Ex) Article Title, Author, Keywords
Online ISSN 2288-5978
Ex) Article Title, Author, Keywords
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2025; 54(1): 34-41
Published online January 31, 2025 https://doi.org/10.3746/jkfn.2025.54.1.34
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
Yujeong Kim , Wonhee Kim, Tae Ji Yun, Jae Jung Lee, Taewan Kim, and Jun Ho Kim
Department of Food Science and Biotechnology, Andong National University
Correspondence to:Jun Ho Kim, Department of Food Science and Biotechnology, Andong National University, 1375, Gyeongdong-ro, Andong-si, Gyeongbuk 36729, Korea, E-mail: jhkim@anu.ac.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
With growing scientific interest in the pharmacological effects of cannabidiol (CBD), several studies have focused on the high-purity extraction of CBD from the inflorescence and leaf of hemp (Cannabis sativa). However, other parts of hemp such as the root and stem have been reported to contain bioactive non-cannabinoid phytochemicals. In the present study, we evaluated the effects of hemp root ethanolic extracts (HRE) on α-glucosidase inhibition and glucose uptake regulation in C2C12 myotubes and normal ICR mice. HRE exhibited an inhibitory effect on α-glucosidase activity, and the effect was comparable to that of acarbose. The HRE treatment increased glucose uptake into C2C12 myotubes and phosphorylation of phosphoinositide-3-kinase and AMP-activated protein kinase (AMPK). Moreover, HRE decreased glucose absorption after administration of starch with reduced activity of α-glucosidase in the small intestines of ICR mice. Western blot analysis of the skeletal muscle demonstrated that HRE increased the phosphorylation of protein kinase B and AMPK. These findings indicate that HRE could suppress the rise in blood glucose by inhibiting α-glucosidase enzyme activity in the small intestine and promoting glucose uptake into the muscle cells.
Keywords: hemp root, α-glucosidase, glucose uptake, C2C12 myotubes, skeletal muscle
전 세계적으로 당뇨병 환자의 유병률과 사망률의 지속적인 증가와 함께 혈당 조절 기능성 원료 탐색에 관한 연구가 광범위하게 진행되고 있다. 정상 상태에서 혈당 저하 기능성 평가를 위한 연구는 크게 탄수화물의 소화와 관련된 체내 효소 활성을 억제하거나 혈액 내 포도당의 세포 내 흡수를 촉진하는 활성을 분석하는 방법으로 진행되어 왔다(Matsui 등, 1996; Ryder 등, 2001). 탄수화물의 소화・흡수율은 식후 혈당 수준에 큰 영향을 주며, 따라서 α-glucosidase 및 α-amylase와 같은 탄수화물 분해효소의 활성을 억제하는 것이 혈당 저하에 상당히 기여할 수 있음이 보고되어 왔다(Casirola와 Ferraris, 2006; Kumar 등, 2011). 또한 식후 혈중 포도당 농도의 증가는 췌장에서 인슐린 분비를 유도하며 인슐린은 근육 및 지방 등 여러 조직으로 포도당 유입을 촉진한다. 골격근은 식후 포도당 흡수의 약 80%를 차지하는 포도당 대사의 주요 조직이다(Merz와 Thurmond, 2020). 인슐린은 대표적으로 근육세포 내에서 PI3K/Akt 신호전달경로의 활성화를 통해 glucose transporter 4(GLUT4)의 세포막 이동을 촉진시켜 포도당의 세포 내 유입을 유도하는 것으로 알려져 있다(Schultze 등, 2012). 또한 근육세포에서 AMPK의 활성화는 PGC-1α의 인산화를 통해 포도당 유입, 지방산화 및 미토콘드리아 생합성에 중요한 작용을 하는 것으로 보고된 바 있다(Jager 등, 2007).
2형 당뇨의 개선 및 치료 목적으로 현재까지 metformin, sulfonylurea, meglitinides, thiazolidinediones 및 α-glucosidase 저해제(acarbose, miglitol, voglibose)와 같은 의약품들이 널리 사용되고 있으며, 이들의 작용 기작은 탄수화물 소화・흡수 저해, glucagon-like peptide 1 호르몬 분비 증가, 인슐린 감수성 개선, 간 내 포도당 신생합성 억제 및 식욕 억제 등 다양하게 나타나는 것으로 보고된다(Rehani 등, 2019). 하지만 다수의 연구에서 보고된 바에 따르면 이러한 의약품들의 사용은 구토, 복부팽만, 설사, 두통 및 간 기능 손상 등의 부작용을 초래할 수 있다고 알려져 있다(Agrawal 등, 2022; Levetan, 2007; Rehani 등, 2019). 따라서 이러한 부작용에 대한 위험을 감소시키고 우수한 혈당 저하 효과를 나타내는 천연물 유래 기능성 소재 개발에 관한 관심이 지속적으로 증가하고 있다.
고대로부터 민간요법 및 섬유 원료로 사용되어 온 대마(
본 실험에서 사용된 대마 뿌리는 경상북도 안동시에서 2023년 7월에 수확한 것을 사용하였다. 분리된 뿌리를 세척, 건조 및 분말화한 후 시료 100 g에 중량 대비 10배수의 70% 에탄올을 가하고 24°C에서 180 rpm으로 교반하며 3시간 추출하였다. 이후 추출물을 여과한 후 회전식 감압농축기(Vaccum pump V-100, BUCHI)를 사용해 감압 농축하고 동결 건조하였다. 준비된 시료는 사용 전까지 4°C에서 보관하였다.
추출물 시료의 α-glucosidase 억제 활성 평가는 Watanabe(1997)의 방법에 준해 α-glucosidase(Sigma-Aldrich) 효소 및 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(Sigma-Aldrich) 기질을 사용하여 분석하였다. 37°C에서 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 6.9)에 효소와 기질을 희석하여 준비해 두었다. 시료 50 μL와 효소(1 U/mL) 50 μL에 buffer 90 μL를 첨가하고, 혼합물을 37°C에서 20분 동안 사전 배양하였다. 이후 buffer에 희석해 두었던 기질(5 mM) 100 μL를 첨가하고 37°C에서 30분간 배양하였다. 1 M Na2CO3 500 μL를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 microplate reader(infinite M nano, TECAN)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 acarbose(Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 효소 활성 저해율은 다음과 같이 계산하였다.
저해율(%)=[(대조군 흡광도-시료 첨가군 흡광도)/시료 첨가군 흡광도]×100
C2C12 myoblast 세포배양을 위해 90% Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM), 10% fetal bovine serum(FBS), 1% antibiotic-antimycotic을 포함하는 성장 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 방지하기 위해 60~70%의 세포 밀도를 유지하며 48시간마다 계대배양을 실시하여 적정 수를 유지하였다. C2C12 myoblast를 myotube로 분화시키기 위하여 90% DMEM, 2% horse serum, 1% antibiotic-antimycotic을 포함하는 분화 배지를 사용하여 48시간마다 배지를 교환하며 6일 동안 분화시킨 후 실험에 사용하였다.
포도당 흡수 조절에 대한 평가를 위해 마우스 근아세포인 C2C12 세포주를 이용하였으며, 세포에 대한 시료의 독성 평가는 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 세포를 1.0×105 cells/well 수준으로 seeding하고 추출물 시료를 다양한 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline)에 녹인 1.0 mg/mL MTT를 20 μL씩 각 well에 처리한 후 1시간 동안 같은 조건에서 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 후 dimethyl sulfoxide 100 μL를 첨가하고 microplate reader(infinite M Nano)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군에 대한 백분율(% of control)로 나타내었다.
Glucose uptake 측정은 세포 내로 유입되는 glucose 탐색에 민감한 probe로서 fluorescent 2-[N-(7-nitrobenz- 2-oxa 1,3-diazol-4yl) amino]-2-deoxy(2-NBDG; Invitrogen)를 이용하여 측정하였다. C2C12 myoblast 세포의 농도를 3.0×105 cells/mL로 계수하여 6-well plate에 분주하여 분화시켰다. 이때 각 well 바닥에 Type B gelatin으로 코팅한 slide glass(Microscope cover glasses, Paul Marienfeld)를 붙여 그 위에 세포가 부착되도록 하였다. 6일간 분화가 완료된 세포는 glucose free DMEM 배지에서 0.5 μM insulin 또는 농도별 추출물 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 200 μM 2-NBDG를 첨가하여 12시간 동안 uptake를 유도한 다음 PBS로 3회 세척 후 완벽히 제거하고 10% formaldehyde를 이용하여 세포를 고정하였다. 세포 내 흡수된 2-NBDG는 형광 현미경(DM2500, Leica)을 이용해 촬영하였으며, ImageJ software(National Institute of Health, version 1.52a)를 이용해 정량화하였다.
실험동물은 7주령 ICR 수컷 마우스를 (주)샘타코 BIO KOREA에서 구입하여 사용하였다. 모든 실험동물은 음용수와 일반 식이를 자유롭게 섭취하였으며 항온(23±2°C), 항습(50±5%) 및 12시간 명암 주기가 유지되는 환경에서 사육되었다. 실험동물은 1주일의 적응 기간 후 3개의 투여군으로 무작위로 분류되었다. 대마 뿌리 에탄올 추출물은 투여군별로 150, 300 mg/kg 용량으로 실험 기간 25일 동안 경구투여하였다. 추출물 시료는 2% tween-80, 0.5% methylcellulose(Sigma-Aldrich)를 포함한 saline 용액에 용해하여 투여하였으며, 대조군은 동일한 양의 용매만 투여하였다. 실험 종료 시점에서 소장 내 효소 활성 분석을 위해 16시간 절식시킨 후 추출물 시료를 경구투여하고 30분 후 avertin(2,2,2-tribromoethanol)(Sigma-Aldrich) 투여에 의한 마취 후 심장 채혈 방법으로 혈액을 수집하였다. 모든 동물실험 절차는 안동대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 진행되었다(승인번호 2023-3-0607-03-01).
경구투여 시작 15일이 되는 시점에 실험동물을 16시간 절식시킨 후 유화 saline(대조군) 및 대마 뿌리 에탄올 추출물을 경구투여하였다. 경구투여 30분 후 포도당(glucose)을 멸균 증류수에 녹여 2 g/kg의 용량으로 경구투여하고 0, 15, 30, 60, 90, 120분 간격으로 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 혈당측정기(Accu-check, Roche)를 이용해 혈당 변화를 모니터링하였다. 자당(sucrose) 및 전분(starch) 용액을 이용한 당부하 검사 역시 동일한 방법으로 이틀 간격으로 수행되었다.
동물실험 종료 시점에서 소장을 절제하고 PBS로 세척 및 내부 점막을 수집하여 bead beater(Precellys 24 tissue homogenizer, Bertin Technologies)를 이용해 차가운 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 균질화하였다. 이후 37°C에서 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 6.9)에 균질액을 희석하여 준비한 후 α-glucosidase 억제 활성 평가와 동일한 방법으로 분석을 진행하였다.
C2C12 myotube 세포 및 마우스 골격근 조직을 radio-immunoprecipitation assay(RIPA) buffer(Thermo Fisher Scientific), protease and phosphatase inhibitor cocktail(Thermo Fisher Scientific) 및 50 mM phenylmethylsulfonyl fluoride를 혼합하여 제조한 lysis buffer와 함께 균질화시킨 후 4°C에서 1시간 incubation을 실시하고 3,000×
모든 실험 결과는 평균(mean)±표준오차(standard error)로 표시하였고, 실험군 간의 통계적 유의성은 R program을 이용하여 one-way ANOVA 분석 후 Duncan’s multiple range test 방법으로 사후 검정하여
α-Glucosidase는 α-amylase에 의해 분해된 당질을 최종적으로 단당류로 전환하며, 이러한 효소의 활성을 저해하는 것은 당질 가수분해와 흡수를 지연시켜 식후 급격한 혈당 상승 억제에 기여하는 것으로 확인되었다(Kashtoh와 Baek, 2022). 본 연구에서는 우선 대마 뿌리 추출물의 α-glucosidase 저해 활성을 평가하였으며 positive control로 acarbose를 사용하였다. Acarbose는 α-glucosidase 억제제로 널리 사용되고 있으며, 장 내강에서의 포도당 흡수 또한 저해하는 것으로 알려져 있다(Rosak과 Mertes, 2012). 실험 결과, α-glucosidase 효소 활성에 대한 대마 뿌리 에탄올 추출물의 농도 의존적 억제 작용이 확인되었으며, 이러한 효과는 처리된 acarbose 농도 대비 유사한 수준의 효과로 확인되었다(Fig. 1). 이러한 결과는 대마 뿌리 에탄올 추출물이 α-glucosidase 활성을 효과적으로 억제함으로써 혈액 내 포도당 흡수를 지연시킬 수 있음을 시사한다. 또한 이전 연구에서 대마 씨앗 추출물과 꽃과 잎의 복합 추출물에서도 α-glucosidase 억제 활성이 보고된 바 있다(Haddou 등, 2024; Suttithumsatid 등, 2022).
C2C12 myoblast에 대한 대마 뿌리 에탄올 추출물의 세포 독성 평가에서 처리 농도가 50 μg/mL 이상일 때 대조군 대비 유의적으로 세포 생존율이 감소하였으며(Fig. 2A), 따라서 본 실험에서는 10~25 μg/mL 농도 범위에서 시료를 처리하였다.
세포 내 glucose uptake는 분화 6일 차의 myotube 상태에서 2-NBDG 형광표지인자를 사용하여 측정하였다. 세포 형광 촬영 이미지와 정량 결과에서 확인된 것처럼 positive control로 사용된 인슐린은 세포 내 포도당 흡수를 유의적으로 증가시켰으며, 대마 뿌리 에탄올 추출물 처리군에서도 농도 의존적으로 포도당 흡수가 증가함이 확인되었다(Fig. 2B). 또한 HepG2 간암 세포주를 이용한 실험에서도 유사하게 대마 뿌리와 줄기 추출물이 포도당 흡수를 개선함이 보고된 바 있다(Jin 등, 2023).
근육세포에서 glucose uptake는 크게 두 가지 세포 내 신호전달경로에 의해 주로 조절되는 것으로 알려져 있다. 첫째는 인슐린 수용체를 시작으로 PI3K-Akt 인산화를 통해 GLUT4의 세포막 이동을 유도하는 경로이며, 둘째는 인슐린 작용과 독립적으로 AMPK 인산화를 통해 p38 MAPK 및 AS160을 매개로 GLUT4의 유전자 발현과 세포막 이동을 촉진하는 경로이다(Ke 등, 2018; Schultze 등, 2012). 본 연구에서는 이러한 세포 내 신호전달 과정의 변화를 확인하고자 주요 조절 단백질들의 인산화 수준을 분석하였다(Fig. 2C). 기존에 알려진 바와 같이 근육세포에서 인슐린 처리는 PI3K와 Akt의 인산화 수준을 증가시켰으나(Ryder 등, 2001; Schultze 등, 2012), AMPK와 p38의 활성화에는 변화가 없었다. 한편, 대마 뿌리 에탄올 추출물은 PI3K와 함께 AMPK 활성화를 농도 의존적으로 유도하는 것으로 나타났으며, Akt와 p38의 인산화 수준도 통계적 유의성은 없었으나 고농도 추출물 처리군에서 증가하는 양상을 보였다. 대마 뿌리 추출물에 의한 Akt 인산화의 증가는 HepG2 세포주를 이용한 이전 연구에서도 확인된 바 있다(Jin 등, 2023). 따라서 이러한 결과는 근육세포에서 대마 뿌리 에탄올 추출물 처리가 PI3K/Akt 신호전달경로 및 AMPK 활성화를 통해 glucose uptake를 촉진할 수 있음을 보여준다. 하지만 본 연구에서는 신호전달 과정의 최종 단계에서 실제로 GLUT4의 세포막 이동이 증가하였는지는 확인하지 못하였으며, 따라서 추후 연구에서 이러한 분석을 통해 추출물의 작용 기전에 대한 보다 세밀한 검증이 필요하다.
또한 근육 내 glucose uptake 신호전달 조절 단백질들의 변화를 확인하고자 동물실험 종료 후 종아리 근육을 수집하여 western blot을 수행하였다. PI3K의 경우 세포실험 결과와는 다르게 추출물 투여군에서 인산화 수준이 다소 감소하는 양상을 보였으나, Akt 인산화는 고농도 추출물 투여군에서 유의미하게 증가하였다(Fig. 5). AMPK 인산화는 세포실험 결과와 동일하게 근육조직에서 추출물 투여에 의한 농도 의존적으로 증가하였다. 따라서 이러한
대마의 대표적인 향정신성 물질로 알려진 tetrahydrocannabinol(THC)은 꽃과 잎 부위에 주로 존재하며 뿌리에는 0.03% 미만으로 함유된 것으로 알려져 있다(Cerino 등, 2021). 대마 각 식물 부위의 2차 대사산물을 분석한 연구에서 THC와 주요 생리활성 물질인 CBD를 포함한 전체 cannabinoids 함량은 0.004% 이하로 확인된 바 있다(Jin 등, 2020). 비록 현재까지 대마의 생리활성 물질로 CBD에 관한 연구가 가장 많이 진행되었으나 뿌리와 같은 대마 부산물 부위에도 CBD를 제외한 다양한 기능성 성분들이 존재하는 것으로 알려져 있다. 이러한 보고에 따르면 특히 대마 뿌리에 sterols(campesterol, stigmasterol, β-sitosterol)와 triterpenoids(β-amyrin, epifriedelanol, friedelin) 함유량이 높으며, 반면 flavonoids 성분은 거의 존재하지 않는 것으로 확인된다(Jin 등, 2020). 또한 본 연구진은 최근 대마 뿌리 추출물의 1형 당뇨 억제 효능을 보고한 바 있으며, 해당 연구에서 GC-MS 분석을 통해 추출물 내 가능한 활성물질로서 vanillin, apocynin, methyl palmitate, syringaldehyde를 제시한 바 있다(Kim 등, 2023). 이러한 물질들은 기존 연구를 통해 α-glucosidase 저해 활성 및 항당뇨, 항산화, 항염증 등 다양한 생리활성 작용을 나타냄이 보고되었다(Ben-Shaul 등, 2001; Bharadwaja 등, 2021; Hamed 등, 2020; Miyazawa 등, 2005; Salau 등, 2021). 향후 대마 뿌리 추출물의 분획별 활성 검증 및 구조분석 등 추가적인 연구를 통해 활성물질 규명에 대한 노력이 수반 될 필요가 있다고 판단된다.
본 연구에서는 대마 뿌리 에탄올 추출물의 포도당 항상성 개선 효능에 대한 평가를 위해 탄수화물 소화・흡수의 핵심 효소인 α-glucosidase에 대한 저해 활성과 근육세포 내 포도당 흡수에 대한 영향을 분석하였다.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2025; 54(1): 34-41
Published online January 31, 2025 https://doi.org/10.3746/jkfn.2025.54.1.34
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
김유정․김원희․윤태지․이재정․김태완․김준호
국립안동대학교 식품생명공학과
Yujeong Kim , Wonhee Kim, Tae Ji Yun, Jae Jung Lee, Taewan Kim, and Jun Ho Kim
Department of Food Science and Biotechnology, Andong National University
Correspondence to:Jun Ho Kim, Department of Food Science and Biotechnology, Andong National University, 1375, Gyeongdong-ro, Andong-si, Gyeongbuk 36729, Korea, E-mail: jhkim@anu.ac.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
With growing scientific interest in the pharmacological effects of cannabidiol (CBD), several studies have focused on the high-purity extraction of CBD from the inflorescence and leaf of hemp (Cannabis sativa). However, other parts of hemp such as the root and stem have been reported to contain bioactive non-cannabinoid phytochemicals. In the present study, we evaluated the effects of hemp root ethanolic extracts (HRE) on α-glucosidase inhibition and glucose uptake regulation in C2C12 myotubes and normal ICR mice. HRE exhibited an inhibitory effect on α-glucosidase activity, and the effect was comparable to that of acarbose. The HRE treatment increased glucose uptake into C2C12 myotubes and phosphorylation of phosphoinositide-3-kinase and AMP-activated protein kinase (AMPK). Moreover, HRE decreased glucose absorption after administration of starch with reduced activity of α-glucosidase in the small intestines of ICR mice. Western blot analysis of the skeletal muscle demonstrated that HRE increased the phosphorylation of protein kinase B and AMPK. These findings indicate that HRE could suppress the rise in blood glucose by inhibiting α-glucosidase enzyme activity in the small intestine and promoting glucose uptake into the muscle cells.
Keywords: hemp root, α-glucosidase, glucose uptake, C2C12 myotubes, skeletal muscle
전 세계적으로 당뇨병 환자의 유병률과 사망률의 지속적인 증가와 함께 혈당 조절 기능성 원료 탐색에 관한 연구가 광범위하게 진행되고 있다. 정상 상태에서 혈당 저하 기능성 평가를 위한 연구는 크게 탄수화물의 소화와 관련된 체내 효소 활성을 억제하거나 혈액 내 포도당의 세포 내 흡수를 촉진하는 활성을 분석하는 방법으로 진행되어 왔다(Matsui 등, 1996; Ryder 등, 2001). 탄수화물의 소화・흡수율은 식후 혈당 수준에 큰 영향을 주며, 따라서 α-glucosidase 및 α-amylase와 같은 탄수화물 분해효소의 활성을 억제하는 것이 혈당 저하에 상당히 기여할 수 있음이 보고되어 왔다(Casirola와 Ferraris, 2006; Kumar 등, 2011). 또한 식후 혈중 포도당 농도의 증가는 췌장에서 인슐린 분비를 유도하며 인슐린은 근육 및 지방 등 여러 조직으로 포도당 유입을 촉진한다. 골격근은 식후 포도당 흡수의 약 80%를 차지하는 포도당 대사의 주요 조직이다(Merz와 Thurmond, 2020). 인슐린은 대표적으로 근육세포 내에서 PI3K/Akt 신호전달경로의 활성화를 통해 glucose transporter 4(GLUT4)의 세포막 이동을 촉진시켜 포도당의 세포 내 유입을 유도하는 것으로 알려져 있다(Schultze 등, 2012). 또한 근육세포에서 AMPK의 활성화는 PGC-1α의 인산화를 통해 포도당 유입, 지방산화 및 미토콘드리아 생합성에 중요한 작용을 하는 것으로 보고된 바 있다(Jager 등, 2007).
2형 당뇨의 개선 및 치료 목적으로 현재까지 metformin, sulfonylurea, meglitinides, thiazolidinediones 및 α-glucosidase 저해제(acarbose, miglitol, voglibose)와 같은 의약품들이 널리 사용되고 있으며, 이들의 작용 기작은 탄수화물 소화・흡수 저해, glucagon-like peptide 1 호르몬 분비 증가, 인슐린 감수성 개선, 간 내 포도당 신생합성 억제 및 식욕 억제 등 다양하게 나타나는 것으로 보고된다(Rehani 등, 2019). 하지만 다수의 연구에서 보고된 바에 따르면 이러한 의약품들의 사용은 구토, 복부팽만, 설사, 두통 및 간 기능 손상 등의 부작용을 초래할 수 있다고 알려져 있다(Agrawal 등, 2022; Levetan, 2007; Rehani 등, 2019). 따라서 이러한 부작용에 대한 위험을 감소시키고 우수한 혈당 저하 효과를 나타내는 천연물 유래 기능성 소재 개발에 관한 관심이 지속적으로 증가하고 있다.
고대로부터 민간요법 및 섬유 원료로 사용되어 온 대마(
본 실험에서 사용된 대마 뿌리는 경상북도 안동시에서 2023년 7월에 수확한 것을 사용하였다. 분리된 뿌리를 세척, 건조 및 분말화한 후 시료 100 g에 중량 대비 10배수의 70% 에탄올을 가하고 24°C에서 180 rpm으로 교반하며 3시간 추출하였다. 이후 추출물을 여과한 후 회전식 감압농축기(Vaccum pump V-100, BUCHI)를 사용해 감압 농축하고 동결 건조하였다. 준비된 시료는 사용 전까지 4°C에서 보관하였다.
추출물 시료의 α-glucosidase 억제 활성 평가는 Watanabe(1997)의 방법에 준해 α-glucosidase(Sigma-Aldrich) 효소 및 p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(Sigma-Aldrich) 기질을 사용하여 분석하였다. 37°C에서 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 6.9)에 효소와 기질을 희석하여 준비해 두었다. 시료 50 μL와 효소(1 U/mL) 50 μL에 buffer 90 μL를 첨가하고, 혼합물을 37°C에서 20분 동안 사전 배양하였다. 이후 buffer에 희석해 두었던 기질(5 mM) 100 μL를 첨가하고 37°C에서 30분간 배양하였다. 1 M Na2CO3 500 μL를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 microplate reader(infinite M nano, TECAN)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 acarbose(Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 효소 활성 저해율은 다음과 같이 계산하였다.
저해율(%)=[(대조군 흡광도-시료 첨가군 흡광도)/시료 첨가군 흡광도]×100
C2C12 myoblast 세포배양을 위해 90% Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM), 10% fetal bovine serum(FBS), 1% antibiotic-antimycotic을 포함하는 성장 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 방지하기 위해 60~70%의 세포 밀도를 유지하며 48시간마다 계대배양을 실시하여 적정 수를 유지하였다. C2C12 myoblast를 myotube로 분화시키기 위하여 90% DMEM, 2% horse serum, 1% antibiotic-antimycotic을 포함하는 분화 배지를 사용하여 48시간마다 배지를 교환하며 6일 동안 분화시킨 후 실험에 사용하였다.
포도당 흡수 조절에 대한 평가를 위해 마우스 근아세포인 C2C12 세포주를 이용하였으며, 세포에 대한 시료의 독성 평가는 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 세포를 1.0×105 cells/well 수준으로 seeding하고 추출물 시료를 다양한 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 DPBS (Dulbecco’s phosphate buffered saline)에 녹인 1.0 mg/mL MTT를 20 μL씩 각 well에 처리한 후 1시간 동안 같은 조건에서 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 후 dimethyl sulfoxide 100 μL를 첨가하고 microplate reader(infinite M Nano)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군에 대한 백분율(% of control)로 나타내었다.
Glucose uptake 측정은 세포 내로 유입되는 glucose 탐색에 민감한 probe로서 fluorescent 2-[N-(7-nitrobenz- 2-oxa 1,3-diazol-4yl) amino]-2-deoxy(2-NBDG; Invitrogen)를 이용하여 측정하였다. C2C12 myoblast 세포의 농도를 3.0×105 cells/mL로 계수하여 6-well plate에 분주하여 분화시켰다. 이때 각 well 바닥에 Type B gelatin으로 코팅한 slide glass(Microscope cover glasses, Paul Marienfeld)를 붙여 그 위에 세포가 부착되도록 하였다. 6일간 분화가 완료된 세포는 glucose free DMEM 배지에서 0.5 μM insulin 또는 농도별 추출물 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 200 μM 2-NBDG를 첨가하여 12시간 동안 uptake를 유도한 다음 PBS로 3회 세척 후 완벽히 제거하고 10% formaldehyde를 이용하여 세포를 고정하였다. 세포 내 흡수된 2-NBDG는 형광 현미경(DM2500, Leica)을 이용해 촬영하였으며, ImageJ software(National Institute of Health, version 1.52a)를 이용해 정량화하였다.
실험동물은 7주령 ICR 수컷 마우스를 (주)샘타코 BIO KOREA에서 구입하여 사용하였다. 모든 실험동물은 음용수와 일반 식이를 자유롭게 섭취하였으며 항온(23±2°C), 항습(50±5%) 및 12시간 명암 주기가 유지되는 환경에서 사육되었다. 실험동물은 1주일의 적응 기간 후 3개의 투여군으로 무작위로 분류되었다. 대마 뿌리 에탄올 추출물은 투여군별로 150, 300 mg/kg 용량으로 실험 기간 25일 동안 경구투여하였다. 추출물 시료는 2% tween-80, 0.5% methylcellulose(Sigma-Aldrich)를 포함한 saline 용액에 용해하여 투여하였으며, 대조군은 동일한 양의 용매만 투여하였다. 실험 종료 시점에서 소장 내 효소 활성 분석을 위해 16시간 절식시킨 후 추출물 시료를 경구투여하고 30분 후 avertin(2,2,2-tribromoethanol)(Sigma-Aldrich) 투여에 의한 마취 후 심장 채혈 방법으로 혈액을 수집하였다. 모든 동물실험 절차는 안동대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 진행되었다(승인번호 2023-3-0607-03-01).
경구투여 시작 15일이 되는 시점에 실험동물을 16시간 절식시킨 후 유화 saline(대조군) 및 대마 뿌리 에탄올 추출물을 경구투여하였다. 경구투여 30분 후 포도당(glucose)을 멸균 증류수에 녹여 2 g/kg의 용량으로 경구투여하고 0, 15, 30, 60, 90, 120분 간격으로 꼬리 정맥으로부터 채혈하여 혈당측정기(Accu-check, Roche)를 이용해 혈당 변화를 모니터링하였다. 자당(sucrose) 및 전분(starch) 용액을 이용한 당부하 검사 역시 동일한 방법으로 이틀 간격으로 수행되었다.
동물실험 종료 시점에서 소장을 절제하고 PBS로 세척 및 내부 점막을 수집하여 bead beater(Precellys 24 tissue homogenizer, Bertin Technologies)를 이용해 차가운 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 균질화하였다. 이후 37°C에서 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 6.9)에 균질액을 희석하여 준비한 후 α-glucosidase 억제 활성 평가와 동일한 방법으로 분석을 진행하였다.
C2C12 myotube 세포 및 마우스 골격근 조직을 radio-immunoprecipitation assay(RIPA) buffer(Thermo Fisher Scientific), protease and phosphatase inhibitor cocktail(Thermo Fisher Scientific) 및 50 mM phenylmethylsulfonyl fluoride를 혼합하여 제조한 lysis buffer와 함께 균질화시킨 후 4°C에서 1시간 incubation을 실시하고 3,000×
모든 실험 결과는 평균(mean)±표준오차(standard error)로 표시하였고, 실험군 간의 통계적 유의성은 R program을 이용하여 one-way ANOVA 분석 후 Duncan’s multiple range test 방법으로 사후 검정하여
α-Glucosidase는 α-amylase에 의해 분해된 당질을 최종적으로 단당류로 전환하며, 이러한 효소의 활성을 저해하는 것은 당질 가수분해와 흡수를 지연시켜 식후 급격한 혈당 상승 억제에 기여하는 것으로 확인되었다(Kashtoh와 Baek, 2022). 본 연구에서는 우선 대마 뿌리 추출물의 α-glucosidase 저해 활성을 평가하였으며 positive control로 acarbose를 사용하였다. Acarbose는 α-glucosidase 억제제로 널리 사용되고 있으며, 장 내강에서의 포도당 흡수 또한 저해하는 것으로 알려져 있다(Rosak과 Mertes, 2012). 실험 결과, α-glucosidase 효소 활성에 대한 대마 뿌리 에탄올 추출물의 농도 의존적 억제 작용이 확인되었으며, 이러한 효과는 처리된 acarbose 농도 대비 유사한 수준의 효과로 확인되었다(Fig. 1). 이러한 결과는 대마 뿌리 에탄올 추출물이 α-glucosidase 활성을 효과적으로 억제함으로써 혈액 내 포도당 흡수를 지연시킬 수 있음을 시사한다. 또한 이전 연구에서 대마 씨앗 추출물과 꽃과 잎의 복합 추출물에서도 α-glucosidase 억제 활성이 보고된 바 있다(Haddou 등, 2024; Suttithumsatid 등, 2022).
C2C12 myoblast에 대한 대마 뿌리 에탄올 추출물의 세포 독성 평가에서 처리 농도가 50 μg/mL 이상일 때 대조군 대비 유의적으로 세포 생존율이 감소하였으며(Fig. 2A), 따라서 본 실험에서는 10~25 μg/mL 농도 범위에서 시료를 처리하였다.
세포 내 glucose uptake는 분화 6일 차의 myotube 상태에서 2-NBDG 형광표지인자를 사용하여 측정하였다. 세포 형광 촬영 이미지와 정량 결과에서 확인된 것처럼 positive control로 사용된 인슐린은 세포 내 포도당 흡수를 유의적으로 증가시켰으며, 대마 뿌리 에탄올 추출물 처리군에서도 농도 의존적으로 포도당 흡수가 증가함이 확인되었다(Fig. 2B). 또한 HepG2 간암 세포주를 이용한 실험에서도 유사하게 대마 뿌리와 줄기 추출물이 포도당 흡수를 개선함이 보고된 바 있다(Jin 등, 2023).
근육세포에서 glucose uptake는 크게 두 가지 세포 내 신호전달경로에 의해 주로 조절되는 것으로 알려져 있다. 첫째는 인슐린 수용체를 시작으로 PI3K-Akt 인산화를 통해 GLUT4의 세포막 이동을 유도하는 경로이며, 둘째는 인슐린 작용과 독립적으로 AMPK 인산화를 통해 p38 MAPK 및 AS160을 매개로 GLUT4의 유전자 발현과 세포막 이동을 촉진하는 경로이다(Ke 등, 2018; Schultze 등, 2012). 본 연구에서는 이러한 세포 내 신호전달 과정의 변화를 확인하고자 주요 조절 단백질들의 인산화 수준을 분석하였다(Fig. 2C). 기존에 알려진 바와 같이 근육세포에서 인슐린 처리는 PI3K와 Akt의 인산화 수준을 증가시켰으나(Ryder 등, 2001; Schultze 등, 2012), AMPK와 p38의 활성화에는 변화가 없었다. 한편, 대마 뿌리 에탄올 추출물은 PI3K와 함께 AMPK 활성화를 농도 의존적으로 유도하는 것으로 나타났으며, Akt와 p38의 인산화 수준도 통계적 유의성은 없었으나 고농도 추출물 처리군에서 증가하는 양상을 보였다. 대마 뿌리 추출물에 의한 Akt 인산화의 증가는 HepG2 세포주를 이용한 이전 연구에서도 확인된 바 있다(Jin 등, 2023). 따라서 이러한 결과는 근육세포에서 대마 뿌리 에탄올 추출물 처리가 PI3K/Akt 신호전달경로 및 AMPK 활성화를 통해 glucose uptake를 촉진할 수 있음을 보여준다. 하지만 본 연구에서는 신호전달 과정의 최종 단계에서 실제로 GLUT4의 세포막 이동이 증가하였는지는 확인하지 못하였으며, 따라서 추후 연구에서 이러한 분석을 통해 추출물의 작용 기전에 대한 보다 세밀한 검증이 필요하다.
또한 근육 내 glucose uptake 신호전달 조절 단백질들의 변화를 확인하고자 동물실험 종료 후 종아리 근육을 수집하여 western blot을 수행하였다. PI3K의 경우 세포실험 결과와는 다르게 추출물 투여군에서 인산화 수준이 다소 감소하는 양상을 보였으나, Akt 인산화는 고농도 추출물 투여군에서 유의미하게 증가하였다(Fig. 5). AMPK 인산화는 세포실험 결과와 동일하게 근육조직에서 추출물 투여에 의한 농도 의존적으로 증가하였다. 따라서 이러한
대마의 대표적인 향정신성 물질로 알려진 tetrahydrocannabinol(THC)은 꽃과 잎 부위에 주로 존재하며 뿌리에는 0.03% 미만으로 함유된 것으로 알려져 있다(Cerino 등, 2021). 대마 각 식물 부위의 2차 대사산물을 분석한 연구에서 THC와 주요 생리활성 물질인 CBD를 포함한 전체 cannabinoids 함량은 0.004% 이하로 확인된 바 있다(Jin 등, 2020). 비록 현재까지 대마의 생리활성 물질로 CBD에 관한 연구가 가장 많이 진행되었으나 뿌리와 같은 대마 부산물 부위에도 CBD를 제외한 다양한 기능성 성분들이 존재하는 것으로 알려져 있다. 이러한 보고에 따르면 특히 대마 뿌리에 sterols(campesterol, stigmasterol, β-sitosterol)와 triterpenoids(β-amyrin, epifriedelanol, friedelin) 함유량이 높으며, 반면 flavonoids 성분은 거의 존재하지 않는 것으로 확인된다(Jin 등, 2020). 또한 본 연구진은 최근 대마 뿌리 추출물의 1형 당뇨 억제 효능을 보고한 바 있으며, 해당 연구에서 GC-MS 분석을 통해 추출물 내 가능한 활성물질로서 vanillin, apocynin, methyl palmitate, syringaldehyde를 제시한 바 있다(Kim 등, 2023). 이러한 물질들은 기존 연구를 통해 α-glucosidase 저해 활성 및 항당뇨, 항산화, 항염증 등 다양한 생리활성 작용을 나타냄이 보고되었다(Ben-Shaul 등, 2001; Bharadwaja 등, 2021; Hamed 등, 2020; Miyazawa 등, 2005; Salau 등, 2021). 향후 대마 뿌리 추출물의 분획별 활성 검증 및 구조분석 등 추가적인 연구를 통해 활성물질 규명에 대한 노력이 수반 될 필요가 있다고 판단된다.
본 연구에서는 대마 뿌리 에탄올 추출물의 포도당 항상성 개선 효능에 대한 평가를 위해 탄수화물 소화・흡수의 핵심 효소인 α-glucosidase에 대한 저해 활성과 근육세포 내 포도당 흡수에 대한 영향을 분석하였다.
본 연구는 안동대학교 기본연구지원사업에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.
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