마이크로바이오타(microbiota)는 특정 환경 내 존재하는 전체 미생물 집단으로 마이크로바이오타를 이루는 미생물과 이들의 유전체를 마이크로바이옴(microbiome)이라 하며, 적정량 섭취 시 숙주에 건강상 유익한 효과를 주는 살아있는 미생물을 프로바이오틱스(probiotics)로 정의하고 있다(Araya 등, 2002; Herrema 등, 2017). 프로바이오틱스의 유익한 효과는 주로 면역조절 및 장 건강에 중점을 두고 연구되어 왔는데, 최근에는 항암 및 항염 효과, 근감소증 예방, 아토피 개선, 항비만, 갱년기 관련 질병 개선 효과 등이 보고되고 있고, 마이크로바이옴과 질환의 상관성 및 인과성에 관한 연구가 보고됨에 따라, 질환 개선 소재로서의 프로바이오틱스에 관한 연구도 증가하고 있다(Araya 등, 2002; Ayob 등, 2023; Barrea 등, 2023; Byeon 등, 2022; Chon 등, 2023; Lee 등, 2022; Liu 등, 2022). 또한, 마이크로바이옴을 활용한 건강 증진과 질병 예방에 관한 관심이 증가함에 따라 프로바이오틱스의 소비량은 꾸준히 증가하고 있는데, 세계 프로바이오틱스 시장 규모는 2021년에서 2026년 사이 연평균 8.3% 성장하여 915억 달러, 국내 프로바이오틱스 시장은 2026년에 1조 5,143억 원 규모가 될 것으로 예상된다(Jang 등, 2023: Sohn, 2022).

이러한 프로바이오틱스의 소비 증가는 프로바이오틱스 사용에 따른 부작용 및 안전성 문제를 동반하고 있는데, 세계보건기구(World Health Organization, WHO)와 국제식량기구(The Food and Agriculture Organization, FAO)에서도 생균 형태로 사용하는 프로바이오틱스의 특성상 일부 부작용 및 안전성 문제가 발생할 수 있음을 제시하고 있다(Malashree 등, 2019). 실제 세계 시장에서 판매되고 있는 프로바이오틱스 제품에서도 독성, 항생제 내성 등의 안전성 문제가 제기되고 있으며 상업적으로 유통되고 있는 Lactobacillus와 Bifidobacterium 중 특히 장에서 분리된 균주의 경우 항생제 내성 유전자가 존재할 수 있다고 알려져 있다(Koirala와 Anal, 2021). 상업적으로 유통되고 있는 Lacticaseibacillus rhamnosus와 Lacticaseibacillus casei 중 일부에서 vancomycin에 대한 내성이 보고된 바 있으며, 시중에 판매되는 제품들에서 분리한 프로바이오틱스의 68% 이상이 두 가지 이상의 항생제에 내성이 있는 것으로 보고된 바 있다(Peters 등, 2003; Saarela 등, 2000). 이러한 안전성 문제를 해결하기 위해 세계 각국에서는 식품 및 사료용 프로바이오틱스에 대한 안전성 평가 기준을 마련하여 제시하고 있는데, 미국은 미국식품의약국(U.S Food and Drug Administration)의 Generally Recognized as Safe, 유럽은 유럽식품안전청(European Food Safety Authority, EFSA)의 Qualified Presumption of Safety를 통해 프로바이오틱스의 안전성을 관리하고 있다(Naidu 등, 2012). 한국에서는 건강기능식품 기능성 원료로 사용되는 프로바이오틱스의 안전성 관리를 위해 2021년 식품의약품안전처(MFDS)에서 WHO/FAO 가이드라인을 중심으로 한 프로바이오틱스 안전성 평가 기준을 마련하고, 고시형 및 식경험 유무에 따른 프로바이오틱스의 안전성 자료 제출 범위를 제시하고 있다(MFDS, 2022). 고시형 균주에 속하거나 식경험이 있는 균주의 경우에도 개별인정형 기능성 식품 원료로 사용하기 위해서는 항생제 내성, 용혈 활성, 독소 생성, 대사적 특성에 관한 안전성 평가 자료를 제시하여야 하며, 고시형 균주 중 Enterococcus 속 균주는 항생제 내성 및 독성 유전자 정보를 추가로 확보하여야 한다. 또한 식경험이 없는 균주의 경우에는 상기 안전성 평가항목과 더불어 독성시험 자료를 제시하여야 한다(MFDS, 2022). 이에 따라 국내 개별 인정형 원료로 인정받은 프로바이오틱스 Lactiplantibacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium breve 등에 대한 안전성 관련 연구 결과도 다수 보고되고 있다(Hsu 등, 2022; Kim 등, 2023; Woo 등, 2022). 발효식품에서 흔히 발견되는 Lactiplanti. plantarum은 소화기 건강 증진, 장내 미생물 균형 유지, 염증 감소, 알레르기 개선 등의 효과가 있다고 보고되어 프로바이오틱스 보충제로 널리 사용되는 균주 중 하나지만(Anderson 등, 2010; Chen 등, 2024; Zhang 등, 2020), 일부 Lactiplanti. plantarum strain이 D-lactate를 생산하고(Chokesajjawatee 등, 2020) bile salts deconjugation 활성을 가지며(Huang 등, 2019), 항생제 내성이 있다고 보고(Sharma 등, 2016)된 바 있다. 따라서 Lactiplanti. plantarum 균종을 기능성 원료로 사용하기 위해서는 상기 안전성 항목에 대한 과학적 근거가 요구된다.

본 연구에서 사용한 Lactiplanti. plantarum KF511(LPKF511)은 한국 전통 발효식품인 김치에서 분리한, 식품 원료로 사용 가능한 균주로써 담배 연기 추출물과 porcine pancreatic elastase로 유도한 만성폐쇄성폐질환 마우스 모델에서 폐 조직 손상 및 염증을 억제하는 등 뛰어난 호흡기 질환 개선 효과를 보였다(Kim 등, 2024). 이에 본 연구에서는 호흡기 건강 개선 활성을 가지는 LPKF511 균주의 항생제 내성, 용혈 활성, 독소 생성 및 대사적 특성 등을 평가하여 개별인정형 기능성 원료로의 사용 가능성을 안전성 측면에서 평가하였다.

균주 준비

본 연구에서 사용한 LPKF511은 한국 전통 발효식품인 김치에서 분리하였으며, 한국미생물보존센터(Korea Culture Center of Microorganisms, KCCM; 관리번호 KCCM 12573P)에 기탁하였다. LPKF511은 deMan Rogos and Sharpe(MRS) 고체 배지(BD Difco)에 도말하여 37°C, 24시간 호기 조건으로 배양하였으며, 단일 콜로니를 MRS 액체 배지(BD Difco)에 2회 계대 배양하여 사용하였다. 비교군으로 사용한 Escherichia coli KCTC 1682는 tryptic soy(TS) 배지에, Lacticasei. rhamnosus GG(LGG), L. acidophilus KCCM 32820은 MRS 배지에 같은 방법으로 배양하여 사용하였다.

항생제 내성 평가

LPKF511의 항생제 내성 평가는 EFSA에서 제시한 기준에 따라 ampicillin, chloramphenicol, clindamycin, erythromycin, gentamicin, kanamycin, tetracycline에 대해 항생제 스트립(E-TEST^®, BioMérieux)을 이용한 E-test법으로 평가하였다. MRS 고체배지에서 배양한 LPKF511 콜로니를 McFarland 탁도 0.5~1.0 사이로 희석하여 MRS 고체 배지에 도말하고 혐기 조건에서 20분간 하였다. 도말한 균주가 고체 배지에 잘 스며든 후 멸균 포셉을 이용해 각 항생제 스트립을 고체 배지 위에 올리고 37°C, 48시간 혐기 조건으로 배양하였다. 최소억제농도(Minimum Inhibitory Concentration; MIC)는 균이 자라지 않는 스트립의 가장 밑 부분으로 확정하였다.

항생제 내성 유전자 분석

LPKF511의 전장유전체 서열은 수탁 번호 GCA_029543005.1로 GenBank에 기탁하였으며, 이를 바탕으로 항생제 내성 특성을 확인하기 위해 RGI 소프트웨어를 이용하여 Comprehensive Antibiotic Resistance Database(CARD)와 비교, 분석하였다(Alcock 등, 2023). 항생제 내성 유전자의 획득/내재 내성 판단을 위해 HGTree PlasmidFinder 버전 2.1, PHASTEST, MobileElementFinder 버전 10.3을 사용하였고(Carattoli 등, 2014; Jeong 등, 2016; Johansson 등, 2021; Wishart 등, 2023), virulence factor를 확인하기 위해 Pathogen Finder, Virulence Finder를 사용하였다.

용혈 활성 평가

활성화한 LPKF511 균주를 Sheep blood agar(KisanBio)에 선상 도말 평판법으로 도말하여 37°C, 48시간 혐기 조건으로 배양한 후, 콜로니 주위에 생기는 환을 관찰하여 용혈 활성을 평가하였다. E. coli KCTC 1682를 양성대조군으로 사용하였다.

독소 생성능 평가

Caco-2(ATCC HTB-37) 세포를 5×10⁴ cells/well 농도로 24-well plate(SPL Life Science)에 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)(WelGENE Inc.), 10% fetal bovine serum(WELGENE Inc.), 1% penicillin/streptomycin(v/v)(WELGENE Inc.) 배지에 seeding하고, 5% CO₂, 37°C 조건에서 24시간 배양하였다. 배양한 Caco-2에 LPKF511을 농도별로(10⁷, 10⁸, 10⁹ CFU/well) 접종하고 5% CO₂, 37°C 조건에서 24시간 배양하였다. 양성대조군으로 10% cell lysis buffer, 음성대조군으로 균주가 들어있지 않은 DMEM 배지를 사용하였다. 독소 생성능의 비교를 위해 독성이 있다고 알려진 E. coli KCTC 1682와 안전성이 널리 알려진 LGG를 대조군으로 사용하였다. 배양 상등액은 LDH assay kit(ab65393, Abcam)을 사용해 lactate dehydrogenase(LDH) 활성을 측정하고, cytotoxicity(%)를 계산하였다.

D-lactate 생성능 평가

In vitro 실험을 위해 MRS 배지에서 37°C, 24시간 호기 배양한 LPKF511 배양액을 5,000×g로 10분간 원심분리하여 상등액을 취하고 D-lactate assay kit(Megazyme International)을 사용해 D-lactate 생성능을 측정하였다. 비교군으로는 안전성이 알려진 프로바이오틱스 균종 중 하나인 LGG를 사용하였다. LPKF511 경구 섭취에 따른 혈중 D-lactate 농도를 측정하기 위한 in vivo 실험을 위해 5주령의 수컷 BALB/c 마우스(Orient Bio Inc.)를 온도 23±2°C, 상대습도 53±5%, 명암주기 12시간으로 일정하게 유지된 사육실에서 7일간 순화시킨 후 연구에 사용하였다(Kim 등, 2024). 본 연구에 사용된 동물실험은 한국식품연구원 동물실험윤리위원회의 승인(KFRI-M-22058) 후 수행하였다. 실험은 정상군, 만성폐쇄성폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD) 유도군, LPKF511 투여군(10⁷, 10⁸, 10⁹ CFU/head)으로 진행하였다. LPKF511은 증류수에 현탁하여 28일 동안 경구투여하였으며, 담배 연기 추출물 20 μL/3회/주, porcine pancreatic elastase 1.8 units/1회/주로 총 3주간 투여해 COPD를 유도하였다. 실험 29일 차에 isoflurane으로 호흡 마취 후 안구에서 혈액을 채취하였다. 혈액을 상온에 30분간 방치한 후, 270×g에서 20분간 원심분리하여 얻은 혈청 내 D-lactate를 D-lactate assay kit(Megazyme International)을 사용해 측정하였다.

Bile salt hydrolase(BSH) 활성 평가

0.5% taurocholic acid(TCA; bile acid)(T4009, Sigma)가 첨가된 MRS 고체배지에 LPKF511을 선상 도말 평판법으로 도말하여 37°C, 48시간 혐기 조건으로 배양한 후, 콜로니 주위에 생기는 변화를 관찰하여 BSH 활성을 평가하였다. 양성대조군으로는 L. acidophilus KCCM 32820을 사용하였다.

통계처리

본 실험 결과는 GraphPad Prism Version 9.5.0(Graph Pad Software)을 이용하여 평균과 표준편차를 나타내었다. 실험군 간의 유의성 검증을 위해 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 P<0.05 수준에서 시행한 후 Dunnett’s post-hoc test로 사후 분석을 실시하였다.

항생제 내성

Lactobacillus 속을 포함한 lactic acid bacteria(LAB)는 일반적으로 안전하다고 여겨져 왔으나 Lacticasei. rhamnosus 및 치즈에서 분리한 Lactobacillus 속 균주에서 항생제 내성이 확인되면서 LAB의 항생제 내성에 대한 안전성 문제가 대두되고 있다(Coppola 등, 2005). 국내에서도 상업적으로 판매되고 있는 프로바이오틱스를 대상으로 항생제 내성을 조사한 결과, 70종 중 L. acidophilus, Levilactobacillus brevis, Lacticaseibacillus paracasei 등 50종이 kanamycin에, L. acidophilus, Limosilactobacillus fermentum, Lacticasei. casei 등 34종이 chloramphenicol 내성을 가진 것으로 보고된 바 있다(Shin 등, 2023). 미생물의 항생제 내성 획득은 감염성 미생물에 대한 항생제 효력을 감소시켜 치료를 어렵게 하므로, 프로바이오틱스가 보유한 항생제 내성 유전자가 병원성 미생물에 전달될 경우 공중 보건학적으로 심각한 문제가 발생할 수 있다. 따라서 프로바이오틱스를 식품 원료로 사용하기 전 균주의 항생제 내성에 대한 특성 파악은 필수적인 요건이라 할 수 있다(Imperial과 Ibana, 2016; McAdam 등, 2012). 이에 LPKF511 균주의 항생제 내성을 평가하기 위해 EFSA가 제시한 프로바이오틱스의 안전성 평가 가이드라인에 준하여 ampicillin, chloramphenicol, clindamycin, erythromycin, gentamicin, kanamycin, tetracycline 등 7종 항균제에 대한 감수성을 평가하였다. 실험 결과 LPKF511은 E-test 법에서 EFSA가 제시한 Lactiplanti. plantarum 종의 MIC cut-off 기준보다 낮은 농도에서 항생제 감수성을 보여, 건강기능식품 원료로 사용 가능한 안전한 균주임을 확인하였다(Table 1).

Table 1 . The antibiotics resistance of Lactiplantibacillus plantarum KF511 (LPKF511) by minimum inhibitory concentration (MIC) test.

Antibiotics.	MIC (μg/mL).
	MIC-cut off value of EFSA1) (for Lactobacillus plantarum).		E-strip MIC of LPKF511.
Ampicillin. Chloramphenicol. Clindamycin. Erythromycin. Gentamicin. Kanamycin. Tetracycline.	2. 8. 2. 1. 16. 64. 32.		0.064. 2. 0.019. 0.75. 0.75. 16. 0.75.

¹⁾EFSA: European Food Safety Authority..

항생제 내성 유전자 분석

LPKF511 균주의 염색체 서열을 RGI 소프트웨어를 이용하여 CARD 버전 3.3.0과 비교 분석해 항생제 내성 관련 추정 유전자를 식별하였다. 그 결과 vancomycin과 teicoplanin type 항생제에 대한 내성에 잠재적으로 관여하는 유전적 결정인자를 확인하였다(Table 2). 해당 유전자의 획득 내성 및 내재 내성을 구분하기 위해 HGTree를 기반으로 horizontal gene transfer(HGT) 이벤트 분석

Table 2 . The antibiotics resistance determinants identified in Lactiplantibacillus plantarum KF511 (LPKF511) using RGI.

Features.		LPKF511.
Locus-tag. Antibiotic. ARO1). AMR gene family. Resistance mechanism. Algorithm. Identifty (%). Coverage (%).		NZ_CP071125.1_849. Vancomycin. vanY gene in vanB cluster. vanY, glycopeptide resistance gene cluster. Antibiotic target alteration. Strict. 31.93. 91.42.

¹⁾ARO: Antibiotic Resistance Ontology..

결과, 해당 유전자에서 HGT 이벤트가 확인되지 않았다. Vancomycin에 대한 내성은 LAB의 내재적 특성으로 알려져 있으며 전이되지 않는다고 알려져 있기 때문에 임상적 우려는 없다고 판단된다(Delcour 등, 1999).

이와 더불어 plasmid 또는 prophage의 항생제 내성 유전자 존재 및 획득/내재 내성 판단을 위해 PlasmidFinder를 사용하여 plasmid가 존재하는지 확인하였고, 그 결과 1개가 존재하는 것을 확인하였다. 해당 plasmid에서 항생제 내성 유전자와 tra 유전자가 있는지 확인한 결과 존재하지 않는 것을 확인하였다. 또한, PAHSTEST를 사용하여 prophage 존재 여부를 확인하였고, 그 결과 3개의 prophage가 존재하는 것을 확인하였다(Fig. 1). 해당 prophage들의 염기서열에 항생제 내성 유전자 존재 여부를 확인한 결과 prophage 내에 항생제 내성 유전자가 존재하지 않았다. Mobile element에 의한 항생제 내성 획득/내재 내성 판단을 위해 MobileElementFinder를 사용하여 분석한 결과에서는 염색체 내에 13개, plasmid 내에 5개의 mobile element 염기서열이 예측되었지만 항생제 내성 유전자는 확인되지 않았다. 추가로 Pathogen Finder와 Virulence Finder를 사용해 virulence factor를 확인한 결과, virulence factor가 확인되지 않았다. 이상의 결과를 통해 LPKF511이 가진 vancomycin에 대한 항생제 내성이 외재적 유전자로 인한 획득 내성이 아님을 확인하였고, 식품의약품안전처에서 제시한 프로바이오틱스 안전성 평가 가이드라인의 항생제 내성 기준을 충족하는 안전한 균주로 판단하였다.

Fig 1. PHASTEST genome outputs showing organization and predicted functions of proteins of Lactiplantibacillus plantarum KF 511 (LPKF511) prophages. The existence of prophage was confirmed by PHASTEST.

용혈 활성 평가

용혈 활성은 sheep blood가 포함된 고체 배지에 균주를 배양한 후, 적혈구 용해에 따른 혈액 고체배지 상의 색상 변화를 통해 확인할 수 있다. 용혈반응은 적혈구의 불완전 용해로 인해 hemoglobin이 methemoglobin으로 산화되면서 녹회색 균주 집락을 형성하는 α-hemolysis, 적혈구의 완전 용해로 균주 집락 주변부에 투명환을 형성하는 β-hemolysis, 용혈반응이 없어 균주 집락 주변부에 색상 변화가 없는 γ-hemolysis로 구분할 수 있다. 실험 결과, 양성대조군으로 사용한 E. coli KCTC 1682는 집락 주변에 투명환을 형성하는 β-hemolysis 반응을 보였지만, LPKF511은 집락 주변부에 색상 변화가 관찰되지 않는 γ-hemolysis 반응이 관찰되어 용혈 활성이 없는 안전한 균주임을 확인하였다(Fig. 2).

Fig 2. The hemolytic test of Lactiplantibacillus plantarum KF 511 (LPKF511). The hemolytic activity was measured by sheep blood agar plates. Escherichia coli KCTC 1682 was used as positive control.

독소 생성능

LDH는 세포가 손상될 때 세포 내에서 세포 배양액으로 유출되는 성분으로 LDH 활성 측정을 통해 프로바이오틱스에 의한 세포막 손상 정도를 평가할 수 있다(Chen 등, 2017). 이전 연구에 의하면 vero 세포에 Lactiplanti. plantarum 처리 시 E. coli에 비해 유의적으로 적은 LDH 유출량을 보이고, E. coli에 의한 LDH 유출 또한 감소시키며 세포독성이 없는 것으로 보도된 바 있다(Kakisu 등, 2013). 본 실험에서는 LPKF511을 Caco-2 세포와 공배양하고 LDH 유출량 측정 후, 독소 생성 균주인 E. coli KCTC 1682 처리 시 유출되는 LDH양과 비교하여 LPKF511의 독소 생성능을 평가하였다. 실험 결과, 독소 생성 균주인 E. coli KCTC 1682의 경우 처리 농도 의존적으로 LDH 유출량이 증가하였으며, 특히 10⁸, 10⁹ CFU/well 농도에서는 계면활성제를 처리하여 세포막을 모두 파괴한 high control 대비 약 70% 정도의 높은 LDH 유출량을 보였다(Fig. 3). 이러한 결과를 바탕으로 E. coli를 독소를 생성하는 비교 균주로 선정하였고, 가이드라인에 따라 비교군보다 정량값이 비슷하거나 유의적으로 높게 나올 경우 독소 생성능이 있어 안전하지 않은 것으로 판정 기준을 설정하였다. 안전성이 알려진 LGG의 경우 10⁷ CFU/well 농도에서 LDH 유출량이 high control과 E. coli 대비 유의적으로 낮게 검출되었다. LPKF511 역시 LGG와 마찬가지로 10⁷, 10⁸, 및 10⁹ CFU/well 농도 처리구간에서 high control과 E. coli 동일 농도 처리군 대비 유의적으로 낮은 LDH 유출량을 보였다. 이로 미루어 보아 LPKF511은 가이드라인의 독소 생성능 기준에 준하는 안전한 균주로 판단된다.

Fig 3. The toxigenicity in Lactiplantibacillus plantarum KF511 (LPKF511). The toxigenicity of LPKF511 was measured by lactate dehydrogenase activity on Caco-2. ^***P<0.001 vs. high control, ^###P<0.001 vs. same concentration between LPKF511 and Escherichia coli KCTC 1682. LGG: Lactobacillus rhomnosus GG.

D-lactate 생성능

L-lactate는 인체에서 대사가 가능하지만 이성질체인 D-lactate의 경우 대사가 불가능하기 때문에 D-lactate를 생성하는 프로바이오틱스의 과량 섭취는 혈액 내 D-lactate 축적을 초래해 D-lactic acidosis를 유발하는 것으로 알려져 있다(Remund 등, 2023; Yilmaz 등, 2018). Short bowel syndrome 환자의 경우 체내 D-lactate 축적에 더 취약하며, D-lactic acidosis에 의해 혼란, 방향 감각 상실 증상이 나타나고, 심하면 혼수상태, 사망에 이를 수 있다(Remund 등, 2023). 건강한 성인의 혈중에는 D-lactate 5~20 µmol/L, L-lactate 1,000 µmol/L가 존재하고 있어 일정 수준의 D-lactate가 존재하는 것은 문제가 되지 않는다(Higgins, 2011). D-lactate는 D-lactate dehydrogenase 및 D,L-lactate racemase 경로에 의해 생성되며, 프로바이오틱스의 종류에 따라 D-lactate 생성 정도가 다른 것으로 알려져 있는데, LPKF511이 속하는 Lactiplanti. plantarum은 D형과 L형을 모두 생산하는 D,L-lactate 혼합 생성 균주로 보고되었다(Song, 2022; Taguchi와 Ohta, 1991). 실험 결과, LPKF511은 D-lactate와 L-lactate를 각각 66.23%와 33.77% 비율로 생성하는 D,L-lactate 혼합 생성 균주로(Fig. 4A), 건강기능식품 원료로 사용 시, 영유아 및 short bowel syndrome 환자군 대상의 섭취 주의 문구 제시가 필요한 균주임을 확인했다. 다만, Fig. 4B에 제시된 바와 같이 10⁸ 및 10⁹ CFU/mouse 농도로 LPKF511을 5주간 섭취시킨 COPD 마우스의 혈액에서는 대조군 대비 D-lactate의 증가가 관찰되지 않아 in vivo 환경에서는 D-lactate의 축적이 미미하다 판단되나, 추후 인체 적용 시험 시 혈중 D-lactate 농도에 대한 면밀한 확인이 필요하다고 생각된다.

Fig 4. The D,L-lactate production of Lactiplantibacillus plantarum KF511 (LPKF511). (A) The D-lactate production was measured in LPKF511 culture medium. Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) was used as comparison control. (B) The D-lactate production was measured in BALB/C with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) mice. ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 vs. COPD group. Results are displayed as mean±SEM of n=8 per group.

BSH 활성

Bile salt는 생물학적 계면활성제로 지질을 유화 및 용해해 지방의 소화와 흡수에 중요한 역할을 하고, 박테리아의 membrane을 용해해 항균 활성을 나타내기도 한다(Begley 등, 2006; Sarkar 등, 2016). BSH는 bile salt로부터 프로바이오틱스를 보호하거나 콜레스테롤의 수용성 대사산물인 bile salt를 가수분해해 숙주의 혈청 콜레스테롤 수치 감소에 도움이 되기도 하지만, bile salt deconjugation을 촉매해 bile salt의 기능을 저하시켜 지방산 분해를 어렵게 한다(Ahn 등, 2003; Lim, 2011). Deconjugation된 bile acid는 소수성이 증가하며 이로 인해 생성된 일부 2차 담즙산은 콜레스테롤 담석 질환 및 대장암 발병에 영향을 미칠 수 있다고 보고된 바 있다(Ridlon 등, 2006). 이러한 BSH의 위험성 때문에 식품의약품안전처에서는 BSH 활성이 양성인 프로바이오틱스에 대해 과다 섭취하지 않도록 주의 표시 표기를 권고하고 있다(De Boever 등, 2000; MFDS, 2022). 이에 본 연구에서는 0.5% TCA 함유 MRS 배지에 LPKF511을 배양하여 BSH 활성 유무를 평가하였으며, 이때 BSH 양성 균주인 L. acidophilus KCCM 32820을 비교군으로 사용하였다(Begley 등, 2006). BSH 양성 균주의 경우, deconjugation된 담즙산 침전으로 인한 콜로니 주변 precipitation halo 형성 및 확산으로 배지가 뿌옇게 흐려지거나, 불투명한 백색 콜로니를 형성하는 양상을 보인다(Dashkevicz와 Feighner, 1989). 실험 결과, L. acidophilus KCCM 32820은 콜로니 주위 배지가 뿌옇게 변하는 BSH 양성 결과를 보였지만, LPKF511는 TCA 미첨가 MRS 배지에서와 같은 콜로니 형태를 보여 BSH 활성 음성 균주로 확인되었다(Fig. 5).

Fig 5. The bile salt hydrolase (BSH) activity of Lactiplantibacillus plantarum KF511 (LPKF 511). The BSH activity was measured by deMan Rogos and Sharpe (MRS) agar plate containing 0.5% taurocholic acid. Lactobacillus acidophilus KCCM 32820 was a positive control for BSH activity.

본 연구에서는 호흡기 건강 개선 활성을 가지는 LPKF511 균주의 안전성을 평가하기 위해 식약처 프로바이오틱스 안전성 평가 가이드에 준하여 항생제 내성, 용혈 활성, 독소 생성 및 대사적 특성을 평가하였다. LPKF511은 ampicillin, chloramphenicol, clindamycin, erythromycin, gentamicin, kanamycin 및 tetracycline 등 7종의 항생제에 대한 가이드라인의 감수성 기준을 충족하는 균주로 genotype 안전성 평가를 통해 관련 항생제 내성 유전자 및 virulence factor가 부재함도 확인되었다. 또한, 용혈반응 음성, 담석 질환 및 대장암 발병과 관련이 있는 BSH 음성 및 장관세포에 손상을 줄 수 있는 세포독성 물질 미생성 균주로 확인되었다. 이상의 결과를 바탕으로 볼 때, LPKF511은 개별인정형 기능성 원료로 사용 가능한 안전한 균주라고 할 수 있다. 다만, LPKF511은 D,L-lactate 혼합 생성 균주임으로 영유아 및 short bowel syndrome 환자군 대상의 섭취 주의 문구 제시가 필요하다고 판단된다.

본 연구는 2024년 과학기술정보통신부 재원으로 한국식품연구원의 지원을 받아 기본연구사업(E0210202-04)으로 수행되었으며, 그 지원에 감사드립니다.