대추(Zizyphus jujuba Mill.)는 갈매나무과(Rhamnaceae)에 속하는 낙엽 활엽 소교목의 열매로, 동아시아를 중심으로 오랫동안 식용 및 약용으로 사용되어 왔다(Gao 등, 2013). 전통적으로 대추는 강장, 진정, 해열 등의 목적으로 한방에서 널리 사용되어 왔으나(Chen 등, 2017), 그 과학적 근거와 구체적인 생리활성 기전에 관한 연구는 상대적으로 부족한 실정이다. 최근 일부 연구에서 대추에 flavonoids, triterpenes, saponin, 다당류, 비타민 C 등 다양한 생리활성 물질이 포함되어 있음이 보고되고 있으나(Pawlowska 등, 2009), 이들 성분의 구체적인 생리활성과 작용 기전에 관한 체계적인 연구는 아직 미흡하다. 특히 대추 추출물의 항산화, 미백, 면역조절 활성에 대한 종합적인 평가와 이들 활성의 상호 연관성에 관한 연구는 거의 이루어지지 않았다.

현대 사회에서 항산화, 미백, 면역조절 활성은 건강과 미용 분야에서 중요한 역할을 하며, 이들은 서로 밀접하게 연관되어 있다. 이러한 활성들의 상호작용은 피부 건강과 전반적인 웰빙에 복합적인 영향을 미칠 수 있다(Addor, 2017). 따라서 이들 활성을 동시에 가진 천연물 소재의 발굴은 기능성 식품 및 화장품 산업에서 큰 의미를 가진다. 항산화 활성은 많은 천연물의 중요한 생리활성 중 하나로, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의한 산화적 스트레스를 감소시키는 역할을 한다(Liguori 등, 2018). Superoxide dismutase(SOD) 유사 활성은 중요한 항산화 지표로 여겨지며, 이는 많은 식물성 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Lobo 등, 2010). SOD는 superoxide anion을 과산화수소와 산소로 전환하는 효소로, SOD 유사 활성을 가진 물질은 생체 내에서 항산화 방어 시스템을 강화하는 데 기여할 수 있다(Lobo 등, 2010). 항산화 물질은 피부 노화 방지, 염증 억제, 그리고 멜라닌 생성 조절에도 관여하여 미백 및 면역조절 활성과도 밀접한 관련이 있다(Addor, 2017). 그러나 대추 추출물의 SOD 유사 활성과 그 기전에 관한 연구는 아직 초기 단계에 머물러 있다.

천연물의 미백 효과에 관한 연구는 최근 화장품 및 피부 관리 분야에서 큰 관심을 받고 있다. 피부 색소 침착의 주요 원인인 멜라닌 생성을 조절하는 다양한 천연 화합물들이 발견되고 있으며, 이들은 멜라닌 생합성 경로의 여러 단계에 작용할 수 있다(Pillaiyar 등, 2017; Zolghadri 등, 2019). 멜라닌 생합성 과정에서 가장 중요한 효소인 티로시나아제(tyrosinase)는 많은 연구의 주요 표적이 되고 있다. Tyrosinase는 L-티로신을 L-DOPA로, 그리고 L-DOPA를 DOPA quinone으로 산화시키는 두 가지 반응을 촉매하는데, 이는 멜라닌 생성의 속도 결정 단계이다(Chang, 2009). 따라서 tyrosinase 활성을 억제하는 물질은 효과적인 미백 성분으로 간주한다. 미백 활성은 단순히 미용적 측면뿐 아니라 과도한 색소 침착으로 인한 피부 문제를 예방하고 개선하는 데 중요하다. 또한, 일부 미백 성분들은 항산화 및 항염증 효과를 동시에 가지고 있어 피부 건강 증진에 다각도로 기여할 수 있다(Sarkar 등, 2013). 많은 천연물 추출물에서 tyrosinase 억제 활성이 보고되고 있다. 예를 들어, 감초(Glycyrrhiza glabra) 추출물의 글라브리딘(glabridin)은 강력한 tyrosinase 억제제로 알려져 있으며(Nerya 등, 2003), 감(Diospyros kaki)잎 추출물도 tyrosinase 활성을 효과적으로 억제한다(Xue 등, 2011). 또한, 녹차(Camellia sinensis) 추출물의 카테킨류, 특히 에피갈로카테킨갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG)는 tyrosinase 억제뿐만 아니라 멜라노좀(melanosome)의 성숙과 이동을 저해하는 것으로 보고되었다(Kim 등, 2015). Tyrosinase 억제 외에도, 천연물은 다양한 기전을 통해 멜라닌 생성을 조절할 수 있다. 예를 들어, 일부 천연 화합물들은 멜라닌 생성 관련 유전자의 발현을 조절하거나 멜라노좀의 이동을 억제하거나, 또는 멜라닌 전구체의 산화를 방지하는 항산화 활성을 통해 미백 효과를 나타낸다(D’Mello 등, 2016). 알부틴(arbutin)과 코직산(kojic acid)과 같은 널리 알려진 미백 성분들도 원래 천연물에서 유래되었으며, 이들은 각각 서양민들레(Arctostaphylos uva-ursi)와 곰팡이(Aspergillus oryzae)에서 발견되었다(D’Mello 등, 2016). 최근에는 단순한 미백 효과를 넘어, 피부 안전성과 다기능성을 갖춘 천연 미백 성분에 관한 관심이 높아지고 있다. 예를 들어, 항산화, 항염증, 콜라겐 생성 촉진 등의 효과를 동시에 가지는 천연 화합물들이 주목받고 있다(Boo, 2019). 이는 피부 노화 방지와 미백을 동시에 달성할 수 있는 가능성을 제시한다. 그러나 천연물의 미백 효과를 평가할 때는 주의가 필요하다. In vitro 실험에서 관찰된 효과가 반드시 in vivo에서도 동일하게 나타나지 않을 수 있으며, 피부 투과율, 안정성, 그리고 실제 사용 조건에서의 효능 등을 종합적으로 고려해야 한다(Brenner와 Hearing, 2008). 또한, 천연물 추출물의 표준화와 품질 관리도 중요한 과제이다.

면역조절 능력은 복잡한 면역 네트워크의 다양한 구성 요소에 영향을 미칠 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 면역 체계는 선천성 면역과 적응성 면역으로 구성되며, 이들은 다양한 면역 매개체들을 통해 긴밀히 상호작용을 한다(Chaplin, 2010). 이러한 면역 반응의 조절에는 여러 사이토카인(cytokine)이 중요한 역할을 한다. 특히, 인터루킨(interleukin, IL)-8, 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α), IL-2는 서로 다른, 그러나 상호 연관된 면역 과정에 관여한다. 적절한 면역조절은 피부 건강 유지, 염증 반응 조절, 그리고 전반적인 건강 상태 개선에 중요하다. 특히, 과도한 면역 반응은 아토피 피부염과 같은 피부 질환을 유발할 수 있으며, 이는 피부 색소 침착 문제로 이어질 수 있다(Geoghegan 등, 2018). 따라서 면역조절 활성은 항산화 및 미백 활성과 밀접하게 연관되어 있다. IL-8은 주로 호중구의 화학주성과 활성화를 유도하는 염증성 사이토카인으로, 급성 염증 반응의 초기 단계에 중요한 역할을 한다(Hoffmann 등, 2002). TNF-α는 더 광범위한 염증 반응을 매개하며 IL-8의 생성을 촉진할 수 있다(Sedger와 McDermott, 2014). 이 두 사이토카인은 종종 염증 반응의 강도를 반영하는 지표로 사용된다. 반면, IL-2는 주로 T 세포에 의해 생성되며, T 세포의 증식과 분화를 촉진하는 중요한 면역조절 사이토카인이다(Boyman과 Sprent, 2012). IL-2는 염증성 사이토카인인 IL-8이나 TNF-α와는 다른 맥락에서 작용하여 적응성 면역 반응을 조절하고 면역 항상성 유지에 기여한다. 흥미롭게도, IL-2는 또한 조절 T 세포의 발달과 기능에 필수적이어서 과도한 면역 반응을 억제하는 역할도 한다. 이러한 사이토카인들 외에도 인터페론-감마(interferon-gamma, IFN-γ), IL-4, IL-10 등 다양한 사이토카인들이 면역 반응의 다양한 측면을 조절한다(Nelms 등, 1999; Saraiva와 O’Garra, 2010; Schoenborn과 Wilson, 2007). 예를 들어, IFN-γ는 대식세포를 활성화하고 Th1 반응을 촉진하는 반면, IL-4는 Th2 반응을 유도하고 B 세포의 항체 생성을 촉진한다. IL-10은 주로 항염증 작용을 하여 과도한 면역 반응을 억제한다. 면역글로불린 E(immunoglobulin E, IgE)는 이러한 사이토카인 네트워크와 밀접하게 연관되어 있다. IgE는 알레르기 반응의 주요 매개체로, 그 생성은 주로 IL-4와 IL-13에 의해 유도된다(Geha 등, 2003; Gould와 Sutton, 2008). 반면, IFN-γ는 IgE 생성을 억제할 수 있다. 따라서 IgE 수준은 Th1/Th2 균형의 지표로도 사용될 수 있으며, 이는 전반적인 면역 상태를 반영한다(Kidd, 2003).

이러한 항산화, 미백, 면역조절 활성의 상호 연관성을 고려할 때, 이들 활성을 동시에 평가하는 것은 천연물의 종합적인 효능을 이해하는 데 중요하다. 대추 추출물에 대한 이러한 통합적 접근은 그 잠재적 가치를 더욱 정확히 평가할 수 있게 해준다. 따라서 본 연구에서는 다양한 용매를 사용하여 추출한 천연물 시료의 항산화 효과를 SOD-유사 활성을 통해 평가하고, 미백 효과를 tyrosinase 억제 활성, 멜라닌 생성 억제, 그리고 세포 내 tyrosinase 활성 등 다각도로 평가하고자 한다. 이를 통해 효과적이고 안전한 천연 미백 성분을 발굴하고 그 작용 기전을 이해하며, 나아가 기능성 화장품 원료로서의 가능성을 탐색하고자 한다. 또한 대추의 다양한 용매별 추출물이 주요 면역 매개체들(IL-8, TNF-α, IL-2, IgE)의 생성과 분비에 미치는 영향을 체계적으로 평가하고자 한다. 이를 통해 대추 추출물의 면역조절 능력을 이해하고, 다양한 면역 관련 질환의 예방 및 치료에 활용될 수 있는 가능성을 탐색하고자 한다.

실험재료

대추 추출물의 제조 방법은 다음과 같다. 대추는 경동한약재시장에서 구입하여 유수연 교수가 검증하였다. 각각의 용매(40% butylene glycol, 70% 에탄올, 증류수)를 사용하여 대추 추출물을 제조하였다. 대추 100 g을 용매별 40% butylene glycol(1,3-butanediol, 99.5%, Sigma-Aldrich), 70% 에탄올(absolute, suitable for HPLC, Sigma-Aldrich), 그리고 증류수 1 kg에 넣어 24시간 상온 침지 시킨 후 한지 이중 필터로 걸러내고, pore 크기가 다른 membrane filter (0.8, 0.45, 0.22 μm, Milipore)에 순차적으로 여과하여 -20°C에 보관하고 사용하였다. 용매별 시료명은 JB(butylene glycol 추출물), JE(에탄올 추출물), JW(증류수 추출물)로 나타냈다. 용매별 추출물의 최종 회수한 건조 잔량(고형분 함량)은 JB 2.8%, JE 3.5%, JW 4.2%였다. 각 추출물의 농도는 추출물 자체의 무게를 기준으로 설정하였다. 고형분 함량을 고려한 환산 농도는 각 실험 결과에 별도로 명시하였다.

세포 배양 및 세포 생존율 측정

마우스 melanoma 세포(B16F10), 사람 장 상피세포(Caco-2), 그리고 사람 B 세포(U266B1)는 American Type Culture Collection에서 구입했고, 사람 T 세포(Jurkat)와 사람 단핵구 세포(THP-1)는 한국세포주은행에서 구입하였다. B16F10 세포는 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL), 1% penicillin/streptomycin(GibcoBRL)이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(GibcoBRL) 배지로 배양하였다. Caco-2 세포는 10% FBS(GibcoBRL), 1% penicillin/streptomycin(GibcoBRL)이 첨가된 Eagle’s minimum essential medium(GibcoBRL) 배지로 배양하였다. Jurkat, THP-1, 그리고 U266B1 세포는 각각 10% FBS (GibcoBRL), 1% penicillin/streptomycin(GibcoBRL)이 첨가된 RPMI-1640(GibcoBRL) 배지를 사용하였다. 모든 세포는 CO₂ incubator(5% CO₂, 95% air, 37°C; SA-MCO-18AIC, Sanyo)에서 배양하였다. 세포 생존율을 측정하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay를 사용하였다. 96-Well plate(Nunc)에 1×10⁴ cells/well씩 seeding 한 후 시료를 다양한 농도로 200 μL씩 분주하여 48시간 배양하였다. 이후 well에 MTT solution(3 mg/mL, Sigma-Aldrich)을 50 μL씩 넣고 incubator에서 4시간 동안 반응시켰다. 상등액을 제거한 뒤 dimethylsulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich)를 150 μL씩 넣고 570 nm에서 흡광도를 마이크로플레이트 리더기(Sunrise, Tecan)에서 측정하였다.

SOD 유사 활성도 측정

SOD 유사 활성은 pyrogallol의 산화 억제 능력을 측정하는 방법으로 평가하였다(Marklund와 Marklund, 1974). 각 추출물의 농도별 시료(0~100 mg/mL, 추출물 자체 무게 기준) 0.1 mL를 2.6 mL의 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.5, Sigma-Aldirch)과 혼합하였다. 이 혼합물에 0.2 mL의 7.2 mM pyrogallol 용액(Sigma-Aldirch)을 첨가하여 반응을 시작하였다. 25°C에서 10분간 반응시킨 후, 0.1 mL의 1 N HCl(Sigma-Aldirch)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 산화된 pyrogallol의 양은 420 nm에서 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 측정하였다. 양성대조군으로는 아스코르브산(ascorbic acid, Sigma-Aldrich)을 사용하였다.

Tyrosinase 저해 활성

Tyrosinase 저해 활성은 Yagi 등(1987)의 방법을 변형하여 측정하였다. 반응 혼합물은 0.175 M sodium phosphate buffer(pH 6.8, Sigma-Aldirch) 500 μL, 10 mM L-DOPA 200 μL, 시료 용액 100 μL로 구성하였다. 여기에 mushroom tyrosinase(110 U/mL, Sigma-Aldrich) 200 μL를 첨가하여 25°C에서 2분간 반응시켰다. 생성된 DOPA chrome은 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Melanoma 세포 내 melanin 생성량 측정

Melanin 생합성 저해 효과는 Hosoi 등(1985)의 방법을 수정하여 실험하였다. B16F10 세포를 6-well plate(Nunc)에 2×10⁵ cells/well 농도로 seeding 하고 24시간 동안 배양한 후, 다양한 농도의 시료가 포함된 배지로 교체하여 48시간 동안 추가 배양하였다. 세포를 phosphate-buffered saline(PBS, Sigma-Aldrich)으로 세척하고 1%(w/v) Triton X-100(Sigma-Aldrich)이 포함된 100 mM sodium phosphate buffer(pH 6.8) 100 μL로 용해하였다. 12,000×g에서 30분간 원심분리(VS-424, 비전과학)하여 얻은 pellet에 10% DMSO를 함유한 1 N NaOH(Sigma-Aldrich)를 첨가하고 65°C에서 1시간 동안 incubation하여 melanin을 용해시켰다. 용해된 melanin의 양은 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 405 nm에서 측정하였으며, 결과는 상대적 melanin content로 표시하였다.

Melanoma 세포 내 tyrosinase 저해 활성 측정

B16F10 세포를 6-well plate(Nunc)에 2×10⁵ cells/well 농도로 seeding 하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 다양한 농도의 시료가 포함된 배지로 교체하여 48시간 동안 추가 배양하였다. PBS로 세척한 후, 1%(w/v) Triton X-100(Sigma-Aldrich)이 포함된 100 mM sodium phosphate buffer(pH 6.8) 100 μL를 첨가하여 세포를 용해하였다. 세포 용해액을 12,000×g에서 30분간 원심분리(VS-424, 비전과학)한 후, 상등액의 단백질 농도를 측정하였다. 100 μg 단백질에 해당하는 상등액과 2 mg/mL L-DOPA 용액 80 μL를 혼합하여 37°C에서 반응시켰다. 형성된 DOPA chrome은 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 490 nm에서 측정하였으며, 결과는 상대적 tyrosinase 활성으로 표시하였다.

사이토카인 분비 변화 측정

사이토카인 분비량은 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)를 이용하여 측정하였다. IL-2, IL-8, TNF-α, IgE에 대한 ELISA kit은 BD Pharmingen에서 구입하였다. 96-Well microplate(Nunc)에 0.1 M sodium carbonate buffer(pH 9.5, Sigma-Aldrich)로 희석한 capture antibody를 100 μL씩 분주하고 4°C에서 overnight 코팅하였다. 플레이트를 washing buffer(PBS with 0.05% Tween-20, Sigma-Aldrich)로 3회 세척한 후, 1% bovine serum albumin(Sigma-Aldrich) 용액 200 μL를 이용해 실온에서 1시간 동안 blocking 하였다. 다시 washing buffer로 3회 세척 후, standard와 시료를 각 well에 100 μL씩 분주하고 실온에서 2시간 동안 incubation 하였다. 다시 washing buffer로 5회 세척 후, biotinylated-detection antibody와 streptavidin-horseradish peroxidase 혼합액을 100 μL씩 분주하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 washing buffer로 7회 세척 후, 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate solution(BD Pharmingen)을 100 μL씩 분주하고 실온에서 30분간 발색 반응을 진행하였다. 1 M phosphoric acid로 반응을 종료시키고, 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계처리

모든 실험 결과는 본문의 그림에서 대조군 대비 상대적 비율(%)로 표현하였다. 각 실험에서 용매 자체의 영향을 확인하기 위해 사용된 blank(추출물을 포함하지 않은 각 용매)의 값과 최고 농도에서의 측정 결과는 Supplementary Table 1에 별도로 제시하였다. 이 supplementary data는 용매의 영향과 각 추출물의 최대 효과를 직접적으로 비교할 수 있게 해준다. 모든 실험은 3회 반복 수행되었으며, 결과는 평균±표준편차로 표시하였다. One-way ANOVA를 실시하였으며, 사후 검정으로 Dunnett’s test를 수행하였다. 음성 대조군과 각 농도 간의 유의성을 평가하여, 유의미한 차이를 보이는 농도에 P<0.05, P<0.01, P<0.001로 유의성을 표시하였다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 9 소프트웨어를 사용하여 수행하였으며, P<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

SOD 유사 활성 측정

세 가지 각각의 용매(butylene glycol, 에탄올, 증류수)를 사용하여 제조한 대추 추출물들의 SOD 유사 활성을 비교 평가하였다. 모든 추출물에서 농도 의존적인 SOD 유사 활성 증가가 관찰되었으나, 용매에 따라 그 효과의 차이가 뚜렷하게 나타났다(Fig. 1). JB는 가장 높은 SOD 유사 활성을 보였다. 추출물 자체 무게 기준 10 mg/mL(고형분 함량 기준 0.28 mg/mL)의 농도에서부터 유의미한 활성(13.7±0.1%, P<0.05)이 관찰되었으며, 농도가 증가함에 따라 활성이 지속적으로 상승하여 100 mg/mL(고형분 함량 기준 2.8 mg/mL)에서 최대 활성(62.4±1.5%, P<0.001)에 도달하였다. 특히 70 mg/mL에서 80 mg/mL(고형분 함량 기준 1.96 mg/mL에서 2.24 mg/mL)로 농도가 증가할 때 활성이 급격히 증가(35.5±0.6%에서 46.9±1.9%로)하는 것이 관찰되었는데, 이는 이 농도 범위에서

Fig 1. Superoxide dismutase (SOD)-like activity of different Zizyphus jujuba extracts and ascorbic acid. The SOD-like activity was measured for (A) butylene glycol extract (JB), ethanol extract (JE), water extract (JW) of Z. jujuba, and (B) ascorbic acid as a positive control. The activity is expressed as a percentage of inhibition of superoxide anion generation. Data are presented as mean±SD from triplicate experiments. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Dunnett’s test. Asterisks indicate significant difference compared to the control (0 mg/mL): ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001.

활성 물질의 임계 농도에 도달했을 가능성을 뜻한다. JW는 JB와 마찬가지로 추출물 자체 무게 기준 10 mg/mL(고형분 함량 기준 0.42 mg/mL)에서부터 유의미한 활성(12.1±1.1%, P<0.05)을 보였으나, 농도 증가에 따른 활성 상승은 JB보다 완만하였다. 100 mg/mL(고형분 함량 기준 4.2 mg/mL)에서의 최대 활성은 42.6±3.0%(P<0.001)로 JB의 약 68% 수준이었다. JE는 세 가지 추출물 중 가장 낮은 활성을 보였다. 유의미한 활성이 50 mg/mL(고형분 함량 기준 1.75 mg/mL)부터 관찰되기 시작했으며(4.6±0.8%, P<0.05), 최고 농도인 100 mg/mL(고형분 함량 기준 3.5 mg/mL)에서도 16.0±4.2%(P<0.001)의 비교적 낮은 활성을 나타냈다. 양성대조군으로 사용된 ascorbic acid는 100 μg/mL에서 61.5±0.52%의 활성을 나타냈으며, EC50은 72.5 μg/mL로 나타났다. 사후 분석 결과, 모든 농도에서 JB, JW, JE 순으로 활성이 높았으며, 이들 간의 차이는 통계적으로 유의했다(P<0.05).

이러한 결과는 대추 추출물이 항산화 효과를 가지며, 추출물 중 JB가 가장 높은 항산화 효과를 가지고 있음을 나타낸다. SOD 유사 활성은 대추에 함유된 폴리페놀 및 플라보노이드 화합물들의 작용으로 추정된다(Yan 등, 2022). 이들 화합물은 자유라디칼을 직접 소거할 뿐만 아니라, Nrf2/ARE 경로 활성화를 통해 내인성 항산화 시스템을 강화할 수 있다(Hseu 등, 2019). JB의 높은 활성은 butylene glycol이 이러한 항산화 물질들을 효과적으로 추출했음을 나타낸다. 추출 용매에 따른 활성 차이는 대추의 항산화 성분들이 용매의 극성에 따라 다르게 추출됨을 나타낸다. 향후 연구에서는 각 추출물의 성분 분석을 통해 주요 항산화 물질을 동정하고, 이들의 구조-활성 관계를 규명할 필요가 있다.

대추 추출물에 대한 세포 생존율

다양한 세포주(B16F10, Caco-2, Jurkat, U266B1, THP-1)에 대추 추출물 JB, JE, JW를 0~10 mg/mL 농도로 처리하여 MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정하였다(Fig. 2). B16F10 세포에서 JB, JE, JW는 0.6 mg/mL 농도에서 각각 85.6%, 85.9%, 96.2%의 세포 생존율을 보였고, Caco-2 세포에서 JB, JE, JW는 0.6 mg/mL 농도에서 각각 82.0%, 93.6%, 90.0%의 세포 생존율을 보였다. Jurkat 세포에서 JB, JE, JW는 0.2 mg/mL 농도에서 각각 93.9%, 91.6%, 86.0%의 세포 생존율을 보였다. THP-1 세포에서 JB, JE, JW는 0.4 mg/mL 농도에서 각각 92.7%, 83.3%, 90.80%의 세포 생존율을 보였으며, U266B1 세포에서 0.4 mg/mL 농도에서 JB, JE, JW는 각각 92.7%, 83.3%, 90.8%의 세포 생존율을 보였다. 이러한 결과를 바탕으로, 추후 실험에서는 세포주별로 80% 이상의 세포 생존율을 보이는 농도 범위 내에서 대추 추출물의 효과를 평가하기로 하였다.

Fig 2. Cytotoxicity of Ziziphus jujuba extracts on cells. (A) B16F10, (B) Caco-2, (C) Jurkat, (D) THP-1, and (E) U266B1 cells were treated with various concentrations of butylene glycol extract (JB), ethanol extract (JE), and water extract (JW) of Z. jujuba for 48 h. Cell viability was measured using the MTT assay and expressed as a percentage relative to untreated control. Data are presented as mean±SD (n=3).

Tyrosinase 저해 활성

대추 추출물의 tyrosinase 저해 활성을 평가한 결과, 추출 용매에 따라 상이한 효과가 관찰되었다(Fig. 3). JB가 가장 높은 저해 활성을 나타냈으며, JE와 JW는 상대적으로 낮은 활성을 보였다. JB는 10 mg/mL의 낮은 농도에서부터 대조군과 비교하여 현저한 저해 활성을 나타내기 시작했으며(P<0.05), 농도가 증가함에 따라 저해 활성이 점진적으로 증가하였다. 특히 50 mg/mL 이상의 농도에서는 매우 높은 유의성(P<0.001)을 보이며 강력한 저해 효과를 나타냈다. 100 mg/mL 농도에서 JB는 36.86±0.07%의 최대 저해율을 보였다. 반면,

Fig 3. Effect of Zizyphus jujuba extracts on tyrosinase inhibi-tion. Butylene glycol extract (JB), ethanol extract (JE), and water extract (JW) were tested at concentrations ranging from 0 to 100 mg/mL. Results are expressed as mean±SD (n=3). Statis-tical significance compared to control: ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 (one-way ANOVA followed by Dunnett’s test).

JE는 80 mg/mL 농도에서 유의한 저해 활성을 나타내기 시작했으며(P<0.05), 100 mg/mL에서 10.02±0.38%의 저해율을 보였다(P<0.01). JW의 경우 50 mg/mL부터 유의한 활성을 보이기 시작했으며(P<0.05), 100 mg/mL에서 12.58±0.24%의 저해율을 나타냈다(P<0.001). 이러한 결과는 대추의 tyrosinase 저해 활성 물질이 주로 중간 극성 용매인 butylene glycol에 잘 추출됨을 의미한다. 이는 대추에 함유된 페놀 화합물들의 극성과 관련이 있을 것으로 추정된다(Şöhretoğlu 등, 2022). 페놀 화합물들은 그들의 hydroxyl 그룹을 통해 tyrosinase의 활성 부위와 상호작용을 하여 효소 활성을 저해할 수 있다(Chang, 2009). JB의 높은 저해 활성은 기존에 보고된 다른 천연 추출물들과 비교해도 상당히 유의미한 수준이다(Wu 등, 2018). 그러나 JE와 JW의 상대적으로 낮은 활성은 이들 추출물에 tyrosinase 저해 활성을 가진 화합물들이 적게 포함되어 있거나, 혹은 다른 성분들과의 상호작용으로 인해 활성이 감소했을 가능성을 제시한다.

Melanoma 세포 내 melanin 생성량 측정

B16F10 세포에서 대추 추출물이 melanin 생성에 미치는 영향을 평가한 결과, 세 가지 추출물 모두 농도 의존적인 억제 효과를 보였다(Fig. 4A). 그러나 그 효과의 정도는 추출 용매에 따라 차이를 나타냈는데, JB가 가장 강한 melanin 생성 억제 효과를 보였다. JB는 10 μg/mL의 낮은 농도에서부터 유의한 억제 효과를 나타냈으며(P<0.05), 농도가 증가함에 따라 억제 효과도 증가하였다. 100 μg/mL 농도에서 JB는 대조군 대비 69.3±2.3%의 melanin 생성량을 보여 가장 강력한 억제 효과를 나타냈다(P<0.01). JE와 JW도 melanin 생성을 억제하는 경향을 보였으나, 그 효과는 JB에 비해 약했다. JE는 100 μg/mL 농도에서 77.3±1.0%의 melanin 생성량을 나타냈다(P<0.01). JW의 경우 10 μg/mL부터 약한 억제 효과를 보이기 시작했으며(P<0.05), 100 μg/mL에서 78.5±3.6%의 melanin 생성량을 나타냈다(P<0.01). 이러한 결과는 앞서 관찰된 tyrosinase 저해 활성 결과와 상당한 연관성을 보인다. Tyrosinase 저해 활성 실험에서 가장 높은 활성을 보인 JB가 세포 내 melanin 생성 억제에서도 가장 강력한 효과를 나타냈다. 이는 JB에 포함된 활성 물질들이 세포 내로 효과적으로 침투하여 tyrosinase 활성을 저해하고, 결과적으로 melanin 생성을 억제했을 가능성을 말한다(Zolghadri 등, 2019). JE와 JW의 경우, tyrosinase 저해 활성 실험에서는 상대적으로 낮은 활성을 보였지만, 세포 내 melanin 생성 억제 실험에서는 어느 정도의 효과를 나타냈다. 이는 이들 추출물이 tyrosinase 이외의 다른 melanogenesis 관련 인자들에 영향을 미쳤을 가능성을 제시한다. 예를 들어, microphthalmia-associated transcription factor나 tyrosinase-related protein-1(TRP-1), TRP-2와 같은 인자들의 발현이나 활성에 영향을 미쳤을 수 있다(D’Mello 등, 2016). 특히 주목할 만한 점은 JB가 낮은 농도(10 μg/mL)에서부터 통계적으로 유의미한 melanin 생성 억제 효과를 보인 반면, tyrosinase 저해 활성에서는 더 높은 농도(10 mg/mL)에서 유의한 효과를 나타냈다는 것이다. 이는 세포 내에서 JB의 활성 물질들이 농축되거나, 또는 세포 내 환경에서 더욱 효과적으로 작용할 수 있는 형태로 변환되었을 가능성을 제시한다(Qian 등, 2020).

Fig 4. Effects of Zizyphus jujuba extracts on (A) melanin content and (B) tyrosinase activity in B16F10 melanoma cells. Cells were treated with various concentrations of butylene glycol extract (JB), ethanol extract (JE), and water extract (JW) of Z. jujuba for 48 h. Melanin content and tyrosinase activity was measured and expressed as a percentage relative to the untreated control. Data are presented as mean±SD (n=3). Statistical significance compared to the untreated control: ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 (one-way ANOVA followed by Dunnett’s test).

그러나 100 μg/mL 농도에서의 melanin 생성 억제 효과(JB: 69.3%, JE: 77.3%, JW: 78.5%)는 tyrosinase 저해 활성 실험에서의 100 mg/mL 농도에서의 효과(JB: 36.86%, JE: 10.02%, JW: 12.58%)보다 상대적으로 약한 것으로 나타났다. 이는 세포 내에서 melanin 생성 과정이 tyrosinase 활성 외에도 다양한 요인들에 의해 조절되기 때문일 수 있다(Pillaiyar 등, 2017). 이러한 결과들은 대추 추출물, 특히 butylene glycol 추출물이 미백 효과를 나타낼 수 있는 잠재적 후보 물질임을 나타내고 있다.

Melanoma 세포 내 tyrosinase 저해 활성 측정

대추 추출물이 melanoma 세포 내 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 평가한 결과, 세 가지 추출물 모두 농도 의존적인 저해 효과를 나타냈다(Fig. 4B). 이러한 결과는 이전의 in vitro tyrosinase 저해 활성 및 melanin 함량 측정 결과와 일관성을 보이면서도 세포 내 환경에서의 특이적인 작용을 유추할 수 있다. JB는 5 μg/mL의 낮은 농도에서부터 대조군과 비교하여 현저한 저해 효과를 보였고(P<0.05), 100 μg/mL에서 대조군 대비 63.8±1.2%의 tyrosinase 활성을 나타내며 가장 강력한 억제 효과를 보였다(P<0.001). JE와 JW도 유사한 경향을 보였으나, 그 효과는 JB에 비해 약간 낮았다. JE는 100 μg/mL에서 61.1±2.6%(P<0.01), JW는 72.1±0.3%(P<0.01)의 tyrosinase 활성을 나타냈다. 이러한 세포 내 tyrosinase 활성 저해 효과는 in vitro tyrosinase 저해 실험 결과와 비교할 때 훨씬 낮은 농도에서 관찰되었다. 이는 세포 내 환경에서 활성 물질들의 작용이 증폭되거나 세포막 투과 과정에서 선택적 농축이 일어났을 가능성을 제시한다(Qian 등, 2020). 또한, 세포 내에서 추출물의 성분들이 대사 과정을 거쳐 더 효과적인 형태로 변환되었을 수 있다(Chen과 Kubo, 2002). 세포 내 tyrosinase 활성 저해 결과는 melanin 함량 감소 결과와 높은 상관관계를 보였다. 그러나 JE와 JW의 경우, melanin 함량 감소에 비해 tyrosinase 활성 저해 효과가 더 뚜렷하게 나타났다. 이는 melanin 생성 과정이 tyrosinase 활성 외에도 다양한 요인들에 의해 조절되며, 추출물들이 이러한 다른 요인들에도 영향을 미칠 수 있음을 뜻한다(D’Mello 등, 2016). 특히 주목할 만한 점은 in vitro tyrosinase 저해 실험에서 JE와 JW가 상대적으로 낮은 활성을 보였음에도 불구하고, 세포 내 tyrosinase 활성 저해에서는 JB와 비교적 유사한 수준의 효과를 나타냈다는 것이다. 이는 세포 내에서 이들 추출물의 활성 물질이 더 효과적으로 작용하거나, 또는 tyrosinase의 발현 자체를 조절하는 상위 신호전달 경로에 영향을 미쳤을 가능성을 제시한다(Hseu 등, 2019). 이러한 결과들은 대추 추출물, 특히 JB가 복합적인 메커니즘을 통해 melanogenesis를 억제할 수 있음을 의미한다. 직접적인 tyrosinase 저해 효과뿐만 아니라, 세포 내 tyrosinase 발현 조절이나 다른 멜라닌 생성 관련 효소들(예: TRP-1, TRP-2)의 활성 조절 등 다양한 경로를 통해 작용할 가능성이 있다(Chang, 2009). 추후 melanogenesis 관련 유전자 발현 분석이나 신호전달 경로 연구를 통해 추출물의 작용 메커니즘을 더욱 명확히 규명할 필요가 있다.

Fig 5. Effect of Zizyphus jujuba extracts on interleukin (IL)-8 secretion in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated (A) Caco-2 and (B) THP-1 cells. Cells were stimulated with 100 ng/mL LPS and treated with butylene glycol extract (JB), ethanol extract (JE), or water extract (JW) at concentrations ranging from 10⁻⁷ to 10² μg/mL for 48 h. IL-8 levels are expressed as a percentage of LPS-stimulated control. Data are presented as mean±SD from two independent experiments. ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 compared to LPS- stimulated control.

IL-8 분비에 미치는 영향

본 연구에서는 대추 추출물이 염증 반응에 미치는 영향을 평가하기 위해 lipopolysaccharide(LPS)로 자극된 Caco-2 세포와 THP-1 세포에서 IL-8 분비량을 측정하였다. Caco-2 세포에서 JB는 10^-4 μg/mL부터 IL-8 분비를 유의하게 억제하기 시작하여(91.17±1.43%, P<0.05) 농도 의존적인 억제 효과를 나타냈다. 10^-3~10^-1 μg/mL 농도 범위에서 가장 강력한 억제 효과를 보였다(P<0.001). JE는 매우 낮은 농도인 10^-7 μg/mL부터 통계적으로 유의미한 IL-8 분비 억제 효과를 나타냈으며(75.66±1.60%, P<0.001), 이 효과는 10^-3 μg/mL까지 지속되었다. JW는 10^-5~10^-2 μg/mL까지 유의한 효과를 보였다(P<0.001). THP-1 세포에서 JB는 10^-3 μg/mL부터 IL-8 분비를 유의하게 억제하기 시작하여(81.13±5.29%, P<0.05) 농도가 증가함에 따라 억제 효과도 증가하였다. 10^-2~10^-1 μg/mL 농도에서 P<0.01의 유의성을 보였으며, 10~10² μg/mL 농도에서는 P<0.001의 강한 유의성을 나타냈다. JE는 10^-2 μg/mL부터 대조군과 비교하여 현저한 효과를 나타냈으며(P<0.05), 10^-1~1 μg/mL 농도에서 P<0.01, 10~10² μg/mL 농도에서 P<0.001의 유의성을 보였다. JW는 10^-1 μg/mL부터 유의한 IL-8 분비 억제 효과를 나타냈으며(P<0.05), 10~10² μg/mL 농도에서 P<0.01의 유의성을 보였다.

이러한 결과는 대추 추출물, 특히 JB와 JE가 염증 반응을 조절하는 데 효과적일 수 있음을 뜻한다. IL-8은 주요 염증성 케모카인으로, 호중구의 화학주성과 활성화를 유도하여 염증 반응을 촉진한다(Hoffmann 등, 2002). 특히 아토피 피부염과 같은 만성 염증성 피부 질환에서 IL-8의 과발현이 보고되어 있다(Jiang 등, 2020). 따라서 대추 추출물의 IL-8 분비 억제 효과는 이러한 염증성 피부 질환의 초기 단계에서 잠재적인 치료 효과를 나타낼 수 있다. 흥미롭게도, Caco-2 세포와 THP-1 세포에서 각 추출물의 효과적인 농도 범위가 다소 차이를 보였다. 이는 각 세포 유형의 특성과 IL-8 생성 기전의 차이에서 기인할 수 있다(Berin 등, 1998). Caco-2 세포는 장 상피세포 모델로, 장 염증과 관련된 연구에 유용할 수 있으며, THP-1 세포는 사람 단핵구 모델로 전신적 염증 반응을 반영할 수 있다. 이러한 결과는 대추 추출물이 다양한 조직과 세포 유형에서 항염증 효과를 나타낼 수 있음을 뒷받침한다. 특히 JE가 Caco-2 세포에서 매우 낮은 농도부터 효과를 보인 점은 주목할 만하다. 이는 에탄올 추출물이 장 상피세포에 특히 민감하게 작용할 수 있음을 시사하며, 경구 투여 시 낮은 농도로도 효과를 볼 수 있는 가능성을 제시한다(Gao 등, 2013). 반면, THP-1 세포에서는 JB가 더 낮은 농도에서 효과를 보이기 시작했다. 이는 butylene glycol 추출물이 면역 세포에 더 효과적으로 작용할 수 있음을 보여준다.

이에 더해, 아토피 피부염의 초기 단계에서도 IL-8을 포함한 다양한 염증성 사이토카인의 과발현이 관찰된다(Leung 등, 2004). 그러므로 대추 추출물, 특히 JB와 JE의 IL-8 억제 효과는 이러한 초기 염증 반응을 조절하는 데 도움이 될 수 있다. 또한, 장 상피세포 모델인 Caco-2 세포에서의 효과는 대추 추출물이 경구 투여 시에도 항염증 효과를 나타낼 수 있음을 시사하며, 이는 아토피 피부염의 전신적 치료 접근법에 도움이 될 수 있다(Boguniewicz와 Leung, 2011). 그러나 고농도의 JB와 JE에서 IL-8 억제 효과가 더욱 강해지는 현상은 추가적인 연구가 필요한 부분이다. 이는 고농도에서 특정 활성 성분의 효과가 더욱 두드러지거나, 또는 여러 활성 성분의 시너지 효과가 나타났을 가능성을 제시한다. 향후 연구에서는 이러한 농도 의존적 효과의 메커니즘을 밝히는 것이 중요할 것이다(Masullo 등, 2019).

TNF-α 분비에 미치는 영향

대추 추출물이 면역조절 반응에 미치는 영향을 평가하기 위해 LPS로 자극된 THP-1 세포에서 TNF-α 분비량을 측정하였다(Fig. 6). JB는 TNF-α 분비에 대해 이중적인 효과를 나타냈다. 낮은 농도(10^-7~10^-3 μg/mL)에서는 통계적으로 유의미한 변화가 관찰되지 않았다. 그러나 10^-2 μg/mL부터 TNF-α 분비의 유의한 감소가 관찰되었으며(P<0.05), 농도가 증가함에 따라 그 효과가 더욱 두드러졌다(10^-1에서 10² μg/mL까지 P<0.001).

Fig 6. Effect of Zizyphus jujuba extracts on tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) secretion in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated THP-1 cells. Differentiated THP-1 cells were stimulated with 100 ng/mL LPS and treated with butylene glycol extract (JB), ethanol extract (JE), or water extract (JW) at concentrations ranging from 10⁻⁷ to 10² μg/mL for 48 h. TNF-α levels are expressed as a percentage of LPS-stimulated control. Data are presented as mean±SD from three independent experiments. Statistical significance compared to LPS control: ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001.

이는 JB가 강력한 항염증 특성을 가진 화합물을 포함하고 있음을 시사하며, 아토피 피부염과 같은 과도한 TNF-α 생성이 특징인 질환에 잠재적으로 유용할 수 있다(Brunello, 2018). JE는 모든 테스트 농도에서 TNF-α 분비에 통계적으로 유의한 영향을 미치지 않았다. 이러한 효과의 부재는 Z. jujuba의 항염증 화합물이 에탄올로 효율적으로 추출되지 않거나, 추출물에 염증 촉진 및 항염증 화합물이 균형을 이루고 있어 서로의 효과를 상쇄할 수 있음을 뜻한다(Gao 등, 2013). JW는 독특한 패턴을 보였는데, 낮은 농도(10^-7~10^-1 μg/mL)에서는 TNF-α 분비에 변화가 관찰되지 않았으나 높은 농도(1~10² μg/mL)에서는 TNF-α 분비가 유의하게 증가했다(P<0.05에서 P<0.001). 이러한 추출물들의 농도별 TNF-α 분비에 대한 서로 다른 효과는 Z. jujuba의 생리활성 화합물의 복잡한 특성을 나타낸다. JB의 강력한 항염증 효과는 Z. jujuba의 전통적인 염증 질환 치료 용도와 일치한다(Chen 등, 2017). 이 추출물은 과도한 TNF-α 생성이 피부 염증에 기여하는 아토피 피부염 관리를 위한 국소 적용에 잠재적으로 개발될 수 있다(De Vuyst 등, 2017). 또한, JW의 고농도에서 관찰된 면역 자극 효과는 주목할 만하다. 특히 1~10² μg/mL의 농도에서 TNF-α 분비가 유의하게 증가했는데, 이는 수용성 대추 추출물이 특정 농도 이상에서 대식세포의 활성화를 유도할 수 있음을 암시한다. 이러한 효과는 대추에 포함된 다당류나 플라보노이드와 같은 수용성 생리활성 물질들의 작용일 수 있다(Yin 등, 2019). 특히, 식물성 다당류는 대식세포의 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor)를 자극하여 TNF-α를 포함한 전염증성 사이토카인의 생산을 유도할 수 있다(Chen과 Oppenheim, 2011). 이러한 메커니즘은 선천 면역 시스템을 활성화해 초기 감염에 대한 방어력을 높일 수 있다. 이에 더해, TNF-α의 적절한 증가는 후천 면역 반응의 개시와 조절에도 중요한 역할을 한다(Sedger와 McDermott, 2014). 또 하나 중요한 것은, 이러한 면역 자극 효과가 반드시 염증성 질환에 부정적인 영향을 미치는 것은 아니라는 것이다. 오히려 적절한 농도와 타이밍에서의 면역 자극은 면역 균형을 회복하고 과도한 염증 반응을 조절하는 데 도움이 될 수 있다. 이는 특히 만성 염증성 질환이나 면역 기능이 저하된 상태에서 중요할 수 있다(Schett 등, 2013). 따라서 JW의 이러한 특성은 면역조절제로서의 잠재적 활용 가능성을 제시한다. 예를 들어, 백신 보조제나 면역 요법의 보조제로 사용될 수 있으며, 이를 통해 면역 반응의 효율성을 높일 수 있다. 또한, 아토피 피부염과 같은 만성 염증성 질환에서도 면역 균형을 회복하는 데 도움이 될 수 있다(Palomares 등, 2014). 반면, JE가 대조군과 비교했을 때 통계적으로 유의미한 효과를 보이지 않는 것은 에탄올이 Z. jujuba에서 항염증 화합물을 추출하는 최적의 용매가 아닐 수 있음을 뒷받침한다. 이는 천연물 연구에서 용매 선택의 중요성을 나타내며(Sasidharan 등, 2011), Z. jujuba가 TNF-α 생성에 미치는 영향에 대한 더 깊은 이해를 제공한다. 정리하면, butylene glycol 추출물은 아토피 피부염과 같은 염증성 질환에 대한 항염증 적용에 유망하지만, 물 추출물의 고농도에서의 면역 자극 효과는 면역 증강 적용의 가능성을 열어준다. 이러한 효과를 나타내는 특정 화합물을 식별하고 그 작용 기전을 규명하기 위한 추가 연구가 필요하다.

IL-2 분비에 미치는 영향

대추 추출물이 면역 반응에 미치는 영향을 평가하기 위해 10 pg/mL LPS, 5 μg/mL phytohemagglutinin, 그리고 10 ng/mL phorbol myristate acetate로 자극된 Jurkat 세포에서 IL-2 분비량을 측정하였다(Fig. 7). JB는 복잡한 농도 의존적 패턴을 보였다. 낮은 농도(10^-7~10^-6 μg/mL)에서는 유의한 변화가 없었으나, 10^-5 μg/mL부터 IL-2 분비가 유의하게 증가하기 시작했다(P<0.05). 특히 10^-4~10^-1 μg/mL 농도 범위에서 가장 강력한 IL-2 분비 증가 효과를 보였다(P<0.001). 그러나 1 μg/mL 이상의 농도에서는 효과가 감소하여 10 μg/mL 이상에서는 대조군과 유의미한 차이를 보이지 않았다. JE는 10^-4 μg/mL부터 IL-2 분비를 유의하게 증가시켰으며(P<0.01), 농도가 증가함에 따라 그 효과도 증가하였다. 특히 1 μg/mL 이상의 농도에서 매우 강력한 IL-2 분비 증가 효과를 나타냈다(P<0.001). JW는 상대적으로 약한 효과를 보였다. 10^-2 μg/mL에서 처음으로 현저한 IL-2 분비 증가가 관찰되었으며(P<0.05), 10^-1 μg/mL 이상의 농도에서 더 뚜렷한 효과를 나타냈다(P<0.01). 이러한 결과는 앞서 관찰된 TNF-α 분비 패턴과 대조를 이룬다. JB의 경우 TNF-α 분비를 억제했던 농도 범위(10^-2 μg/mL 이상)에서 IL-2 분비는 오히려 증가하는 경향을 보였다. 이는 JB가 염증성 사이토카인과 면역조절성 사이토카인 사이의 균형을 조절할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주고 있다(Hsu 등, 2014). JE의 경우 TNF-α에 대해서는 유의한 효과를 보이지 않았지만, IL-2 분비를 강력하게 증가시켰다. 이는 JE가 특히 T 세포 활성화에 선택적인 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다(Yu 등, 2016). JW는 고농도에서 TNF-α와 IL-2 모두를 증가시켰는데, 이는 전반적인 면역 활성화 효과를 암시한다(Gao 등, 2013). 이러한 복합적인 효과는 대추 추출물이 면역조절제로서 큰 잠재력을 가지고 있음을 보여준다. 특히 JB와 JE는 염증성 반응을 억제하면서도 T 세포 매개 면역을 활성화할 수 있는 가능성을 제시한다. 이는 면역 불균형 상태의 치료에 유용할 수 있다(Seo 등, 2013). 또한, 이러한 결과는 대추 추출물이 농도에 따라 다양한 면역조절 효과를 나타낼 수 있음을 보여준다. 낮은 농도에서는 주로 IL-2 분비를 증가시켜 면역 활성화를 유도하고, 높은 농도에서는 TNF-α와 IL-2의 균형을 조절하여 전반적인 면역 항상성 유지에 기여할 수 있다. 향후 연구에서는 이러한 면역조절 효과의 분자적 메커니즘을 규명할 필요가 있으며, 다양한 면역 세포 유형에 대한 영향을 종합적으로 평가하여 대추 추출물의 전체적인 면역조절 프로파일을 확립하는 것이 중요할 것이다.

Fig 7. Effect of Zizyphus jujuba extracts on interleukin (IL)-2 secretion in LPS/PHA/PMA-stimulated Jurkat cells. Jurkat cells were stimulated with 10 pg/mL LPS, 5 μg/mL PHA, and 10 ng/mL PMA, then treated with butylene glycol extract (JB), ethanol extract (JE), or water extract (JW) at concentrations ranging from 10⁻⁷ to 10² μg/mL for 48 h. IL-2 levels are expressed as a percentage of LPS/PHA/PMA-stimulated control. Data are presented as mean±SD from two independent experiments. Statistical significance compared to stimulated control: ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001. LPS, lipopolysaccharide; PHA, phytohemagglutinin; PMA, phorbol myristate acetate.

IgE 분비에 미치는 영향

본 연구에서는 대추 추출물이 IgE 생성에 미치는 영향을 평가하기 위해 사람 B 세포주인 U266B1 세포를 이용하여 두 가지 조건에서 실험을 수행하였다. LPS와 IL-4로 자극한 조건(Fig. 8A)에서 JB는 5×10³ μg/mL부터 유의한 IgE 분비 억제 효과를 나타냈으며(P<0.01), 고농도에서 더 강한 억제 효과를 보였다(P<0.001). JE와 JW도 유사한 경향을 보였으나, JB보다는 약한 효과를 나타냈다. JE는 10⁴ μg/mL부터 대조군과 비교하여 현저한 억제 효과를 보였고(P<0.05), JW는 5×10³ μg/mL부터 통계적으로 유의미한 효과를 나타냈다(P<0.05). LPS만으로 자극한 조건(Fig. 8B)에서는 전반적으로 억제 효과가 약화하였다. JB는 10⁴ μg/mL부터 억제 효과를 보였으며(P<0.05), JE와 JW도 유사한 농도에서 효과를 나타냈다. 이는 IL-4가 IgE 생성을 더욱 촉진하며, 대추 추출물의 억제 효과가 IL-4 매개 경로와 관련이 있을 가능성을 시사한다.

Fig 8. Effect of Zizyphus jujuba extracts on immunoglobulin (Ig) E production in U266B1 cells. (A) Cells were stimulated with 4 μg/mL lipopolysaccharide (LPS) and 100 U/mL IL-4, then treated with butylene glycol extract (JB), ethanol extract (JE), or water extract (JW) at concentrations ranging from 10² to 10⁵ μg/mL for 6 days. (B) Cells were stimulated with 4 μg/mL LPS only, then treated with JB, JE, or JW at the same concentration range. IgE levels are expressed as a percentage of stimulated control. Data are presented as mean±SD from two independent experiments. Statistical significance compared to stimulated control: ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001.

상기한 사이토카인 분비 실험과 IgE 생성 실험에서 사용된 농도 범위의 차이는 세포 유형과 측정 대상에 따른 최적 조건 조정의 결과이다. B 세포주인 U266B1은 T 세포나 단핵구에 비해 더 높은 농도의 자극이 필요했으며, IgE 생성을 위해 사이토카인 분비보다 더 긴 시간이 필요했고, 더 높은 농도의 시료 처리가 요구되었다. 그래서 IgE 생성에 대한 억제 효과를 명확히 관찰하기 위해 JB, JE, JW를 처리할 때 더 높고 넓은 농도 범위를 설정하였다.

이러한 결과는 대추 추출물, 특히 JB가 IgE 생성을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타낸다. IgE는 알레르기 반응의 주요 매개체로, 그 생성 억제는 아토피 피부염과 같은 알레르기 질환의 치료에 잠재적으로 유용할 수 있다(Leung 등, 2004). JB의 IgE 생성 억제 효과는 B 세포의 class switch recombination 과정에 영향을 미칠 가능성이 있다(Seo 등, 2013). 특히, IL-4 존재 하에서 더 강한 억제 효과를 보인 점은 JB가 IL-4 매개 신호전달 경로를 조절할 수 있음을 보여준다. JE와 JW도 농도 의존적인 IgE 억제 효과를 보였으나, JB에 비해 그 효과가 약했다. 이는 추출 용매에 따라 대추의 생리활성 물질이 다르게 추출되었을 가능성을 제시한다. 이러한 복합적인 면역조절 효과는 대추 추출물이 아토피 피부염과 같은 알레르기 질환이나 자가면역 질환의 치료에 잠재적으로 유용할 수 있음을 시사한다(Leung 등, 2004; Seo 등, 2013). 특히, IgE 생성 억제와 IL-8 분비 감소 효과는 알레르기 반응과 염증 조절에 도움이 될 수 있으며, IL-2 분비 증가는 면역 균형 유지에 기여할 수 있다(Hsu 등, 2014). 그러나 이러한 효과들이 농도에 따라 다르게 나타나는 점을 주의해야 한다. 대추 추출물은 낮은 농도에서 주로 항염증 효과가 나타나고 높은 농도에서는 면역 활성화 효과가 나타나는 경향을 보였다. 이는 대추 추출물의 면역조절 효과가 농도 의존적이며, 사용 목적에 따라 적절한 농도 선택이 중요하다는 것을 나타낸다.

대추의 butylene glycol, 에탄올, 물 추출물의 항산화, 미백, 면역조절 활성을 평가하였다. JB가 가장 높은 SOD 유사 활성과 tyrosinase 저해 효과를 나타냈으며, melanin 생성 억제에도 가장 효과적이었다. 면역조절 활성에서도 JB가 IL-8, TNF-α, IgE 분비를 억제하고 IL-2 분비를 증가시키는 등 추출물 중 가장 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 대추 추출물, 특히 JB가 기능성 식품, 화장품, 면역조절제 등으로 활용될 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여준다.

이 논문은 2024년 국립순천대학교 학술연구비(과제번호: 2024-0345) 공모과제로 연구되었음