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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2025; 54(1): 11-21

Published online January 31, 2025 https://doi.org/10.3746/jkfn.2025.54.1.11

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

AdiPhenonTM Improves Lipid Metabolism and Insulin-Stimulated Glucose Uptake in 3T3-L1 Adipocytes

Hyun Woo Jeong , Jaehong Park , HyunJin Nam , Jin-Oh Chung , Byung-Fhy Suh , and Jonghee Sohn

Healthcare Research Division, AMOREPACIFIC Research and Innovation Center

Correspondence to:Hyun Woo Jeong, AMOREPACIFIC R&I Center, 1920 Yonggudaero, Giheung-gu, Yongin-si, Gyeonggi 17074, Korea, E-mail: misterjay@amorepacific.com

Received: October 2, 2024; Revised: November 11, 2024; Accepted: November 12, 2024

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

There has been a steady increase in the prevalence of obesity in the past few decades. Since obesity is a major causal factor for various metabolic diseases including insulin resistance, type 2 diabetes, hyperlipidemia, hypertension, atherosclerosis, hepatic steatosis and their complications, the prevention or treatment of obesity is essential for maintaining a healthy life. Enhancing lipid catabolism can improve obesity and related metabolic disorders. In this study, we demonstrated the efficacy of AdiPhenonTM, a mixture of heat treated green teat extract and enzymatically modified isoquercitrin in preventing triglyceride accumulation in differentiated 3T3-L1 adipocytes. AdiPhenonTM inhibited the mRNA expression of lipogenesis-related genes, whereas it augmented that of the fatty acid oxidation-related genes. AdiPhenonTM also induced mitochondrial biogenesis, indicating that it can promote energy expenditure in adipocytes. The beneficial effects of AdiPhenonTM on lipid metabolism are mediated by the activation of AMP-activated protein kinase (AMPK), a master regulator of catabolic energy metabolism. Interestingly, AdiPhenonTM suppressed the mRNA expression of inflammation-related genes, which is closely related to insulin resistance, in an AMPK independent manner, and ameliorated the inflammation-related impairment of insulin-stimulated glucose uptake. Considering the role and effect of chronic inflammation in the progression of obesity-mediated metabolic syndromes, we propose AdiPhenonTM as a novel material for treating obesity and related metabolic disorders.

Keywords: AdiPhenon, lipid metabolism, mitochondria, inflammation, insulin sensitivity

에너지 소비량에 비해 칼로리 유입량이 많아지면 잉여 에너지는 다양한 형태로 체내에 축적된다. 지방산은 중성지방의 형태로 지방 조직에 저장되며, 포도당은 주로 글리코겐의 형태로 간 및 근육에 저장되거나 지방산 합성을 거쳐 중성지방으로 변환되기도 한다. 비만은 과도한 지방이 체내에 축적된 상태로, 단순히 체형의 변화만을 야기하는 것뿐만 아니라 지방 축적 과정에서 발생하는 산화스트레스 및 염증 반응 등에 의해 세포 내 대사 이상을 유발하게 된다(Kopelman, 2000; Park 등, 2005, 2006; Song 등, 2006; Wellen과 Hotamisligil, 2005). 제2형 당뇨병, 고지혈증, 고혈압, 죽상경화 및 관련 심혈관계 질환 등 다양한 대사성 질환의 주요 원인으로 비만이 지목되고 있고, 이에 세계보건기구에서는 비만을 질병으로 규정하기에 이르렀다. 최근 수년간 코로나바이러스 감염증 사태를 겪으면서 전 세계적으로 비만 인구가 크게 증가하였고(Abbas 등, 2020; Belancic 등, 2020; Hauerslev 등, 2022), 비만으로 인해 비롯되는 각종 대사성 질환은 완치가 어렵고 재발 우려가 높은 만성 질환이기 때문에 여러 국가에서 비만의 치료 및 개선에 많은 사회적 비용을 투입하고 있다.

앞서 설명한 대로 비만은 칼로리 유입과 사용의 불균형으로 야기되기 때문에 식이 섭취를 줄이거나 섭취한 영양소의 체내 흡수를 저해하는 방법 등으로 에너지 저장을 감소시키거나 운동 등으로 에너지 소비를 증가시키는 방법을 통하여 비만을 개선할 수 있다. 식욕을 억제하여 덜 먹게 하는 방법은 Rimonabant, Sibutramine, Lorcaserine 등의 약제를 통하여 구현되었으나, 대부분의 식욕 억제 기반 비만 치료제들이 우울증 및 심혈관계 질환 유발과 같은 심각한 부작용을 유발하기 때문에 현재는 사용이 중단된 상황이다(Christensen 등, 2007; White, 2022). 대신 포만감을 유도하는 장 호르몬의 일종인 Glucagon-like Peptide 1(GLP-1) 유사체 기반의 약제(Liraglutide, Semaglutide, Tirzepatide 외)들이 새로운 비만 치료제로 널리 이용되고 있다. 아메리카독도마뱀에서 GLP-1 유사 성분(Exendin-4)이 발견된 이후(Eng, 1992), 긴 반감기를 가지고 지속적인 포만감을 유도하는 GLP-1 수용체 작용제는 기존의 식욕 억제제 대비 부작용이 경미하며 적절한 체중 감량 효과를 보인다는 장점이 있으나, 주사제라는 특성에 기인한 높은 투약 난이도 및 비싼 가격 등이 대중의 접근성을 떨어뜨리는 요인으로 지적되고 있다. 또한, 투약을 중단하면 급격한 식이 섭취 증가와 함께 요요 현상(weight regain)이 발생하기 때문에 장기간 체중 관리를 위해서는 고가의 약물을 지속적으로 구매해야 하는 부담이 따른다. 이처럼 식욕 억제 또는 식이 섭취 감소를 유도하는 방법으로는 안정적이고 지속적인 비만 치료를 보장하기 어렵기 때문에 차세대 비만 치료제의 작용점은 근육, 갈색지방 등 에너지 소비량이 큰 조직에서의 에너지 대사 활성화를 통한 신체 대사율을 증가시키는 방법이 될 것으로 예측된다.

세포는 생존을 포함한 다양한 생리 현상에 대응하기 위하여 ATP를 사용한다. 포도당과 지방 등의 영양소는 해당 과정 또는 지방 분해 과정을 거쳐 아세틸-CoA로 변환된다. 생성된 아세틸-CoA는 시트르산 회로와 미토콘드리아 전자전달계를 거쳐 양성자 구배를 형성하고, 이를 기반으로 ATP가 합성된다. 미토콘드리아는 세포에 저장된 영양소를 분해(소비)하는 역할을 수행하기 때문에 에너지 대사를 촉진하기 위해서는 세포 내 미토콘드리아의 수 또는 활성을 증가시켜야 한다. 미토콘드리아는 에너지 수요가 많은 근세포, 간세포 등에 많이 분포하는 반면, 잉여 에너지를 중성지방의 형태로 저장하는 것이 주목적인 백색지방세포에는 미토콘드리아의 수가 상대적으로 적은 것으로 알려져 있다. 반면 동면하는 포유동물에 주로 존재하는 갈색지방은 미토콘드리아를 다수 보유하고 있으며, 전자전달계를 거쳐 형성된 양성자 구배를 짝풀림 단백질 1(UCP1)을 통하여 열로 전환해 체온을 유지한다(Klingenspor 등, 2008). 체온을 유지하기 위해서는 UCP1을 통한 지속적인 열 발생이 필요하고, 열의 발생에는 전자전달계의 활성화를 통한 양성자 구배 형성이 선행되어야 하므로 갈색지방이 활성화되면 에너지 소비가 활발하게 이루어진다(Gesta 등, 2007). 사람의 경우, 신생아는 갈색지방을 갖고 있다가 성장하면서 퇴화하여 사라지는 것으로 알려져 있었으나, 21세기에 들어서 성인 갈색지방이 발견되면서(Christensen 등, 2006; Nedergaard 등, 2007) 사람에게서도 갈색지방을 활성화하거나(Osuna-Prieto 등, 2019), 백색지방을 갈색지방과 유사하게 변화시키는 기술이 연구되고 있다(Lee 등, 2016). 이처럼 지방세포 내 미토콘드리아의 양을 증가시켜 에너지 생성(이화 작용)을 촉진하면 에너지 소비를 크게 증가시켜 비만을 개선할 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구팀은 식물 추출물에 존재하는 활성 물질(bioactive compound) 라이브러리를 이용하여 비만 등 대사질환 예방 및 치료에 관여할 수 있는 에너지 대사 조절 소재를 탐색하였고, 카테킨 성분 중 하나인 gallocatechin gallate(GCG)와 플라보노이드 중 하나인 quercetin이 지방세포 및 근세포에서 미토콘드리아 생합성에 관여하는 유전자들의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(data not shown). GCG를 함유하는 차 추출물은 고지혈증을 개선하고(Cho 등, 2019; Lee 등, 2008), quercetin은 최근 들어 백색지방세포를 베이지 지방으로 전환하는 등 에너지 대사에 관여한다는 점이 알려져 있다(Lee 등, 2017). 카테킨은 주로 녹차에 많이 함유되어 있으나, 대부분이 에피카테킨(에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 에피갈로카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 에피카테킨) 형태로 존재하고 GCG는 거의 함유되어 있지 않다(Cho 등, 2019). 또한, quercetin의 경우 생체 이용률이 낮다는 단점이 있다(Gugler 등, 1975). 이에 녹차추출물 내 GCG 함량을 증가시키기 위하여 EGCG를 GCG로 전환한 열처리녹차추출물을 개발하였고(Kim 등, 2019), quercetin의 생체 이용률을 향상시킨 효소처리루틴 소재를 도입하였다(Hasumura 등, 2004). 이들 소재는 단독으로도 갈색지방 활성화와 백색지방의 갈색지방화를 유도하지만, 복합 처리(열처리녹차추출물 및 효소처리루틴 복합물; AdiPhenon)할 경우 갈색지방 활성화 및 항비만 효과에 있어서 현저한 시너지 효과를 보인다는 점을 밝혀내었다(Im 등, 2022; Moon 등, 2023). 두 소재의 복합 처방에 의한 향상된 갈색지방 활성화 효과에 대한 구체적인 분자적 작용 기전이 명확하게 밝혀지지는 않았으나, AdiPhenon을 투여한 실험동물군은 동량의 heat-treated green tea extract(HTGT) 또는 enzyme-modified isoquercitrin(EMIQ) 소재 단독 투여군 대비 미토콘드리아 전자전달계 구성 단백질의 발현이 현저하게 증가하였고, 또한 지방 분해 및 갈색지방 활성화에 관여하는 protein kinase A 신호전달체계가 크게 활성화되는 점을 관찰하였다(Moon 등, 2023). 그뿐만 아니라 이러한 갈색지방 활성화 등에 대한 시너지 효과는 각 소재를 1:1로 혼합 처리하는 경우 가장 우수하다는 점 역시 확인할 수 있었다(Im 등, 2022).

지방세포 내 미토콘드리아가 증가한 만큼 지방 산화 역시 함께 증가한다면 세포 내 에너지 대사 효율이 극대화되어 저장된 지방을 효율적으로 제거할 수 있다. 또한, 지방산 합성을 억제함으로써 세포 내 중성지질의 축적을 예방한다면, 더욱 우수한 항비만 효과를 기대할 수 있을 것이다. 이에 AdiPhenon에 의한 지방세포 내 지질 대사 조절 변화 가능성을 추가로 탐색하는 것은 본 소재의 우수한 항비만 효능 및 작용 기전을 규명하는 데 있어서 필요한 일이라 하겠다. 이에 3T3-L1 지방세포를 이용하여 지방 합성에 관여하는 유전자 및 지방 산화에 관여하는 유전자들의 발현을 확인하고, 지질 대사 이상으로 인하여 발생하는 부작용(염증 반응, 인슐린 저항성 등)에 대한 개선 효과를 함께 밝혀내고자 한다.

시약 구매

지질 대사를 조절하는 전사 인자인 peroxisome proliferator-activated receptor α(PPARα) 작용제인 fenofibrate(Feno)와 PPARγ의 작용제인 rosiglitazone(Rosi), 염증 반응 유발을 위한 tumor necrosis factor α(TNFα)와 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS), 세포 배양을 위한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) 배지 및 인슐린 신호전달체계 확인을 위한 저농도 포도당(4.5 g/dL) 함유 배지(low-glucose DMEM), 지방세포 분화에 필요한 dexamethasone, insulin, 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), oleic acid, AMP-activated protein kinase(AMPK) 저해제인 compound C(ComC)는 모두 Sigma Aldrich에서 구입하였다. 세포 배양 및 분화에 필요한 세럼[bovine calf serum(BCS), fetal bovine serum(FBS)]은 Gibco에서 구입하였다.

열처리녹차추출물 및 효소처리루틴 복합물(AdiPhenon) 제조

열처리녹차추출물(HTGT; Lot #. 211228)은 삼경코스텍에서 제조한 것을 구입하였으며, 제조법을 간략하게 설명하면 다음과 같다. 건조 녹차엽을 50% 주정을 이용하여 추출한 후, 115°C에서 5시간 동안 열을 가하여 EGCG를 GCG로 전환하였다(Moon 등, 2023). 식품첨가물공전에 수록된 방법대로 제조한 효소처리루틴(EMIQ; Lot #. 220704)은 비에스씨에서 구입하였다. AdiPhenon(Lot #. 230913)은 HTGT와 EMIQ 소재를 1:1로 혼합하여 사용하였으며, 지표 성분은 Table 1과 같다.

Table 1 . Content of marker components of AdiPhenon

Marker moleculeContent (mg/g)
EGCG1)6.3
GCG2)29.5
IQC3)64.3

1)EGCG: epigallocatechin gallate.

2)GCG: gallocatechin gallate.

3)IQC: isoquercitrin.



지방세포 배양

American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입한 3T3-L1 지방전구세포를 10% BCS(Gibco), 1% penicillin/streptomycin(P/S; Sigma Aldrich)이 함유된 DMEM을 이용하여 배양하였다. 지방전구세포에서 지방세포로의 분화는 다음과 같은 방법을 사용하였다. 먼저, 3T3-L1 지방전구세포가 100% 가득 찰 때까지 배양한 후 24시간을 더 두었다. 이후 10% FBS, 1% P/S, 1 μM dexamethasone, 10 μg/insulin 및 500 μM IBMX가 첨가된 DMEM으로 갈아준 후 48시간 동안 배양한다. 그다음 10% FBS, 1% P/S, 10 μg/insulin이 함유된 DMEM을 이틀 간격으로 바꾸어 주면서 계속 배양하였다. 전체 세포 중 80% 이상이 섬유아세포 모양의 지방전구세포에서 둥근 모양의 지방세포로 분화된 시점에서 분화를 종료하였으며, 일반적으로 10~14일 사이에 지방세포로의 분화가 완료된다. 생쥐 유래 RAW 264.7 대식세포(ATCC)의 배양에는 10% FBS, 1% P/S가 함유된 DMEM을 이용하였으며, 모든 세포는 37°C, 5% CO2 조건으로 ACO-230AICUV 인큐베이터(Panasonic Healthcare)에 넣어 배양하였다.

지방세포 내 축적된 중성지질은 중성지방 특이 형광 염색물질인 Nile Red(Sigma Aldrich)를 이용하여 염색하였다. 지방세포를 phosphate-buffered saline(PBS; Sigma Aldrich)으로 2회 세척하여 배지를 제거한 후, 10% formaldehyde(Sigma Aldrich) 용액에 5분간 두어 세포를 고정하였다. 이후 PBS로 2회 세척하여 formaldehyde를 제거하고, dimethyl sulfoxide(Sigma Aldrich)에 녹인 30 nM Nile Red 용액에 30분간 두어 중성지방을 염색하였다. 염색된 지방은 형광현미경(EVOS M5000, Invitrogen; RFP channel)을 이용하여 관찰하였다. 미토콘드리아는 MitoTrackerTM Green FM(Invitrogen)을 이용하여 염색하였고, EVOS M5000 형광현미경(GFP channel)을 이용하여 관찰하였다.

포도당 흡수 및 인슐린 민감도 확인 실험을 위해서는 인슐린 신호전달체계의 비활성화가 선행되어야 하므로 세포를 low-glucose DMEM 배지에서 6시간 동안 전처리하였다. 포도당 흡수율은 Glucose Uptake Fluorometric Assay kit(Sigma Aldrich)을 이용하여 측정하였다.

RNA 추출 및 Q-PCR

3T3-L1 지방세포 및 RAW 264.7 대식세포에서 RNA를 추출하기 위해 TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(Takara Bio)을 사용하였다. 추출 과정은 제조사에서 제공한 프로토콜을 따랐으며, 샘플별로 일정량(1 μg)의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다(RevertAid 1st-strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Fisher Scientific). mRNA 수준에서의 유전자 발현을 확인하기 위하여 합성된 cDNA를 주형으로 삼아 quantitative real-time PCR(Q-PCR; CFX96, Bio-Rad)을 수행하였다. 상대적인 유전자 발현 정도는 하우스키핑 유전자 중 하나인 cyclophilin을 이용하였다.

단백질 추출 및 western blotting

단백질의 추출에는 Radioimmunoprecipitation Assay(RIPA) lysis buffer(Pierce)를 활용하였다. 먼저 세포를 PBS로 세척하여 잔여 배지를 제거한 후, RIPA lysis buffer 300 μL를 추가하여 세포를 분해하였다. 4°C, 13.8×g에서 15분간 원심분리하여 단백질이 포함된 상등액을 분리하였다. 추출한 단백질은 bicinchoninic acid(BCA) assay kit(Pierce)을 이용하여 정량하였다. 이후 동량(40 μg)의 단백질에 NuPAGETM LDS Sample Buffer 4×(Invitrogen), 10× reducing reagent(Invitrogen)를 첨가하고 70°C에서 10분간 가열하였다. 준비된 단백질 샘플을 MOPS buffer(Invitrogen)를 채운 NuPAGETM 4~12% Bis-Tris gel(Invitrogen)에 로딩한 후 150 V, 50 mA 조건으로 90분간 전기영동을 수행하였다. iBlotTM 2 PVDF(polyvinylidene fluoride) Regular Stack(Invitrogen) 및 iBlotTM 2 Transfer Device(Invitrogen)를 이용하여 겔로부터 PVDF 막으로 단백질을 전달시켰다. PVDF 막을 Tris-buffered saline-Tween 20(TBST, Invitrogen)에 Tween 20(Sigma Aldrich)을 추가하여 0.15%의 Tween 20이 함유된 용액(washing solution)으로 세척한 후 0.05% Tween 20 TBST, 5% bovine serum albumin(Sigma Aldrich), 0.2% sodium azide(Sigma Aldrich)가 포함된 TBS 용액(blocking solution)에 5분간 담갔다. 이후 1차 항체를 1:1,000 농도로 상온에서 2시간 동안 처리하고 washing solution으로 3회 세척하였다. 5분간의 blocking solution 처리 후 2차 항체를 1:5,000 농도로 상온에서 2시간 추가 처리한 후, 다시 washing solution으로 3회 세척하였다. 표적 단백질의 양은 Pico Enhanced Chemiluminescence Solution(DoGenBio)을 처리한 후 AmershamTM ImageQuantTM 800(Cytiva) 장비를 이용하여 측정하였다. 실험에 사용된 1차 항체[AMPK, p-AMPK, Akt, p-Akt, extracellular signal-regulated kinase(ERK), p-ERK, P38, p-P38, glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase(GAPDH)]는 Cell Signaling에서, 2차 항체(horseradish peroxide-conjugated goat anti-mouse secondary antibody, horseradish peroxide-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody)는 Bio-Rad에서 구매하였다.

통계 처리

실험 결과는 일원분산분석법(사후검정으로 Student-Newman-Keuls test 사용)을 이용하여 통계적 유의성을 확인하였다. P값이 0.05보다 작은 경우 통계적 유의성이 있다고 판단하였으며, 통계 분석은 Prism 9 프로그램(Graph Pad Software)을 이용하였다.

AdiPhenon에 의한 지방세포 내 지질 대사 변화

잉여 영양성분은 지방세포에서 지방 합성 과정을 거쳐 중성지방의 형태로 지방구 내에 저장된다. 지방구 내에 저장된 지방의 양이 많아지면 자연스럽게 지방세포의 크기 역시 커지게 되는데, 성인성 비만은 이러한 지방세포의 크기 증가로 발생하는 경우가 많다(Gustafson 등, 2009). 비만은 과도한 지방의 축적 상태를 의미하기에 지방세포에 저장된 지방의 양을 감소시키는 것이 비만 해결의 당면 과제라고 할 수 있다. AdiPhenon이 지방세포에서 중성지방의 축적을 억제할 수 있는지 알아보기 위하여 분화된 지방세포에 AdiPhenon을 처리한 뒤 중성지방을 염색하여 관찰하였다(Fig. 1). 실험 결과, 3T3-L1 지방세포에서 AdiPhenon 처리로 축적된 지방구의 수 및 크기가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 1. AdiPhenon reduces intracellular triglyceride accumulation in adipocytes. Differentiated 3T3-L1 adipocytes were treated with various concentrations of AdiPhenon (AP; 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respectively) for 72 h. Fenofibrate (Feno; 30 μM) and rosiglitazone (Rosi; 3 μM) were used as controls. Cells were washed and stained with Nile Red solution and photographed. Red spots indicate lipid droplets in 3T3-L1 adipocytes. Bar=200 μm.

지방 축적의 감소는 투여한 물질의 독성에 의해서도 나타날 수 있으므로 실험에 사용한 농도의 AdiPhenon이 세포 독성을 유발하는지 확인해 보았다(Supplementary Fig. 1). 그 결과, AdiPhenon을 1,000 μg/mL 이상 처리하는 경우 세포의 생장이 억제되었으나, 실험에 사용된 농도 수준에서는 AdiPhenon이 세포 독성을 유발하지 않는 것을 확인하였다. 이것으로 보아, AdiPhenon에 의한 지방세포 내 지질 축적 감소는 독성에 의한 것이 아님을 알 수 있다. 그렇다면 세포 내 지질 축적 감소는 지질 대사 변화로 이루어졌을 것이기에 지방세포 내 지질 대사 관련 유전자들의 발현을 확인하였다. 먼저 지방 합성 관련 유전자들의 발현 변화를 관찰한 결과, 지방세포에서 sterol regulatory element-binding protein 1c, acetyl-CoA carboxylase, fatty acid synthase, steroyl-CoA desaturase 1 등 지방산 합성에 관여하는 유전자들의 발현이 AdiPhenon 처리로 억제되는 것을 알 수 있었다(Fig. 2A).

Fig. 2. AdiPhenon modulates lipid metabolism. 3T3-L1 adipocytes were treated with AdiPhenon (AP; 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respec-tively) for 24 h. Relative mRNA levels were examined and shown as bar graphs. Fenofibrate (Feno; 30 μM) and rosiglitazone (Rosi; 3 μM) were used as controls for lipid metabolism modu-lation. mRNA expression of lipogenic genes (A) or fatty acid oxidation-related genes (B) were examined as described in Mateials and Methods and shown as bar graphs. Different alphabet symbols indicate the statistical significance (P<0.05). SREBP1c: sterol regulatory element-binding protein 1c, ACC: acetyl-CoA carboxylase, FAS: fatty acid synthase, SCD1: steroyl-CoA desaturase 1, ACO: acyl-CoA oxidase, CPT1: carnitine-palmitoyl transferase 1, mCAD: middle-chain acyl- CoA dehydrogenase, PPARα: peroxisome proliferator-activated receptor α.

지방세포 내 지질 축적을 감소시키는 기전은 지방 합성 억제 이외에도 지방 분해 촉진이 있다. 지방산 산화를 통하여 유리지방산을 아세틸-CoA로 변환시키는 것인데, 이 과정에서 acyl-CoA oxidase(ACO), carnitine-palmitoyl transferase(CPT), middle chain acyl-Coa dehydrogenase 등 다양한 지방 연소 관련 유전자들이 관여한다. AdiPhenon은 지방세포 내 지방 합성 유전자들의 발현을 억제함과 동시에(Fig. 2A) 지방세포 내 지방산 산화 관련 유전자들의 발현을 증가시켰다(Fig. 2B). 이것으로 보아, AdiPhenon은 지방 합성은 억제하고 지방 연소를 촉진하여 지방세포 내 중성지방 축적을 감소시킬 것으로 생각된다.

AdiPhenon에 의한 지방세포 내 미토콘드리아 증가

중성지방의 분해로 생성된 유리지방산은 미토콘드리아로 이동하여 지방 산화 과정을 거쳐 아세틸-CoA로 변환되며, 이후 시트르산 회로 및 전자전달계를 통하여 ATP를 생성하는 데 이용된다. 미토콘드리아의 수가 부족하거나 정상적으로 기능하지 않으면 지방 산화 및 ATP 합성 작용이 원활하게 이루어지지 않고, 이는 지방 분해 효율이 억제되는 현상의 원인이 된다. 또한, 미토콘드리아 내 에너지 전환 과정은 복잡한 산화/환원 반응을 연속적으로 거치기 때문에 미토콘드리아 기능 이상은 과도한 산화스트레스의 발생에도 영향을 미칠 수 있다. 이 때문에 지방을 포함한 에너지 대사 촉진 과정, 특히 이화 과정에서는 미토콘드리아의 기능이 매우 중요하다고 할 수 있다. 앞선 실험에서 AdiPhenon이 지방 산화 관련 유전자들의 발현을 증가시키는 것을 확인하였으며(Fig. 2B), 기능성 소재 탐색 과정에서 GCG와 quercetin이 미토콘드리아 생성에 관여하는 유전자들의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다. 이에 GCG와 quercetin 배당체를 포함하고 있는 AdiPhenon이 미토콘드리아를 증가시켜 지방 분해 과정이 효율적으로 이루어질 수 있도록 유도하는지 알아보기 위해 3T3-L1 지방세포에 AdiPhenon을 처리한 후 미토콘드리아의 수를 관찰하였다. 예상했던 바와 같이, Adi Phenon 처리 시 지방세포 내 미토콘드리아가 증가하였으며(Fig. 3A), 미토콘드리아 생합성(PPARγ coactivator 1β, mitochondrial transcription factor A) 및 ATP 생성에 관여하는 전자전달계[cytochrome C oxidase subunit 4, ATP synthase F1 complex subunit α 1(ATP5A1)] 관련 유전자들의 발현 역시 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 3B). 또한, 미토콘드리아에 존재하여 양성자의 유출을 조절하는 짝풀림 단백질 2(UCP2)의 발현 역시 증가하는 것을 알 수 있었다(Supplementary Fig. 2). UCP는 미토콘드리아 전자전달계 과정에서 생성되는 양성자 구배를 ATP 합성이 아닌 열 발생으로 전환하는 단백질로, 갈색지방에서 발현되어 체온을 유지하는 UCP1이 잘 알려져 있다. 비록 UCP1 이외에 다른 UCP(UCP2, UCP3 등)는 체온 유지를 위한 열 발생을 유도하지는 않으나(Gaudry와 Jastroch, 2019), 작용 기전은 거의 동일하기 때문에 UCP가 증가하면 미토콘드리아 막 사이 공간 내 양성자 구배의 축적이 억제된다고 볼 수 있다. 이에 세포 내 UCP의 발현이 증가하면 동일한 양의 ATP를 생성하기 위해 더 많은 에너지를 소비하게 된다. 또한, 신경세포에서 UCP2의 발현이 증가하는 경우 미토콘드리아의 생합성이 유도되어 세포 내 에너지 대사 및 ATP 합성은 오히려 증가하는 양상을 보이는데(Andrews 등, 2005; Diano 등, 2003), 이러한 특성을 이용하여 사람에게서도 UCP 발현을 증가시켜 에너지 대사를 촉진하면 비만 및 이로 인한 대사질환이 개선될 수 있으리라 생각된다. UCP2는 모든 종류의 세포에 발현되며 세포 내 산화스트레스를 조절하는 역할 또한 수행하는데(Brand와 Esteves, 2005; Mailloux와 Harper, 2011), AdiPhenon에 의한 지방세포 내 UCP2의 증가는 세포 내 에너지 소비를 극대화하고 산화스트레스를 억제하여 세포를 보호하는 데 기여할 것으로 생각된다.

Fig. 3. AdiPhenon increases mitochondrial con-tent. 3T3-L1 adipocytes were differentiated as described in Materials and Methods. Differentiated adipocytes were treated with fenofibrate (Feno; 30 μM), rosiglitazone (Rosi; 3 μM), or AdiPhenon (AP; 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respec-tively) for 72 h (A) or 24 h (B), respectively. Cells were washed with phosphate-buffered saline twice and stained with MitoTracker green dye (A). Relative mRNA expression levels were deter-mined with Q-PCR and shown as bar graphs (B). Different alphabet symbols indicate statistical significance (P<0.05). Bar=400 μm. PGC1b: PPARγ coactivator 1b, TFAM: mitochondrial transcrip-tion factor A, COX4: cytochrome C oxidase subunit 4, ATP5A1: ATP synthase F1 subunit α.

AdiPhenon에 의한 지방세포 및 대식세포 내 염증 반응 개선

염증 반응은 면역 체계의 일환으로 외부의 감염원으로부터 세포를 보호하는 데 이용된다. 세포가 톨유사수용체(toll-like receptors; TLR) 등의 패턴 인지 수용체를 통하여 외부의 감염원 또는 손상된 세포를 인지하면(Beutler 등, 2006; Kumar 등, 2011), 내인성 면역 체계가 활성화되어 이를 제거한다. 여러 TLR 타입 중 TLR4는 박테리아의 세포벽 구성 성분인 지질다당체를 인지하는데, 이 외에도 유리지방산을 인지하여 염증 반응을 유발하기도 한다(Song 등, 2006). 비만이 과도한 지방의 축적으로 인한 질환 상태라는 점을 고려하였을 때, 과도한 지방의 축적은 필연적으로 혈중 및 조직 내 중성지방 및 유리지방산의 상승을 유도한다는 점은 자명하다. 증가한 유리지방산이 외부 오염원의 부재에도 불구하고 염증 반응을 유발하게 되면(만성 염증 반응), c-Jun N-terminal kinase/ERK/p38 등의 미토겐 활성화 단백질 인산화 효소(mitogen-activated protein kinase; MAPK) 신호전달체계가 활성화된다. 이들 MAPK는 대표적인 Ser/Thr 인산화 효소로, 인슐린 신호전달체계에 관여하는 단백질(insulin receptor, insulin receptor substrate, phosphatidylinositol-3-kinase 등)의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다(Krebs와 Roden, 2005; Shoelson 등, 2006; Wellen과 Hotamisligil, 2005). 그 때문에 만성 염증 반응이 유발되면 인슐린 저항성이 발생하고, 이는 고혈당 및 당뇨 등 다른 대사성 질환의 원인으로 작용하게 된다. 따라서 만성 염증 반응을 개선하는 것이 비만 및 이로 인한 다른 대사질환의 발병을 예방하고 개선하는 방법의 하나로 볼 수 있다.

지방 조직 내 염증 반응은 지방세포에서도 발생하나, 주로 지방세포 주변에 있는 대식세포 등의 면역세포에 의해 매개된다(Jeong 등, 2009). 이에 AdiPhenon이 지방세포 및 대식세포 내 염증 반응을 개선할 수 있는지 확인해 보기 위하여 RAW 264.7 대식세포와 3T3-L1 지방세포에 각각 LPS 및 TNFα를 처리하여 염증 반응을 유발하였다. 예상한 바와 같이, LPS(Fig. 4A) 및 TNFα(Fig. 4B) 처리로 증가한 염증 반응 관련 유전자들의 발현이 AdiPhenon 전처리에 의해 농도 의존적으로 감소하였음을 알 수 있다. 또한, Adi Phenon은 유리지방산에 의한 염증 반응 매개 유전자의 발현 역시 억제하는 것을 확인하였다(Supplementary Fig. 3). 이것으로 보아 AdiPhenon은 유발원의 종류와 관계없이 염증 반응을 억제하는 것을 알 수 있다.

Fig. 4. AdiPhenon blunts inflammatory responses. RAW 264.7 macrophages (A) and 3T3-L1 adipocytes (B) were pre-treated with fenofibrate (Feno; 30 μM), rosiglitazone (Rosi; 3 μM), or AdiPhenon (AP; 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respectively) for 2 h, and then cells were treated with 10 μg/mL of LPS (A) or 20 ng/mL of TNFα (B) for additional 12 h, respectively. Relative mRNA levels for inflammation-related genes were examined by Q-PCR analysis and shown as bar graphs. Differ-ent alphabet symbols indicate that those results are statistically significant (P<0.05). IL-1β: interleukin-1β, IL-6: interleukin-6, iNOS: inducible nitric oxide synthase, COX2: cyclooxygenase 2, LPS: lipopolysaccharide, TNFα: tumor necrosis factor α.

앞서 기술한 대로 염증 반응은 Set/Thr 인산화 효소의 활성화를 거쳐 인슐린 신호전달체계를 억제한다. 이에 Adi Phenon에 의한 염증 반응 억제가 인슐린 민감성을 개선할 수 있는지 추가로 확인하여 보았다. 먼저 염증 반응에 의한 인슐린 신호전달체계 교란을 확인하기 위해 지방세포에 AdiPhenon 및 TNFα를 선 처리한 후 인슐린을 처리하였다. Fig. 5A에서 보이는 바와 같이 TNFα를 처리하게 되면 인슐린 신호전달체계의 하나인 Akt의 인산화가 억제되고 염증 반응을 매개하는 ERK, p38 MAPK의 인산화가 증가하는 반면, AdiPhenon을 TNFα와 함께 처리한 세포에서는 MAPK 인산화가 상대적으로 감소했지만, Akt의 인산화는 증가한다. 이것으로 보아 AdiPhenon에 의한 염증 반응 억제는 인슐린 신호전달체계를 회복시켜 주는 것을 알 수 있다.

Fig. 5. AdiPhenon improves insulin sensitivity. 3T3-L1 adipocytes were fasted with low-glucose DMEM for 6 h and treated with AdiPhenon (AP; 100 μg/mL) for 2 h, followed by tumor necrosis factor α (TNFα; 50 ng/mL) treatment for 24 h. After TNFα treatment, cells were treated with insulin (INS; 10 ng/mL) for 1 h. Cells were harvested and western blot was performed (A), or cells were further utilized for glucose uptake assay (B). Different alphabet symbols indicate that those results are statistically significant (P<0.05).

인슐린 신호전달체계의 회복이 실제로 인슐린의 기능 향상에 영향을 미치는지 추가로 확인하기 위하여 지방세포에 AdiPhenon, TNFα 및 인슐린을 순차적으로 처리한 후 포도당 흡수 실험을 수행하였다(Fig. 5B). 인슐린 신호전달체계 변화와 마찬가지로, AdiPhenon의 처리는 지방세포에서 TNFα에 의한 인슐린 의존적 포도당 흡수 억제를 회복시켜 주는 것을 확인하였다. 실험 결과에 따르면, AdiPhenon은 인슐린 저항성을 저해하는 염증 반응을 억제하고, 이러한 작용을 통하여 인슐린 민감성을 회복시켜 주는 것으로 보인다. 이에 AdiPhenon은 단순히 지방 축적만 억제하는 것이 아닌 대사성 질환의 원인이 되는 만성 염증 반응을 함께 억제하여 비만뿐 아니라 대사성 질환을 예방하는 데 도움을 줄 것으로 생각된다.

AdiPhenon의 AMPK 활성화

AMPK는 AMP/ATP 비율을 감지하여 AMP/ATP 비율이 증가하면 활성화되어 ATP를 생성하도록 세포 내 에너지 대사를 조절한다(Gowans와 Hardie, 2014). AMP/ATP 비율이 증가하는 상황은 세포가 일반적이지 않은 상황으로, 세포 내 ATP 부족, 온도 변화, 삼투압 변화 등 다양한 스트레스 환경이 이에 포함된다(Hardie, 2008; Hardie 등, 2012). AMPK가 활성화되면 세포 내 에너지를 소모하는 다양한 작용(이화 대사 작용, 세포 생장 및 분열 등)이 중단되고 에너지를 생성할 수 있는 작용(지방 산화, 자가포식 등)이 활성화된다. 또한, 세포 내 에너지 공장인 미토콘드리아의 증가를 유도하며 염증 반응을 억제하기도 한다(Jeong 등, 2009).

지방세포에 AdiPhenon을 처리하였을 때 나타났던 현상이 AMPK가 활성화되었을 때 나타나는 현상과 유사하기에, AdiPhenon의 처리가 세포 내 AMPK의 활성화를 유도할 수 있는지 확인하여 보았다(Fig. 6). 예상한 바와 같이, AdiPhenon의 처리는 세포 내 AMPK의 활성화를 유도하였다. 다음으로 AMPK 활성화가 AdiPhenon에 의한 지방세포 내 에너지 대사 변화를 매개할 수 있는지 확인하였다. AMPK의 저해제인 ComC를 전처리하는 경우 AdiPhenon에 의한 AMPK 활성화 현상이 나타나지 않는 것을 알 수 있었으며(Fig. 7A), AdiPhenon 처리에 의한 지방세포 내 중성지방 축적 억제(Fig. 7B) 및 미토콘드리아 증가(Fig. 7C) 현상 모두 저해되는 것을 관찰하였다.

Fig. 6. AdiPhenon activates AMPK. 3T3-L1 cells were treated with fenofibrate (Feno; 30 μM), rosiglitazone (Rosi; 3 μM), or AdiPhenon (AP; 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respectively) for 1 h. Cells were washed with phosphate-buffered saline and harvested for protein extraction as described in Materials and Methods. Protein expression of p-AMPK, AMPK, and GAPDH was assessed by western blot. AMPK: AMP-activated protein kinase, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
Fig. 7. AMPK mediates the effects of AdiPhenon on lipid metabolism. (A) Differentiated 3T3-L1 adipocytes were pre-treated with compound C (ComC; 100 μM) for 2 h, followed by AdiPhenon (AP; 100 μg/mL) treatment for 1 h. p-AMPK, AMPK, and GAPDH protein levels were determine by western blot. (B) and (C). 3T3-L1 cells were sequentially treated with ComC (100 μM) and AdiPhenon (100 μg/mL) for 2 h. Then cells were treated with oleic acid (OA; 500 μM) for 72 h. Cells were washed with phosphate-buffered saline twice and stained with Nile Red (B) or MitoTracker green (C), respectively. Bar=400 μm. AMPK: AMP-activated protekin kinase, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate deydrogenase.

흥미롭게도 AdiPhenon에 의한 항염증 효과는 AMPK 저해제에 의해 완전히 억제되지 않았다(Fig. 8A, 8B). 동일 조건에서 지방 산화 관련 유전자(ACO, CPT1) 발현 촉진이 ComC에 의해 저해되는 것으로 보아(Fig. 8C), AdiPhenon의 지방 대사 활성화 작용과 항염 효능은 최소한 부분적으로나마 독립적인 경로를 통해 작용하는 것으로 보인다. 염증 반응 등에 의해 발생하는 산화스트레스가 계속해서 염증 반응을 매개하는 양성 피드백으로 작용할 수 있고, 강력한 항산화 효능을 보이는 비타민 C가 항염증 효능을 보이는 것을 감안하면(Gegotek과 Skrzydlewska, 2022; Tan 등, 2005), AdiPhenon에 함유된 폴리페놀의 항산화 효과가 부분적으로라도 항염증 효능을 매개할 것으로 생각된다(Supplementary Fig. 4).

Fig. 8. AdiPhenon suppresses mRNA expression of pro-inflammatory genes in an AMPK-inde-pendent manner. RAW 264.7 cells (A) or differentiated 3T3-L1 cells (B and C) were pre-treated with compound C (ComC; 100 μM) for 2 h, followed by AdiPhenon (AP; 100 μg/mL) treatment for 2 h. Then, cells were further treated with 10 μg/mL of LPS (A) or 20 ng/mL of TNFα (B and C) for additional 24 h. Relative mRNA levels for inflammation-related genes (A and B) or fatty acid oxidation-related genes (C) were examined by Q-PCR analysis and shown as bar graphs. Different alphabet symbols indicate that those results are statistically significant (P<0.05). IL-1β: interleukin-1β, IL-6: interleukin-6, ACO: acyl- CoA oxidase, CPT1: carnitine-palmitoyl transferase 1, LPS: lipopolysaccharide, TNFα: tumor necrosis factor α.

열처리녹차추출물과 효소처리루틴 복합물인 AdiPhenon은 지방세포 내 지방산 합성을 저해하지만 지방산 산화는 촉진하여 지방세포 내 지질 축적을 억제할 수 있다. 또한, 지방을 연소시켜 에너지를 생성하는 세포 소기관인 미토콘드리아를 증가시키며, 각종 대사성 질환 및 노화의 원인이 되는 염증 반응을 억제한다. 염증 반응은 인슐린 저항성을 유발하여 각종 대사성 질환을 일으키는데, AdiPhenon은 지질 대사뿐 아니라 지방세포 내 인슐린 민감도 또한 개선하여 비만 이외에도 내당능장애, 당뇨병 등의 대사성 질환의 개선에도 효과를 보일 것으로 생각된다.

본 연구를 원활히 수행할 수 있도록 연구 방향 제시에 도움을 주신 경희대학교 의학영양학과 이정민 교수님께 감사드립니다.

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2025; 54(1): 11-21

Published online January 31, 2025 https://doi.org/10.3746/jkfn.2025.54.1.11

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

열처리녹차추출물 및 효소처리루틴 복합물(AdiPhenonTM)의 지질 대사 및 인슐린 의존적 포도당 흡수 개선 효과

정현우․박제홍․남현진․정진오․서병휘․손종희

아모레퍼시픽 기술연구원 헬스케어연구소

Received: October 2, 2024; Revised: November 11, 2024; Accepted: November 12, 2024

AdiPhenonTM Improves Lipid Metabolism and Insulin-Stimulated Glucose Uptake in 3T3-L1 Adipocytes

Hyun Woo Jeong , Jaehong Park , HyunJin Nam , Jin-Oh Chung , Byung-Fhy Suh , and Jonghee Sohn

Healthcare Research Division, AMOREPACIFIC Research and Innovation Center

Correspondence to:Hyun Woo Jeong, AMOREPACIFIC R&I Center, 1920 Yonggudaero, Giheung-gu, Yongin-si, Gyeonggi 17074, Korea, E-mail: misterjay@amorepacific.com

Received: October 2, 2024; Revised: November 11, 2024; Accepted: November 12, 2024

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

There has been a steady increase in the prevalence of obesity in the past few decades. Since obesity is a major causal factor for various metabolic diseases including insulin resistance, type 2 diabetes, hyperlipidemia, hypertension, atherosclerosis, hepatic steatosis and their complications, the prevention or treatment of obesity is essential for maintaining a healthy life. Enhancing lipid catabolism can improve obesity and related metabolic disorders. In this study, we demonstrated the efficacy of AdiPhenonTM, a mixture of heat treated green teat extract and enzymatically modified isoquercitrin in preventing triglyceride accumulation in differentiated 3T3-L1 adipocytes. AdiPhenonTM inhibited the mRNA expression of lipogenesis-related genes, whereas it augmented that of the fatty acid oxidation-related genes. AdiPhenonTM also induced mitochondrial biogenesis, indicating that it can promote energy expenditure in adipocytes. The beneficial effects of AdiPhenonTM on lipid metabolism are mediated by the activation of AMP-activated protein kinase (AMPK), a master regulator of catabolic energy metabolism. Interestingly, AdiPhenonTM suppressed the mRNA expression of inflammation-related genes, which is closely related to insulin resistance, in an AMPK independent manner, and ameliorated the inflammation-related impairment of insulin-stimulated glucose uptake. Considering the role and effect of chronic inflammation in the progression of obesity-mediated metabolic syndromes, we propose AdiPhenonTM as a novel material for treating obesity and related metabolic disorders.

Keywords: AdiPhenon, lipid metabolism, mitochondria, inflammation, insulin sensitivity

서 론

에너지 소비량에 비해 칼로리 유입량이 많아지면 잉여 에너지는 다양한 형태로 체내에 축적된다. 지방산은 중성지방의 형태로 지방 조직에 저장되며, 포도당은 주로 글리코겐의 형태로 간 및 근육에 저장되거나 지방산 합성을 거쳐 중성지방으로 변환되기도 한다. 비만은 과도한 지방이 체내에 축적된 상태로, 단순히 체형의 변화만을 야기하는 것뿐만 아니라 지방 축적 과정에서 발생하는 산화스트레스 및 염증 반응 등에 의해 세포 내 대사 이상을 유발하게 된다(Kopelman, 2000; Park 등, 2005, 2006; Song 등, 2006; Wellen과 Hotamisligil, 2005). 제2형 당뇨병, 고지혈증, 고혈압, 죽상경화 및 관련 심혈관계 질환 등 다양한 대사성 질환의 주요 원인으로 비만이 지목되고 있고, 이에 세계보건기구에서는 비만을 질병으로 규정하기에 이르렀다. 최근 수년간 코로나바이러스 감염증 사태를 겪으면서 전 세계적으로 비만 인구가 크게 증가하였고(Abbas 등, 2020; Belancic 등, 2020; Hauerslev 등, 2022), 비만으로 인해 비롯되는 각종 대사성 질환은 완치가 어렵고 재발 우려가 높은 만성 질환이기 때문에 여러 국가에서 비만의 치료 및 개선에 많은 사회적 비용을 투입하고 있다.

앞서 설명한 대로 비만은 칼로리 유입과 사용의 불균형으로 야기되기 때문에 식이 섭취를 줄이거나 섭취한 영양소의 체내 흡수를 저해하는 방법 등으로 에너지 저장을 감소시키거나 운동 등으로 에너지 소비를 증가시키는 방법을 통하여 비만을 개선할 수 있다. 식욕을 억제하여 덜 먹게 하는 방법은 Rimonabant, Sibutramine, Lorcaserine 등의 약제를 통하여 구현되었으나, 대부분의 식욕 억제 기반 비만 치료제들이 우울증 및 심혈관계 질환 유발과 같은 심각한 부작용을 유발하기 때문에 현재는 사용이 중단된 상황이다(Christensen 등, 2007; White, 2022). 대신 포만감을 유도하는 장 호르몬의 일종인 Glucagon-like Peptide 1(GLP-1) 유사체 기반의 약제(Liraglutide, Semaglutide, Tirzepatide 외)들이 새로운 비만 치료제로 널리 이용되고 있다. 아메리카독도마뱀에서 GLP-1 유사 성분(Exendin-4)이 발견된 이후(Eng, 1992), 긴 반감기를 가지고 지속적인 포만감을 유도하는 GLP-1 수용체 작용제는 기존의 식욕 억제제 대비 부작용이 경미하며 적절한 체중 감량 효과를 보인다는 장점이 있으나, 주사제라는 특성에 기인한 높은 투약 난이도 및 비싼 가격 등이 대중의 접근성을 떨어뜨리는 요인으로 지적되고 있다. 또한, 투약을 중단하면 급격한 식이 섭취 증가와 함께 요요 현상(weight regain)이 발생하기 때문에 장기간 체중 관리를 위해서는 고가의 약물을 지속적으로 구매해야 하는 부담이 따른다. 이처럼 식욕 억제 또는 식이 섭취 감소를 유도하는 방법으로는 안정적이고 지속적인 비만 치료를 보장하기 어렵기 때문에 차세대 비만 치료제의 작용점은 근육, 갈색지방 등 에너지 소비량이 큰 조직에서의 에너지 대사 활성화를 통한 신체 대사율을 증가시키는 방법이 될 것으로 예측된다.

세포는 생존을 포함한 다양한 생리 현상에 대응하기 위하여 ATP를 사용한다. 포도당과 지방 등의 영양소는 해당 과정 또는 지방 분해 과정을 거쳐 아세틸-CoA로 변환된다. 생성된 아세틸-CoA는 시트르산 회로와 미토콘드리아 전자전달계를 거쳐 양성자 구배를 형성하고, 이를 기반으로 ATP가 합성된다. 미토콘드리아는 세포에 저장된 영양소를 분해(소비)하는 역할을 수행하기 때문에 에너지 대사를 촉진하기 위해서는 세포 내 미토콘드리아의 수 또는 활성을 증가시켜야 한다. 미토콘드리아는 에너지 수요가 많은 근세포, 간세포 등에 많이 분포하는 반면, 잉여 에너지를 중성지방의 형태로 저장하는 것이 주목적인 백색지방세포에는 미토콘드리아의 수가 상대적으로 적은 것으로 알려져 있다. 반면 동면하는 포유동물에 주로 존재하는 갈색지방은 미토콘드리아를 다수 보유하고 있으며, 전자전달계를 거쳐 형성된 양성자 구배를 짝풀림 단백질 1(UCP1)을 통하여 열로 전환해 체온을 유지한다(Klingenspor 등, 2008). 체온을 유지하기 위해서는 UCP1을 통한 지속적인 열 발생이 필요하고, 열의 발생에는 전자전달계의 활성화를 통한 양성자 구배 형성이 선행되어야 하므로 갈색지방이 활성화되면 에너지 소비가 활발하게 이루어진다(Gesta 등, 2007). 사람의 경우, 신생아는 갈색지방을 갖고 있다가 성장하면서 퇴화하여 사라지는 것으로 알려져 있었으나, 21세기에 들어서 성인 갈색지방이 발견되면서(Christensen 등, 2006; Nedergaard 등, 2007) 사람에게서도 갈색지방을 활성화하거나(Osuna-Prieto 등, 2019), 백색지방을 갈색지방과 유사하게 변화시키는 기술이 연구되고 있다(Lee 등, 2016). 이처럼 지방세포 내 미토콘드리아의 양을 증가시켜 에너지 생성(이화 작용)을 촉진하면 에너지 소비를 크게 증가시켜 비만을 개선할 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구팀은 식물 추출물에 존재하는 활성 물질(bioactive compound) 라이브러리를 이용하여 비만 등 대사질환 예방 및 치료에 관여할 수 있는 에너지 대사 조절 소재를 탐색하였고, 카테킨 성분 중 하나인 gallocatechin gallate(GCG)와 플라보노이드 중 하나인 quercetin이 지방세포 및 근세포에서 미토콘드리아 생합성에 관여하는 유전자들의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(data not shown). GCG를 함유하는 차 추출물은 고지혈증을 개선하고(Cho 등, 2019; Lee 등, 2008), quercetin은 최근 들어 백색지방세포를 베이지 지방으로 전환하는 등 에너지 대사에 관여한다는 점이 알려져 있다(Lee 등, 2017). 카테킨은 주로 녹차에 많이 함유되어 있으나, 대부분이 에피카테킨(에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG), 에피갈로카테킨, 에피카테킨 갈레이트, 에피카테킨) 형태로 존재하고 GCG는 거의 함유되어 있지 않다(Cho 등, 2019). 또한, quercetin의 경우 생체 이용률이 낮다는 단점이 있다(Gugler 등, 1975). 이에 녹차추출물 내 GCG 함량을 증가시키기 위하여 EGCG를 GCG로 전환한 열처리녹차추출물을 개발하였고(Kim 등, 2019), quercetin의 생체 이용률을 향상시킨 효소처리루틴 소재를 도입하였다(Hasumura 등, 2004). 이들 소재는 단독으로도 갈색지방 활성화와 백색지방의 갈색지방화를 유도하지만, 복합 처리(열처리녹차추출물 및 효소처리루틴 복합물; AdiPhenon)할 경우 갈색지방 활성화 및 항비만 효과에 있어서 현저한 시너지 효과를 보인다는 점을 밝혀내었다(Im 등, 2022; Moon 등, 2023). 두 소재의 복합 처방에 의한 향상된 갈색지방 활성화 효과에 대한 구체적인 분자적 작용 기전이 명확하게 밝혀지지는 않았으나, AdiPhenon을 투여한 실험동물군은 동량의 heat-treated green tea extract(HTGT) 또는 enzyme-modified isoquercitrin(EMIQ) 소재 단독 투여군 대비 미토콘드리아 전자전달계 구성 단백질의 발현이 현저하게 증가하였고, 또한 지방 분해 및 갈색지방 활성화에 관여하는 protein kinase A 신호전달체계가 크게 활성화되는 점을 관찰하였다(Moon 등, 2023). 그뿐만 아니라 이러한 갈색지방 활성화 등에 대한 시너지 효과는 각 소재를 1:1로 혼합 처리하는 경우 가장 우수하다는 점 역시 확인할 수 있었다(Im 등, 2022).

지방세포 내 미토콘드리아가 증가한 만큼 지방 산화 역시 함께 증가한다면 세포 내 에너지 대사 효율이 극대화되어 저장된 지방을 효율적으로 제거할 수 있다. 또한, 지방산 합성을 억제함으로써 세포 내 중성지질의 축적을 예방한다면, 더욱 우수한 항비만 효과를 기대할 수 있을 것이다. 이에 AdiPhenon에 의한 지방세포 내 지질 대사 조절 변화 가능성을 추가로 탐색하는 것은 본 소재의 우수한 항비만 효능 및 작용 기전을 규명하는 데 있어서 필요한 일이라 하겠다. 이에 3T3-L1 지방세포를 이용하여 지방 합성에 관여하는 유전자 및 지방 산화에 관여하는 유전자들의 발현을 확인하고, 지질 대사 이상으로 인하여 발생하는 부작용(염증 반응, 인슐린 저항성 등)에 대한 개선 효과를 함께 밝혀내고자 한다.

재료 및 방법

시약 구매

지질 대사를 조절하는 전사 인자인 peroxisome proliferator-activated receptor α(PPARα) 작용제인 fenofibrate(Feno)와 PPARγ의 작용제인 rosiglitazone(Rosi), 염증 반응 유발을 위한 tumor necrosis factor α(TNFα)와 지질다당체(lipopolysaccharide; LPS), 세포 배양을 위한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) 배지 및 인슐린 신호전달체계 확인을 위한 저농도 포도당(4.5 g/dL) 함유 배지(low-glucose DMEM), 지방세포 분화에 필요한 dexamethasone, insulin, 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX), oleic acid, AMP-activated protein kinase(AMPK) 저해제인 compound C(ComC)는 모두 Sigma Aldrich에서 구입하였다. 세포 배양 및 분화에 필요한 세럼[bovine calf serum(BCS), fetal bovine serum(FBS)]은 Gibco에서 구입하였다.

열처리녹차추출물 및 효소처리루틴 복합물(AdiPhenon) 제조

열처리녹차추출물(HTGT; Lot #. 211228)은 삼경코스텍에서 제조한 것을 구입하였으며, 제조법을 간략하게 설명하면 다음과 같다. 건조 녹차엽을 50% 주정을 이용하여 추출한 후, 115°C에서 5시간 동안 열을 가하여 EGCG를 GCG로 전환하였다(Moon 등, 2023). 식품첨가물공전에 수록된 방법대로 제조한 효소처리루틴(EMIQ; Lot #. 220704)은 비에스씨에서 구입하였다. AdiPhenon(Lot #. 230913)은 HTGT와 EMIQ 소재를 1:1로 혼합하여 사용하였으며, 지표 성분은 Table 1과 같다.

Table 1 . Content of marker components of AdiPhenon.

Marker moleculeContent (mg/g)
EGCG1)6.3
GCG2)29.5
IQC3)64.3

1)EGCG: epigallocatechin gallate..

2)GCG: gallocatechin gallate..

3)IQC: isoquercitrin..



지방세포 배양

American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입한 3T3-L1 지방전구세포를 10% BCS(Gibco), 1% penicillin/streptomycin(P/S; Sigma Aldrich)이 함유된 DMEM을 이용하여 배양하였다. 지방전구세포에서 지방세포로의 분화는 다음과 같은 방법을 사용하였다. 먼저, 3T3-L1 지방전구세포가 100% 가득 찰 때까지 배양한 후 24시간을 더 두었다. 이후 10% FBS, 1% P/S, 1 μM dexamethasone, 10 μg/insulin 및 500 μM IBMX가 첨가된 DMEM으로 갈아준 후 48시간 동안 배양한다. 그다음 10% FBS, 1% P/S, 10 μg/insulin이 함유된 DMEM을 이틀 간격으로 바꾸어 주면서 계속 배양하였다. 전체 세포 중 80% 이상이 섬유아세포 모양의 지방전구세포에서 둥근 모양의 지방세포로 분화된 시점에서 분화를 종료하였으며, 일반적으로 10~14일 사이에 지방세포로의 분화가 완료된다. 생쥐 유래 RAW 264.7 대식세포(ATCC)의 배양에는 10% FBS, 1% P/S가 함유된 DMEM을 이용하였으며, 모든 세포는 37°C, 5% CO2 조건으로 ACO-230AICUV 인큐베이터(Panasonic Healthcare)에 넣어 배양하였다.

지방세포 내 축적된 중성지질은 중성지방 특이 형광 염색물질인 Nile Red(Sigma Aldrich)를 이용하여 염색하였다. 지방세포를 phosphate-buffered saline(PBS; Sigma Aldrich)으로 2회 세척하여 배지를 제거한 후, 10% formaldehyde(Sigma Aldrich) 용액에 5분간 두어 세포를 고정하였다. 이후 PBS로 2회 세척하여 formaldehyde를 제거하고, dimethyl sulfoxide(Sigma Aldrich)에 녹인 30 nM Nile Red 용액에 30분간 두어 중성지방을 염색하였다. 염색된 지방은 형광현미경(EVOS M5000, Invitrogen; RFP channel)을 이용하여 관찰하였다. 미토콘드리아는 MitoTrackerTM Green FM(Invitrogen)을 이용하여 염색하였고, EVOS M5000 형광현미경(GFP channel)을 이용하여 관찰하였다.

포도당 흡수 및 인슐린 민감도 확인 실험을 위해서는 인슐린 신호전달체계의 비활성화가 선행되어야 하므로 세포를 low-glucose DMEM 배지에서 6시간 동안 전처리하였다. 포도당 흡수율은 Glucose Uptake Fluorometric Assay kit(Sigma Aldrich)을 이용하여 측정하였다.

RNA 추출 및 Q-PCR

3T3-L1 지방세포 및 RAW 264.7 대식세포에서 RNA를 추출하기 위해 TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(Takara Bio)을 사용하였다. 추출 과정은 제조사에서 제공한 프로토콜을 따랐으며, 샘플별로 일정량(1 μg)의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다(RevertAid 1st-strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Fisher Scientific). mRNA 수준에서의 유전자 발현을 확인하기 위하여 합성된 cDNA를 주형으로 삼아 quantitative real-time PCR(Q-PCR; CFX96, Bio-Rad)을 수행하였다. 상대적인 유전자 발현 정도는 하우스키핑 유전자 중 하나인 cyclophilin을 이용하였다.

단백질 추출 및 western blotting

단백질의 추출에는 Radioimmunoprecipitation Assay(RIPA) lysis buffer(Pierce)를 활용하였다. 먼저 세포를 PBS로 세척하여 잔여 배지를 제거한 후, RIPA lysis buffer 300 μL를 추가하여 세포를 분해하였다. 4°C, 13.8×g에서 15분간 원심분리하여 단백질이 포함된 상등액을 분리하였다. 추출한 단백질은 bicinchoninic acid(BCA) assay kit(Pierce)을 이용하여 정량하였다. 이후 동량(40 μg)의 단백질에 NuPAGETM LDS Sample Buffer 4×(Invitrogen), 10× reducing reagent(Invitrogen)를 첨가하고 70°C에서 10분간 가열하였다. 준비된 단백질 샘플을 MOPS buffer(Invitrogen)를 채운 NuPAGETM 4~12% Bis-Tris gel(Invitrogen)에 로딩한 후 150 V, 50 mA 조건으로 90분간 전기영동을 수행하였다. iBlotTM 2 PVDF(polyvinylidene fluoride) Regular Stack(Invitrogen) 및 iBlotTM 2 Transfer Device(Invitrogen)를 이용하여 겔로부터 PVDF 막으로 단백질을 전달시켰다. PVDF 막을 Tris-buffered saline-Tween 20(TBST, Invitrogen)에 Tween 20(Sigma Aldrich)을 추가하여 0.15%의 Tween 20이 함유된 용액(washing solution)으로 세척한 후 0.05% Tween 20 TBST, 5% bovine serum albumin(Sigma Aldrich), 0.2% sodium azide(Sigma Aldrich)가 포함된 TBS 용액(blocking solution)에 5분간 담갔다. 이후 1차 항체를 1:1,000 농도로 상온에서 2시간 동안 처리하고 washing solution으로 3회 세척하였다. 5분간의 blocking solution 처리 후 2차 항체를 1:5,000 농도로 상온에서 2시간 추가 처리한 후, 다시 washing solution으로 3회 세척하였다. 표적 단백질의 양은 Pico Enhanced Chemiluminescence Solution(DoGenBio)을 처리한 후 AmershamTM ImageQuantTM 800(Cytiva) 장비를 이용하여 측정하였다. 실험에 사용된 1차 항체[AMPK, p-AMPK, Akt, p-Akt, extracellular signal-regulated kinase(ERK), p-ERK, P38, p-P38, glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase(GAPDH)]는 Cell Signaling에서, 2차 항체(horseradish peroxide-conjugated goat anti-mouse secondary antibody, horseradish peroxide-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody)는 Bio-Rad에서 구매하였다.

통계 처리

실험 결과는 일원분산분석법(사후검정으로 Student-Newman-Keuls test 사용)을 이용하여 통계적 유의성을 확인하였다. P값이 0.05보다 작은 경우 통계적 유의성이 있다고 판단하였으며, 통계 분석은 Prism 9 프로그램(Graph Pad Software)을 이용하였다.

결과 및 고찰

AdiPhenon에 의한 지방세포 내 지질 대사 변화

잉여 영양성분은 지방세포에서 지방 합성 과정을 거쳐 중성지방의 형태로 지방구 내에 저장된다. 지방구 내에 저장된 지방의 양이 많아지면 자연스럽게 지방세포의 크기 역시 커지게 되는데, 성인성 비만은 이러한 지방세포의 크기 증가로 발생하는 경우가 많다(Gustafson 등, 2009). 비만은 과도한 지방의 축적 상태를 의미하기에 지방세포에 저장된 지방의 양을 감소시키는 것이 비만 해결의 당면 과제라고 할 수 있다. AdiPhenon이 지방세포에서 중성지방의 축적을 억제할 수 있는지 알아보기 위하여 분화된 지방세포에 AdiPhenon을 처리한 뒤 중성지방을 염색하여 관찰하였다(Fig. 1). 실험 결과, 3T3-L1 지방세포에서 AdiPhenon 처리로 축적된 지방구의 수 및 크기가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

Fig 1. AdiPhenon reduces intracellular triglyceride accumulation in adipocytes. Differentiated 3T3-L1 adipocytes were treated with various concentrations of AdiPhenon (AP; 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respectively) for 72 h. Fenofibrate (Feno; 30 μM) and rosiglitazone (Rosi; 3 μM) were used as controls. Cells were washed and stained with Nile Red solution and photographed. Red spots indicate lipid droplets in 3T3-L1 adipocytes. Bar=200 μm.

지방 축적의 감소는 투여한 물질의 독성에 의해서도 나타날 수 있으므로 실험에 사용한 농도의 AdiPhenon이 세포 독성을 유발하는지 확인해 보았다(Supplementary Fig. 1). 그 결과, AdiPhenon을 1,000 μg/mL 이상 처리하는 경우 세포의 생장이 억제되었으나, 실험에 사용된 농도 수준에서는 AdiPhenon이 세포 독성을 유발하지 않는 것을 확인하였다. 이것으로 보아, AdiPhenon에 의한 지방세포 내 지질 축적 감소는 독성에 의한 것이 아님을 알 수 있다. 그렇다면 세포 내 지질 축적 감소는 지질 대사 변화로 이루어졌을 것이기에 지방세포 내 지질 대사 관련 유전자들의 발현을 확인하였다. 먼저 지방 합성 관련 유전자들의 발현 변화를 관찰한 결과, 지방세포에서 sterol regulatory element-binding protein 1c, acetyl-CoA carboxylase, fatty acid synthase, steroyl-CoA desaturase 1 등 지방산 합성에 관여하는 유전자들의 발현이 AdiPhenon 처리로 억제되는 것을 알 수 있었다(Fig. 2A).

Fig 2. AdiPhenon modulates lipid metabolism. 3T3-L1 adipocytes were treated with AdiPhenon (AP; 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respec-tively) for 24 h. Relative mRNA levels were examined and shown as bar graphs. Fenofibrate (Feno; 30 μM) and rosiglitazone (Rosi; 3 μM) were used as controls for lipid metabolism modu-lation. mRNA expression of lipogenic genes (A) or fatty acid oxidation-related genes (B) were examined as described in Mateials and Methods and shown as bar graphs. Different alphabet symbols indicate the statistical significance (P<0.05). SREBP1c: sterol regulatory element-binding protein 1c, ACC: acetyl-CoA carboxylase, FAS: fatty acid synthase, SCD1: steroyl-CoA desaturase 1, ACO: acyl-CoA oxidase, CPT1: carnitine-palmitoyl transferase 1, mCAD: middle-chain acyl- CoA dehydrogenase, PPARα: peroxisome proliferator-activated receptor α.

지방세포 내 지질 축적을 감소시키는 기전은 지방 합성 억제 이외에도 지방 분해 촉진이 있다. 지방산 산화를 통하여 유리지방산을 아세틸-CoA로 변환시키는 것인데, 이 과정에서 acyl-CoA oxidase(ACO), carnitine-palmitoyl transferase(CPT), middle chain acyl-Coa dehydrogenase 등 다양한 지방 연소 관련 유전자들이 관여한다. AdiPhenon은 지방세포 내 지방 합성 유전자들의 발현을 억제함과 동시에(Fig. 2A) 지방세포 내 지방산 산화 관련 유전자들의 발현을 증가시켰다(Fig. 2B). 이것으로 보아, AdiPhenon은 지방 합성은 억제하고 지방 연소를 촉진하여 지방세포 내 중성지방 축적을 감소시킬 것으로 생각된다.

AdiPhenon에 의한 지방세포 내 미토콘드리아 증가

중성지방의 분해로 생성된 유리지방산은 미토콘드리아로 이동하여 지방 산화 과정을 거쳐 아세틸-CoA로 변환되며, 이후 시트르산 회로 및 전자전달계를 통하여 ATP를 생성하는 데 이용된다. 미토콘드리아의 수가 부족하거나 정상적으로 기능하지 않으면 지방 산화 및 ATP 합성 작용이 원활하게 이루어지지 않고, 이는 지방 분해 효율이 억제되는 현상의 원인이 된다. 또한, 미토콘드리아 내 에너지 전환 과정은 복잡한 산화/환원 반응을 연속적으로 거치기 때문에 미토콘드리아 기능 이상은 과도한 산화스트레스의 발생에도 영향을 미칠 수 있다. 이 때문에 지방을 포함한 에너지 대사 촉진 과정, 특히 이화 과정에서는 미토콘드리아의 기능이 매우 중요하다고 할 수 있다. 앞선 실험에서 AdiPhenon이 지방 산화 관련 유전자들의 발현을 증가시키는 것을 확인하였으며(Fig. 2B), 기능성 소재 탐색 과정에서 GCG와 quercetin이 미토콘드리아 생성에 관여하는 유전자들의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다. 이에 GCG와 quercetin 배당체를 포함하고 있는 AdiPhenon이 미토콘드리아를 증가시켜 지방 분해 과정이 효율적으로 이루어질 수 있도록 유도하는지 알아보기 위해 3T3-L1 지방세포에 AdiPhenon을 처리한 후 미토콘드리아의 수를 관찰하였다. 예상했던 바와 같이, Adi Phenon 처리 시 지방세포 내 미토콘드리아가 증가하였으며(Fig. 3A), 미토콘드리아 생합성(PPARγ coactivator 1β, mitochondrial transcription factor A) 및 ATP 생성에 관여하는 전자전달계[cytochrome C oxidase subunit 4, ATP synthase F1 complex subunit α 1(ATP5A1)] 관련 유전자들의 발현 역시 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 3B). 또한, 미토콘드리아에 존재하여 양성자의 유출을 조절하는 짝풀림 단백질 2(UCP2)의 발현 역시 증가하는 것을 알 수 있었다(Supplementary Fig. 2). UCP는 미토콘드리아 전자전달계 과정에서 생성되는 양성자 구배를 ATP 합성이 아닌 열 발생으로 전환하는 단백질로, 갈색지방에서 발현되어 체온을 유지하는 UCP1이 잘 알려져 있다. 비록 UCP1 이외에 다른 UCP(UCP2, UCP3 등)는 체온 유지를 위한 열 발생을 유도하지는 않으나(Gaudry와 Jastroch, 2019), 작용 기전은 거의 동일하기 때문에 UCP가 증가하면 미토콘드리아 막 사이 공간 내 양성자 구배의 축적이 억제된다고 볼 수 있다. 이에 세포 내 UCP의 발현이 증가하면 동일한 양의 ATP를 생성하기 위해 더 많은 에너지를 소비하게 된다. 또한, 신경세포에서 UCP2의 발현이 증가하는 경우 미토콘드리아의 생합성이 유도되어 세포 내 에너지 대사 및 ATP 합성은 오히려 증가하는 양상을 보이는데(Andrews 등, 2005; Diano 등, 2003), 이러한 특성을 이용하여 사람에게서도 UCP 발현을 증가시켜 에너지 대사를 촉진하면 비만 및 이로 인한 대사질환이 개선될 수 있으리라 생각된다. UCP2는 모든 종류의 세포에 발현되며 세포 내 산화스트레스를 조절하는 역할 또한 수행하는데(Brand와 Esteves, 2005; Mailloux와 Harper, 2011), AdiPhenon에 의한 지방세포 내 UCP2의 증가는 세포 내 에너지 소비를 극대화하고 산화스트레스를 억제하여 세포를 보호하는 데 기여할 것으로 생각된다.

Fig 3. AdiPhenon increases mitochondrial con-tent. 3T3-L1 adipocytes were differentiated as described in Materials and Methods. Differentiated adipocytes were treated with fenofibrate (Feno; 30 μM), rosiglitazone (Rosi; 3 μM), or AdiPhenon (AP; 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respec-tively) for 72 h (A) or 24 h (B), respectively. Cells were washed with phosphate-buffered saline twice and stained with MitoTracker green dye (A). Relative mRNA expression levels were deter-mined with Q-PCR and shown as bar graphs (B). Different alphabet symbols indicate statistical significance (P<0.05). Bar=400 μm. PGC1b: PPARγ coactivator 1b, TFAM: mitochondrial transcrip-tion factor A, COX4: cytochrome C oxidase subunit 4, ATP5A1: ATP synthase F1 subunit α.

AdiPhenon에 의한 지방세포 및 대식세포 내 염증 반응 개선

염증 반응은 면역 체계의 일환으로 외부의 감염원으로부터 세포를 보호하는 데 이용된다. 세포가 톨유사수용체(toll-like receptors; TLR) 등의 패턴 인지 수용체를 통하여 외부의 감염원 또는 손상된 세포를 인지하면(Beutler 등, 2006; Kumar 등, 2011), 내인성 면역 체계가 활성화되어 이를 제거한다. 여러 TLR 타입 중 TLR4는 박테리아의 세포벽 구성 성분인 지질다당체를 인지하는데, 이 외에도 유리지방산을 인지하여 염증 반응을 유발하기도 한다(Song 등, 2006). 비만이 과도한 지방의 축적으로 인한 질환 상태라는 점을 고려하였을 때, 과도한 지방의 축적은 필연적으로 혈중 및 조직 내 중성지방 및 유리지방산의 상승을 유도한다는 점은 자명하다. 증가한 유리지방산이 외부 오염원의 부재에도 불구하고 염증 반응을 유발하게 되면(만성 염증 반응), c-Jun N-terminal kinase/ERK/p38 등의 미토겐 활성화 단백질 인산화 효소(mitogen-activated protein kinase; MAPK) 신호전달체계가 활성화된다. 이들 MAPK는 대표적인 Ser/Thr 인산화 효소로, 인슐린 신호전달체계에 관여하는 단백질(insulin receptor, insulin receptor substrate, phosphatidylinositol-3-kinase 등)의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다(Krebs와 Roden, 2005; Shoelson 등, 2006; Wellen과 Hotamisligil, 2005). 그 때문에 만성 염증 반응이 유발되면 인슐린 저항성이 발생하고, 이는 고혈당 및 당뇨 등 다른 대사성 질환의 원인으로 작용하게 된다. 따라서 만성 염증 반응을 개선하는 것이 비만 및 이로 인한 다른 대사질환의 발병을 예방하고 개선하는 방법의 하나로 볼 수 있다.

지방 조직 내 염증 반응은 지방세포에서도 발생하나, 주로 지방세포 주변에 있는 대식세포 등의 면역세포에 의해 매개된다(Jeong 등, 2009). 이에 AdiPhenon이 지방세포 및 대식세포 내 염증 반응을 개선할 수 있는지 확인해 보기 위하여 RAW 264.7 대식세포와 3T3-L1 지방세포에 각각 LPS 및 TNFα를 처리하여 염증 반응을 유발하였다. 예상한 바와 같이, LPS(Fig. 4A) 및 TNFα(Fig. 4B) 처리로 증가한 염증 반응 관련 유전자들의 발현이 AdiPhenon 전처리에 의해 농도 의존적으로 감소하였음을 알 수 있다. 또한, Adi Phenon은 유리지방산에 의한 염증 반응 매개 유전자의 발현 역시 억제하는 것을 확인하였다(Supplementary Fig. 3). 이것으로 보아 AdiPhenon은 유발원의 종류와 관계없이 염증 반응을 억제하는 것을 알 수 있다.

Fig 4. AdiPhenon blunts inflammatory responses. RAW 264.7 macrophages (A) and 3T3-L1 adipocytes (B) were pre-treated with fenofibrate (Feno; 30 μM), rosiglitazone (Rosi; 3 μM), or AdiPhenon (AP; 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respectively) for 2 h, and then cells were treated with 10 μg/mL of LPS (A) or 20 ng/mL of TNFα (B) for additional 12 h, respectively. Relative mRNA levels for inflammation-related genes were examined by Q-PCR analysis and shown as bar graphs. Differ-ent alphabet symbols indicate that those results are statistically significant (P<0.05). IL-1β: interleukin-1β, IL-6: interleukin-6, iNOS: inducible nitric oxide synthase, COX2: cyclooxygenase 2, LPS: lipopolysaccharide, TNFα: tumor necrosis factor α.

앞서 기술한 대로 염증 반응은 Set/Thr 인산화 효소의 활성화를 거쳐 인슐린 신호전달체계를 억제한다. 이에 Adi Phenon에 의한 염증 반응 억제가 인슐린 민감성을 개선할 수 있는지 추가로 확인하여 보았다. 먼저 염증 반응에 의한 인슐린 신호전달체계 교란을 확인하기 위해 지방세포에 AdiPhenon 및 TNFα를 선 처리한 후 인슐린을 처리하였다. Fig. 5A에서 보이는 바와 같이 TNFα를 처리하게 되면 인슐린 신호전달체계의 하나인 Akt의 인산화가 억제되고 염증 반응을 매개하는 ERK, p38 MAPK의 인산화가 증가하는 반면, AdiPhenon을 TNFα와 함께 처리한 세포에서는 MAPK 인산화가 상대적으로 감소했지만, Akt의 인산화는 증가한다. 이것으로 보아 AdiPhenon에 의한 염증 반응 억제는 인슐린 신호전달체계를 회복시켜 주는 것을 알 수 있다.

Fig 5. AdiPhenon improves insulin sensitivity. 3T3-L1 adipocytes were fasted with low-glucose DMEM for 6 h and treated with AdiPhenon (AP; 100 μg/mL) for 2 h, followed by tumor necrosis factor α (TNFα; 50 ng/mL) treatment for 24 h. After TNFα treatment, cells were treated with insulin (INS; 10 ng/mL) for 1 h. Cells were harvested and western blot was performed (A), or cells were further utilized for glucose uptake assay (B). Different alphabet symbols indicate that those results are statistically significant (P<0.05).

인슐린 신호전달체계의 회복이 실제로 인슐린의 기능 향상에 영향을 미치는지 추가로 확인하기 위하여 지방세포에 AdiPhenon, TNFα 및 인슐린을 순차적으로 처리한 후 포도당 흡수 실험을 수행하였다(Fig. 5B). 인슐린 신호전달체계 변화와 마찬가지로, AdiPhenon의 처리는 지방세포에서 TNFα에 의한 인슐린 의존적 포도당 흡수 억제를 회복시켜 주는 것을 확인하였다. 실험 결과에 따르면, AdiPhenon은 인슐린 저항성을 저해하는 염증 반응을 억제하고, 이러한 작용을 통하여 인슐린 민감성을 회복시켜 주는 것으로 보인다. 이에 AdiPhenon은 단순히 지방 축적만 억제하는 것이 아닌 대사성 질환의 원인이 되는 만성 염증 반응을 함께 억제하여 비만뿐 아니라 대사성 질환을 예방하는 데 도움을 줄 것으로 생각된다.

AdiPhenon의 AMPK 활성화

AMPK는 AMP/ATP 비율을 감지하여 AMP/ATP 비율이 증가하면 활성화되어 ATP를 생성하도록 세포 내 에너지 대사를 조절한다(Gowans와 Hardie, 2014). AMP/ATP 비율이 증가하는 상황은 세포가 일반적이지 않은 상황으로, 세포 내 ATP 부족, 온도 변화, 삼투압 변화 등 다양한 스트레스 환경이 이에 포함된다(Hardie, 2008; Hardie 등, 2012). AMPK가 활성화되면 세포 내 에너지를 소모하는 다양한 작용(이화 대사 작용, 세포 생장 및 분열 등)이 중단되고 에너지를 생성할 수 있는 작용(지방 산화, 자가포식 등)이 활성화된다. 또한, 세포 내 에너지 공장인 미토콘드리아의 증가를 유도하며 염증 반응을 억제하기도 한다(Jeong 등, 2009).

지방세포에 AdiPhenon을 처리하였을 때 나타났던 현상이 AMPK가 활성화되었을 때 나타나는 현상과 유사하기에, AdiPhenon의 처리가 세포 내 AMPK의 활성화를 유도할 수 있는지 확인하여 보았다(Fig. 6). 예상한 바와 같이, AdiPhenon의 처리는 세포 내 AMPK의 활성화를 유도하였다. 다음으로 AMPK 활성화가 AdiPhenon에 의한 지방세포 내 에너지 대사 변화를 매개할 수 있는지 확인하였다. AMPK의 저해제인 ComC를 전처리하는 경우 AdiPhenon에 의한 AMPK 활성화 현상이 나타나지 않는 것을 알 수 있었으며(Fig. 7A), AdiPhenon 처리에 의한 지방세포 내 중성지방 축적 억제(Fig. 7B) 및 미토콘드리아 증가(Fig. 7C) 현상 모두 저해되는 것을 관찰하였다.

Fig 6. AdiPhenon activates AMPK. 3T3-L1 cells were treated with fenofibrate (Feno; 30 μM), rosiglitazone (Rosi; 3 μM), or AdiPhenon (AP; 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respectively) for 1 h. Cells were washed with phosphate-buffered saline and harvested for protein extraction as described in Materials and Methods. Protein expression of p-AMPK, AMPK, and GAPDH was assessed by western blot. AMPK: AMP-activated protein kinase, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
Fig 7. AMPK mediates the effects of AdiPhenon on lipid metabolism. (A) Differentiated 3T3-L1 adipocytes were pre-treated with compound C (ComC; 100 μM) for 2 h, followed by AdiPhenon (AP; 100 μg/mL) treatment for 1 h. p-AMPK, AMPK, and GAPDH protein levels were determine by western blot. (B) and (C). 3T3-L1 cells were sequentially treated with ComC (100 μM) and AdiPhenon (100 μg/mL) for 2 h. Then cells were treated with oleic acid (OA; 500 μM) for 72 h. Cells were washed with phosphate-buffered saline twice and stained with Nile Red (B) or MitoTracker green (C), respectively. Bar=400 μm. AMPK: AMP-activated protekin kinase, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate deydrogenase.

흥미롭게도 AdiPhenon에 의한 항염증 효과는 AMPK 저해제에 의해 완전히 억제되지 않았다(Fig. 8A, 8B). 동일 조건에서 지방 산화 관련 유전자(ACO, CPT1) 발현 촉진이 ComC에 의해 저해되는 것으로 보아(Fig. 8C), AdiPhenon의 지방 대사 활성화 작용과 항염 효능은 최소한 부분적으로나마 독립적인 경로를 통해 작용하는 것으로 보인다. 염증 반응 등에 의해 발생하는 산화스트레스가 계속해서 염증 반응을 매개하는 양성 피드백으로 작용할 수 있고, 강력한 항산화 효능을 보이는 비타민 C가 항염증 효능을 보이는 것을 감안하면(Gegotek과 Skrzydlewska, 2022; Tan 등, 2005), AdiPhenon에 함유된 폴리페놀의 항산화 효과가 부분적으로라도 항염증 효능을 매개할 것으로 생각된다(Supplementary Fig. 4).

Fig 8. AdiPhenon suppresses mRNA expression of pro-inflammatory genes in an AMPK-inde-pendent manner. RAW 264.7 cells (A) or differentiated 3T3-L1 cells (B and C) were pre-treated with compound C (ComC; 100 μM) for 2 h, followed by AdiPhenon (AP; 100 μg/mL) treatment for 2 h. Then, cells were further treated with 10 μg/mL of LPS (A) or 20 ng/mL of TNFα (B and C) for additional 24 h. Relative mRNA levels for inflammation-related genes (A and B) or fatty acid oxidation-related genes (C) were examined by Q-PCR analysis and shown as bar graphs. Different alphabet symbols indicate that those results are statistically significant (P<0.05). IL-1β: interleukin-1β, IL-6: interleukin-6, ACO: acyl- CoA oxidase, CPT1: carnitine-palmitoyl transferase 1, LPS: lipopolysaccharide, TNFα: tumor necrosis factor α.

요 약

열처리녹차추출물과 효소처리루틴 복합물인 AdiPhenon은 지방세포 내 지방산 합성을 저해하지만 지방산 산화는 촉진하여 지방세포 내 지질 축적을 억제할 수 있다. 또한, 지방을 연소시켜 에너지를 생성하는 세포 소기관인 미토콘드리아를 증가시키며, 각종 대사성 질환 및 노화의 원인이 되는 염증 반응을 억제한다. 염증 반응은 인슐린 저항성을 유발하여 각종 대사성 질환을 일으키는데, AdiPhenon은 지질 대사뿐 아니라 지방세포 내 인슐린 민감도 또한 개선하여 비만 이외에도 내당능장애, 당뇨병 등의 대사성 질환의 개선에도 효과를 보일 것으로 생각된다.

감사의 글

본 연구를 원활히 수행할 수 있도록 연구 방향 제시에 도움을 주신 경희대학교 의학영양학과 이정민 교수님께 감사드립니다.

Fig 1.

Fig 1.AdiPhenon reduces intracellular triglyceride accumulation in adipocytes. Differentiated 3T3-L1 adipocytes were treated with various concentrations of AdiPhenon (AP; 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respectively) for 72 h. Fenofibrate (Feno; 30 μM) and rosiglitazone (Rosi; 3 μM) were used as controls. Cells were washed and stained with Nile Red solution and photographed. Red spots indicate lipid droplets in 3T3-L1 adipocytes. Bar=200 μm.
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Fig 2.

Fig 2.AdiPhenon modulates lipid metabolism. 3T3-L1 adipocytes were treated with AdiPhenon (AP; 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respec-tively) for 24 h. Relative mRNA levels were examined and shown as bar graphs. Fenofibrate (Feno; 30 μM) and rosiglitazone (Rosi; 3 μM) were used as controls for lipid metabolism modu-lation. mRNA expression of lipogenic genes (A) or fatty acid oxidation-related genes (B) were examined as described in Mateials and Methods and shown as bar graphs. Different alphabet symbols indicate the statistical significance (P<0.05). SREBP1c: sterol regulatory element-binding protein 1c, ACC: acetyl-CoA carboxylase, FAS: fatty acid synthase, SCD1: steroyl-CoA desaturase 1, ACO: acyl-CoA oxidase, CPT1: carnitine-palmitoyl transferase 1, mCAD: middle-chain acyl- CoA dehydrogenase, PPARα: peroxisome proliferator-activated receptor α.
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Fig 3.

Fig 3.AdiPhenon increases mitochondrial con-tent. 3T3-L1 adipocytes were differentiated as described in Materials and Methods. Differentiated adipocytes were treated with fenofibrate (Feno; 30 μM), rosiglitazone (Rosi; 3 μM), or AdiPhenon (AP; 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respec-tively) for 72 h (A) or 24 h (B), respectively. Cells were washed with phosphate-buffered saline twice and stained with MitoTracker green dye (A). Relative mRNA expression levels were deter-mined with Q-PCR and shown as bar graphs (B). Different alphabet symbols indicate statistical significance (P<0.05). Bar=400 μm. PGC1b: PPARγ coactivator 1b, TFAM: mitochondrial transcrip-tion factor A, COX4: cytochrome C oxidase subunit 4, ATP5A1: ATP synthase F1 subunit α.
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Fig 4.

Fig 4.AdiPhenon blunts inflammatory responses. RAW 264.7 macrophages (A) and 3T3-L1 adipocytes (B) were pre-treated with fenofibrate (Feno; 30 μM), rosiglitazone (Rosi; 3 μM), or AdiPhenon (AP; 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respectively) for 2 h, and then cells were treated with 10 μg/mL of LPS (A) or 20 ng/mL of TNFα (B) for additional 12 h, respectively. Relative mRNA levels for inflammation-related genes were examined by Q-PCR analysis and shown as bar graphs. Differ-ent alphabet symbols indicate that those results are statistically significant (P<0.05). IL-1β: interleukin-1β, IL-6: interleukin-6, iNOS: inducible nitric oxide synthase, COX2: cyclooxygenase 2, LPS: lipopolysaccharide, TNFα: tumor necrosis factor α.
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Fig 5.

Fig 5.AdiPhenon improves insulin sensitivity. 3T3-L1 adipocytes were fasted with low-glucose DMEM for 6 h and treated with AdiPhenon (AP; 100 μg/mL) for 2 h, followed by tumor necrosis factor α (TNFα; 50 ng/mL) treatment for 24 h. After TNFα treatment, cells were treated with insulin (INS; 10 ng/mL) for 1 h. Cells were harvested and western blot was performed (A), or cells were further utilized for glucose uptake assay (B). Different alphabet symbols indicate that those results are statistically significant (P<0.05).
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Fig 6.

Fig 6.AdiPhenon activates AMPK. 3T3-L1 cells were treated with fenofibrate (Feno; 30 μM), rosiglitazone (Rosi; 3 μM), or AdiPhenon (AP; 10, 20, 50, 100, and 200 μg/mL, respectively) for 1 h. Cells were washed with phosphate-buffered saline and harvested for protein extraction as described in Materials and Methods. Protein expression of p-AMPK, AMPK, and GAPDH was assessed by western blot. AMPK: AMP-activated protein kinase, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
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Fig 7.

Fig 7.AMPK mediates the effects of AdiPhenon on lipid metabolism. (A) Differentiated 3T3-L1 adipocytes were pre-treated with compound C (ComC; 100 μM) for 2 h, followed by AdiPhenon (AP; 100 μg/mL) treatment for 1 h. p-AMPK, AMPK, and GAPDH protein levels were determine by western blot. (B) and (C). 3T3-L1 cells were sequentially treated with ComC (100 μM) and AdiPhenon (100 μg/mL) for 2 h. Then cells were treated with oleic acid (OA; 500 μM) for 72 h. Cells were washed with phosphate-buffered saline twice and stained with Nile Red (B) or MitoTracker green (C), respectively. Bar=400 μm. AMPK: AMP-activated protekin kinase, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate deydrogenase.
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Fig 8.

Fig 8.AdiPhenon suppresses mRNA expression of pro-inflammatory genes in an AMPK-inde-pendent manner. RAW 264.7 cells (A) or differentiated 3T3-L1 cells (B and C) were pre-treated with compound C (ComC; 100 μM) for 2 h, followed by AdiPhenon (AP; 100 μg/mL) treatment for 2 h. Then, cells were further treated with 10 μg/mL of LPS (A) or 20 ng/mL of TNFα (B and C) for additional 24 h. Relative mRNA levels for inflammation-related genes (A and B) or fatty acid oxidation-related genes (C) were examined by Q-PCR analysis and shown as bar graphs. Different alphabet symbols indicate that those results are statistically significant (P<0.05). IL-1β: interleukin-1β, IL-6: interleukin-6, ACO: acyl- CoA oxidase, CPT1: carnitine-palmitoyl transferase 1, LPS: lipopolysaccharide, TNFα: tumor necrosis factor α.
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Table 1 . Content of marker components of AdiPhenon.

Marker moleculeContent (mg/g)
EGCG1)6.3
GCG2)29.5
IQC3)64.3

1)EGCG: epigallocatechin gallate..

2)GCG: gallocatechin gallate..

3)IQC: isoquercitrin..


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