 0.082±0.004 g; 100 mg/kg, 0.084±0.005 g)에서는 비장의 크기가 대조군과 유사하게 회복되는 것을 확인하였다(Fig. 4A). 몸무게, 비장의 크기와 무게를 계산한 spleen index에서는 50 mg/kg부터 유의적인 효과가 나타났으며, 100 mg/kg에서는 베타글루칸(25 mg/kg)의 면역증진 효능과 유사한 효과가 나타났다(Fig. 4B). 이러한 비장의 크기 증가가 비장세포 증식과 관련이 있는지 분석하였으며, B 세포와 T 세포의 증식을 유도하는 mitogen으로써 LPS와 Con A를 사용하였다. Con A는 세포 표면의 당단백질과 비공유결합을 하는 콩과 렉틴으로 림프구와 결합하면 칼슘 유입 속도를 증가시켜 DNA 합성 촉진을 통해 세포 증식을 유도한다(Kim 등, 2024). LPS는 그람 음성 박테리아 외벽의 주요 구성성분으로 lymphocyte의 증식과 분화를 유도하고 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 발현을 유도하는 강력한 면역 활성 유도제이다(Andersson 등, 1979; Bohacova 등, 2021). 비장조직에서 비장세포를 분리한 후 mitogen을 처리하여 이틀간 배양한 결과, 대조군과 비교하여 CPA 투여군에서는 비장세포의 증식이 약 50% 억제되어 있으나, CFPY 투여군에서는 비장세포 증식이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(Fig. 5A, 5B). Mitogen이 없는 배양에서도 mitogen이 있는 배양과 유사한 결과를 나타냈으며, CFPY 투여군에서 비장세포의 증식이 확연히 증가하였다(Fig. 5C). 이러한 결과는 와송 추출물의 비장세포 증식을 통한 면역증진 효능과 유사한 결과로, CPA는 비장세포 증식을 억제하였으나 와송 추출물은 lymphocytes, granulocytes, monocytes의 증식을 유의적으로 증가시켰다(Lee 등, 2019). 상황버섯 에탄올 추출물은 CPA에 의해 억제된 IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-12의 발현을 증가시켰으며, 비장세포와 bone marrow 세포의 증식을 유도하고 NK 활성을 증가시킴으로써 면역증진 효능을 보고하였다(Yoo 등, 2020). NK 세포는 IFN-γ를 분비하여 종양세포 또는 바이러스 감염 세포 등을 직접 죽이는 세포로, NK 세포 활성을 측정하여 면역기능 상태를 평가할 수 있다(Hong 등, 2019). 본 연구에서 NK 세포 활성을 분석하기 위해 비장세포를 암세포와 일정한 비율로 혼합 배양한 후 MTT 분석을 하거나 채혈을 통해 얻은 전혈에 activator를 첨가 및 배양하여 NK 세포를 활성화해 분석하였다. 비장세포와 전혈에서 분석한 결과 모두에서 CPA에 의해 감소한 NK 세포 활성이 CFPY 투여군에서 유의적으로 증가함을 확인하였다(Fig. 6).

Fig 5. Effects of extracts on splenocytes proliferation in CPA-treated mice. CPA was administered via i.p. at 150 mg/kg 3 days before extract administration, and 110 mg/kg 1 day before extract administration. The extract was orally administered daily to CPA-immunosuppressed mice for 2 weeks. After 2 weeks, isolated splenocytes were cultured for 2 days in the presence and absence of mitogen (Con A and LPS). Splenoocytes viability was measured by MTT assay. Proliferation index of splenocytes in presence of LPS (A) and Con A (B) and the absence of mitogen (C). Each experiment was performed two times, with n=3 or more for each group. ^*P<0.05 and ^**P<0.01 vs. ＋CPA-treated group. CPA, cyclophosphamide; CFPY, Codium fragile＋Porphyra yezoensis.

Fig 6. Effects of extracts on NK activity in CPA-treated mice. CPA was administered via i.p. at 150 mg/kg 3 days before extract administration, and 110 mg/kg 1 day before extract administration. The extract was orally administered daily to CPA-immunosuppressed mice for 2 weeks. After 2 weeks, splenocytes was isolated. (A) Splenocytes were co-cultured with YAC cells at a ratio of 1:10, and then NK activity was analyzed using MTT assay. (B) NK activity in blood was analyzed using the NK activity kit. Each experiment was performed two times, with n=3 or more for each group. ^*P<0.05 and ^**P<0.01 vs. CPA-treated group. CPA, cyclophosphamide; CFPY, Codium fragile＋Porphyra yezoensis.

본 연구는 청각 추출물과 방사무늬김 추출물의 각각 낮은 농도에서 면역증진 효과가 전혀 없었으나 같은 농도의 복합물에서는 면역증진 효과가 있음을 분석한 것으로, 청각과 방사무늬김 추출복합물의 면역증진에 대한 시너지 효과를 분석하였다. 우리의 자체 연구에서 청각 열수 추출물과 방사무늬김 열수 추출물에 만노스(mannose), 아라비노스(arabinose) 등과 같은 단당류가 다량 함유되어 있으며 이 외에도 brassicasterol과 lutein 등이 다량 함유되어 있음을 확인하였다. 그러나 어떤 성분 간의 활성을 통해 복합추출물의 시너지 효과가 나타나는지는 추가 연구가 필요하다. 이 복합추출물(CFPY)은 마우스 대식세포에서 면역 인자들의 발현을 유의적으로 증가시켰으며 비장세포 증식 및 NK 세포 활성을 증가시켰다. 본 연구 결과를 통해 면역증진 기능성에 대한 건강기능식품으로써 개발 가능성을 기대할 수 있다. 추출물 간의 시너지 효과의 발견은 매우 이례적이며 혁신적이지만 그 기전에 대해서는 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.

본 연구에서는 CFPY의 면역증진 효능을 분석하였다. CF와 PY의 단독 처리는 대식세포의 사이토카인 분비에 영향을 미치지 못하였으나, 같은 농도에서 CFPY는 iNOS, TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현이 유의적으로 증가하였으며, 이러한 효과는 MAPK와 NF-κB 신호전달을 통해 매개되는 것을 확인하였다. CPA를 통해 면역력이 억제된 실험동물에 CFPY를 2주간 경구투여한 결과 비장의 크기와 무게가 정상군과 유사하게 회복되었으며, 비장조직에서 분리한 비장세포의 증식을 확인한 결과 mitogen(LPS 및 Con A)이 있는 조건과 없는 조건 모두에서 유의적으로 증식을 증가시켰다. 또한, NK 세포 활성을 분석한 결과 비장세포와 전혈 모두에서 NK 세포 활성이 증가하였다. 이러한 결과는 CF와 PY의 단독 처리보다 CFPY 형태일 때 소량의 농도로 충분한 효과를 나타낼 수 있음을 시사하며 면역증진 기능성 식품 소재로써 가능성을 제공한다. 그러나 두 추출물 간의 시너지 기전에 대한 추가 연구가 수행된다면, CFPY의 면역증진 효능 기전을 더 잘 이해할 수 있을 것으로 사료된다.

이 논문은 2021년도 해양수산부 재원으로 해양수산과학기술진흥원의 지원을 받아 수행된 연구임(20210656, 빅데이터 기반 해양 바이러스 제어 및 마린바이오틱스 개발 사업).