Ex) Article Title, Author, Keywords
Online ISSN 2288-5978
Ex) Article Title, Author, Keywords
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(12): 1252-1258
Published online December 31, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.12.1252
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
Department of Biology Education, Chosun University
Correspondence to:Jeong Hoon Cho, Department of Biology Education, Chosun University, 146 Chosundaegil, Dong-gu, Gwangju 61452,
Korea, E-mail: renocho@chosun.ac.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Cyanidin, an anthocyanin pigment responsible for the red, purple, and blue hues in various fruits and flowers, exhibits a wide range of biological activities, including potential anti-aging effects. In this study, we investigated the effects of cyanidin on aging and neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Cyanidin treatment extended the lifespan of C. elegans by approximately 15% compared to dimethyl sulfoxide-treated controls. Additionally, neurodegeneration assays showed a more than 20% reduction in the frequency of abnormal mechanosensory neuron formation and a 19% improvement in nerve function. Short-term memory was also enhanced by approximately 40%. These effects are likely mediated by cyanidin’s antioxidant properties, activation of age-related gene pathways, involvement in mitochondrial uncoupling, reduction of reactive oxygen species, and enhanced mitophagy. Our findings suggest that cyanidin holds promise as a candidate for preventing aging and neurodegenerative diseases, warranting further research into its potential applications in the development of functional foods and therapeutic products.
Keywords: cyanidin, Caenorhabditis elegans, aging, longevity, neurodegeneration
노화는 신체 기능의 점진적 저하를 수반하는 복합적인 생물학적 과정으로, 전 세계적인 고령화 현상으로 노화와 노화 관련 질환에 관한 관심이 급증하고 있다(Guo 등, 2022; Micó 등, 2017). 노화는 신경퇴화, 면역력 감소, 운동 능력 저하 등 다양한 신체 능력에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Hou 등, 2019; Milanović 등, 2013; Wyss-Coray, 2016). 노화의 주요 원인 중 하나로 알려진 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 자외선, 음주, 흡연과 같은 외부적 요인이나 체내 대사 과정에서 생성되는 것으로 알려져 있다(Cadenas와 Davies 등, 2000; Caliri 등, 2021; Das와 Vasudevan, 2007). 과도하게 생성된 ROS는 생체 조직을 손상시키며, 퇴행성 신경 질환이나 당뇨병과 같은 노화 관련 질환의 발병과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Barnham 등, 2004; Vaiserman 등, 2020). 이에 따라 ROS에 의해 발생하는 손상을 줄이기 위한 항산화 물질에 관한 연구가 주목받고 있다(Jomova 등, 2023; Martemucci 등, 2022).
플라보노이드는 식물의 2차 대사산물로, ROS 제거 능력을 가진 대표적인 항산화 물질로 알려져 있다(Havsteen, 2002; Pietta, 2000). 그중에서도 안토시아닌은 강력한 항산화 물질로 알려져 있으며, 항염 및 항암 작용과 퇴행성 신경 질환 예방 효과가 있다고 보고되고 있다(Khoo 등, 2017; Mattioli 등, 2020; Wang 등, 1997). 안토시아닌이 풍부한 곡물, 채소와 과일은 예쁜꼬마선충(
따라서 본 연구에서는 약 3주의 짧은 수명을 가지며, 노화에 따른 생리적 활동 감소를 나타내어 노화 연구의 주요 모델 동물로 사용되는 예쁜꼬마선충(Hertweck 등, 2003; Zhang 등, 2020)을 이용하여 cyanidin의 항노화 효과를 확인하고자 하였다. 이를 위해 cyanidin을 처리한 선충의 수명, 신경퇴화, 운동 능력, 그리고 단기 기억 능력을 측정하여 cyanidin의 항노화 작용을 종합적으로 평가하고자 하였다.
본 연구에서는 cyanidin chloride(Sigma-Aldrich Co.)를 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich Co.)에 녹여 최종 농도를 100 μM로 설정하였다. DMSO의 최종 농도는 모든 실험에서 1%(v/v)로 유지하였다.
본 연구에는 두 종류의 예쁜꼬마선충(
수명 관찰은 NGM agar 배지에서 수행하였다. 멸균한 후, NGM agar 배지가 굳기 전(약 65°C) DMSO와 DMSO에 용해된 cyanidin을 각각 추가하였다. 모든 배지의 DMSO 최종 농도는 1%(v/v)로 유지하였으며, cyanidin의 최종 농도는 100 μM로 설정하였다. 예쁜꼬마선충은 20°C에서 배양되었다. 수명 관찰은 도립현미경(Eclipse Ts 100-F, Nikon Co.)을 사용하여 진행하였으며, 선충의 인두근 수축 및 골격근 움직임을 기준으로 매일 생사를 확인하였다. 굶주림 충격을 방지하기 위해 각 그룹의 선충은 1~2일마다 대장균(OP50)이 도말된 새로운 배지로 옮겨주었다. 생존율 분석은 OASIS 2(Online Application for Survival Analysis 2)(Han 등, 2016)를 이용하여 수행하였다.
선충의 신경퇴화 관찰을 위해 기계적 감각 신경세포인 anterior lateral microtubule(ALM)과 posterior lateral microtubule(PLM)을 녹색 형광단백질로 표지한
선충의 운동 능력을 확인하기 위해 기계적 자극에 대한 반응을 측정하였다. 기계적 자극에 대한 반응 측정은 Chalfie와 Sulston(1981)의 연구 방법에 따라 수행하였다. 평균 30마리의 선충을 먹이인 대장균(OP50)이 도말된 NGM 배지 위에 옮겼다. 5분 후, 속눈썹을 사용하여 각 선충의 전면부 절반 부위를 부드럽게 자극하였다. 자극 후 선충이 후퇴하는 행동을 보일 경우, 이를 회피 반응으로 간주하였다. 각 선충에 대해 10회 반복하였으며, 자극에 대한 회피 반응의 비율을 측정하였다.
선충의 단기 기억 능력 측정을 위해 Kauffman 등(2011)과 Margie 등(2013)의 연구 방법에 따라 주화성 테스트를 수행하였다. 주화성 테스트는 butanone에 노출되지 않은 기본 주화성 그룹(Cnaive), OP50과 butanone에 노출된 후 즉시 주화성 테스트를 진행한 그룹(C0), 그리고 OP50과 butanone에 노출된 후 새로운 NGM 배지에서 배양한 뒤 테스트한 그룹(C1)으로 나누어 진행하였다. 약 1,000마리의 선충을 15 mL conical tube에 넣고 M9으로 3회 세척 후 가라앉혔다. 이후 가라앉은 선충 중 약 100마리를 분석용 배지의 중앙에 올려놓은 후 Cnaive 그룹의 주화성을 관찰하였다. 남은 선충은 상온에서 1시간 동안 굶긴 후, OP50과 butanone이 도말된 NGM 배지 두 개에 옮겼다. 각 배지의 선충을 상온에서 1시간 동안 배양한 후, 한 그룹은 즉시 분석용 배지로 옮겨 주화성을 관찰하였고(C0), 다른 그룹은 OP50이 도말되지 않은 NGM 배지에 옮겨 상온에서 1시간 동안 추가로 배양한 후 분석용 배지에서 주화성 테스트를 진행하였다(C1). 분석용 배지의 한쪽 지점에는 10% butanone을, 반대쪽 지점에는 95% 에탄올을 각각 1 μL씩 분주하였다. 분석을 위해 약 100마리의 선충을 배지의 중앙에 올려놓고 30분이 지난 후 선충의 분포를 측정하였다. 주화성 지수(Chemotaxis Index, CI)는 [butanone 지점에 있는 선충의 수-에탄올 지점에 있는 선충의 수]/ [배지 위 전체 선충의 수-배지 중앙에 있는 선충의 수]로 산출하였으며, 학습 지수(Learning Index)는 [C0, C1 그룹의 CI 값의 합-naive 그룹의 CI 값]으로 계산하였다.
통계 자료의 값은 평균값±표준오차(SEM)로 표시하였다. 예쁜꼬마선충의 수명 데이터는 log-rank test를 이용하여 분석하였으며, 각 그룹 간의 통계적 유의성 검정은 Student’s
Cyanidin의 노화 억제 효과를 확인하기 위해 예쁜꼬마선충에 cyanidin을 처리한 후 수명을 측정하였다. 대조군은 DMSO만을 처리하였고, 실험군은 DMSO에 용해한 cyanidin을 최종 농도 100 μM로 처리한 고체 배지(NGM agar)를 사용하였다. 해당 배지에는 대장균(OP50)을 도말하여 선충의 먹이로 제공하였다. L4 단계의 유충을 실험 배지로 옮긴 후, 모든 선충이 사망할 때까지 매일 사망한 선충의 수를 기록하였다. 생존율 분석은 OASIS 2 프로그램을 사용하여 진행하였다(Han 등, 2016). 실험 결과, DMSO 처리 대조군의 평균 수명은 18.58일이었으나, 100 μM cyanidin을 처리한 실험군의 평균 수명은 21.39일로 대조군에 비해 15.12% 증가하였다. 총 개체 수의 50%가 사망한 시점은 대조군에서 19일, cyanidin 처리군은 22일로 15.79% 증가하였으며, 최대 수명은 각각 31일과 36일로 cyanidin 처리군에서 16.13% 더 연장되었다(Fig. 1, Table 1).
Table 1 . Summary of mean lifespan in
Fraction | No. of worms | Mean lifespan (days) | Age in days at 50% mortality | Maximum lifespan (days) | Change in mean lifespan (%) |
---|---|---|---|---|---|
DMSO 100 μM Cyanidin | 402 405 | 18.58±0.25 21.39±0.3 | 19 22 | 31 36 | - +15.12 |
The values were derived from the survival curves. A log-rank test showed a statistically significant difference (
Cyanidin의 신경퇴화 억제 효과를 평가하기 위해 신경세포의 형태 변화를 기반으로 한 실험을 수행하였다. 본 연구에서는 기계적 감각신경세포인 ALM과 PLM에 녹색 형광단백질을 표지한
PLM은 선충의 몸통 뒤쪽에 위치하며, 세포체가 꼬리 끝에 있고 축삭이 몸의 중앙 쪽으로 뻗어있다. PLM의 형태 변화는 노화에 따른 축삭의 변형을 관찰하는 데 사용하였다. 노화가 진행됨에 따라 PLM 축삭에서 새로운 축삭들이 자라거나, 축삭이 물결 모양으로 변형되는 현상이 나타난다(Fig. 2B). Cyanidin 처리군은 PLM에서도 대조군과 비교하여 신경퇴화율이 낮았다. 15일 차 측정 결과, 100 μM cyanidin 처리군의 비정상 PLM 비율은 0.46으로, 대조군의 비정상 PLM 비율(0.58)과 비교하여 20.69% 감소하였다(Fig. 2D).
Cyanidin이 신경세포의 형태 변형 억제 효과 외에도 신경세포의 기능적 측면에 미치는 영향을 확인하기 위해 자극에 대한 반응 실험을 수행하였다. Jiang 등(2015)은 노화된 예쁜꼬마선충에서 ALM 형태의 변형과 기계적 자극에 대한 반응 감소 사이에 유의미한 관계가 있음을 보고한 바 있다. 본 실험에서는 선충의 기계적 자극에 대한 반응을 측정하기 위해 100 μM cyanidin을 처리한 NGM 배지에 옮긴 후 속눈썹을 이용하여 선충의 전면부를 자극하였다. 이후 선충의 뒤로 물러나는 회피 반응 비율을 측정하였다. 실험 결과, cyanidin 처리 후 1일 차에 측정한 회피 반응에서는 대조군과 cyanidin 처리군 간에 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 그러나 노화가 진행된 5일 차와 10일 차에서는 cyanidin의 기계적 자극 반응 향상 효과가 확인되었다. 5일 차에 대조군의 회피 반응 비율은 0.69(69%)였으며, cyanidin 처리군은 0.78(78%)로 대조군에 비해 13.04% 증가하였다. 10일 차에는 cyanidin 처리군의 회피 반응 비율이 0.75(75%)로 나타났으며, 이는 대조군[0.63(63%)]과 비교하여 19.05% 증가한 수치이다(Fig. 3).
Cyanidin의 신경계 기능적 건강 상태를 평가하기 위해 자극 반응 실험 외에도 주화성 테스트를 통해 선충의 단기 기억 능력을 측정하였다. 주화성 테스트는 단기 기억 정보를 제공하지 않은 대조군 그룹(Cnaive), 단기 기억 정보를 제공한 후 즉시 테스트를 진행한 그룹(C0), 그리고 단기 기억 정보를 제공한 후 새로운 배지에서 1시간 동안 배양한 후 테스트를 진행한 그룹(C1)으로 나누어 진행하였다. Cyanidin 처리 후 1일 차에는 DMSO만 처리한 대조군과 cyanidin 처리군 간의 단기 기억 능력에서 유의미한 차이가 나타나지 않았다(Fig. 4A). 그러나 노화가 진행된 선충에서 cyanidin의 단기 기억 능력 향상 효과를 평가하기 위해 5일 차와 10일 차에 주화성 테스트를 수행한 결과, cyanidin 처리군에서 단기 기억 능력이 유의하게 향상됨을 확인하였다. 5일 차 C0 그룹에서 100 μM cyanidin 처리군의 학습 지수는 대조군에 비해 28.85% 증가하였으며, C1 그룹에서는 42.07% 증가하였다(Fig. 4B). 10일 차 C0 그룹에서는 cyanidin 처리군의 학습 지수가 대조군 대비 39.29% 증가하였고, C1 그룹에서도 40.00% 증가한 결과를 보였다(Fig. 4C).
본 연구에서는 대표적인 안토시아닌계 플라보노이드인 cyanidin의 항노화 효과를 확인하기 위해 예쁜꼬마선충을 모델로 사용하였다. 예쁜꼬마선충은 짧은 수명과 인간과 유사한 노화 생리적 변화를 나타내기 때문에 노화 연구에 적합한 모델로 널리 사용된다(Hertweck 등, 2003; Zhang 등, 2020).
Cyanidin 처리군에서 선충의 수명이 15.12% 증가한 것은 플라보노이드의 항산화 능력에 의한 산화 스트레스 감소와 노화 관련 유전자 경로의 활성화와 관련 있을 가능성이 높다(Hu 등, 2021). 이와 유사하게 baicalein과 chrysin 등의 플라보노이드 처리 연구에서도 선충의 수명이 연장되었으며, 이는 insulin/IGF-1 signaling(IIS) 경로와 SKN-1/Nrf2 경로에 영향을 미친 결과일 가능성이 제시되었다(Guerrero-Rubio 등, 2021). IIS 경로는 예쁜꼬마선충에서의 수명 조절과 관련된 중요 경로이며, DAF-2에 의해 억제되는 DAF-16이 선충의 수명 조절과 연관된 유전자 발현을 촉진함으로써 수명 연장에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2003; Murphy 등, 2003). Nuclear factor erythroid-derived 2(Nrf2)의 유사체인 skinhead family member-1(SKN-1)은 수명 조절과 관련된 전사 인자 중 하나이며, 산화 스트레스에 대한 저항성을 조절하는 것으로 알려져 있다(Oliveira 등, 2009; Park 등, 2009; Tullet 등, 2008).
Cyanidin의 노화에 따른 신경퇴화 억제 효과를 확인하기 위해 기계적 감각 신경세포인 ALM과 PLM을 녹색 형광단백질로 표지한 형질전환체를 사용하여 세포의 형태적 변화를 관찰한 결과, cyanidin 처리군에서 신경퇴화가 현저하게 감소하였다. 이는 cyanidin이 노화에 따른 신경 손상과 기능 저하를 방지하고, 신경 보호 효과를 통해 신경계의 기능을 유지할 수 있음을 시사한다. 또한, 기계적 자극에 대한 반응 실험에서도 cyanidin 처리군이 대조군보다 19.05% 높은 반응 비율을 보였으며, 이는 cyanidin이 신경 기능 향상에 기여할 수 있음을 의미한다(Cho 등, 2022).
Cyanidin의 인지 기능 개선 효과는 본 연구의 중요한 결과 중 하나이다. 노화 과정에서 인지 기능 저하는 인간의 주요 문제 중 하나이며(Munasinghe 등, 2021), cyanidin 처리군에서 5일 및 10일 차에 각각 42.07%와 40.00%의 학습 지수 향상이 확인되었다. 이는 cyanidin이 신경 보호뿐만 아니라 인지 능력에도 긍정적인 영향을 미칠 가능성을 제시한다.
본 연구의 결과는 cyanidin이 예쁜꼬마선충에서 수명 연장, 신경퇴화 억제, 자극 반응 향상 및 인지 기능 개선에 유의미한 영향을 미친다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 cyanidin이 다양한 세포에서 노화 과정을 억제하는 데 기여할 수 있음을 시사하며, 그 항노화 효과는 SKN-1/Nrf2 경로와 IIS 경로 외에도 미토콘드리아의 기능적 조절과 관련이 있을 가능성을 제시한다.
특히, 플라보노이드가 미토콘드리아 기능 조절에 중요한 역할을 한다는 연구가 있으며(Cho 등, 2020), cyanidin 또한 미토콘드리아 짝풀림과 관련된 역할을 수행할 가능성이 제기된다. 미토콘드리아는 노화와 밀접한 관련이 있으며, 특히 ROS의 축적과 ATP 합성 감소는 세포 손상과 노화를 촉진하는 주요 요인으로 알려져 있다(Grimm과 Eckert, 2017). 미토콘드리아의 질적 조절 기작 중 하나인 mitophagy는 손상된 미토콘드리아를 제거하는 자가포식 작용(autophagy)으로 노화된 세포에서 중요한 역할을 한다(Ashrafi와 Schwarz, 2013). 많은 플라보노이드가 양성자를 운반하는 protonophore의 역할을 수행하기 적합한 산 해리상수(pKa) 값과 친유성(lipophilicity, logP) 값을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Cho 등, 2020). Cyanidin의 pKa와 logP 값은 각각 6.47과 2.41로(Wishart 등, 2007), cyanidin이 protonophore로서 작용할 가능성이 있음을 제시한다. 따라서 cyanidin이 선충의 노후한 미토콘드리아의 높아진 막전위(Ψm)를 낮추어 ROS 생성을 줄이거나, mitophagy를 유발하여 노후한 미토콘드리아를 제거하고 새로운 미토콘드리아의 생성을 촉진할 가능성이 제시된다. 따라서 cyanidin이 미토콘드리아의 막전위 조절을 통해 항산화 효과를 발휘하고 노화 과정을 늦추는 데 기여할 수 있는지에 대한 추가 연구가 필요하다. 특히, 미토콘드리아 짝풀림 효과와 관련된 구체적인 기전 연구는 cyanidin이 노화를 억제하는 작용을 더 명확히 규명하는 데 중요한 자료를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구는 cyanidin이 예쁜꼬마선충의 노화 및 신경 퇴행에 미치는 영향을 확인하기 위해 수행되었다. 수명 연장 실험에서 cyanidin 처리군은 대조군에 비해 15% 이상의 수명 연장 효과를 보였다. 또한, 노화에 의한 신경 퇴행 실험에서는 15일 차의 PLM 신경세포를 기준으로 비정상적인 형태의 발생 빈도가 대조군에 비해 20% 이상 감소하였으며, 자극 반응 실험에서도 10일 차를 기준으로 19% 이상의 반응 능력 향상이 관찰되었다. 단기 기억력 평가에서도 cyanidin 처리군은 대조군과 비교하여 10일 차를 기준으로 40% 이상 기억력이 향상되었다. 이러한 결과는 cyanidin이 항노화, 신경 퇴행 억제, 자극 반응 능력 및 단기 기억력 향상에 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사하며, 노화 및 노화 관련 질환 예방과 치료를 위한 잠재적 물질로서의 활용 가능성을 제시한다. 이를 위해 cyanidin의 항노화 작용기전에 대한 보다 심도 있는 연구와 기능성 제품 개발을 위한 추가 연구의 필요성이 제시된다.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(12): 1252-1258
Published online December 31, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.12.1252
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
조용하․조정훈
조선대학교 생물교육과
Department of Biology Education, Chosun University
Correspondence to:Jeong Hoon Cho, Department of Biology Education, Chosun University, 146 Chosundaegil, Dong-gu, Gwangju 61452,
Korea, E-mail: renocho@chosun.ac.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Cyanidin, an anthocyanin pigment responsible for the red, purple, and blue hues in various fruits and flowers, exhibits a wide range of biological activities, including potential anti-aging effects. In this study, we investigated the effects of cyanidin on aging and neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Cyanidin treatment extended the lifespan of C. elegans by approximately 15% compared to dimethyl sulfoxide-treated controls. Additionally, neurodegeneration assays showed a more than 20% reduction in the frequency of abnormal mechanosensory neuron formation and a 19% improvement in nerve function. Short-term memory was also enhanced by approximately 40%. These effects are likely mediated by cyanidin’s antioxidant properties, activation of age-related gene pathways, involvement in mitochondrial uncoupling, reduction of reactive oxygen species, and enhanced mitophagy. Our findings suggest that cyanidin holds promise as a candidate for preventing aging and neurodegenerative diseases, warranting further research into its potential applications in the development of functional foods and therapeutic products.
Keywords: cyanidin, Caenorhabditis elegans, aging, longevity, neurodegeneration
노화는 신체 기능의 점진적 저하를 수반하는 복합적인 생물학적 과정으로, 전 세계적인 고령화 현상으로 노화와 노화 관련 질환에 관한 관심이 급증하고 있다(Guo 등, 2022; Micó 등, 2017). 노화는 신경퇴화, 면역력 감소, 운동 능력 저하 등 다양한 신체 능력에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Hou 등, 2019; Milanović 등, 2013; Wyss-Coray, 2016). 노화의 주요 원인 중 하나로 알려진 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 자외선, 음주, 흡연과 같은 외부적 요인이나 체내 대사 과정에서 생성되는 것으로 알려져 있다(Cadenas와 Davies 등, 2000; Caliri 등, 2021; Das와 Vasudevan, 2007). 과도하게 생성된 ROS는 생체 조직을 손상시키며, 퇴행성 신경 질환이나 당뇨병과 같은 노화 관련 질환의 발병과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Barnham 등, 2004; Vaiserman 등, 2020). 이에 따라 ROS에 의해 발생하는 손상을 줄이기 위한 항산화 물질에 관한 연구가 주목받고 있다(Jomova 등, 2023; Martemucci 등, 2022).
플라보노이드는 식물의 2차 대사산물로, ROS 제거 능력을 가진 대표적인 항산화 물질로 알려져 있다(Havsteen, 2002; Pietta, 2000). 그중에서도 안토시아닌은 강력한 항산화 물질로 알려져 있으며, 항염 및 항암 작용과 퇴행성 신경 질환 예방 효과가 있다고 보고되고 있다(Khoo 등, 2017; Mattioli 등, 2020; Wang 등, 1997). 안토시아닌이 풍부한 곡물, 채소와 과일은 예쁜꼬마선충(
따라서 본 연구에서는 약 3주의 짧은 수명을 가지며, 노화에 따른 생리적 활동 감소를 나타내어 노화 연구의 주요 모델 동물로 사용되는 예쁜꼬마선충(Hertweck 등, 2003; Zhang 등, 2020)을 이용하여 cyanidin의 항노화 효과를 확인하고자 하였다. 이를 위해 cyanidin을 처리한 선충의 수명, 신경퇴화, 운동 능력, 그리고 단기 기억 능력을 측정하여 cyanidin의 항노화 작용을 종합적으로 평가하고자 하였다.
본 연구에서는 cyanidin chloride(Sigma-Aldrich Co.)를 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich Co.)에 녹여 최종 농도를 100 μM로 설정하였다. DMSO의 최종 농도는 모든 실험에서 1%(v/v)로 유지하였다.
본 연구에는 두 종류의 예쁜꼬마선충(
수명 관찰은 NGM agar 배지에서 수행하였다. 멸균한 후, NGM agar 배지가 굳기 전(약 65°C) DMSO와 DMSO에 용해된 cyanidin을 각각 추가하였다. 모든 배지의 DMSO 최종 농도는 1%(v/v)로 유지하였으며, cyanidin의 최종 농도는 100 μM로 설정하였다. 예쁜꼬마선충은 20°C에서 배양되었다. 수명 관찰은 도립현미경(Eclipse Ts 100-F, Nikon Co.)을 사용하여 진행하였으며, 선충의 인두근 수축 및 골격근 움직임을 기준으로 매일 생사를 확인하였다. 굶주림 충격을 방지하기 위해 각 그룹의 선충은 1~2일마다 대장균(OP50)이 도말된 새로운 배지로 옮겨주었다. 생존율 분석은 OASIS 2(Online Application for Survival Analysis 2)(Han 등, 2016)를 이용하여 수행하였다.
선충의 신경퇴화 관찰을 위해 기계적 감각 신경세포인 anterior lateral microtubule(ALM)과 posterior lateral microtubule(PLM)을 녹색 형광단백질로 표지한
선충의 운동 능력을 확인하기 위해 기계적 자극에 대한 반응을 측정하였다. 기계적 자극에 대한 반응 측정은 Chalfie와 Sulston(1981)의 연구 방법에 따라 수행하였다. 평균 30마리의 선충을 먹이인 대장균(OP50)이 도말된 NGM 배지 위에 옮겼다. 5분 후, 속눈썹을 사용하여 각 선충의 전면부 절반 부위를 부드럽게 자극하였다. 자극 후 선충이 후퇴하는 행동을 보일 경우, 이를 회피 반응으로 간주하였다. 각 선충에 대해 10회 반복하였으며, 자극에 대한 회피 반응의 비율을 측정하였다.
선충의 단기 기억 능력 측정을 위해 Kauffman 등(2011)과 Margie 등(2013)의 연구 방법에 따라 주화성 테스트를 수행하였다. 주화성 테스트는 butanone에 노출되지 않은 기본 주화성 그룹(Cnaive), OP50과 butanone에 노출된 후 즉시 주화성 테스트를 진행한 그룹(C0), 그리고 OP50과 butanone에 노출된 후 새로운 NGM 배지에서 배양한 뒤 테스트한 그룹(C1)으로 나누어 진행하였다. 약 1,000마리의 선충을 15 mL conical tube에 넣고 M9으로 3회 세척 후 가라앉혔다. 이후 가라앉은 선충 중 약 100마리를 분석용 배지의 중앙에 올려놓은 후 Cnaive 그룹의 주화성을 관찰하였다. 남은 선충은 상온에서 1시간 동안 굶긴 후, OP50과 butanone이 도말된 NGM 배지 두 개에 옮겼다. 각 배지의 선충을 상온에서 1시간 동안 배양한 후, 한 그룹은 즉시 분석용 배지로 옮겨 주화성을 관찰하였고(C0), 다른 그룹은 OP50이 도말되지 않은 NGM 배지에 옮겨 상온에서 1시간 동안 추가로 배양한 후 분석용 배지에서 주화성 테스트를 진행하였다(C1). 분석용 배지의 한쪽 지점에는 10% butanone을, 반대쪽 지점에는 95% 에탄올을 각각 1 μL씩 분주하였다. 분석을 위해 약 100마리의 선충을 배지의 중앙에 올려놓고 30분이 지난 후 선충의 분포를 측정하였다. 주화성 지수(Chemotaxis Index, CI)는 [butanone 지점에 있는 선충의 수-에탄올 지점에 있는 선충의 수]/ [배지 위 전체 선충의 수-배지 중앙에 있는 선충의 수]로 산출하였으며, 학습 지수(Learning Index)는 [C0, C1 그룹의 CI 값의 합-naive 그룹의 CI 값]으로 계산하였다.
통계 자료의 값은 평균값±표준오차(SEM)로 표시하였다. 예쁜꼬마선충의 수명 데이터는 log-rank test를 이용하여 분석하였으며, 각 그룹 간의 통계적 유의성 검정은 Student’s
Cyanidin의 노화 억제 효과를 확인하기 위해 예쁜꼬마선충에 cyanidin을 처리한 후 수명을 측정하였다. 대조군은 DMSO만을 처리하였고, 실험군은 DMSO에 용해한 cyanidin을 최종 농도 100 μM로 처리한 고체 배지(NGM agar)를 사용하였다. 해당 배지에는 대장균(OP50)을 도말하여 선충의 먹이로 제공하였다. L4 단계의 유충을 실험 배지로 옮긴 후, 모든 선충이 사망할 때까지 매일 사망한 선충의 수를 기록하였다. 생존율 분석은 OASIS 2 프로그램을 사용하여 진행하였다(Han 등, 2016). 실험 결과, DMSO 처리 대조군의 평균 수명은 18.58일이었으나, 100 μM cyanidin을 처리한 실험군의 평균 수명은 21.39일로 대조군에 비해 15.12% 증가하였다. 총 개체 수의 50%가 사망한 시점은 대조군에서 19일, cyanidin 처리군은 22일로 15.79% 증가하였으며, 최대 수명은 각각 31일과 36일로 cyanidin 처리군에서 16.13% 더 연장되었다(Fig. 1, Table 1).
Table 1 . Summary of mean lifespan in
Fraction. | No. of worms. | Mean lifespan (days). | Age in days at 50% mortality. | Maximum lifespan (days). | Change in mean lifespan (%). |
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DMSO. 100 μM Cyanidin. | 402. 405. | 18.58±0.25. 21.39±0.3. | 19. 22. | 31. 36. | -. +15.12. |
The values were derived from the survival curves. A log-rank test showed a statistically significant difference (
Cyanidin의 신경퇴화 억제 효과를 평가하기 위해 신경세포의 형태 변화를 기반으로 한 실험을 수행하였다. 본 연구에서는 기계적 감각신경세포인 ALM과 PLM에 녹색 형광단백질을 표지한
PLM은 선충의 몸통 뒤쪽에 위치하며, 세포체가 꼬리 끝에 있고 축삭이 몸의 중앙 쪽으로 뻗어있다. PLM의 형태 변화는 노화에 따른 축삭의 변형을 관찰하는 데 사용하였다. 노화가 진행됨에 따라 PLM 축삭에서 새로운 축삭들이 자라거나, 축삭이 물결 모양으로 변형되는 현상이 나타난다(Fig. 2B). Cyanidin 처리군은 PLM에서도 대조군과 비교하여 신경퇴화율이 낮았다. 15일 차 측정 결과, 100 μM cyanidin 처리군의 비정상 PLM 비율은 0.46으로, 대조군의 비정상 PLM 비율(0.58)과 비교하여 20.69% 감소하였다(Fig. 2D).
Cyanidin이 신경세포의 형태 변형 억제 효과 외에도 신경세포의 기능적 측면에 미치는 영향을 확인하기 위해 자극에 대한 반응 실험을 수행하였다. Jiang 등(2015)은 노화된 예쁜꼬마선충에서 ALM 형태의 변형과 기계적 자극에 대한 반응 감소 사이에 유의미한 관계가 있음을 보고한 바 있다. 본 실험에서는 선충의 기계적 자극에 대한 반응을 측정하기 위해 100 μM cyanidin을 처리한 NGM 배지에 옮긴 후 속눈썹을 이용하여 선충의 전면부를 자극하였다. 이후 선충의 뒤로 물러나는 회피 반응 비율을 측정하였다. 실험 결과, cyanidin 처리 후 1일 차에 측정한 회피 반응에서는 대조군과 cyanidin 처리군 간에 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 그러나 노화가 진행된 5일 차와 10일 차에서는 cyanidin의 기계적 자극 반응 향상 효과가 확인되었다. 5일 차에 대조군의 회피 반응 비율은 0.69(69%)였으며, cyanidin 처리군은 0.78(78%)로 대조군에 비해 13.04% 증가하였다. 10일 차에는 cyanidin 처리군의 회피 반응 비율이 0.75(75%)로 나타났으며, 이는 대조군[0.63(63%)]과 비교하여 19.05% 증가한 수치이다(Fig. 3).
Cyanidin의 신경계 기능적 건강 상태를 평가하기 위해 자극 반응 실험 외에도 주화성 테스트를 통해 선충의 단기 기억 능력을 측정하였다. 주화성 테스트는 단기 기억 정보를 제공하지 않은 대조군 그룹(Cnaive), 단기 기억 정보를 제공한 후 즉시 테스트를 진행한 그룹(C0), 그리고 단기 기억 정보를 제공한 후 새로운 배지에서 1시간 동안 배양한 후 테스트를 진행한 그룹(C1)으로 나누어 진행하였다. Cyanidin 처리 후 1일 차에는 DMSO만 처리한 대조군과 cyanidin 처리군 간의 단기 기억 능력에서 유의미한 차이가 나타나지 않았다(Fig. 4A). 그러나 노화가 진행된 선충에서 cyanidin의 단기 기억 능력 향상 효과를 평가하기 위해 5일 차와 10일 차에 주화성 테스트를 수행한 결과, cyanidin 처리군에서 단기 기억 능력이 유의하게 향상됨을 확인하였다. 5일 차 C0 그룹에서 100 μM cyanidin 처리군의 학습 지수는 대조군에 비해 28.85% 증가하였으며, C1 그룹에서는 42.07% 증가하였다(Fig. 4B). 10일 차 C0 그룹에서는 cyanidin 처리군의 학습 지수가 대조군 대비 39.29% 증가하였고, C1 그룹에서도 40.00% 증가한 결과를 보였다(Fig. 4C).
본 연구에서는 대표적인 안토시아닌계 플라보노이드인 cyanidin의 항노화 효과를 확인하기 위해 예쁜꼬마선충을 모델로 사용하였다. 예쁜꼬마선충은 짧은 수명과 인간과 유사한 노화 생리적 변화를 나타내기 때문에 노화 연구에 적합한 모델로 널리 사용된다(Hertweck 등, 2003; Zhang 등, 2020).
Cyanidin 처리군에서 선충의 수명이 15.12% 증가한 것은 플라보노이드의 항산화 능력에 의한 산화 스트레스 감소와 노화 관련 유전자 경로의 활성화와 관련 있을 가능성이 높다(Hu 등, 2021). 이와 유사하게 baicalein과 chrysin 등의 플라보노이드 처리 연구에서도 선충의 수명이 연장되었으며, 이는 insulin/IGF-1 signaling(IIS) 경로와 SKN-1/Nrf2 경로에 영향을 미친 결과일 가능성이 제시되었다(Guerrero-Rubio 등, 2021). IIS 경로는 예쁜꼬마선충에서의 수명 조절과 관련된 중요 경로이며, DAF-2에 의해 억제되는 DAF-16이 선충의 수명 조절과 연관된 유전자 발현을 촉진함으로써 수명 연장에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2003; Murphy 등, 2003). Nuclear factor erythroid-derived 2(Nrf2)의 유사체인 skinhead family member-1(SKN-1)은 수명 조절과 관련된 전사 인자 중 하나이며, 산화 스트레스에 대한 저항성을 조절하는 것으로 알려져 있다(Oliveira 등, 2009; Park 등, 2009; Tullet 등, 2008).
Cyanidin의 노화에 따른 신경퇴화 억제 효과를 확인하기 위해 기계적 감각 신경세포인 ALM과 PLM을 녹색 형광단백질로 표지한 형질전환체를 사용하여 세포의 형태적 변화를 관찰한 결과, cyanidin 처리군에서 신경퇴화가 현저하게 감소하였다. 이는 cyanidin이 노화에 따른 신경 손상과 기능 저하를 방지하고, 신경 보호 효과를 통해 신경계의 기능을 유지할 수 있음을 시사한다. 또한, 기계적 자극에 대한 반응 실험에서도 cyanidin 처리군이 대조군보다 19.05% 높은 반응 비율을 보였으며, 이는 cyanidin이 신경 기능 향상에 기여할 수 있음을 의미한다(Cho 등, 2022).
Cyanidin의 인지 기능 개선 효과는 본 연구의 중요한 결과 중 하나이다. 노화 과정에서 인지 기능 저하는 인간의 주요 문제 중 하나이며(Munasinghe 등, 2021), cyanidin 처리군에서 5일 및 10일 차에 각각 42.07%와 40.00%의 학습 지수 향상이 확인되었다. 이는 cyanidin이 신경 보호뿐만 아니라 인지 능력에도 긍정적인 영향을 미칠 가능성을 제시한다.
본 연구의 결과는 cyanidin이 예쁜꼬마선충에서 수명 연장, 신경퇴화 억제, 자극 반응 향상 및 인지 기능 개선에 유의미한 영향을 미친다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 cyanidin이 다양한 세포에서 노화 과정을 억제하는 데 기여할 수 있음을 시사하며, 그 항노화 효과는 SKN-1/Nrf2 경로와 IIS 경로 외에도 미토콘드리아의 기능적 조절과 관련이 있을 가능성을 제시한다.
특히, 플라보노이드가 미토콘드리아 기능 조절에 중요한 역할을 한다는 연구가 있으며(Cho 등, 2020), cyanidin 또한 미토콘드리아 짝풀림과 관련된 역할을 수행할 가능성이 제기된다. 미토콘드리아는 노화와 밀접한 관련이 있으며, 특히 ROS의 축적과 ATP 합성 감소는 세포 손상과 노화를 촉진하는 주요 요인으로 알려져 있다(Grimm과 Eckert, 2017). 미토콘드리아의 질적 조절 기작 중 하나인 mitophagy는 손상된 미토콘드리아를 제거하는 자가포식 작용(autophagy)으로 노화된 세포에서 중요한 역할을 한다(Ashrafi와 Schwarz, 2013). 많은 플라보노이드가 양성자를 운반하는 protonophore의 역할을 수행하기 적합한 산 해리상수(pKa) 값과 친유성(lipophilicity, logP) 값을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Cho 등, 2020). Cyanidin의 pKa와 logP 값은 각각 6.47과 2.41로(Wishart 등, 2007), cyanidin이 protonophore로서 작용할 가능성이 있음을 제시한다. 따라서 cyanidin이 선충의 노후한 미토콘드리아의 높아진 막전위(Ψm)를 낮추어 ROS 생성을 줄이거나, mitophagy를 유발하여 노후한 미토콘드리아를 제거하고 새로운 미토콘드리아의 생성을 촉진할 가능성이 제시된다. 따라서 cyanidin이 미토콘드리아의 막전위 조절을 통해 항산화 효과를 발휘하고 노화 과정을 늦추는 데 기여할 수 있는지에 대한 추가 연구가 필요하다. 특히, 미토콘드리아 짝풀림 효과와 관련된 구체적인 기전 연구는 cyanidin이 노화를 억제하는 작용을 더 명확히 규명하는 데 중요한 자료를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구는 cyanidin이 예쁜꼬마선충의 노화 및 신경 퇴행에 미치는 영향을 확인하기 위해 수행되었다. 수명 연장 실험에서 cyanidin 처리군은 대조군에 비해 15% 이상의 수명 연장 효과를 보였다. 또한, 노화에 의한 신경 퇴행 실험에서는 15일 차의 PLM 신경세포를 기준으로 비정상적인 형태의 발생 빈도가 대조군에 비해 20% 이상 감소하였으며, 자극 반응 실험에서도 10일 차를 기준으로 19% 이상의 반응 능력 향상이 관찰되었다. 단기 기억력 평가에서도 cyanidin 처리군은 대조군과 비교하여 10일 차를 기준으로 40% 이상 기억력이 향상되었다. 이러한 결과는 cyanidin이 항노화, 신경 퇴행 억제, 자극 반응 능력 및 단기 기억력 향상에 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사하며, 노화 및 노화 관련 질환 예방과 치료를 위한 잠재적 물질로서의 활용 가능성을 제시한다. 이를 위해 cyanidin의 항노화 작용기전에 대한 보다 심도 있는 연구와 기능성 제품 개발을 위한 추가 연구의 필요성이 제시된다.
본 연구는 2023년도 조선대학교 학술 연구비의 지원을 받아 수행되었음.
Table 1 . Summary of mean lifespan in
Fraction. | No. of worms. | Mean lifespan (days). | Age in days at 50% mortality. | Maximum lifespan (days). | Change in mean lifespan (%). |
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DMSO. 100 μM Cyanidin. | 402. 405. | 18.58±0.25. 21.39±0.3. | 19. 22. | 31. 36. | -. +15.12. |
The values were derived from the survival curves. A log-rank test showed a statistically significant difference (
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