흰털 오가피(Acanthopanax divaricatus var. albeofructus, ADA)는 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 다년생 낙엽관목으로, 한반도에 분포하는 특산 변종이다(Jang과 Lee, 2022). 이 식물은 한국의 전통 의학에서 중요한 약용 식물로 오랫동안 사용되어 왔으며, 일반 오가피(Acanthopanax sessiliflorus)와는 구별되는 독특한 특성이 있는데, 특히 흰털 오가피의 열매는 백색을 띠는 특징이 있어 ‘albeofructus’라는 학명이 부여되었다(Jang과 Lee, 2022; Yan 등, 2014). 흰털 오가피는 높이 2~3 m까지 자라며 줄기와 가지에는 특징적인 흰색 털이 있다(Hahn과 Park, 2010). 잎은 손바닥 모양으로 5~7개의 작은 잎으로 구성되어 있고 각 작은 잎의 가장자리에는 날카로운 톱니가 있으며, 꽃은 6~7월에 피고 열매는 9~10월에 성숙한다. 열매는 구형으로 지름 6~8 mm 정도이며 다른 오가피와 달리 백색을 띤다(Huh와 Huh, 2005). 전통적으로 흰털 오가피는 강장, 강정, 해열, 진통, 혈압 강하 등의 목적으로 사용되어 왔다. 특히 뿌리와 줄기 껍질은 약용 부위로 널리 활용되었으며, 최근에는 잎과 열매의 약리 활성에 관한 관심도 증가하고 있다(Gębalski 등, 2024). 현대 과학적 연구에 따르면, 흰털 오가피는 다양한 생리활성 물질을 함유하고 있으며, 이들은 항산화, 항염증, 면역조절 등의 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(Hong과 Lyu, 2023).

현대 사회에서 만성 질환의 증가와 함께 건강에 관한 관심이 높아지면서 천연물 유래 생리활성 물질에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다(Newman과 Cragg, 2020). 특히 항산화 물질은 다양한 질병의 예방과 치료, 그리고 노화 방지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져서 주목받고 있다(Pisoschi와 Pop, 2015). 산화 스트레스는 체내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 과도한 생성으로 인해 발생하며, 이는 세포 손상, DNA 변형, 지질 과산화 등을 유발하여 다양한 질병의 원인이 된다(Liguori 등, 2018). 항산화 물질은 이러한 활성산소종을 제거하거나 그 생성을 억제함으로써 산화 스트레스로부터 세포를 보호한다(Lobo 등, 2010). 천연물에서 유래한 항산화 물질은 합성 항산화제에 비해 부작용이 적고 인체에 더 안전한 것으로 여겨져, 식품, 화장품, 의약품 산업에서 널리 활용되고 있다(Carocho와 Ferreira, 2013). 특히 식물성 천연물에 풍부하게 함유된 폴리페놀, 플라보노이드, 카로티노이드 등은 강력한 항산화 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다(Zhang 등, 2015). 항산화 활성을 평가하는 방법 중 가장 널리 사용되는 것은 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD) 유사 활성 측정법이다. SOD는 체내 항산화 효소 시스템의 중요한 구성 요소이다(Younus, 2018). 이는 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼(O₂^•-)을 과산화수소(H₂O₂)와 산소(O₂)로 전환하는 반응을 촉매하여 활성산소종으로 인한 세포 손상을 방지한다(Fukai와 Ushio-Fukai, 2011). SOD 활성의 증가는 세포의 산화 스트레스 대응 능력이 향상되었음을 의미하며, 이는 항산화 물질의 효과를 간접적으로 나타내는 지표로 활용된다(Gusti 등, 2021). 이러한 SOD 활성 증가 효과는 천연물의 항산화 활성을 평가하는 데 중요한 지표로 사용되며, 이를 통해 새로운 기능성 소재 개발의 기초 자료를 제공할 수 있다(Kasote 등, 2015).

피부 미백은 화장품 및 기능성 식품 산업에서 중요한 연구 주제 중 하나로, 소비자들의 관심이 지속해서 증가하고 있다(Pillaiyar 등, 2017). 피부 색소 침착의 주요 원인 물질인 멜라닌(melanin)의 생성을 조절하는 것이 미백 효과의 핵심 작용 기전이다(Shtivelman 등, 2014). 멜라닌은 멜라노사이트(melanocyte)라는 특수한 세포에서 생성되는 고분자 색소로, 자외선으로부터 피부를 보호하는 중요한 역할을 한다(Brenner와 Hearing, 2008). 그러나 과도한 멜라닌 생성은 기미, 주근깨, 검버섯 등의 색소 침착 문제를 유발할 수 있다(Videira 등, 2013). 따라서 미백 효과를 얻기 위해서는 멜라닌 생성을 적절히 조절하는 것이 중요하다. 멜라닌 생합성 과정에서 가장 중요한 효소는 티로시나아제(tyrosinase)이다(Chang, 2009). 티로시나아제는 멜라닌 생성의 초기 단계인 티로신(tyrosine)에서 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로의 전환을 촉매하는 핵심 효소이다(Slominski 등, 2004). 따라서 티로시나아제의 활성을 억제하는 것은 효과적인 미백 전략으로 널리 연구되고 있다(Kim과 Uyama, 2005). 천연물에서 유래한 미백 소재는 합성 화합물에 비해 부작용이 적고 안전성이 높다는 장점이 있어 주목받고 있다(Sarkar 등, 2013). 특히 식물 추출물에 포함된 다양한 폴리페놀 화합물들이 티로시나아제 억제 활성을 보이는 것으로 알려져서 이들을 활용한 새로운 미백 소재 개발 연구가 활발히 진행되고 있다(Kim과 Uyama, 2005).

피부 노화는 내인성 및 외인성 요인에 의해 발생하며, 특히 자외선에 의한 광노화는 피부 노화의 주요 원인 중 하나이다(Ganceviciene 등, 2012). 피부 노화 과정에서 matrix metalloproteinase-1(MMP-1)과 히알루론산 분해효소(hyaluronidase, HAase)는 중요한 역할을 한다(Papakonstantinou 등, 2012; Quan 등, 2009). MMP-1은 콜라겐 분해효소-1로도 알려져 있으며, I형 및 III형 콜라겐을 분해하는 주요 효소이다(Visse와 Nagase, 2003). 자외선 노출은 피부세포에서 MMP-1의 발현을 증가시켜 콜라겐 분해를 촉진하고, 이는 주름 형성과 탄력 저하를 유발한다(Fisher 등, 1996). MMP-1의 발현은 주로 mitogen-activated protein kinases와 nuclear factor-κB(NF-κB) 경로를 통해 조절된다(Rittié와 Fisher, 2002). 히알루론산은 피부의 주요 구성 성분으로, 수분 보유 능력이 뛰어나 피부의 보습과 탄력 유지에 중요하다(Stern과 Maibach, 2008). HAase는 히알루론산을 분해하는 효소로, 과도한 활성은 피부의 수분 손실과 탄력 저하를 초래할 수 있다(Bukhari 등, 2018). 피부 노화 과정에서 HAase의 활성이 증가하면 피부 내 히알루론산이 감소하게 된다(Meyer와 Stern, 1994). 많은 연구에서 식물 추출물이나 천연 화합물이 MMP-1의 발현을 억제하거나 HAase의 활성을 저해하는 효과가 있음이 보고되고 있다(Mukherjee 등, 2011). 특히 폴리페놀 화합물들이 이러한 항노화 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Zillich 등, 2015). 천연물 유래 항노화 소재는 합성 화합물에 비해 부작용이 적고 안전성이 높아 화장품 및 기능성 식품 산업에서 큰 관심을 받고 있다(Binic 등, 2013). 결론적으로, MMP-1과 HAase의 활성을 조절하는 것은 피부 노화 방지를 위한 중요한 전략이며, 이를 타깃으로 하는 천연물 유래 소재의 개발은 항노화 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있다.

본 연구에서는 ADA의 줄기, 뿌리, 열매 부위의 열수 추출물에 대해 항산화, 미백, 항노화 효과를 알아보고자 한다. 이를 통해 흰털 오가피의 부위별 생리활성 차이를 규명하고, 각 부위의 기능성 소재로서의 잠재적 가치를 평가하고자 한다. 본 연구 결과는 향후 흰털 오가피를 활용한 기능성 화장품 및 건강기능식품 개발을 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

실험재료

충남 천안시 소재 (주)수신오가피에서 재배하고 재취한 국내산 흰털 오가피의 잎, 줄기, 뿌리, 열매를 선별하여 세척하고 건조한 후 열수로 추출한 분말을 제공받았다. 흰털 오가피의 열수 추출물 제조는 다음과 같이 진행되었다. 건조된 흰털 오가피의 각 부위(잎, 줄기, 뿌리, 열매)를 분쇄하여 분말 형태로 만든 후, 중량 대비 20배의 증류수를 가하여 100°C에서 3시간 동안 환류 추출하였다. 추출액을 여과지(Whatman No. 2)로 여과한 후, 감압농축기를 이용하여 40°C에서 농축하였다. 농축된 추출물은 동결건조하여 분말 형태로 제조하였다. 실험 시 분말을 부위별로 멸균 증류수에 용해시킨 후 0.80, 0.45, 0.22 μm의 pore 크기를 가지고 있는 membrane filter에 순차적으로 여과하여 4°C에 보관하였다.

세포 배양 및 세포 생존율 측정

사람 유래 섬유아세포(human dermal fibroblast, neonatal, HDF-n)는 American Type Culture Collection에서 구입하였고, 마우스 흑색종 세포주인 B16F10은 한국세포주은행에서 구입하였다. 세포들은 10% fetal bovine serum(GibcoBRL), 1% penicillin/streptomycin(GibcoBRL)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, GibcoBRL) 배지를 사용하였으며, CO₂ incubator(5% CO₂, 95% air, 37°C; Sanyo)에서 배양하였다. 세포 생존율을 측정하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay를 사용하였다. 96-Well plate(Nunc)에 1×10⁴ cells/well씩 seeding 한 후 시료를 다양한 농도로 200 μL씩 분주하여 48시간 배양하였다. 이후 well에 MTT solution(3 mg/mL, Sigma-Aldrich)을 50 μL씩 넣고 incubator에서 4시간 동안 반응시켰다. 상등액을 제거한 뒤 dimethylsulfoxide 150 μL씩 넣고 570 nm에서 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 흡광도를 측정하였다(Sunrise, Tecan).

자외선(UV-A) 조사

HDF-n 세포를 산화적으로 손상시키기 위해 100 mm culture dish에 1×10⁶ cells/mL로 분주한 다음 24시간 동안 배양하였다. 자외선 조사 직전에 phosphate buffered saline(PBS)으로 1회 세척하고, PBS를 세포가 살짝 잠길 정도로 넣어 준 상태에서 plate 뚜껑을 열고 UV-A를 조사하였다. 자외선 조사 즉시 다시 PBS로 1회 세척한 후, 5% fetal bovine serum을 첨가한 DMEM과 농도별 시료를 넣고 CO₂ incubator에 넣어 배양하였다. 배양 후, 세포를 모아 차가운 PBS로 세척한 후 초음파 분쇄기를 이용하여 용해하였다. 용해된 세포를 4°C에서 12,000×g로 15분간 원심 분리하여 상등액을 취하고, 단백질 농도는 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 정량 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정하였다.

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능

DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하기 위해 농도별 ADA 추출물 시료 용액 100 μL에 0.1 mM DPPH 용액 100 μL를 가하여 혼합한 후, 실온에서 30분간 암소에서 반응시켰다. 반응 후, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 다음 식을 이용하여 계산하였다: DPPH 라디칼 소거 활성(%)=[1－(시료 첨가군의 흡광도/ 대조군의 흡광도)]×100. 양성대조군으로는 아스코르브산(ascorbic acid, Sigma-Aldrich)을 사용하였으며, 모든 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.

SOD 유사 활성도 측정

SOD 유사 활성도는 pyrogallol assay(Marklund와 Marklund, 1974)를 이용하여 측정하였다. 상등액 50 μL에 50 mM Tris-HCl buffer(pH 8.5) 500 μL와 7.2 mM pyrogallol 50 μL를 첨가하여 25°C에서 10분간 반응시켰다. 이후 1 N HCl 50 μL를 가하여 반응을 정지시키고 420 nm에서 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 아스코르브산을 사용하였다.

세포 내 멜라닌 저해 활성 측정

세포 내 멜라닌 생성량은 Hosoi 등의 방법(Hosoi 등, 1985)을 변형하여 측정하였다. B16BL6 마우스 흑색종 세포를 6-well 플레이트에 2×10⁵ cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 ADA를 농도별로 가한 후 48시간 동안 추가 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 1%(w/v) Triton X-100이 함유된 100 mM sodium phosphate(pH 6.8) 100 μL를 첨가하여 -80°C에서 30분간 세포를 용해하였다. 용해된 세포를 12,000×g에서 30분간 원심 분리하여 멜라닌이 포함된 pellet을 모았다. 여기에 10% dimethylsulfoxide가 함유된 1 N NaOH를 첨가하고 65°C에서 1시간 동안 반응시켜 멜라닌을 용해하였다. 용해된 멜라닌 용액의 흡광도를 405 nm에서 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 측정하였다.

티로시나아제 저해 활성 측정

세포 내 티로시나아제 활성은 Tomita 등(1992)의 방법을 변형하여 측정하였다. B16BL6 마우스 흑색종 세포를 6-well 플레이트에 2×10⁵ cells/well의 밀도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 ADA를 농도별로 가한 후 48시간 동안 추가 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 1%(w/v) Triton X-100이 함유된 100 mM sodium phosphate(pH 6.8) 100 μL를 첨가하여 -80°C에서 30분간 세포를 용해하였다. 용해된 세포를 12,000×g에서 30분간 원심 분리하여 상등액을 수집하였다. 상등액과 100 mM sodium phosphate(pH 6.8)에 용해한 L-DOPA(2 mg/mL) 용액을 1:4의 비율로 혼합하였다. 이 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 내 MMP-1 분비 저해 활성 측정

HDF-n에서의 MMP-1 분비량은 UV-A 조사 후 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)를 이용하여 측정하였다. HDF-n 세포를 6-well 플레이트에 1×10⁵ cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS로 세척하고 무혈청 배지로 교체한 뒤 UV-A를 조사하였다. UV-A 조사 직후, 다양한 농도의 시료가 포함된 무혈청 배지로 교체하여 48시간 동안 추가 배양하였다. 배양 완료 후, 세포 배양 상등액을 수거하여 MMP-1 단백질 분비량을 측정하였다. MMP-1의 정량은 human MMP-1 ELISA kit(R&D Systems)을 이용하였다. 수거한 세포 배양 상등액을 적절히 희석하여 capture antibody가 코팅된 96-well 마이크로플레이트에 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS로 세척 후 detection antibody를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 다시 PBS로 세척한 후, streptavidin-horseradish peroxidase를 첨가하여 반응을 유도하고 30분 후 황산을 이용해 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

HAase 저해 활성 측정

HAase 활성은 Reissig 등(1955)의 방법을 변형하여 측정하였다. 먼저, 300 mM sodium phosphate(pH 5.35, 37°C)를 제조하고, 이를 이용하여 0.3%(w/v) 히알루론산 용액을 만들었다. 기질 용액은 0.3% 히알루론산 용액을 10배 희석하여 0.03%(w/v) 농도로 준비하였다. 효소 희석 완충액은 20 mM sodium phosphate(pH 7.0), 77 mM NaCl, 0.01%(w/v) bovine serum albumin(BSA)을 포함하도록 제조하였다. 반응 정지 용액으로는 24 mM sodium acetate, 79 mM acetic acid, 0.1%(w/v) BSA를 포함하는 acid albumin solution(pH 3.75)을 사용하였다. 효소 희석 완충액을 이용하여 HAase 효소 용액(5 units/mL)과 National Formulary(NF) 표준 HAase 용액(10 units/mL)을 준비하였다. 시험관에 HAase 효소 용액 125 μL, 시료 용액, 그리고 완충액을 넣고 혼합한 후 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 0.03% 히알루론산 용액 250 μL를 첨가하고 혼합한 후 37°C에서 45분간 반응시켰다. 반응 혼합물 125 μL에 acid albumin solution 625 μL를 첨가하여 반응을 정지시키고 실온에서 10분간 방치하였다. 최종적으로 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 탄닌산(tannic acid)을 사용하였다.

통계처리

통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어(버전 9.0, Graph Pad Software)를 사용하여 수행하였다. 대조군과 실험군 사이의 유의적 차이를 비교하기 위해 one-way ANOVA를 실시하였으며, 사후 검정으로는 Dunnett’s test를 사용하였다. P<0.05인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였으며, 유의성 수준은 P<0.05, P<0.01, P<0.001로 표시하였다. 모든 실험은 3회 반복하였다.

HDF-n 세포 및 B16F10 세포에 대한 ADA의 세포 독성

HDF-n 및 B16F10 세포에 대한 ADA의 세포 독성과 UV-A 조사의 영향을 평가하였다. ADA 부위별 추출물을 다양한 농도로 처리하고 48시간 동안 배양한 후 MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정한 결과, HDF-n 세포에서는 0.8 mg/mL, B16F10 세포에서는 0.6 mg/mL 농도까지 80% 이상의 생존율을 보였다(Fig. 1A, 1B). UV-A 조사 실험에서는 2~8 J/cm² 범위에서 HDF-n 세포의 생존율에 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였고, 이를 바탕으로 8 J/cm²의 UV-A 세기를 설정하였다(Fig. 1C). UV-A 조사 후 ADA 추출물 처리 시에도 0.8 mg/mL 이하의 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 유지하였다(Fig. 1D). 이러한 결과는 본 연구진의 이전 연구에서 보고한 흰털 오가피의 항아토피 피부염 효과와 관련된 세포 독성 실험 결과와 일치했다(Hong과 Lyu, 2023). 해당 연구에서는 HaCaT, Caco-2, THP-1, Jurkat, U266B1 세포에 대해 ADA 추출물이 0.8 mg/mL 농도까지 80% 이상의 세포 생존율을 보였다. 이는 본 연구에서 사용한 HDF-n 및 B16F10 세포에서의 결과와 유사한 경향을 나타냈다.

Fig 1. Cytotoxicity of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus (ADA) extracts and UV-A irradiation on HDF-n and B16F10 cells. (A) HDF-n cells and (B) B16F10 cells were treated with various concentrations of ADA extracts from different parts (root, fruit, leaf, and stem) for 48 h. (C) HDF-n cells were exposed to different doses of UV-A irradiation (2∼8 J/cm²) and incubated for 48 h. (D) HDF-n cells were exposed to UV-A irradiation (8 J/cm²) and then treated with various concentrations of ADA extracts for 48 h. Cell viability was measured using the MTT assay. Data are presented as mean±SD (n=3). Non-irradiated cells served as a negative control in (C).

DPPH 라디칼 소거능

ADA 부위별 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다(Fig. 2A). 모든 부위의 추출물은 농도 의존적으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타냈으나, 그 효과는 부위에 따라 차이를 보였다. 줄기 추출물이 가장 강력한 라디칼 소거 활성을 나타냈다. 0.313 mg/mL 농도에서부터 유의한 소거 효과를 보였으며(95.36±2.5%, P<0.05), 5 mg/mL 농도에서는 99.89±1.5%(P<0.01)의 매우 높은 소거율을 달성했다. 뿌리 추출물은 두 번째로 높은 활성을 보였다. 0.156 mg/mL 농도에서 유의한 효과를 나타냈으며(76.16±3.8%, P<0.05), 0.625 mg/mL 이상의 농도에서 94% 이상의 높은 소거율을 유지했다(P<0.01). 열매와 잎 추출물은 상대적으로 낮은 농도에서 약한 활성을 보였으나, 농도가 증가함에 따라 유의한 효과를 나타냈다. 열매 추출물은 0.625 mg/mL부터 유의한 소거 활성을 보였으며(52.88±4.2%, P<0.05), 5 mg/mL에서 93.63±2.9%(P<0.01)의 소거율을 나타냈다. 잎 추출물은 가장 낮은 활성을 보였으나, 1.25 mg/mL 이상의 농도에서 유의한 효과를 나타냈다(63.05±4.0%, P<0.05). 양성대조군으로 사용된 아스코르브산은 25 μg/mL 농도에서 95.9±0.8%의 소거율을 나타내어 강력한 항산화 활성을 보였다(Table 1). 이러한 결과는 ADA 추출물, 특히 줄기와 뿌리 추출물이 강력한 항산화 활성을 가지고 있음을 시사하였다. 줄기와 뿌리 추출물의 높은 항산화 활성은 이들 부위에 함유된 eleutheroside E, chlorogenic acid 등의 항산화 물질에 기인할 것으로 추정된다(Huang 등, 2011). 열매와 잎 추출물의 경우, 상대적으로 높은 농도에서 유의한 활성을 나타내는 것은 이들 부위에 함유된 항산화 물질의 조성이나 함량이 줄기나 뿌리와는 다를 수 있음을 시사했다. 이는 식물체 부위별로 이차대사산물의 분포가 다르기 때문으로 해석될 수 있다(Reshi 등, 2023). 결론적으로, ADA 추출물, 특히 줄기와 뿌리 추출물은 강력한 항산화 활성을 가지고 있어 항산화 기능성 소재로서의 활용 가능성이 높다고 판단된다. 향후 연구에서는 부위별 추출물의 주요 항산화 성분을 분리, 동정하고 이들의 작용 메커니즘을 규명하는 것이 필요할 것이다.

Table 1 . Free radical scavenging activity of ascorbic acid.

Concentration (μg/mL).	Free radical scavenging activity (%).
0. 5. 10. 15. 20. 25.	0. 13.2. 29.6. 54.1. 80.4. 95.9.

Fig 2. Antioxidant activities of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus (ADA) extracts. (A) DPPH radical scavenging activity of different parts of ADA extracts. Data are presented as mean±SD (n=3). Statistical significance compared to the control: ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 (one-way ANOVA followed by Dunnett’s test). (B) Superoxide dismutase (SOD)-like activity of different parts of ADA extracts in UV-A irradiated HDF-n cells. Cells were exposed to UV-A (8 J/cm²) and treated with various concentrations (0∼100 μg/mL) of ADA extracts from root, fruit, leaf, and stem. Ascorbic acid (1,000 μg/mL) was used as a positive control. Data are presented as mean±SD (n=3). Statistical significance compared to the UV-irradiated control (UV+, 0 μg/mL): ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 (one-way ANOVA followed by Dunnett’s test).

세포 내 SOD 유사 활성도 측정

본 연구에서는 UV-A로 유도된 산화 스트레스 조건에서 ADA 부위별 추출물(뿌리, 열매, 잎, 줄기)의 SOD 유사 활성을 평가하였다(Fig. 2B). UV-A 조사는 HDF-n 세포의 SOD 활성을 현저히 감소시켰으며(64.9%, P<0.001), 이는 UV-A에 의한 산화 스트레스로 인한 항산화 방어 시스템의 손상을 나타냈다. 모든 부위의 ADA 추출물은 농도 의존적으로 SOD 유사 활성을 증가시켰으나, 그 효과는 부위와 농도에 따라 다양하게 나타났다. 뿌리 추출물은 0.1~5 μg/mL 농도 범위에서 가장 높은 SOD 유사 활성 증가를 보였다(P<0.001). 특히 0.1 μg/mL의 낮은 농도에서도 UV-A 비조사군 수준으로 활성이 회복되었다(101.3%). 10~50 μg/mL 농도에서도 유의한 활성 증가를 유지했으며(P<0.01), 100 μg/mL에서도 여전히 유의한 효과를 나타냈다(P<0.05). 열매 추출물은 0.1~10 μg/mL 농도 범위에서 매우 유의한 활성 증가를 보였다(P<0.001). 50 μg/mL에서도 여전히 유의한 효과를 나타냈으나(P<0.05), 100 μg/mL에서는 통계적 유의성이 관찰되지 않았다. 잎 추출물은 0.1~5 μg/mL 농도에서 가장 높은 활성 증가를 보였으며(P<0.001), 10 μg/mL에서도 유의한 활성을 유지했다(P<0.05). 그러나 50~100 μg/mL의 고농도에서는 통계적 유의성이 관찰되지 않았다. 줄기 추출물은 0.1~10 μg/mL 농도 범위에서 매우 높은 SOD 유사 활성 증가를 보였으며(P<0.001), 50~100 μg/mL의 고농도에서도 유의한 활성을 유지했다(P<0.01). 양성대조군으로 사용된 아스코르브산(1,000 μg/mL)은 88%의 SOD 유사 활성을 나타냈다(P<0.001).

흥미롭게도, ADA의 모든 부위 추출물은 저농도(0.1~1 μg/mL)에서 아스코르브산과 비슷하거나 더 높은 활성을 보였다. 이러한 결과는 ADA 추출물, 특히 뿌리와 줄기 추출물이 UV-A로 인한 산화 스트레스로부터 피부세포를 보호하는 데 효과적일 수 있음을 시사했다. 저농도에서 높은 활성을 보이는 점은 ADA 추출물의 강력한 항산화 능력을 나타내며, 이는 폴리페놀, 플라보노이드 등의 항산화 물질에 기인한 것으로 추정된다(William 등, 2019). 그러나 열매와 잎 추출물에서 고농도 처리 시 활성이 감소하는 현상은 주목할 만하다. 이는 고농도의 항산화 물질이 오히려 pro-oxidant로 작용할 수 있다는 기존의 연구 결과와 일치했다(Procházková 등, 2011). 이는 ADA 추출물이 단순한 항산화제가 아닌, 복합적이고 정교한 세포 보호 메커니즘을 가지고 있을 가능성을 제시하였다. 따라서 ADA 추출물의 최적 사용 농도 범위를 설정하는 것이 중요할 것으로 보인다.

본 연구에서 관찰된 ADA 추출물의 생리활성은 기존 오가피 연구 결과들과 비교하여 새로운 인사이트를 제공한다. Jo와 Cho(2012)는 일반 오가피(Acanthopanax sessiliflorus) 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 보고했으나, 본 연구에서는 UV-A 유도 산화 스트레스 모델에서 ADA의 SOD 유사 활성을 확인하여 더 생체 관련성 높은 결과를 얻었다. 향후 연구 방향으로는 ADA 추출물이 세포 내 항산화 효소 시스템에 미치는 영향을 더욱 깊이 있게 조사할 필요가 있다. 예를 들어, 카탈라아제, 글루타치온 퍼옥시다아제 등 다른 항산화 효소들의 활성 변화를 함께 관찰하거나, Nrf2/ARE 경로와 같은 항산화 관련 신호전달 체계에 대한 영향을 분석하는 것이 유용할 것이다. 또한, 각 추출물의 주요 활성 성분을 분리하여 개별 성분의 효과를 평가하는 것도 중요한 후속 연구가 될 수 있다. 이러한 심층적인 연구는 ADA 추출물의 항산화 메커니즘을 더욱 명확히 규명할 뿐만 아니라, 피부 항노화 제품 개발에 있어 과학적 근거를 강화하고 최적의 배합 전략을 수립하는 데 기여할 것이다.

멜라닌 저해 활성 측정

본 연구에서는 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 ADA 부위별 추출물(뿌리, 열매, 잎, 줄기)의 멜라닌 생성 억제 효과를 평가하였다(Fig. 3A). 모든 부위의 추출물은 농도 의존적으로 멜라닌 생성을 억제하는 경향을 보였으나, 그 효과는 부위와 농도에 따라 상이했다. 열매 추출물이 가장 강력한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타냈다. 10 μg/mL 농도에서부터 유의한 억제 효과를 보였으며(P<0.05), 50 μg/mL와 100 μg/mL 농도에서는 각각 73.9%(P<0.01)와 66.9%(P<0.001)로 매우 높은 억제율을 나타냈다. 이는 열매 추출물이 강력한 미백 효과를 가질 수 있음을 시사했다.

Fig 3. Effects of Acanthopanax divaricatus var. albeofructus (ADA) extracts on melanin synthesis and tyrosinase activity in B16F10 melanoma cells. (A) Melanin content in cells treated with various concentrations (0∼100 μg/mL) of ADA extracts from root, fruit, leaf, and stem for 48 h. Melanin content was measured and expressed as a percentage relative to the untreated control. (B) Tyrosinase activity in cells treated with various concentrations (0, 5, 10, 50, and 100 μg/mL) of ADA extracts from different plant parts for 48 h. Tyrosinase activity was measured spectrophotometrically and expressed as a percentage of the control. Data are presented as mean±SD from three independent experiments. Statistical significance compared to the untreated control: ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 (one-way ANOVA followed by Dunnett’s test).

잎 추출물은 두 번째로 높은 억제 효과를 보였다. 50 μg/mL와 100 μg/mL 농도에서 각각 78.8%(P<0.01)와 72.2%(P<0.001)의 유의한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타냈다. 뿌리 추출물은 50 μg/mL 농도에서부터 유의한 억제 효과를 보였으며(91.8%, P<0.05), 100 μg/mL 농도에서는 80.9%(P<0.01)의 억제율을 나타냈다. 줄기 추출물은 가장 약한 억제 효과를 보였으며, 100 μg/mL 농도에서만 유의한 억제 효과(93.7%, P<0.05)를 나타냈다. 이러한 결과는 ADA 추출물, 특히 열매와 잎 추출물이 멜라닌 생성을 효과적으로 억제할 수 있음을 시사했다. 멜라닌은 피부 색소 침착의 주요 원인 물질로, 그 생성을 억제하는 것이 미백 효과의 핵심이다(Pillaiyar 등, 2017). 따라서 ADA 열매와 잎 추출물은 미백 화장품 및 기능성 식품 개발에 잠재적으로 유용할 수 있다. 부위별 효과의 차이는 각 부위에 함유된 생리활성 물질의 종류와 함량 차이에서 기인할 것으로 추정된다. 향후 연구에서는 ADA 추출물의 주요 활성 성분을 분리, 동정하고 이들의 작용 메커니즘을 규명하는 것이 필요할 것이다. 특히 microphthalmia-associated transcription factor(MITF), tyrosinase related protein(TRP)-1, TRP-2 등 멜라닌 생성 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 조사할 필요가 있다.

티로시나아제 저해 활성 측정

B16F10 세포에서 ADA 부위별 추출물의 티로시나아제 활성 저해 효과를 평가하였다(Fig. 3B). 모든 추출물은 농도 의존적으로 티로시나아제 활성을 억제하는 경향을 보였으며, 이는 이전에 관찰된 멜라닌 생성 억제 효과와 일관성 있는 결과를 나타냈다. 열매 추출물이 가장 강력한 티로시나아제 저해 활성을 나타냈다. 10 μg/mL 농도부터 유의한 저해 효과를 보였으며(92.1±1.2%, P<0.01), 100 μg/mL에서 63.4±3.8%(P<0.001)의 높은 저해율을 달성했다. 이는 이전의 멜라닌 생성 억제 실험에서 열매 추출물이 가장 효과적이었던 결과와 일치했다. 특히, 멜라닌 실험에서 100 μg/mL 농도에서 66.9%(P<0.001)의 억제율을 보인 것과 유사한 수준의 효과를 티로시나아제 활성 저해에서도 확인할 수 있었다. 뿌리 추출물은 10 μg/mL 농도부터 유의한 티로시나아제 저해 효과(94.2±3.3%, P<0.05)를 나타냈으며, 100 μg/mL에서 77.9±2.3%(P<0.01)의 저해율을 보였다. 이는 멜라닌 생성 억제 실험에서 100 μg/mL 농도에서 80.9%(P<0.01)의 억제율을 보인 결과와 매우 유사하다. 잎 추출물은 50 μg/mL 농도에서부터 유의한 티로시나아제 저해 효과를 나타냈으며(82.5±3.4%, P<0.01), 100 μg/mL에서 76.7±0.0%(P<0.001)의 저해율을 보였다. 이는 멜라닌 생성 억제 실험에서 100 μg/mL 농도에서 72.2%(P<0.001)의 억제율을 보인 것과 일치하는 결과이다. 줄기 추출물은 가장 낮은 티로시나아제 저해 활성을 보였으며, 100 μg/mL의 고농도에서만 유의한 효과(88.3±0.4%, P<0.05)를 나타냈다. 이는 멜라닌 생성 억제 실험에서도 줄기 추출물이 가장 약한 효과를 보였던 것과 일치했다.

미백 효과에 있어 Im 등(2008)은 일반 오가피 페놀산 분획물의 멜라닌 생성 억제를 보고했으나, 본 연구에서는 잎 및 열매 열수 추출물도 유사한 수준의 높은 미백 효과를 가짐을 확인했다. 이는 ADA의 다양한 부위가 화장품 원료로 활용될 수 있는 가능성을 제시하였다. 또한 본 연구에서 관찰된 ADA 추출물의 티로시나아제 저해 효과는 앞서 확인한 멜라닌 생성 억제 결과와 높은 상관관계를 보여주고 있다. 이는 ADA 추출물의 미백 효과가 주로 티로시나아제 억제를 통해 매개됨을 강하게 시사했다. 또한 본 연구에서 관찰된 ADA 추출물의 티로시나아제 저해 효과는 여러 가지 기전을 통해 나타날 수 있다. 첫째, ADA 추출물 내의 특정 성분들이 티로시나아제의 활성 부위에 직접 결합하여 효소 활성을 억제할 수 있다. 둘째, 추출물의 항산화 성분들이 티로신에서 DOPA, DOPA에서 도파퀴논으로의 산화 과정을 억제할 수 있다. 셋째, ADA 추출물이 MITF와 같은 전사 인자의 활성을 조절하여 티로시나아제 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다(Baek 등, 2020). 향후 연구에서는 이러한 가능한 기전들을 검증하기 위해 티로시나아제 유전자 발현 수준과 관련 신호전달 경로에 대한 분석이 필요할 것이다.

자외선(UV-A) 노출 시간에 따른 MMP-1 분비 측정

HDF-n 세포에서 자외선 노출 시간에 따른 MMP-1 분비량 변화를 측정한 결과, 노출 시간이 증가함에 따라 MMP-1 분비량이 점진적으로 증가하는 것을 관찰하였다(Fig. 4A). 자외선 비조사군과 비교하여 30분 노출 시 MMP-1 분비량이 1.52배(P<0.05) 증가하였으며, 60분 노출 시 1.80배(P<0.01), 180분 노출 시 2.95배(P<0.001)로 현저히 증가하였다. 특히 60분 노출 시점에서 MMP-1 분비량이 유의하게 증가하면서도(1.80±0.03배), 세포의 생존율에 큰 영향을 미치지 않는 적정 시간으로 판단되어 이후 실험의 자외선 조사 시간으로 선정하였다. 이는 Fisher 등(1997)의 연구에서 보고된 바와 같이, 자외선 노출이 피부 섬유아세포의 MMP-1 발현을 유의하게 증가시킨다는 결과와 일치했다. 자외선 노출 시간 증가에 따른 MMP-1 분비량의 지속적인 증가는 자외선에 의한 산화 스트레스와 세포 손상이 누적되어 나타나는 결과로 해석될 수 있다(Brenneisen 등, 1998). 180분 노출 시 관찰된 MMP-1 분비량의 급격한 증가(2.95±0.10배)는 장시간의 자외선 노출로 인한 세포 손상이 임계점에 도달했을 가능성을 시사한다. 60분의 자외선 조사 시간 선정은 유의한 MMP-1 증가를 유도하면서도 극단적인 세포 손상을 방지할 수 있는 균형점으로 판단된다. 향후 연구에서는 이 조건을 바탕으로 다양한 오가피 부위별 추출물의 MMP-1 억제 효과를 평가하였다.

Fig 4. Effects of UV-A irradiation and Acanthopanax divaricatus var. albeofructus (ADA) extracts on MMP-1 expression in HDF-n cells. (A) Time-dependent changes in MMP-1 secretion in HDF-n cells exposed to UV-A irradiation. Cells were exposed to UV-A irradiation for various durations ranging from 0 to 180 min. MMP-1 levels were quantified using ELISA and expressed as a ratio relative to the non-irradiated control (0 min), which was set to 1. The 60 min exposure time was selected for subsequent experiments. (B) Effects of ADA extracts on MMP-1 expression in UV-A irradiated HDF-n cells. Cells were exposed to UV-A (8 J/cm²) and treated with various concentrations of ADA extracts from root, fruit, leaf, and stem. MMP-1 expression levels are presented as the ratio to non-irradiated control. Data are expressed as mean±SD (n=3). Statistical significance compared to the non-irradiated control in (A) or UV-irradiated control (UV+, 0 μg/mL) in (B): ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 (one-way ANOVA followed by Dunnett’s test).

자외선(UV-A)을 조사한 HDF-n 세포 내에서의 MMP-1 분비 저해 측정

UV-A 조사는 HDF-n 세포의 MMP-1 발현을 현저히 증가시켰다(1.94배, P<0.001)(Fig. 4B). 이는 UV-A가 피부세포의 콜라겐 분해를 촉진하여 광노화를 유발할 수 있음을 시사했다(Fisher 등, 2002). ADA의 부위별 추출물은 UV-A로 유도된 MMP-1 발현 증가를 농도 의존적으로 억제하는 경향을 보였으나, 그 효과는 부위에 따라 상이했다. 뿌리 추출물은 가장 일관된 억제 효과를 나타냈다. 10 μg/mL 농도부터 유의한 MMP-1 발현 감소를 보였으며(P<0.05), 농도가 증가함에 따라 억제 효과도 증가했다(50 μg/mL에서 P<0.01, 100 μg/mL에서 P<0.001). 이는 뿌리 추출물이 UV-A로 인한 콜라겐 분해를 효과적으로 방지할 수 있음을 시사했다. 열매와 잎 추출물 역시 유사한 패턴을 보였다. 두 추출물 모두 10 μg/mL 농도부터 유의한 MMP-1 발현 억제 효과를 나타냈으며(P<0.05), 100 μg/mL 농도에서 가장 강한 억제 효과를 보였다(P<0.01). 이러한 결과는 열매와 잎 추출물도 피부 항노화 효과를 가질 수 있음을 제시했다. 반면, 줄기 추출물은 예상치 못한 결과를 보였다. 1 μg/mL의 낮은 농도에서는 MMP-1 발현을 유의하게 감소시켰으나(P<0.05), 농도가 증가함에 따라 오히려 MMP-1 발현이 증가하는 경향을 보였다. 특히 100 μg/mL 농도에서는 UV-A 조사군보다도 높은 MMP-1 발현을 나타냈다(P<0.001). 이러한 현상은 호르메시스(hormesis) 효과로 설명될 수도 있다. 호르메시스는 낮은 농도에서는 보호 효과를 나타내지만, 높은 농도에서는 오히려 해로운 영향을 미치는 현상을 말한다(Calabrese와 Baldwin, 2002). 또한, 줄기 추출물에 존재하는 다양한 화합물들이 농도에 따라 서로 다른 상호작용을 일으켜 예상치 못한 효과를 나타낼 수 있다(Williamson, 2001). 세 번째 가능성은 높은 농도의 줄기 추출물이 세포에 스트레스를 유발하여 MMP-1 발현을 증가시켰을 수도 있다는 것이다(Brenneisen 등, 1998). 마지막 가능성은 줄기 추출물이 고농도에서 MMP-1 발현을 증가시킨 현상은 복잡한 생리활성 물질의 상호작용에 기인할 수 있다는 것이다. 한 가지 가설은 줄기 추출물에 포함된 특정 화합물이 고농도에서 세포 스트레스 반응을 유발할 수 있다는 것이다. Jomová 등(2019)은 일부 식물 성분들이 세포 내 ROS 생성을 증가시킬 수 있음을 보고했다. 이러한 ROS의 증가는 NF-κB나 AP-1과 같은 전사인자를 활성화해 MMP-1의 발현을 촉진할 수 있다. 이러한 가설들을 검증하기 위해서는 줄기 추출물의 농도별 처리에 따른 세포 내 ROS 수준, 염증 관련 유전자 발현 등을 종합적으로 분석하는 후속 연구가 필요할 것이다.

본 실험 결과는 ADA의 부위별 추출물이 UV-A로 인한 피부 노화에 대해 서로 다른 영향을 미칠 수 있음을 보여준다. 뿌리, 열매, 잎 추출물은 피부 항노화 제품 개발에 잠재적으로 유용할 수 있으나, 줄기 추출물의 경우 추가적인 연구가 필요하다. 항노화 효과와 관련하여, Lee 등(2019)은 가시오가피순 메탄올 추출물의 콜라겐 합성 촉진 효과를 보고했다. 본 연구에서는 이와 관련하여 MMP-1 발현 억제를 통한 콜라겐 분해 방지 효과를 확인했다. 특히 뿌리, 열매, 잎 추출물 모두 유의미한 MMP-1 억제 효과를 보인 점은 ADA의 다면적인 항노화 메커니즘을 시사했다. 향후 연구에서는 각 추출물의 성분 분석과 함께 다양한 피부세포 모델에서의 효과 검증, 그리고 in vivo 실험을 통한 안전성 및 유효성 평가가 필요할 것으로 사료된다.

HAase 저해 활성 측정

본 연구에서는 ADA의 부위별 추출물(뿌리, 열매, 잎, 줄기)의 HAase 저해 활성을 평가하였다(Fig. 5A). 모든 부위의 추출물은 농도 의존적으로 HAase 활성을 억제하는 것으로 나타났으나, 그 효과는 부위별로 상이했다. 열매 추출물은 가장 강력한 HAase 저해 활성을 보였다. 2 mg/mL 농도에서부터 유의한 효과를 나타냈으며(P<0.05), 3 mg/mL 이상의 농도에서는 매우 높은 유의성(P<0.001)을 보였다. 8 mg/mL 농도에서는 93.6%의 높은 저해율을 달성했다. 이는 양성대조군으로 사용된 탄닌산(0.3 mg/mL에서 96.4% 저해)과 유사한 수준의 활성이다(Fig. 5B). 줄기 추출물 역시 높은 저해 활성을 나타냈다. 1 mg/mL의 낮은 농도에서도 유의한 효과를 보였으며(P<0.05), 2 mg/mL 이상에서는 매우 높은 유의성(P<0.001)을 나타냈다. 8 mg/mL 농도에서 90.4%의 저해율을 보여 열매 추출물 다음으로 높은 활성을 보였다. 뿌리 추출물은 열매, 줄기보다는 낮은 저해 활성을 보였다. 3 mg/mL 농도부터 유의한 효과(P<0.05)를 나타냈으며, 농도가 증가함에 따라 유의성도 증가하여 7 mg/mL 이상에서는 P<0.001 수준의 유의성을 보였다. 그러나 8 mg/mL 농도에서의 최대 저해율은 23.3%로, 열매나 줄기 추출물에 비해 상대적으로 낮았다. 잎 추출물은 가장 낮은 저해 활성을 보였다. 6 mg/mL 이상의 높은 농도에서만 유의한 효과(P<0.05)를 나타냈으며, 8 mg/mL 농도에서도 14.3%의 상대적으로 낮은 저해율을 보였다. 이러한 결과는 ADA 추출물, 특히 열매와 줄기 추출물이 강력한 HAase 저해 활성을 가지고 있음을 시사했다.

Fig 5. Hyaluronidase (HAase) inhibitory activity of (A) Acanthopanax divaricatus var. albeofructus (ADA) extracts and (B) tannic acid (positive control). The inhibitory effects of root, fruit, leaf, and stem extracts of ADA on HAase activity were evaluated at concentrations ranging from 0 to 8 mg/mL. Tannic acid was tested at concentrations of 0.1, 0.2, and 0.3 mg/mL. Data are presented as mean±SD (n=3). Statistical significance compared to the control: ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 (one-way ANOVA followed by Dunnett’s test).

HAase는 히알루론산을 분해하는 효소로, 이의 억제는 피부의 수분 보유력과 탄력 유지에 중요한 역할을 한다(Papakonstantinou 등, 2012). Choi 등(2003)은 일반 오가피 뿌리껍질의 HAase 저해 활성을 보고했으나, 본 연구에서는 열매 및 줄기 추출물도 높은 HAase 저해 활성을 가짐을 확인했다. 이는 ADA의 다양한 부위가 피부 보습과 탄력 유지에 기여할 수 있음을 시사했다. 따라서 ADA 열매와 줄기 추출물은 피부 보습과 항노화 제품 개발에 잠재적으로 유용할 수 있다.

본 연구에서는 흰털 오가피의 부위별(뿌리, 열매, 잎, 줄기) 열수 추출물의 피부 생리활성을 평가하였다. UV-A로 유도된 산화 스트레스 조건에서 HDF-n 세포의 항산화 활성을 측정한 결과, 모든 추출물이 유의한 항산화 효과를 나타냈으며, 특히 뿌리와 줄기 추출물이 저농도에서도 높은 활성을 보였다.

B16F10 마우스 흑색종 세포에서 열매와 잎 추출물은 멜라닌 생성 및 티로시나아제 활성을 가장 효과적으로 억제하였다. UV-A 조사에 의한 HDF-n 세포의 MMP-1 발현 증가는 뿌리, 열매, 잎 추출물에 의해 유의하게 감소하였으나, 줄기 추출물은 농도에 따라 상반된 효과를 보였다. HAase 활성 저해 실험에서는 열매와 줄기 추출물이 가장 높은 효과를 나타냈다. 이러한 결과는 ADA 추출물, 특히 열매와 잎 추출물이 항산화, 항노화 및 미백 기능성 화장품 원료로서 높은 잠재력을 지니고 있음을 시사했다. 또한, 부위별 생리활성의 차이는 ADA의 응용 목적에 따른 선택적 활용이 중요함을 나타냈다.

이 논문은 2024년 국립순천대학교 학술연구비(과제번호: 2024-0428) 공모과제로 연구되었음