비알코올성 지방간 질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 간세포의 5% 이상에서 지방변성을 특징으로 하는 진행성 간 질환으로 전 세계적 유병률은 30%이며 계속 증가하고 있다(Younossi 등, 2023; Yuan 등, 2024). 이 질환은 간 염증이나 손상 없이 단순히 지방이 축적된 상태로, 비만, 당뇨병, 고지혈증, 대사증후군 등에 의해 발생한다(Tang 등, 2024). 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)은 NAFLD의 한 형태로, 지방 축적뿐만 아니라 간세포에 대한 지방독성으로 인해 간 염증과 세포 주변 섬유증을 동반한다. 이로 인해 간 섬유화, 간경변, 심지어 간세포암의 위험이 높아진다(Tokushige 등, 2021). NASH는 전 세계적으로 심각한 건강 문제로 인정되지만, 승인된 약물이나 수술이 없어 치료 옵션이 제한적이다. 현재 관리 방식은 체중 감량, 지중해식 식단, 신체 활동 증가 등 생활 방식 개선에 의존한다(Lv와 Liu, 2024). 따라서 임상에서 효과적인 치료제 개발이 시급하다(Yuan 등, 2024).

콜린(choline)은 친수성 양이온으로, 신경 전달, 기억 강화, 막 생합성 및 대사 등 다양한 생리적 역할을 한다. 콜린 결핍 식단(choline-deficient high-fat diet, CDHFD)을 지속적으로 섭취하면 인간의 NASH와 유사한 심각한 간 지방증, 섬유증, 염증 세포 침윤을 유발할 수 있다(Iwata 등, 2008). 고지방 사료(high-fat diet, HFD)에 의한 NASH는 주로 지방 축적과 인슐린 저항성으로 인해 발생하며, 염증 및 산화 스트레스가 간 손상을 일으킨다(Zhang 등, 2023). 반면, CDHFD에 의한 NASH는 지방 대사와 수송 장애로 간에서 지방이 분해되지 않고 축적된다. 이는 콜린 결핍이 간세포 막 형성에 필요한 물질 부족을 초래해 지방간과 염증을 촉진하기 때문이다. 예를 들어, CDHFD를 섭취한 쥐는 초저밀도 지질단백질(very low density lipoprotein, VLDL)을 제대로 생성하거나 이동시키지 못해 간에 지방이 축적된다(Teodoro 등, 2008). CDHFD 모델은 유의미한 체중 변화 없이도 빠르게 NASH 병리를 유도하기 때문에, NASH의 병리 기전 규명과 치료 표적 식별에 자주 사용된다(Mei 등, 2024; Sato와 Oishi, 2024).

대마종자유[hemp(Cannabis sativa L.) seed oil]는 식물성 지방산으로 구성되어 있으며, 주요 오메가-3 및 오메가-6 다중불포화 지방산인 α-리놀렌산과 리놀레산을 포함한다. 이 지방산들은 강력한 항산화 활성을 지니고 있으며 면역 증강제로 작용한다. 또한, 대마종자유는 혈액순환과 신진대사를 촉진하고 염증을 완화하며 발암 억제 효과를 보여준다(Ampem 등, 2024). 최근 연구에 따르면, 대마종자유는 아질산나트륨 함량을 낮추어 발효육 제품의 영양가와 건강을 개선하는 기능성 성분으로 활용될 수 있다. 식품 산업에서 효과적인 열처리 방법으로 주목받고 있는 원적외선(far infrared) 조사는 식물 재료의 표면과 내부에서 균일하게 열을 발생시킨다(Duan 등, 2022). 이 방법은 건조 시간을 단축하고 비용을 줄이며, 식품의 품질과 안전성을 향상시킬 수 있어 다양한 분야에서 활용되고 있다(Wang 등, 2024). 또한, 올리브유(olive oil)는 최대 80%에 달하는 높은 단일불포화지방산(monounsaturated fatty acid, MUFA)을 함유하고 있으며, 페닐 알코올, 페놀산, 세코이리도이드, 플라보노이드 및 리그난과 같은 다양한 페놀성 항산화제가 존재하고, 주요 페놀성 화합물은 티로솔, 하이드록시티로솔, 올레우로페인 및 올레오칸탈이다(Córdoba 등, 2023). 항산화 역할 외에도 항균, 항염증 효과도 있으며(Tsimihodimos와 Psoma, 2024), 이러한 모든 특성은 신경퇴행성 질환, 암 및 류마티스 병리의 예방과 관련이 있다(Servili 등, 2014; Zhan-Dai 등, 2024).

본 연구에서는 원적외선 처리된 대마종자유와 올리브유의 식이 보충이 콜린 결핍 식이로 유발된 비알코올성 지방간염 마우스에서 간세포의 지질 축적을 개선한다는 것을 증명하였다. 이 효과는 산화적 스트레스 억제 및 염증성 반응 조절과 관련이 있었다.

시료 준비

본 실험에 사용한 대마종자유와 올리브유 혼합물은 농업회사법인(주)농부플러스에서 공급받았다. 대마종자는 원적외선 곡물볶음기(한국에너지기술)를 이용하여 온도 130°C, 열량 60으로 제조한 후, 내쇼날 콜드프레스 30K(내쇼날엔지니어링)를 이용하여 온도 85°C, 압착 속도 70, 필터 크기 3 μm로 착유하였다. 이후 올리브유를 1:1 배합으로 혼합하여 본 연구의 샘플로 사용하였다.

시약

본 실험에 사용된 nitrocellulose membrane은 Amersham GE Healthcare에서 구입하였다. Sterol regulatory element binding protein 1(SREBP-1), fatty acid synthase(FAS), stearoyl-CoA desaturase-1(SCD-1), sterol regulatory element binding protein 2(SREBP-2), 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase(HMGCR), inducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2), tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleukin-6(IL-6), interleukin-1β(IL-1β), lamin B1, β-actin은 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. 2차 항체는 GeneTex, Inc.에서 구입하였다. Protease inhibitor mixture, ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에서 구입하였다. ECL western blotting detection reagents는 GE Healthcare로부터 구입하여 사용하였으며, 단백질 정량을 위한 BCA protein assay kit은 Thermo Scientific에서 구입하였다.

오메가-3와 오메가-6 지방산 분석법

기체크로마토그래피는 SP-2560(100 m×0.25 mm×0.2 μm)을 이용하여 칼럼 온도 100°C에서 4분간 유지한 후 3°C/min의 비율로 240°C까지 온도를 상승시키고, 이후 15분 이상 유지하였다. 검출기 온도는 285°C, 유량은 헬륨 0.75 mL/min으로 하여 분석하였다. 지방산 분석 시 C18:3(linolenic acid)과 C20:1(eicosenic acid) 및 C22:1(docosaenoic acid), C20:3(eicosatrienoic acid)과 C20:4(arachidonic acid)의 분리도는 1.0 이상이었다. 유지를 메탄올성 수산화나트륨 용액으로 처리하여 알칼리염을 만든 후, 14% 트리플루오로보란메탄올 용액을 가하고 100°C에서 30분간 가열하여 에스테르화하였다. 생성된 지방산에스테르를 이소옥탄(isooctane)에 녹여 분석하였다. 개별 지방산 함량과 대표적인 지방산의 총량을 계산하여 다중불포화 지방산인 오메가-3와 오메가-6 지방산의 함량을 산출하였다.

비알코올성 지방간염 동물실험 모델 및 약물 투여

6주령의 수컷 C57BL/6J 생쥐를 DBL에서 구입했으며, 물과 NIH-41, Zeigler Bros, Inc.의 고형사료(조단백질 18% 이상, 조회분 8.0% 이하, 조지방 5.0% 이상, 조섬유 5.0% 이하, 칼슘 1.0% 이상, 나트륨 0.25% 이상, 인 0.85% 이상, 칼륨 0.55% 이상, 마그네슘 0.15% 이상)를 충분히 공급하며 일주일 동안 실험실 환경에 적응시켰다. 동물 사육실의 환경조건은 명암주기 12시간, 온도 22±2°C, 습도 50±5%로 조절하였다. 실험은 대구한의대학교 동물실험윤리위원회의 승인(번호: DHU2023-050)을 받아 윤리적 및 과학적 타당성 검토한 후 진행하였으며, 동물 관리 규정을 준수하였다.

실험군은 총 5군으로 각 군당 7마리로 나누었다. 나머지 3군은 45% 콜린 결핍 식이(CDHFD)를 14주 동안 공급하였으며 실험 종료 4주 전부터 약물을 경구투여하였다. 콜린이 결핍된 식단을 섭취하면 콜린이 포함된 식단 대비 체중 증가가 현저히 지연되며, 부고환주위 지방조직의 무게 또한 감소한다(Wu 등, 2012). 정상군 및 고지방 대조군에 대해서는 물을 투여하였고, 원적외선 처리된 대마종자유와 올리브유 혼합물 투여군에 대해서 저농도군(FML)은 1 mL/kg/d, 고농도군(FMH)은 2 mL/kg/d로 구분하여 투여하였다. 경구 투여량은 성인(60 kg)이 하루에 10 mL를 먹는다고 가정하여 마우스 환산지수(12.33)를 곱해 산출된 값을 고농도로, 그리고 고농도의 반에 해당하는 값을 저농도로 설정하였다. 혼합물은 매일 일정한 시간에 존대를 이용하여 1회 경구 투여하였다. 14주 실험 종료 후, isoflurane으로 마취한 뒤 심장천자를 통해 혈액을 채취하였으며, 4°C에서 1,508×g로 10분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 간조직은 -80°C에 보관하였다.

실험 식이

실험군에 공급된 식이는 Research Diets, Inc.로부터 구입하여 14주 동안 제공하였으며, 정상군(Normal)은 10% LFD를, 고지방 대조군(HFD-Control)은 45% HFD를 먹였다. 또한, 콜린 결핍 식이를 급여한 군들은 45% CDHFD를 먹였다(Table 1).

Table 1 . Composition of the experimental diet used in this study.

(unit: g).

		10% LFD1) (D12450B).	45% HFD2) (D12451).	45% CDHFD3) (D05010402).
Protein.	Casein, lactic, 30 mesh. Cystine, L.	200. 3.	200. 3.	200. 3.
Carbohydrate.	Sucrose. Starch, corn. Lodex 10.	354. 315. 35.	176.8. 72.8. 100.	176.8. 72.8. 100.
Fiber.	Fiber, solka floc.	50.	50.	50.
Fat.	Soybean oil. Lard.	25. 20.	25. 177.5.	25. 177.5.
Mineral.	Mineral.	50.	50.	50.
Vitamin.	Vitamin, choline bitartrate. Vitamin, V10001C.	2. 1.	2. 1.	－. 1.
Dye.	Dye, yellow. Dye, red. Dye, blue.	0.05. －. －.	－. 0.05. －.	－. 0.03. 0.03.
Total.		1,055.05.	858.15.	856.15.

¹⁾LFD: low-fat diet. ²⁾HFD: high-fat diet. ³⁾CDHFD: choline-deficient high-fat diet..

혈청 분석

활성 산소종(reactive oxygen species, ROS) 측정은 Ali 등(1992)의 방법을 적용하여 측정하였다. ROS 측정을 위해 혈청과 molecular probes의 25 mM 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate(DCF-DA)를 혼합한 후, 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 5분씩 35분간 emission 파장 530 nm와 excitation 파장 485 nm를 이용하여 30분간 측정하였다. 결과는 25분에 측정된 ROS 값을 기준으로 계산하였으며, 정상군의 값에 대해 상대적인 비로 표현하였다.

혈청 내 간 기능 관련 바이오마커인 glutamic oxaloacetic transaminase(GOT)와 glutamic pyruvic transaminase(GPT)는 Asan Pharmaceutical Co., Ltd.로부터 assay kit을 구입하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.

혈청 내 지질 관련 지표인 triglyceride(TG)와 total cholesterol(TC)은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.의 상업용 kit을 사용하여 측정하였다. 고밀도지단백 콜레스테롤(HDL-cholesterol, HDL-C)은 Asan Pharmaceutical Co., Ltd.로부터 kit을 구매하여 분석하였다. 반면, 저밀도지단백 콜레스테롤(LDL-cholesterol, LDL-C)은 TC, TG, HDL-C 수치를 이용하여 다음과 같이 계산하였다.

LDL-C＝TC－HDL-C－(TG/5)

간조직 western blotting

단백질 분리는 이전 연구에서 사용한 방법에 따라 수행하였다(Lee 등, 2022). 10~12 μg의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동 한 후, nitrocellulose membrane으로 단백질을 전이시켰다. 이후, 4°C에서 membrane에 1차 항체를 phosphate buffered saline with Tween 20(PBS-T)로 1:1,000으로 희석하여 overnight 반응시킨 후, PBS-T로 세척하였다. 다음으로, 1차 항체에 맞는 2차 항체를 PBS-T로 1:5,000으로 희석하여 실온에서 2시간 반응시킨 후, 다시 PBS-T로 세척하였다. 마지막으로, ECL 용액을 적용하여 Vilber Fusion Solo X로 단백질 발현을 촬영하였고, 촬영된 밴드는 Vilber EvolutionCapt 소프트웨어를 사용하여 정량하였으며, 이를 정상군과 비교하여 상대적인 발현량(fold of normal)을 평가하였다.

조직병리학적 분석

간조직 및 부고환주위 지방조직의 조직병리학적 변화를 평가하기 위하여 간조직을 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린을 이용하여 고정하고 5 μm 섹션으로 절단 후, hematoxylin & eosin(H&E) 조직 염색 방법으로 염색하였으며, 염색된 슬라이드를 광학현미경(Olympus BX51)으로 관찰하였다.

통계분석

실험 데이터는 평균(mean)과 표준오차의 평균(SEM)으로 표시하였으며, SPSS(version 27.0, IBM)를 사용하여 일원배치분석(one-way analysis of variance)을 실시한 후, 최소유의차검정(least-significant differences)으로 사후검정을 진행하였다. 유의수준은 P<0.05로 설정하였으며, 이를 기준으로 통계적 유의성을 판단하였다.

총폴리페놀, 총플라보노이드, 오메가-3 및 오메가-6 측정

세포 호흡 과정에서 생성된 ROS는 DNA, 세포막 지질, 단백질과 반응하여 당뇨병, 고혈압, 암, 신경 퇴행성 질환 등 다양한 건강 문제를 일으킬 수 있다(Dibacto 등, 2021). 항산화제가 풍부한 식품을 섭취하면 이러한 만성 질환의 위험이 감소하는 것으로 알려져 있으며, 식품의 페놀 함량이 총 항산화 활성에 중요한 역할을 한다(Tremocoldi 등, 2018). 오메가-3 및 오메가-6 다중불포화지방산(PUFA)은 일반적으로 식이 보충제로 사용되며 관상동맥 심장질환 및 천식에 대해 상당한 예방 효과를 나타내는 것으로 입증되었다(Jiang 등, 2022). 오메가-3 PUFA는 항염 특성으로 인해 염증성 장질환의 위험을 감소시키고(Astore 등, 2022), 오메가-6 PUFA는 무릎과 엉덩이의 골관절염 위험을 감소시킬 수 있으므로 자가면역 질환의 예방 및 치료에 잠재력이 있을 수 있다. 그러나 종양 위험에 대한 효과는 논란의 여지가 있다(Chen 등, 2024).

원적외선 공정을 거치기 전 냉압착 대마종자유의 총폴리페놀, 총플라보노이드, 오메가-3 및 오메가-6는 각각 20.04±0.68 mg/100 g, 29.20±0.45 mg/100 g, 15.96±0.74 g/100 g, 54.11±0.92 g/100 g으로 나타났으며, 오메가-3와 오메가-6의 비율은 1:3.4였다. 반면, 원적외선 공정을 거친(열량 세기 60°C, 130°C) 냉압착 대마종자유의 총폴리페놀, 총플라보노이드, 오메가-3 및 오메가-6는 각각 45.10±1.92 mg/100 g, 35.27±0.98 mg/100 g, 17.96±0.12 g/100 g, 51.51±0.35 g/100 g으로 나타났으며, 총폴리페놀은 2.25배, 총플라보노이드는 1.21배, 오메가-3는 1.13배로 증가하였고 오메가-6는 4.8% 감소하는 효과를 보여주었다(Table 2).

Table 2 . Measurement of far infrared processed hemp seed oil used in this study.

Test items.	Cold pressing hemp seed oil.	Far infrared-processed cold. pressing hemp seed oil.
Total polyphenol (mg/100 g). Total flavonoid (mg/100 g). Omega-3 (g/100 g). Omega-6 (g/100 g).	20.04±0.68. 29.20±0.45. 15.96±0.74. 54.11±0.92.	45.10±1.92. 35.27±0.98. 17.96±0.12. 51.51±0.35.

Values are mean of three replicate determinations±SEM..

원적외선 공정으로 총플라보노이드와 총폴리페놀 함량이 증가하면 항산화 기전이 강화될 뿐만 아니라, 오메가-3와 오메가-6 비율의 증가로 염증성 질환 및 NASH와 같은 염증 관련 질환의 위험이 감소하고 지방 분해가 촉진되어 지질 대사가 개선됨으로써 NASH의 예방과 진행 억제에 기여할 수 있을 것이다.

주별 체중 변화

NASH는 간경변과 간세포암으로 진행될 수 있는 만성 간질환의 흔한 원인으로 인간 NASH의 병인을 밝히기 위해 마우스 모델(식이 유도 모델 또는 유전적 돌연변이 모델)에서 여러 실험 연구가 수행되었다(Kamada 등, 2007; Rinella 등, 2008). 식이 유도 모델 중 콜린 결핍 NASH 모델은 지방 대사를 연구하는 데 적합한 모델이다(Honda 등, 2017). 최근 연구에서는 만성 질환을 저용량으로도 효과적으로 치료할 수 있다는 증거를 제시하며, 최적의 약물 복용량이 개인마다 다르고 시간이 지남에 따라 변할 수 있음을 밝히고 있다. 따라서 만성 질환 치료 시 각 환자에게 적절한 복용량을 설정하고 유지하기 위해서는 면밀한 임상 모니터링이 필요하다(Dimmitt와 Stampfer, 2009). 또한, 기출판된 연구에서는 대마종자유를 저농도로 투여했을 때, 고콜레스테롤 식이를 섭취한 흰쥐에서 더 뛰어난 항염증 효과와 지질 축적 개선 효과를 보였음을 확인하였다(Lee 등, 2022). 실험 기간의 체중 변화를 분석한 결과(Fig. 1), HFD-Control군은 정상군 대비 3주부터 14주까지 유의적으로 체중이 증가하였으며, CDHFD-Control군은 8주부터 실험 종료까지 연속적으로 유의하게 증가하였다(3주 P<0.05, 8~9주 P<0.05, 10~14주 P<0.01). 또한, HFD-Control군과 CDHFD-Control군을 비교 분석하였을 때 4주부터 유의한 차이를 보여주었다(4~5주 P<0.05, 6주 P<0.01, 7~14주 P<0.001). 실험 종료 시 CDHFD-Control군은 체중 변화가 정상군 대비 2.7배로 유의하게 증가하였다(P<0.001). HFD-Control군과 CDHFD-Control군을 비교 평가하였을 때, CDHFD-Control군이 HFD-Control군 대비 45% 유의하게(P<0.001) 감소함을 보여주었다. FML의 처리는 CDHFD-Control군 대비 3.0% 감소하였고, FMH의 처리는 CDHFD-Control군 대비 2.5% 감소하였다.

Fig 1. Weekly body weight. During the 14-week experiment, we conducted a weekly weight change analysis, starting with a comparison of the normal group, HFD-Control, and CDHFD-Control. We then compared CDHFD-Control with the far infrared-processed hemp seed oil and olive oil mixture (FM) treatment group, finding no significant differences between them. Normal: mice fed a 10% low-fat diet, HFD-Control: mice fed a 45% high-fat diet, CDHFD-Control: mice fed a 45% high-fat diet without choline, FML: mice fed a 45% high-fat diet without choline and treated with at FM 1 mL/kg/d orally, FMH: mice fed a 45% high-fat diet without choline and treated with at FM 2 mL/kg/d orally. All values are expressed as means±SEM (n=7 animal/group). ^#P<0.05, ^##P<0.01, ^###P<0.001 compared with Normal group.

상대적 지방조직 무게 분석

콜린 공급이 고지방 식단으로 인한 비만과 마우스의 인슐린 저항성과 직접적으로 관련이 있다는 것이 널리 알려져 있다. 따라서 콜린이 결핍된 식단을 섭취하면 콜린이 포함된 식단 대비 체중 증가가 현저히 지연되며, 부고환주위 지방조직의 무게 또한 감소한다(Wu 등, 2012).

실험 종료 후, 부고환주위 지방조직을 채취한 뒤 체중으로 나누어 상대적 비(%)를 구하였을 시, 정상군 대비 HFD-Control은 4.3배로 유의하게 증가하였으며(P<0.001), CDHFD-Control군은 정상군 대비 3.4배로 유의하게 증가하였다(P<0.001). 이러한 증가는 FM의 처리에 의해 두드러지게 감소하였으며(FML P<0.001, FMH P<0.05), 특히 FML의 처치가 FMH 처치보다 13.96% 감소시켰다(Fig. 2).

Fig 2. Effects of FM treatment on relative fat weight. Relative fat weight (%) was calculated by dividing fat weight by body weight. All values are expressed as means±SEM (n=7 animal/group). ^###P<0.001 compared with Normal group and ^*P<0.05, ^***P<0.001 compared with CDHFD-Control group.

혈청 내 활성산소종 분석

일반적으로 정상 조건에서 미토콘드리아의 β-산화로 인해 발생하여 에너지가 생성한다. 그러나 과도한 지방산의 유입이 이루어지면 미토콘드리아의 β-산화가 포화하고 과산화물 및 미세소체를 포함한 부위에서 산화 과정이 증가하여 ROS의 생성이 증가한다. 따라서 미토콘드리아 기능 장애와 산화 스트레스의 유발은 간 손상의 진행에 중요한 역할을 한다(Park 등, 2023).

혈청에서 산화적 스트레스 인자인 ROS를 측정하였을 때(fold of normal), HFD-Control군은 정상군 대비 1.35배로 유의하게 증가하였고(P<0.01), CDHFD-Control군은 정상군 대비 1.18배로 유의하게 증가하였다(P<0.05). 반면에 FML군은 CDHFD-Control군보다 11.86% 유의하게 감소하였고(P<0.01), FMH군은 CDHFD-Control군보다 8.47% 유의하게 감소하였다(P<0.01). 혈청 내 ROS를 FML군과 FMH군 간에 비교 분석하였을 때, FML군이 FMH군에 비해 유의하지는 않으나(P=0.671) 3.7% 더 개선함을 보여주었다(Fig. 3).

Fig 3. Effects of FM treatment on serum ROS level in a diet-induced NASH model. Mice were fed HFD or CDHFD for the induction of NASH for 14 weeks. FM was supplied orally in concentration of 1 or 2 mL/kg/d for 4 weeks. All values are expressed as means±SEM (n=7 animal/group). ^#P<0.05, ^##P<0.01 compared with Normal group and ^**P<0.01 compared with CDHFD-Control group.

혈청 내 간기능 효소 및 지질 관련 인자 분석

콜린 결핍 식단의 공급은 간 총 지질, 중성지방, 콜레스테롤 및 인지질 함량이 콜린이 충분한 식단보다 유의하게 높음을 보고하였다(Nocianitri와 Aoyama, 2001). 또한, 콜린은 VLDL의 필수 구성 요소인 포스파티딜콜린의 합성에 필요하기에 콜린이 부족하면 VLDL의 생성이 억제되거나 불균형해진다(Sergi, 2024). 간 내 지방 축적은 간세포의 손상과 염증을 유발하며, 이로 인해 간 기능 효소 수치가 상승한다(Sookoian과 Pirola, 2019). Fig. 4A에서는 GOT와 GPT를 포함하는 간기능 효소를, Fig. 4B에서는 지질 관련 인자들을 분석하였다. 혈청 내 GOT와 GPT는 HFD와 CDHFD의 급여에 의해 탁월하게 상승하였으며(P<0.001), 이러한 증가는 FML 처치에 의해 각각 23.1%와 6.1% 유의하게(GOT P<0.01, GPT P<0.05) 감소하였다.

Fig 4. Effects of FM treatment on serum liver function tests (A) and serum lipid related factors (B). Mice were fed HFD or CDHFD for the induction of NASH for 14 weeks. FM was supplied orally in concentration of 1 or 2 mL/kg/d for 4 weeks. All values are expressed as means±SEM (n=7 animal/group). ^##P<0.01, ^###P<0.001 compared with Normal group and ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared with CDHFD-Control group.

혈청 내 중성지방(mg/dL) 함량 분석 결과(Fig. 4B), HFD-Control군은 정상군 대비 1.78배로 유의하게 증가하였고(P<0.001), CDHFD-Control군은 정상군 대비 1.48배로 유의하게 증가하였다(P<0.01). 반면 FML군은 CDHFD-Control군 대비 24.66%(P<0.05), FMH군은 15.64% 감소하였다. 하지만 HFD-Control군과 비교하였을 시, FML군은 37.24%(P<0.001)로, FMH군은 29.74%(P<0.01)로 유의하게 감소하였다. 혈청 내 TC(mg/dL) 함량 분석 결과, HFD-Control군은 정상군 대비 2.21배로 유의하게 증가하였고(P<0.001), CDHFD-Control군은 정상군 대비 1.51배로 유의하게 증가하였다(P<0.001). 반면 FML군은 CDHFD-Control군 대비 17.97%(P<0.001), FMH군은 11.77%(P<0.01)로 유의하게 감소하였다. 특히 HFD-Control군과 비교하였을 시, FML군은 43.97%(P<0.001)로, FMH군은 39.73%(P<0.001)로 유의하게 감소하였다. 결과적으로 FML의 처치가 FMH 처치보다 7% 더 감소시키는 것으로 나타났다. 또한, HDL-C는 FM 처치군에서 CDHFD-Control군 대비 각각(FML 1.14배, FMH 1.20배) 상승하였으나 LDL-C는 FM 처치군에서 CDHFD-Control군 대비 각각(FML 22.6%, FMH 15.3배) 감소하였다. 특히, VLDL-C는 FM을 처치한 모든 군에서 유의적으로(FML P<0.01, FMH P<0.05) 각각 20.8%, 16.7% 억제하였다.

간조직 내 중성지방 및 콜레스테롤 함량 분석

간조직 내 중성지방(mg/g protein) 함량 분석 결과, HFD-Control군은 정상군 대비 1.56배로 유의하게 증가하였고(P<0.001), CDHFD-Control군은 정상군 대비 1.66배로 유의하게 증가하였다(P<0.001). 반면, FML 처치는 HFD-Control군 대비 23.6%, CDHFD-Control군 대비 28.2% 유의하게 감소하였다(P<0.001). 간조직 내 TC(mg/g protein) 함량 분석 결과, HFD-Control군과 CDHFD-Control군은 정상군 대비 1.45배로 유의하게 증가하였지만(P<0.001), FML 처치는 HFD-Control군 대비 28.2%, CDHFD-Control군 대비 28.2% 유의하게 감소하였다(Fig. 5).

Fig 5. Effects of FM treatment on hepatic triacylglycerol (TG) and cholesterol contents in a diet-induced NASH model. Mice were fed HFD or CDHFD for the induction of NASH for 14 weeks. FM was supplied orally in concentration of 1 or 2 mL/kg/d for 4 weeks. All values are expressed as means±SEM (n=7 animal/group). ^##P<0.01, ^###P<0.001 compared with Normal group and ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared with CDHFD-Control group.

Western blotting 결과 분석

간의 지방 생성과 지방산 β-산화는 간의 지질 축적을 조절하는 데 중요한 역할을 한다(Yang 등, 2020). 콜린이 결핍된 식단을 섭취하면 지질 대사와 관련된 다양한 유전자의 발현이 유도되며, 특히 디아실글리세롤(diacylglycerol)의 중성지방으로의 최종 에스테르화 단계를 담당하는 효소인 Dgat2의 수치가 증가하는 것으로 보고되었다(Raubenheimer 등, 2006). De novo lipogenesis는 아세틸-CoA가 아세틸-CoA 카르복실화효소와 지방산 합성효소(FAS)를 통해 지방산으로 전환되는 과정으로, 지질 대사에서 중요한 역할을 하며 비정상적으로 활성화할 경우 간 지방증을 초래할 수 있다. 이 과정에서 주요 지방 생성 효소는 스테롤 조절 요소 결합 단백질(SREBP)에 의해 조절되며, SREBP-1c는 중성지방 합성에, SREBP-2는 콜레스테롤 합성에 관여한다(Yao 등, 2024). 또한, 미토콘드리아의 β-산화가 장애를 겪으면 과도하게 생성된 ROS와 지질 과산화 생성물이 염증성 사이토카인 생성을 상향 조절하여 염증 반응을 가속한다(Park 등, 2023; Sergi, 2024).

간조직 내 중성지방 합성 관련 인자 발현량을 분석한 면역 블롯 결과, HFD 또는 CDHFD 보충이 전사인자인 SREBP-1의 발현을 유의하게(HFD P<0.01, CDHFD P<0.001) 증가시킨 것으로 나타났다(Fig. 6). 그러나 FML 투여는 이러한 단백질 수치를 CDHFD-Control군 대비 24.4% 유의하게 억제하였고(SREBP-1 P<0.05), 이로 인해 하위 인자인 지방 생성 유전자(FAS P<0.01, SCD-1 P<0.05)의 발현이 각각 22.2%와 25.8%로 유의하게 감소하였다.

Fig 6. Effects of FM treatment on proteins involved in the synthesis of triacylglycerol (TG) in liver tissue of a diet-induced NASH model. SREBP-1, a transcription factor for TG synthesis, and its downstream factor, FAS and SCD-1, were analyzed. All values are expressed as means±SEM (n=7 animal/group). ^#P<0.05, ^##P<0.01, ^###P<0.001 compared with Normal group and ^*P<0.05, ^**P<0.01 compared with CDHFD-Control group.

간조직 내 콜레스테롤 합성 관련 인자 발현량을 분석한 면역 블롯 결과(Fig. 7), HFD 또는 CDHFD 보충이 전사인자인 SREBP-2의 발현을 유의하게(HFD P<0.001, CDHFD P<0.001) 증가시킨 것으로 나타났다. 그러나 FML 투여는 이러한 단백질 수치를 CDHFD-Control군 대비 28.5% 의미 있게 억제하였고(SREBP-2 P<0.001), 이로 인해 하위 인자인 지방 생성 유전자(HMGCR P<0.01)의 발현이 CDHFD-Control군 대비 20.0%로 유의하게 감소하였다.

Fig 7. Effects of FM treatment on proteins involved in the synthesis of cholesterol in liver tissue of a diet-induced NASH model. SREBP-2, a transcription factor for cholesterol synthesis, and its downstream factor, HMGCR, were analyzed. All values are expressed as means±SEM (n=7 animal/group). ^###P<0.001 compared with Normal group and ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared with CDHFD-Control group.

간조직에서 염증성 매개인자인 iNOS와 COX-2의 발현을 분석한 결과(Fig. 8A), HFD-Control군에서 정상군 대비 각각 1.61배와 1.82배로 유의하게 증가하였고(P<0.001), CDHFD-Control군에서도 각각 1.49배, 1.50배 유의하게 증가하였다(P<0.001). 반면, FML 처치군에서는 두 인자가 유의하게 억제되었으며(iNOS P<0.01, COX-2 P<0.001), CDHFD-Control군 대비 각각 22.8%와 32.0% 효과적으로 억제되었다. 또한, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현을 분석한 결과(Fig. 8B), 모든 HFD-Control군과 CDHFD-Control군에서 유의한 증가가 확인되었다. 이러한 증가는 FML 처치에 의해 TNF-α에서는 감소하는 경향을 보였으나, 나머지 두 인자(IL-1β 및 IL-6)는 CDHFD-Control군대비 각각 20.8%와 19.7% 유의하게 억제되었다(IL-1β P<0.01, IL-6 P<0.01). 따라서 FML 처치는 염증성 단백질의 발현을 효과적으로 억제하여 염증 완화 효과를 보이는 것으로 판단된다.

Fig 8. Effects of FM treatment on the protein expressions of inflammatory mediators (A) and inflammatory cytokines (B) in liver tissue. All values are expressed as means±SEM (n=7 animal/group). ^##P<0.01, ^###P<0.001 compared with Normal group and ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared with CDHFD-Control group.

조직병리학적 관찰

콜린이 결핍된 식단을 섭취하면 간 지방 축적이 증폭되어 NASH 모델을 유도할 수 있다(Cortez-Pinto와 Camilo, 2004). H&E 염색으로 지방조직의 지방세포 크기를 분석한 결과, 정상군에 비해 45% 고지방 사료를 먹은 HFD-Control군의 지방세포 크기가 확연하게 커진 것을 확인하였다. 반면 CDHFD-Control군의 지방세포 크기는 HFD-Control군보다 줄어든 것을 확인하였으며, FML군과 FMH군은 CDHFD-Control군 대비 지방세포 크기가 줄어든 것으로 나타났다(Fig. 9).

Fig 9. Histopathoological analysis using H&E staining in the epididymal fat tissue (A) and Oil Red O staining in the liver tissue (B). Magnification: ×200, scale bar: 50 μm.

이 연구는 원적외선 처리된 대마종자유와 올리브유 혼합물(FM)이 콜린 결핍 고지방 식이(CDHFD)로 유도된 비알코올성 지방간염(NASH) 모델에서 간의 지방 축적에 미치는 영향을 조사하였다. 실험 결과, CDHFD 대조군의 상대적 간 지방 무게가 유의하게 증가했지만, FM 처리군에서는 극적으로 감소하였다. 특히, FM 1 mL/kg/d로 투여한 처리군은 간 지방 축적, 염증 단백질, 지방세포 크기의 감소에 효과적이었다. 결론적으로, 원적외선 처리된 대마종자유와 올리브유 혼합물은 산화 스트레스 억제, 염증 완화, 지질 관련 인자들의 억제를 통해 간조직 내 지질 축적을 개선할 수 있음을 증명하였다.

본 성과물은 2023년 대구한의대학교 한의학과•제한동의학술원 연구 기금과 중소벤처기업부(MSS)의 기술개발사업(S3371467), 그리고 2024년도 정부(과학기술정보통신부, RS-2018-NR031032)의 재원을 받아 수행된 연구이다.