바다제비집(edible bird’s nest, EBN)은 동남아시아 지역에 주로 서식하는 작은 바다제비인 금사연(金絲燕, 학명: Aerodramus fuciphagus)의 타액으로 형성된 둥지를 의미한다. 금사연은 해안 절벽 위에 둥지를 짓는데, 이는 소화샘에서 나온 소화되지 않은 음식물을 토해내어 이루어진다. 바다제비집은 수백 년 동안 중국에서 귀한 식재료로 여겨져 왔으며, 보양과 건강증진 효과가 있다고 알려져 있다(Babji 등, 2008; Hobbs, 2004). 우리나라에서도 바다제비집 요리는 보양강장식으로 유명하며, 본초강목습유에서는 ‘피부를 윤택하게 하고 혈액에 유익하여 생기를 돋운다’고 소개되어 있다. 또한, 가래를 제거하고 천식을 조절하며 기관지염이나 기침에 특히 효과적인 것으로 기록되어 있다(Kim과 Yoon, 2013). 바다제비집은 풍부한 단백질, 아미노산, 당, 미네랄 및 항산화 물질을 포함하고 있으며, 세포 기능을 촉진하고 면역 체계를 강화하는 데 필수적인 에너지원으로 제시되고 있다(Matsukawa 등, 2011; Roh 등, 2012; Yu-Qin 등, 2000; Zhang 등, 2012).

인체의 면역계는 자외선, 환경오염 물질, 바이러스, 박테리아 등 다양한 외부 요인에 민감하게 반응하며, 이러한 요인에 대응하여 항상성을 유지하는 것이 매우 중요하다. 인체 면역 반응은 선천 면역(innate immune response)과 적응 면역(adaptive immune response)으로 구분된다(London 등, 2016). 선천 면역은 감염에 대한 경험이 없더라도 신속하게 반응하여 일차 방어 역할을 수행하는 비특이적 면역(non-specific immunity)이다(Greenberg와 Grinstein, 2002; Hoebe 등, 2004). 후천 면역은 선천 면역 반응 이후 특정 항원에 반응하는 특이적 면역 반응을 의미한다(Marshall 등, 2018). 두 면역 체계는 병원성 물질의 침입을 통제할 뿐만 아니라, 병원성 물질에 대한 항체 생산을 증가시켜 각종 질병을 예방하는 데 효과적인 방어체계를 형성한다(Cho 등, 2018). 특히 대식세포는 체내의 모든 조직에 분포하며 선천 면역과 후천 면역 모두에 관여하고 있다. 대식세포가 항원 자극에 의해 활성화되면 면역 활성 매개 물질인 산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 증가시켜 체내 유해균의 증식을 억제할 뿐만 아니라 바이러스와 암세포 등에 대한 탐식 작용 및 interleukin-1β(IL-1β), IL-6, tumor necrosis factor-α(TNF-α)와 같은 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 생산하여 체내 면역반응에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다(Hibbs 등, 1988; Higuchi 등, 1990; McDaniel 등, 1996). 이러한 선천 면역 반응은 nuclear factor-κB(NF-κB) 및 mitogen-activated protein kinases(MAPKs) 신호전달경로의 활성화와 관련된 인자의 인산화가 관여하는 것으로 알려져 있다(Byun, 2017; Yoo 등, 2022).

바다제비집의 효능과 관련된 연구에서 Yida 등(2015)은 바다제비집 추출물이 고지방 식단(high fat diet) 유도 인슐린 저항성 랫에서 혈청 아디포넥틴 수준을 증가시켜 총콜레스테롤을 감소시키고 인슐린 저항성을 개선했다고 보고하였다. 또한 Yew 등(2014)에 따르면 바다제비집 추출물은 SH-SY5Y 신경아세포를 사용한 neurotoxin 6-hydroxydopamine 유도 파킨슨병 모델에서 산화적 스트레스를 감소시켜 세포 사멸을 억제한다고 보고하였다. 뿐만 아니라 T 림프구 형질 전환과 면역글로불린 M(IgM) 생성을 촉진하고, B세포 활성화를 통해 항체 생산 수준이 증가하여 특이적 및 비특이적 면역 기능이 모두 향상되는 것으로 알려져 있다(Cao 등, 2012; Zhang 등, 1994; Zhao 등, 2016). 그러나 현재까지 바다제비집의 대식세포 기반의 면역 증강 효과에 대한 과학적 근거는 부족한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 대표적인 대식세포 중 하나인 RAW 264.7 세포에 대한 EBN 추출물의 대식세포 내 면역 활성 효과 및 작용 기전을 확인하였고, 이를 기반으로 면역 증강 기능성 소재로의 이용 가능성을 평가하고자 한다.

EBN 추출물 제조

EBN 추출물을 얻기 위하여 푸억틴네스트(Phuoc Tín Nest)에서 원물을 구매하여 사용하였다. 원물을 곱게 분쇄한 후 시료 100 g에 원물 대비 20배에 해당하는 정제수 2 L를 추가하여 온도 90°C에서 3시간 동안 추출하였다. 추출된 용액을 400×g, 4°C 조건에서 원심분리하여 상등액을 획득하였다. 이 추출 상등액은 거름종이(qualitative filter papers No. 2, Advantec)로 필터링한 다음 동결 건조하여 -70°C에서 보관하여 실험에 사용하였다. 모든 실험의 대조군(CON)은 EBN 추출물 제조에 사용된 정제수를 사용하였다.

세포 배양

한국세포주은행에서 RAW 264.7 마우스 대식세포를 분양받아 10% fetal bovine serum(Gibco BRL), 100 unit/mL의 penicillin 및 streptomycin이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Gibco BRL) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

세포 생존율 측정

RAW 264.7 대식세포에 대한 EBN의 세포독성을 확인하기 위해서 WST-1 assay 원리를 이용하였다. 먼저 세포독성은 96-well plate에 RAW 264.7 대식세포를 1×10⁴ cell/well의 농도로 100 μL씩 접종하여 24시간 배양 후 EBN을 12.5, 25, 50, 100, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL 농도로 24시간 처리하여 확인하였다. 배양된 well에 각각 Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System(Takara) 10 μL를 첨가하여 1시간 배양 후 microplate reader(Perkin Elmer)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

NO 생성량 측정

96-Well plate에 RAW 264.7 대식세포를 1×10⁴ cell/well로 분주한 후, 37°C, 5% CO₂ incubator에 24시간 동안 배양하면서 세포를 완전히 부착되도록 하였다. 이후 농도별 EBN(12.5, 25, 50, 100, 125, 250, 500, 1,000 μg/mL)과 양성대조군인 lipopolysaccharide(LPS; Sigma-Aldrich) 1 µg/mL를 처리한 후 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양 상등액을 분리하고 분리된 배양 상등액 100 µL에 동량의 Griess 시약(Sigma-Aldrich)을 추가하여 10분 동안 암실에서 반응시킨 후 micro-plate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

대식세포 탐식능(phagocytosis) 측정

RAW 264.7 대식세포의 탐식능은 Phagocytosis assay 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 제조사가 제시한 방법에 따라 측정하였다. RAW 264.7 세포를 96-well plate에 1×10⁵ cell/well로 분주하여 24시간 배양한 후 50, 100, 200 μg/mL 농도의 EBN과 양성대조군으로 LPS 1 µg/mL 함유된 배지로 세포배양액을 교환하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 FITC-labeled E. coli 입자를 2시간 동안 처리한 후 0.25% trypan blue를 150 μL를 실온에서 1시간 처리하여 lysis buffer를 이용해 세포를 용해시켰다. Microplate reader를 사용하여 480~520 nm에서 형광 강도를 측정하였다.

Real-time polymerase chain reaction(PCR)

RAW 264.7 대식세포를 6-well plate에 1×10⁶ cell/well로 분주하여 12시간 동안 부착시켰다. 이후 EBN을 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 처리하였고, 양성대조군으로 LPS 1 µg/mL 농도로 처리하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 세포에 RNAiso Plus(Takara)를 처리하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 cDNA reverse transcription kit(바이오팩트)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 프라이머, SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad)을 혼합하여 실시간 정량 PCR을 실시하였고, 기기는 CFX Opus 96 Real-Time PCR System(Bio-Rad)을 사용하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR 프라이머의 염기서열은 다음과 같다: IL-1β forward 5′ CCT TCC AGG ATG AGG ACA TGA 3′, reverse 5′ TGA GTC ACA GAG GAT GGG CTC 3′, IL-6 forward 5′ GAG GAT ACC ACT CCC AAC AGA CC 3′, reverse 5′ AAG TGC ATC ATC GTT GTT CAT ACA 3′, TNF-α forward 5′ CAG GCG GTG CCT ATG TCT C 3′, reverse 5′ CGA TCA CCC CGA AGT TCA GTA G 3′, iNOS forward 5′ ACA TCG ACC CGT CCA CAG TAT 3′, reverse 5′ CAG AGG GGT AGG CTT GTC TC 3′, GAPDH forward 5′ CGA CTT CAA CAG CAA CTC 3′, reverse 5′ GTA GCC GTA TTC ATT GTC AT 3′. Real-time PCR 반응은 총 20 μL 내에 cDNA 2 μL와 2× SYBR mix 10 μL, forward 및 reverse 프라이머 각각 100 pmol/μL를 1 μL씩 첨가하고, 나머지는 정제수로 채워 주었다. 모든 유전자에 대해 PCR 증폭 단계는 다음과 같으며, 총 40 cycle을 실시하였다. 95°C에서 8분간 초기 변성 후 증폭 단계에서 변성을 95°C에서 15초, 결합을 60°C에서 45초, 신장을 72°C에서 45초간 반복하였다. 각 cycle의 신장 단계 후에 값이 기록되었다. 모든 cycle이 완료된 후 프라이머의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다.

Western blot

RAW 264.7 대식세포를 6-well plate에 1×10⁶ cell/well로 분주하여 12시간 동안 부착시켰다. 완전히 부착시킨 후 EBN의 농도 및 시간별 MAPKs(extracellular signal regulated kinase, ERK; p38; c-Jun N-terminal kinase, JNK), NF-κB, inhibitor kappa B(IκB) 인산화에 대한 영향을 조사하기 위하여 100 μg/mL 농도의 EBN을 10, 30, 60, 120분 동안 처리하거나 50, 100, 200 μg/mL 농도의 EBN을 60분 동안 처리하였다. CETi Lysis Buffer(트랜스랩)로 cell lysis 시켜 3,000×g, 10분 동안 원심분리하여 cell lysate를 분리하였으며, 단백질 정량은 Protein Assay Plus kit(GenDEPOT)을 이용하여 정량하였다. Well당 40 µg의 cell lysate를 10% polyacrylamide gel에 각각 loading 하여 SDS-PAGE로 변성 분리하였으며, 이를 poly-vinylidene difluoride membrane(Millipore)으로 전기영동하였다. 이후 membrane에 5% 탈지유로 1시간 정도 blocking 하였다. 이후 TBST(20 nM tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.5)로 20분씩 3회 세척하였으며, phosphate-ERK(p-ERK), ERK, p-p38, p38, p-JNK, JNK, p-NF-κB, NF-κB, p-IκB, IκB의 발현량을 측정하기 위해 1차 항체(Cell Signaling Technology)를 1:1,000으로 희석하여 4°C에서 overnight 시키고, TBST로 10분간 3회 세척하였다. 이후 2차 항체(Cell Signaling Technology)를 1:1,000으로 희석하여 3시간 동안 반응시켰다. TBST로 20분간 3회 세척한 뒤 SuperSignal™ West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific) reagent를 이용하고, FUSION Solo S(VILBER) 이미지 장치를 사용하여 단백질의 발현을 확인하였다.

통계 처리

실험 결과의 통계 처리는 GraphPad Prism 8.0.1 프로그램(GraghPad Prism Software)을 사용하여 최소 3회 반복에 대한 평균±표준편차로 표시하였다. 대조군에 대한 통계적 유의성은 Tukey’s multiple test에 따라 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA test)으로 분석하였고, P<0.05 값을 유의한 값으로 처리하였다.

EBN의 세포독성

EBN의 세포독성 여부를 평가하기 위하여 RAW 264.7 대식세포에 농도별로 처리한 후 24시간 배양하고 WST-1 assay를 수행하였다(Fig. 1). EBN을 처리하지 않고 배양한 대조군(CON)의 세포 생존율을 100%로 설정하였을 때 EBN 처리군에서는 일부 저농도(12.5, 25 μg/mL)에서 세포증식이 유도되었으며, 1,000 μg/mL 농도까지 90% 이상의 세포 생존율을 나타내어 처리 농도 범위 내에서 세포독성이 없음을 확인하였다.

Fig 1. Effects of edible bird’s nest (EBN) on cell viability in RAW 264.7 cells. Cells (1×10⁴ cell/well in a 96-well plate) were treated with 12.5, 25, 50, 100, 125, 250, 500, and 1,000 μg/mL of EBN for 24 h. Cell viability was determined by WST -1 assay. All values were expressed as mean±SD (n=3). ^*P<0.05 when compared to the normal control group.

EBN이 NO 생성 및 iNOS 발현에 미치는 영향

NO는 생체 내 NO synthase(NOS)에 의해 산소분자와 L-arginine의 guanidino nitrogen으로부터 생성되며, 대식세포를 비롯한 다양한 세포에서 생성되어 생체 내의 여러 기능을 매개하거나 조절하는 중요한 역할을 한다(Nathan, 1992). 대식세포는 탐식된 병원균을 죽이기 위해 탐식작용을 하는 동안 NO를 생성하며, NO는 병원균 사멸의 매개체로서 핵심적인 역할을 한다(Chen 등, 2018; Coleman, 2001; Han 등, 2021).

본 연구에서는 RAW 264.7 대식세포를 1 μg/mL LPS로 처리한 결과, LPS를 처리하지 않은 대조군에 비해 NO 생산과 iNOS 발현이 유의미하게 증가하는 것을 관찰하였으며(Fig. 2), 이는 본 실험에 사용한 RAW 264.7 세포가 정상적인 면역 반응을 나타냄을 보여준다. RAW 264.7 대식세포에 EBN을 농도별(12.5~1,000 μg/mL)로 처리한 경우 농도 의존적으로 NO의 생성이 증가했으며, 250 μg/mL 이상의 농도에서 NO 생성에 대한 영향이 최대로 관찰되었다(Fig. 2A). 따라서 이후 실험에서 EBN의 농도는 250 μg/mL 이하의 농도(50, 100, 200 μg/mL)로 고정하여 진행하였다. 또한 iNOS 발현의 경우에도 EBN의 처리에 따른 농도 의존적으로 증가하였고, 이러한 결과는 EBN이 iNOS 발현을 통하여 NO 생성을 촉진하였음을 의미한다(Fig. 2B).

Fig 2. Effects of edible bird’s nest (EBN) on NO production and iNOS mRNA expression in RAW 264.7 cells. (A) Cells (1×10⁴ cell/well in a 96-well plate) were treated with 12.5, 25, 50, 100, 125, 250, 500, and 1,000 μg/mL of EBN and 1 μg/mL of lipopolysaccharide (LPS) for 24 h. NO levels were measured using Griess reagent in the culture medium. (B) Cells (1×10⁶ cell/well in 6-well plate) were treated with 50, 100, and 200 μg/mL of EBN and 1 μg/mL of LPS for 24 h. iNOS mRNA expression were measured by qPCR. The relative mRNA level of iNOS was normalized to that of GAPDH. All values were expressed as mean±SD (n=3). ^*P<0.05 when compared to the normal control group.

EBN이 대식세포 탐식능에 미치는 영향

대식세포는 거의 모든 조직에 존재하며, 체내에 박테리아나 바이러스 등의 외부 물질이 침입하면 탐식 작용을 통해 선천면역의 일차 방어로 작용한다(Ghosh와 Stuehr, 1995). 대식세포의 탐식 작용은 생체 내에서 일어나는 초기 면역 반응으로 대식세포의 탐식능 증가는 면역 활성 증가를 나타내며, 여러 연구에서 천연물 유래 성분이 대식세포의 탐식능을 증가시켜 면역 활성을 증가시키는 것으로 보고되었다(Park과 Kim, 2017; Yoo 등, 2014).

EBN이 대식세포의 탐식능에 미치는 영향을 조사하기 위해 RAW 264.7 대식세포에 FITC-labeled E. coli 입자를 사용하여 대식세포의 탐식능을 평가하였다. Fig. 3에 나타난 바와 같이 음성 대조군(CON)과 비교하여 EBN 처리 농도가 증가할수록 탐식능은 유의미하게 증가하였으며, 200 μg/mL 농도로 EBN을 처리한 경우 대식세포의 탐식능은 LPS 처리군과 유사한 수준으로 나타났다. 또한 본 연구에서와 같이 Li 등(2024)은 EBN이 하이드로코르티손(hydrocortisone) 유도 면역 억제 마우스에서 대식세포 탐식능과 자연살해세포 활성을 증가시켰다고 보고하였다. 이는 EBN이 대식세포의 탐식능을 증가시킴으로써 초기 면역 반응인 선천 면역 활성화에 기여할 수 있음을 시사한다.

Fig 3. Effect of edible bird’s nest (EBN) on phagocytosis activity in RAW 264.7 cells. Cells (1×10⁵ cell/well in a 96-well plate) were treated with 50, 100, and 200 μg/mL of EBN and 1 μg/mL of LPS for 24 h. Phagocytic activity was assessed by (A) observing intracellular FITC-labeled E. coli using fluorescence microscopy or (B) measuring fluorescence intensity. All values were expressed as mean±SD (n=3). ^*P<0.05 when compared to the normal control group.

EBN이 사이토카인 발현에 미치는 영향

면역 체계에는 백혈구, 대식세포, 자연살해세포 등으로 구성되어 있다. 그중 대식세포는 감염원에 대응하고자 사이토카인을 분비하고, 분비된 사이토카인은 다른 면역세포들을 감염소로 유인하여 감염체를 제거하는 작용을 하는데, 대표적으로 인터류킨류가 존재한다(Park, 2022). 인터류킨류의 사이토카인에는 IL-6와 IL-1β가 있으며, IL-6는 단백질 합성과 항암효과를 유도하고 IL-1β는 주로 대식세포에서 합성되어 T세포에 대한 lymphokine의 생산과 B세포의 성장 및 분화를 촉진하는 중요한 역할을 한다(Park과 Ryu, 2013). 이들은 체내 면역 방어에 있어서 핵심적인 요소이기 때문에 이러한 사이토카인의 분비를 향상시키는 것에 관한 관심이 집중되고 있는 추세이다(Heo와 Jung, 2021).

EBN의 탄수화물 성분 중 약 60~160 mg/kg가량의 농도로 함유된 시알산(sialic acid)은 바이러스에 대한 리셉터 작용, 세포와 분자의 면역학적 인식 부위, 세포접착 또는 암의 전이 등 중요한 생리적 기능에 관여하는 것으로 알려져 있다(Kim 등, 2020). 최근 연구에서 시알산을 RAW 264.7 대식세포에 처리 시 M1 표현형으로의 분극화를 촉진하여 IL-1β 및 TNF-α 등의 사이토카인의 발현을 촉진하는 것으로 보고되었다(Hu 등, 2023).

본 연구에서는 다양한 사이토카인 중 IL-1β, IL-6, TNF-α의 발현 수준을 관찰하여, EBN 처리가 RAW 264.7 대식세포에서 선천 면역 활성화에 필요한 사이토카인의 생성에 미치는 영향을 LPS 처리군과 비교하여 조사하였다.

Fig. 4에 나타낸 바와 같이 EBN을 농도별(50, 100, 200 μg/mL)로 처리 시 대조군에 비해 IL-1β, IL-6, TNF-α의 발현이 유의성 있게 증가하여, IL-1β, TNF-α의 발현은 200 μg/mL 농도의 경우 양성대조군인 LPS 처리군과 유사한 수준으로 나타났다. Dobutr 등(2023)의 연구에서는 EBN이 마우스 비장 세포증식을 유도하고 IL-6의 발현을 증가시켜 면역을 활성화한다고 보고하였다. 이는 EBN이 대식세포를 활성화시키기 위한 IL-1β, IL-6, TNF-α 등 사이토카인 발현을 유도함으로써 선천 면역의 활성화에 기여할 수 있음을 시사한다.

Fig 4. Effect of edible bird’s nest (EBN) on cytokine mRNA expression in RAW 264.7 cells. Cells (1×10⁶ cell/well in 6-well plate) were treated with 50, 100, and 200 μg/mL of EBN and 1 μg/mL of lipopolysaccharide (LPS) for 24 h. IL-1β, IL-6, and TNF-α mRNA expression were measured by qPCR. The relative mRNA levels of IL-1β, IL-6, and TNF-α were normalized to that of GAPDH. All values were expressed as mean±SD (n=3). ^*P<0.05 when compared to the normal control group.

EBN이 MAPKs 및 NF-κB의 활성에 미치는 영향

MAPK family는 다양한 세포에서 증식, 분화 및 사멸 등의 중요한 역할을 수행하는데, 특히 면역세포에서 사이토카인 생성 및 선천성 면역세포의 생존력과 하원 제시세포(antigen-presenting cell)의 기능을 조절하여 선천 면역 반응에서 중요하게 작용한다고 보고된 바 있다(Kim 등, 2023). MAPK family에는 ERK, JNK, p38이 있으며, 이들은 스트레스에 의해 유발되는 신호를 조절하는 역할을 담당할 뿐만 아니라 다양한 세포 기능에도 관여하는 것으로 알려져 있다(Kim 등, 2019). MAPK family의 활성화는 IκB의 인산화 및 분해로 이어지고, 이러한 과정이 NF-κB를 핵 내부로 유도하여 면역 활성 관련 유전자의 활성을 유발한다(Cha 등, 2021). NF-κB는 면역시스템 조절, 세포 증식, 상피세포 분화 등에 관여하는 단백질로, 신호전달 체계의 중심에 있다(Park 등, 2023).

따라서 앞서 EBN의 처리로 인하여 사이토카인의 발현이 증가한 것이 이러한 MAPK family(ERK, p38, JNK)의 인산화와 NF-κB의 핵 내 전사에 의해 활성화되는 것인지 알아보고자 RAW 264.7 대식세포에 EBN(50, 100, 200 μL/mL)을 처리하여 western blot 분석을 진행하였다. 먼저 200 μg/mL의 EBN이 처리된 RAW 264.7 대식세포에서는 ERK, p38, JNK의 인산화가 EBN 처리 10분 뒤부터 증가하여 1시간째 최고치가 되었으며 이후 감소하는 경향을 보였다(Fig. 5A). IκB와 NF-κB의 경우 30분 뒤부터 인산화가 증가하여 2시간째 지속되는 경향을 보여주었다. 앞서 200 μg/mL EBN의 처리 1시간 뒤 MAPK family 및 IκB/NF-κB의 인산화가 최고치로 나타남에 따라 처리시간을 1시간으로 고정하고 EBN을 농도별(50, 100, 200 μL/mL)로 처리한 결과, EBN의 처리에 따라 농도 의존적으로 MAPK family 및 IκB/NF-κB의 인산화가 증가하는 경향을 관찰하였다(Fig. 5B). Lai 등(2021)은 HaCaT 인간 피부각질세포에 EBN을 처리한 결과, 1시간 후 p-p38/p38의 발현이 증가한 것으로 보고하였다. 또한 Shabani Sadr 등(2020)은 EBN의 주요성분인 시알산을 C118 인간 신경교세포주에 처리하였을 때 NF-κB의 발현이 증가하는 것으로 보고하였다. 이러한 결과는 MAPK family의 인산화 및 NF-κB의 핵 내 전사가 EBN 처리에 의해 효과적으로 유도됨을 나타낸다. 따라서 본 연구에서 농도별 EBN 처리에 따른 RAW 264.7 대식세포의 면역 활성 증가는 MAPK family의 인산화 및 NF-κB의 핵 내 전사에 의한 것으로 사료된다.

Fig 5. Effect of edible bird’s nest (EBN) on the activation of NF-κB and MAPK signaling pathway in RAW 264.7 cells. Cells (1×10⁶ cell/well in 6-well plate) were treated with (A) 200 μg/mL of EBN for 10, 30, 60, and 120 min or (B) 50, 100, and 200 μg/mL of EBN for 60 min. The protein levels of NF-κB and MAPK signal related factors were detected by western blotting. All values were expressed as mean±SD (n=3). ^*P<0.05 when compared to the normal control group.

다만, 본 연구에서 사용된 EBN 추출물의 주요성분인 시알산에 대한 정량 분석이 이루어지지 않았기 때문에 EBN 추출물의 대식세포 활성과 시알산 간의 관계를 명확히 규명하기 위해서는 추가적인 물질 분석이 필요할 것으로 판단된다. 또한 본 세포 실험 결과를 바탕으로 EBN 추출물이 대식세포 기반 면역 증진 효과를 가진다는 것을 검증하기 위해 향후 면역 저하 동물 모델을 활용한 면역 증진 활성에 관한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

본 연구에서는 마우스 유래 대식세포주으로 알려진 RAW 264.7 세포에서 EBN 처리에 의한 면역증진 효능을 확인하였다. 먼저 EBN이 RAW 264.7 대식세포에서 처리 농도 범위 내에서 세포독성이 없음을 확인했으며, 250 μg/mL의 EBN 처리 농도에서 NO 생성에 대한 영향이 최대가 되어 추후 실험에서 EBN의 농도를 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 고정하여 진행하였다. 농도별 EBN의 처리에 따라 대식세포의 탐식능과 NO 생성반응에 촉매 역할을 하는 iNOS 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한 면역 활성과 관련된 여러 사이토카인(IL-1β, IL-6, TNF-α) 유전자 발현이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 특히 면역반응을 매개하는 이러한 인자들의 생성은 MAPK 및 NF-κB 신호전달경로와 관련된 신호전달 인자들의 인산화에 의한 신호전달경로의 활성화를 통해 이루어진다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 EBN이 대식세포 활성화를 통해 면역기능 증진에 도움을 주는 기능성 소재로서 잠재력을 가지고 있다는 것을 시사하였다.

본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술기획평가원의 국제협력 기반 수출 농업경쟁력 강화기술 개발사업의 지원을 받아 연구되었습니다(RS-2023-00232640).