나이가 증가함에 따라 골격 근육량이 감소하여 점진적으로 근력 저하가 유발되는 근육질환인 근감소증(sarcopenia)은 각종 신체 기능 저하 및 장애를 일으켜 심혈관 질환, 만성 호흡기 질환, 당뇨병, 만성 신장병, 치매, 골절 등의 유병률 및 사망의 위험성을 증가시킨다고 보고되었다(Park, 2007; Yoshida 등, 2023). 근감소증의 위험 인자로는 노화에 따른 위성세포의 활성 저하, 호르몬 변화, 단백질 섭취와 같은 영양 결핍 상태, 신체 활동 감소, 산화 스트레스, 만성 염증 등이 보고되었다(Fielding 등, 2011; Hunter 등, 2019). 근육 수축에 필요한 에너지 공급을 위해 골격근 섬유에 풍부하게 존재하는 미토콘드리아의 경우, 그 대사 부산물로 생성되는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)가 과도하게 생성되면 세포의 주요 구성 성분인 지질, 단백질, DNA 등을 손상함으로써 산화 스트레스를 유발하고, 이는 위성세포 활성화 저해, 미토콘드리아 기능 장애, 조직 분해, 골격근 위축, 근육 기능 감소 등을 초래하며 섬유성 조직 증가를 유발하여 근육 기능을 손상한다(Fulle 등, 2004; Heo 등, 2017). 따라서 현재 매우 빠르게 진행되고 있는 인구의 노령화로 인한 근감소증 환자 증가에 대비하기 위해 근감소증 예방을 위한 연구가 필요한 시점이다.

근감소증 치료 방법에는 운동, 영양 보충제, 약물 복용 등이 있다고 알려져 있다(Yin 등, 2021). 운동의 경우 유산소 운동은 peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha(PGC-1α)의 발현을 증가시키는 등 미토콘드리아 생합성을 자극하지만, 근육 크기와 근력은 향상하지 못하는 반면, 저항성 운동은 미토콘드리아 기능에는 영향을 주지 않지만, 근육량을 증가시켜 신체적 수행력을 증가시킨다고 알려져 있다(Heo 등, 2017). 이처럼 운동은 근감소증에 효과가 있지만 침상에 누워 있거나 극도로 허약한 환자에게는 운동 요법이 적합하지 않고, 근감소증 치료에 잠재적인 효과가 있다고 알려진 약물로는 마이오스타틴 억제제, 테스토스테론, 선택적 안드로겐 수용체 조절제 등이 있으나 부작용의 위험성과 임상 연구 자료 부족으로 추가적인 연구가 필요한 실상이다(Yin 등, 2021). 따라서 근감소 개선 효능이 있으면서 체내 부작용이 상대적으로 낮은 식물 추출물 및 천연물 유래 단일 물질에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있다(Chae와 Nam, 2020). 커큐민, 레스베라트롤, 카테킨, 대두 단백질 및 인삼과 같은 식물 유래 천연물은 부작용 없이 근감소증에 유익한 효능이 있다는 연구가 보고되어 있다(Bagherniya 등, 2022). 이러한 식물 유래 천연물에는 골격근 위축 예방에 효과가 있는 폴리페놀이 풍부하게 함유되어 있다(Salucci와 Falcieri, 2020).

베리류는 ROS를 제거하는 폴리페놀의 좋은 공급원으로써 산화 스트레스로 인한 골격근의 세포 손상 완화 효능과 근육량과 근력에 유익한 효과가 있다고 보고되었다(Hurst 등, 2010; Yun 등, 2021). 붉은 베리류 과일인 블랙커런트(Ribes nigrum L.)는 쌍떡잎식물 장미목 범의귀과의 낙엽관목으로 폴리페놀, 비타민, 미량 무기질, 유기산 등이 함유되어 있다(Jang 등, 2021). 블랙커런트에는 플라보노이드와 안토시아닌과 같은 항산화 효과가 뛰어난 폴리페놀이 주로 존재한다(Oczkowski, 2021). 블랙커런트의 효능으로는 대장염에 대한 완화 효능(Moon 등, 2023), 비만으로 유발된 염증에 대한 항염증 효능(Benn 등, 2014)과 블랙커런트 껍질 추출물의 간암 예방 효능(Bishayee 등, 2011) 등이 보고되었다. 그러나 지금까지 근감소에 대한 블랙커런트의 효능에 관한 연구는 아직 보고된 바 없다. 이에 본 연구에서는 근육세포인 C2C12에서 H₂O₂ 처리를 통해 산화 스트레스로 인한 근위축을 유도한 후 블랙커런트 추출물(blackcurrant extract, BCE)이 근위축에 미치는 영향을 평가하였다.

재료

본 연구에 사용된 블랙커런트 추출물은 VDF Future Ceuticals에서 제공받아 사용하였다.

세포배양

근아세포(myoblasts)인 C2C12 세포를 10% fetal bovine serum(FBS, Cytiva)과 1% penicillin-streptomycin(Cytiva)을 혼합한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Cytiva)을 배양액으로 하여 37°C, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 세포의 밀도가 75~85%가 되었을 때 2% horse serum과 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM으로 배지를 교환하여 근관 세포(myotubes)로 분화시켰다. 분화 배지는 2일마다 1회씩 교체하고, 분화 4일 또는 5일 차에 블랙커런트 추출물(5, 10, 20, 40 μg/mL) 및 H₂O₂ 500 μmol/L를 처리하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

블랙커런트 추출물의 전자공여능은 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich) 라디칼 소거능을 이용하여 분석하였다. 96-Well plate에 블랙커런트 추출물을 농도별(250, 500, 1,000 μg/mL)로 10 μL씩 넣고 95% 에탄올을 이용하여 희석한 0.15 mM DPPH 용액 190 μL씩 분주하였다. 암실에서 30분간 반응시키고 난 후 UV plate reader(BioTek)로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 ascorbic acid를 사용하였고 아래의 식으로 DPPH 라디칼 소거능을 계산하여 백분율로 나타내었다.

ABTS 라디칼 소거능 측정

블랙커런트 추출물의 전자공여능은 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS, Sigma-Aldrich) 라디칼 소거능을 이용하여 분석하였다. 7 mM ABTS 용액 10 mL와 140 mM potassium persulfate 용액 170 μL를 혼합하고 암실에서 12시간 반응시킨 뒤, 734 nm에서 흡광도 값이 0.7±0.02가 되도록 95% 에탄올로 희석한 ABTS 용액을 사용하였다. 96-Well plate에 블랙커런트 추출물을 농도별로 10 μL씩 넣고 ABTS 용액을 200 μL씩 첨가하여 암실에서 2분 30초간 반응시킨 후 UV plate reader로 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 ascorbic acid를 사용하였으며, ABTS 라디칼 소거능은 아래의 식으로 계산하고 백분율로 나타내었다.

세포 생존율(cell viability) 평가

C2C12 세포에서 블랙커런트 추출물 및 H₂O₂에 의한 세포독성 평가는 water soluble tetrazolium salts(WST, Daeillab Service) assay를 이용하여 측정하였다. C2C12 cell을 1×10⁴ cells/well의 농도로 96-well culture plate에 분주하여 48시간 동안 배양한 후 분화 배지로 배양액을 교체하여 4일 동안 분화시켰다. 블랙커런트 추출물은 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. H₂O₂는 100, 200, 250, 400, 500, 800, 1,000 μmol/L의 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 여기에 각 well당 Ez-Cytox WST assay reagent를 10 μL씩 넣고 2시간 배양한 후 발색 정도를 UV plate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

May-Grunwald Giemsa 염색

분화된 근관 세포에 블랙커런트 추출물 및 H₂O₂를 처리하여 24시간 배양한 후 cold PBS로 세척하고 100% 메탄올로 5분 동안 고정하였다. 1:3 비율로 May-Grunwald 염색액(Sigma-Aldrich)과 인산나트륨 완충액(1 mM NaH₂PO₄･H₂O, 1 mM Na₂HPO₄, pH 6.0)을 섞어 만든 염색액을 사용하여 세포를 5분간 염색하고 증류수로 세척하였다. Giemsa 염색액(Sigma-Aldrich)을 증류수와 1:10 비율로 희석한 염색액으로 세포를 10분간 염색하고 증류수로 세척하였다. 염색된 세포에서 200× 배율로 이미지를 얻고 Image J software(National Institutes of Health)를 사용하여 무작위로 선택된 부분의 근관 너비를 측정하였다.

Western blot

C2C12 cell을 6-well culture plate에 1×10⁵ cells/well의 농도로 분주하여 37°C, 5% CO₂ 환경의 incubator에서 48시간 동안 배양한 다음 분화 배지로 4일 또는 5일간 분화시켰다. 분화 후 블랙커런트 추출물(5, 10, 20, 40 μg/mL)과 H₂O₂ 500 μmol/L를 처리해 주고 24시간 배양하였다. 세포를 cold PBS로 세척 후 RIPA buffer를 넣어 단백질을 추출하였다. 4°C, 16,000×g에서 15분 동안 원심분리하여 얻은 상등액을 이용하여 Bradford reagent로 단백질 농도를 정량하고 30 μg 단백질을 SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질을 polyvinylidene difluoride membrane(Bio-Rad)에 transfer 한 후 5% skim milk에 담아 blocking 하였다. Membrane에 1차 antibody로 nuclear factor erythroid-2-related factor 2(Nrf2, Abcam), heme oxygenase-1(HO-1, Santa Cruz Biotechnology), muscle RING-finger protein-1(MuRF1, Santa Cruz Biotechnology), Atrogin-1(Santa Cruz Biotechnology), AMP-activated protein kinase(AMPK, Cell Signaling Technology), p-AMPK(Cell Signaling Technology), silent information regulator T1(Sirt1, Cell Signaling Technology), PGC-1α(Santa Cruz Biotechnology)를 1/1,000로 희석하여 4°C에서 overnight하고 다음날 상온에서 30분 이상 반응시켜 부착시킨 후 5분씩 1×TBST buffer(Tris-buffered saline, 0.1% Tween-2)로 3회 세척하였다. 2차 antibody를 상온에서 1시간 부착시킨 후 1×TBST buffer로 5분씩 3회 세척한 후 EzWest Lumi plus(ATTO) 용액으로 발색하고 chemi-doc(Luminograph Ⅰ, ATTO)을 이용하여 관찰한 단백질 밴드를 Image J software를 사용하여 정량하였다.

통계분석

본 연구에서 얻은 실험 결과에 대한 통계분석은 IBM SPSS program(statistics version 26)을 이용하였으며, 모든 결과는 평균과 표준편차(mean±SD)로 나타내었다. 각 군 간 평균값의 차이는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)과 Tukey’s multiple comparisons test를 실시하여 α=0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.

블랙커런트 추출물의 항산화 활성

블랙커런트 추출물의 라디칼 소거능은 ABTS와 DPPH assay를 통해 평가하였다. DPPH assay는 비교적 안정적인 DPPH 자유라디칼이 전자나 수소를 공여하는 항산화 물질과 반응하면 짙은 보라색이 엷어지는 원리를 이용하여 항산화능을 측정하는 방법이다(Kedare와 Singh, 2011). 블랙커런트 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 측정 결과는 Fig. 1A와 같이 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid(95.7%)와 비교하여 농도가 250, 500, 1,000 μg/mL로 증가할수록 43.1%, 79.9%, 89.1%로 농도 의존적으로 라디칼 소거능이 증가하였다. 본 연구 결과와 유사하게 Jang 등(2021)의 연구에서도 블랙커런트 추출물의 농도가 50~500 μg/mL일 때 DPPH 라디칼 소거율이 추출물의 농도 증가에 따라 증가 양상을 보였다고 보고하였다. Li와 Jeong(2015)의 베리 추출물(0.2 mg/mL)의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 아로니아 90.9%, 아사이베리 50.1%, 블랙커런트 40.8%, 블루베리 40.5%, 크랜베리 24.8%의 소거능을 보고하였다. ABTS assay는 potassium persulfate와 반응하여 생성되는 녹색을 띠는 ABTS 라디칼이 항산화 물질로부터 전자를 받아 무색이 되는 원리를 이용하여 물질의 항산화 활성을 측정하는 방법이다(Kim과 Park, 2011). 블랙커런트 추출물의 ABTS 라디칼 소거능 측정 결과는 Fig. 1B와 같이 250, 500, 1,000 μg/mL 농도에서 각각 88.7%, 98.3%, 98.2%로 나타나 500 μg/mL의 농도부터 ascorbic acid(99.9%)와 유사한 ABTS 라디칼 소거율을 보였다. Lee 등(2015)이 베리류 4종의 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과 블랙라즈베리가 가장 높았고 블루베리, 오디, 라즈베리 순으로 높은 소거능이 나타났다고 보고하였다. 베리류는 항산화 활성이 뛰어난 ascorbic acid, phenolic acid, ellagic flavonoid, anthocyanin과 같은 페놀성 화합물을 가지고 있으며, 이는 활성산소종 생성을 억제하거나 소거에 효과적이라고 보고되었다(Jang 등, 2021).

Fig 1. Antioxidant capacities of blackcurrant extract (BCE). (A) DPPH and (B) ABTS radical scavenging activities from BCE. Data indicate mean±SD. ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs. ascorbic acid (ASA) group.

C2C12 세포에 대한 블랙커런트 추출물과 H₂O₂의 세포독성

블랙커런트 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 C2C12 myotubes를 이용하여 다양한 농도의 블랙커런트 추출물을 처리한 결과 200 μg/mL 이하의 농도에서는 세포독성을 보이지 않았다(Fig. 2A). 또한 세포에 H₂O₂를 농도별(100, 200, 250, 400, 500, 800, 1,000 μmol/L)로 처리한 결과 800 μmol/L 이상의 농도에서 유의하게 세포 생존율이 감소하였다(Fig. 2B). 따라서 이후 실험에서 블랙커런트 추출물은 200 μg/mL 이하의 농도로 처리하고 H₂O₂의 경우 97% 생존율을 나타낸 500 μmol/L 농도로 고정하여 진행하였다.

Fig 2. Effect of (A) blackcurrant extract (BCE) and (B) H₂O₂ on cell viability in C2C12 myotubes. Data indicate mean±SD. ^*P<0.05, ^***P<0.001 vs. control group.

블랙커런트 추출물이 H₂O₂로 유도된 C2C12 근관세포의 형태에 미치는 영향

H₂O₂로 근위축이 유도된 C2C12 근관세포에서 블랙커런트 추출물의 근위축 억제 효능을 평가하기 위하여 분화가 완료된 C2C12 myotubes에 블랙커런트 추출물과 H₂O₂를 24시간 동안 처리한 후, May-Grunwald Giemsa 염색을 수행하고 근관 직경의 변화를 측정하였다. 그 결과, H₂O₂ 단독 처리군에서 근관 직경이 유의적으로 감소하였고 블랙커런트 추출물과 H₂O₂가 함께 처리된 근관세포의 근관 직경은 모든 농도에서 농도 의존적으로 유의하게 증가함을 확인하였다(Fig. 3). 이러한 결과는 블랙커런트 추출물 처리가 H₂O₂에 의해 유도된 근위축을 개선함을 의미하였다. Yun 등(2021)의 연구에서 베리류 중 하나인 아로니아의 근관 직경 감소에 대한 회복 효과 결과와 Lee 등(2021)의 연구에서 Lonicera caerulea(honeysuckle berry)의 마우스 골격근에서 비만으로 유도된 근육량과 섬유 크기 감소를 예방한 효과와도 유사한 경향을 보였다.

Fig 3. Measurement of myotube diameter based on images stained with May-Grunwald Giemsa. (A) May-Grunwald Giemsa staining. The scale bar represents 100 μm. (B) Quantification of myotube widths from May-Grunwald Giemsa stained images. Data indicate mean±SD. ^###P<0.001 vs. control group, ^***P<0.001 vs. H₂O₂ group. BCE: blackcurrant extract.

블랙커런트 추출물이 Nrf2 및 HO-1의 단백질 발현에 미치는 영향

Nrf2는 항산화 효소 발현을 조절하는 주요 전사 인자 중 하나로, ROS를 제거하고 항산화 작용을 증가시키는 HO-1의 발현을 증가시킨다고 알려져 있다(Shin 등, 2023). 항산화제는 산화 스트레스에 의한 손상으로부터 세포를 보호한다고 보고되었다(Kwon 등, 2023). 따라서 앞서 관찰한 블랙커런트 추출물의 항산화 활성 기전을 확인하기 위하여 Nrf2와 Nrf2의 표적인자인 HO-1의 발현을 western blot assay를 통해 확인하였다. 그 결과, Nrf2의 경우 H₂O₂ 단독 처리군에서 유의적으로 발현이 감소하였고 블랙커런트 추출물과 H₂O₂ 복합 처리군에서는 발현이 증가하였다. 특히, 블랙커런트 추출물 20 µg/mL 농도에서부터 유의적으로 Nrf2의 발현이 증가하였다. HO-1의 경우에도 H₂O₂ 단독 처리군에서 발현이 감소하는 경향을 나타내었고, 블랙커런트 추출물과 H₂O₂ 복합 처리군에서는 블랙커런트 추출물 20 µg/mL 농도에서부터 발현이 유의적으로 증가하였다(Fig. 4). 이러한 결과를 통해 C2C12 myotubes에서 블랙커런트 추출물은 Nrf2/HO-1 발현 증가 기전을 통해 산화적 스트레스로부터 항산화 효능을 나타낸 것으로 사료된다. Rahman 등(2021)과 Xu 등(2020)의 연구에서 블랙커런트의 주요 안토시아닌인 cyanidin-3-glucoside와 delphinidin은 Nrf2 경로를 활성화하여 ROS 수준을 감소시킨다고 보고된 바가 있으므로 본 연구 결과에서 관찰한 블랙커런트 추출물이 Nrf2와 HO-1에 미치는 영향은 cyanidin-3-glucoside, delphinidin 등 블랙커런트의 주요 안토시아닌에 기인한 것으로 사료된다.

Fig 4. Effect of blackcurrant extract (BCE) on protein expression of Nrf2 and HO-1 in H₂O₂-treated C2C12 myotubes. (A) Western blot of Nrf2 and HO-1. (B) Quantification of Nrf2 and HO-1. Data indicate mean±SD. ^#P<0.05 vs. control group, ^*P<0.05, ^***P<0.001 vs. H₂O₂ group.

블랙커런트 추출물이 근위축 관련 MuRF1 및 Atrogin-1의 단백질 발현에 미치는 영향

근위축과 연관된 단백질 분해 경로로 보고되고 있는 유비퀴틴 단백질 분해 시스템에서 muscle-specific ubiquitin ligase에 해당하는 atrogin-1/muscle atrophy F-box(MAFbx)와 MuRF1의 발현 증가는 단백질 분해와 합성 사이의 불균형을 유도하여 근위축을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Bodine과 Baehr, 2014; Hong과 Choi, 2012). Yoo 등(2022)은 오미자가 마우스 골격근에서 비만으로 인한 근위축을 개선하는 효능을 MuRF1과 Atrogin-1의 발현 감소를 통해 보고한 바 있다. 따라서 MuRF1과 Atrogin-1의 발현 변화를 western blot을 통해 평가하여 블랙커런트 추출물이 H₂O₂ 유도 근위축에 미치는 효과를 조사한 결과, H₂O₂ 단독 처리군에서 MuRF1과 Atrogin-1의 발현이 유의적으로 증가하였으나 블랙커런트 추출물과 H₂O₂ 복합 처리군에서는 발현이 감소함을 확인하였다. MuRF1은 블랙커런트 추출물 20 µg/mL 농도에서부터 유의적으로 발현이 감소하였고, Atrogin-1은 블랙커런트 추출물 10 µg/mL 농도에서부터 농도 의존적으로 유의하게 발현이 감소하였다(Fig. 5). 이러한 결과에서 블랙커런트 추출물에 의해 근위축 지표의 단백질 발현이 감소함을 확인하였다. 또한, 앞서 May-Grunwald Giemsa 염색으로 세포 형태를 관찰한 결과, C2C12 myotubes에서 블랙커런트 추출물이 근관 직경 감소를 개선함을 확인하였으므로 이러한 결과를 종합해 보면 C2C12 myotubes에서 블랙커런트 추출물이 근위축 현상을 개선하는 효과가 있음을 보여준다. 다만 본 연구는 세포 수준에서 확인하였기에 in vivo 수준에서의 연구가 뒷받침되어야 한다.

Fig 5. Effect of blackcurrant extract (BCE) on protein expression of MuRF1 and Atrogin-1 in H₂O₂-treated C2C12 myotubes. (A) Western blot of MuRF1 and Atrogin-1. (B) Quantification of MuRF1 and Atrogin-1. Data indicate mean±SD. ^###P<0.001 vs. control group, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs. H₂O₂ group.

블랙커런트 추출물이 Sirt1/AMPK/PGC-1α pathway에 미치는 영향

Sirt1은 NAD⁺ 의존적 탈아세틸화 효소로 미토콘드리아 생합성의 중요한 조절자인 PGC-1α를 활성화한다고 알려져 있다(Cantó와 Auwerx, 2009). AMPK는 동화작용과 이화작용 사이의 전환을 조절하며 세포 내 에너지 균형을 유지하는 역할을 수행하고 Sirt1과 상호작용을 하여 시너지 효과를 일으켜 mouse 골격근에서 PGC-1α를 활성화한다고 보고되고 있다(Chen 등, 2023). Sirt1/AMPK/PGC-1α pathway는 골격근에서 에너지 항상성을 조절한다고 알려져 있으며(Bak 등, 2019), Ma 등(2019)은 구기자나무(Lycium chinense) 열매 추출물이 C2C12 세포에서 AMPK를 활성화하여 PGC-1α, Sirt1 발현이 상향 조절되어 미토콘드리아 생합성이 촉진되었다고 보고하였다. Yeon 등(2022)의 연구에서는 발목 고정으로 불용성 근위축을 유발한 동물 모델과 H₂O₂ 처리로 C2C12 세포에 불용성 근위축을 모방한 세포모델에서 근위축과 관련된 MuRF1과 Atrogin-1의 단백질 발현이 증가하였고 Sirt1/PGC-1α signaling pathway가 억제되었으나, 오미자에 함유된 Gomisin G 처리가 근위축 지표 발현 감소와 Sirt1/PGC-1α signaling pathway 활성화를 통해 미토콘드리아 생합성을 조절하여 미토콘드리아 기능을 향상시켰다고 보고한 바 있다. 본 연구에서 블랙커런트 추출물의 미토콘드리아 생합성 증가 활성을 확인하기 위해 Sirt1, PGC-1α의 발현과 AMPK의 인산화 수준을 western blot을 통해 측정한 결과, AMPK 인산화 수준은 H₂O₂ 단독 처리군에서 감소하는 경향을 나타내었고, 블랙커런트 처리에 의해 블랙커런트 추출물 10 µg/mL 농도에서부터 농도 의존적으로 증가하였다. 또한, Sirt1과 PGC-1α 발현은 H₂O₂ 단독 처리군에서 유의적으로 감소하였고 블랙커런트 처리에 의한 농도 의존적인 발현 증가를 관찰하였다(Fig. 6). 이러한 결과는 블랙커런트 추출물이 Sirt1/AMPK/PGC-1α signaling pathway를 조절함으로써 미토콘드리아 생합성을 증가시킬 수 있음을 의미한다.

Fig 6. Effect of blackcurrant extract (BCE) on Sirt1/AMPK/PGC-1α pathway in H₂O₂-treated C2C12 myotubes. (A) Western blot of p-AMPK, AMPK, Sirt1, and PGC-1α. (B) Quantification of p-AMPK/AMPK, Sirt1, and PGC-1α. Data indicate mean±SD. ^#P<0.05 vs. control group, ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs. H₂O₂ group.

본 연구에서는 블랙커런트 추출물의 항산화 효능과 근위축 개선 효능을 평가하기 위해 C2C12 myotubes에 H₂O₂로 근위축을 유발하고 근위축 억제 효능과 그 기전이 되는 에너지대사 조절 관련 경로를 관찰하였다. DPPH와 ABTS assay를 통하여 블랙커런트 추출물의 항산화능이 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다. WST assay 결과, 블랙커런트 추출물은 200 μg/mL의 농도까지 독성이 나타나지 않았으며, H₂O₂는 800 μmol/L의 농도부터 세포 생존율이 감소하는 경향을 보였다. May-Grunwald Giemsa 염색을 통한 근관 세포 염색 결과로 블랙커런트 추출물이 농도 의존적으로 근관 세포의 근관 직경을 증가시켰으며, western blot을 통해 확인한 결과 블랙커런트 추출물이 H₂O₂에 의한 산화 스트레스로부터 항산화 조절 인자인 Nrf2와 HO-1의 단백질 발현을 증가시킴을 확인하였다. 또한, 블랙커런트 추출물이 근위축 지표인 MuRF1과 Atrogin-1의 발현을 감소시키고, 미토콘드리아 생합성 관련 인자인 Sirt1, PGC-1α의 단백질 발현 및 AMPK 인산화 수준을 증가시킴을 확인하였다. 결론적으로 블랙커런트 추출물은 항산화능을 바탕으로 C2C12 세포 내 항산화 조절 인자 발현 및 Sirt1/AMPK/PGC-1α signaling pathway 활성화를 통해 근위축을 감소시키고 근위축 지표의 발현을 억제하는 것으로 사료된다. 이러한 본 연구 결과는 블랙커런트 추출물의 근감소증 예방 기능성 소재로의 개발을 위한 기초자료 마련에 그 의의가 있다. 향후 유효성 확보를 위해서 동물 모델에서의 후속 연구가 필요할 것으로 판단된다.

본 연구는 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구(NO. RS-2023-0025165131482092640001)로, 그 지원에 감사드립니다. 블랙커런트 추출물을 제공해 준 VDF FutureCeuticals에 감사드립니다.