현대 사회에서는 인간의 평균 수명 증가와 경제적 생활 수준이 향상됨에 따라 현대인들의 외적인 미에 관한 관심이 높아지고 있다. 이는 노화 억제, 미백 개선과 같은 기능성 화장품 시장의 성장으로 이어지고 있다. 또한 건강과 웰빙에 관한 관심 증가로 화장품 원료의 안전성에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 현대 산업에 사용되고 있던 유기 합성 성분의 화장품이 알러지와 같은 부작용으로 소비자의 불만을 야기하자 천연 물질 화장품의 개발이 증가하는 추세이다(Park과 Ryu, 2022). 화장품의 인공 합성 물질은 알레르기, 아토피 등의 피부 질환을 유발하는 등 인공 합성 물질의 위험성이 확산함에 따라 화장품 원료 안전에 대한 인식 증가와 함께 천연화장품의 수요가 증가하는 추세를 보인다(Park과 Kim, 2020).

로즈마리(Rosmarinus officinalis L.)는 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 상록성 다년초이며, 지중해에서 유래한 장미과에 속하는 허브로, 바다의 이슬을 뜻하는 라틴어 로스(dew)와 마리너스(sea)에서 유래되었다. 로즈마리는 과거부터 다양한 용도로 사용됐으며, 특히 고대 유럽에서는 주로 약용으로서의 사용이 보고되었다. 현대에는 경제성과 활용성, 그리고 무독성의 이점을 가져 식품 산업뿐만 아니라 의약품, 천연물, 식품 보존을 위해서도 사용되며, 항산화, 항종양, 항균, 항염증, 항우울제와 같은 생리활성이 보고되었다(Aziz 등, 2022). 로즈마리는 20가지 이상의 품종이 있으며, 그중 크리핑 로즈마리(creeping rosemary)는 로즈마리 중 Rosmarinus officinalis Prostratus group에 해당한다. 직경은 8피트 또는 10피트에 달하고 매우 짧은 시간 안에 자라며, 잎이 자라면서 땅에 떨어지는 형상을 띄고 연한 푸른색 꽃이 피는 상록수 다년생 식물이다(Coker, 2014). 크리핑 로즈마리는 잎과 꽃, 줄기, 열매, 부리에서 독특한 향과 맛이 있어 향신료로 많이 사용되며, 최근에는 항산화 활성이 보고됨에 따라 화장품과 건강 보조제의 원료로 사용된다. 로즈마리의 보고된 효능에 비해 크리핑 로즈마리는 장식용 및 요리용으로만 활용되고 있으며, 그 효능에 관한 연구는 진행되어 있지 않다(Begum 등, 2013).

통계 기법에서 기계학습(machine learning) 알고리즘을 이용한 machine 기반의 회귀분석 기법을 이용하여 다양한 효능을 검정 예측 수행하고 있다(Drucker 등, 1996). 이들 중 support vector machine(SVM)은 통계학적으로 많이 활용되고 있는 기계학습 기법 중 하나로 데이터 분류, 패턴 인식 및 각종 데이터의 회귀분석에 특화된 트레이닝 알고리즘이다. 해당 알고리즘은 주어진 데이터 집합을 바탕으로 새로운 데이터가 어떠한 목록에 포함될지 판단하는 선형모델을 만들고, 이를 기준으로 여유 간격(margin)을 설정하여 두 범주를 분류하는 최적의 초평면(hyper-plane)을 구한다는 원리를 기본으로 한다(Hearst, 1998). 다양한 분야에 활발하게 응용되고 있는 SVM 등의 기계학습, 딥러닝 방식들이 각종 질병에 대한 사망률 및 완치율 예측, 코로나 팬데믹 상황에서 질병의 확산율 예측 등 바이오 통계 분야에서도 이미 적용되어 통계 처리에 활용되고 있으며, 예측모델 구축에도 활용되고 있다. 이러한 SVM 통계 기법은 각종 천연 기능성 물질들이 나타내는 생리활성 효능의 예측에도 적용이 가능할 것이며, SVM 통계 기법 중 support vector regression(SVR) 기법을 활용하여 최적 효능 발현 조건을 예측할 수 있을 것으로 판단된다.

본 연구에서는 크리핑 로즈마리 추출물을 이용하여 기능성 화장품 소재로의 적합성을 평가하기 위해 tyrosinase, elastase, collagenase 및 hyaluronidase 등의 다양한 피부미용 관련 효소의 억제 활성과 astringent 효과 등을 측정하였다. 기능성 식품분야에도 SVM 통계 기법으로 SVR을 활용한 다양한 접근법을 제시할 수 있기에 본 연구에 기계학습 방식의 바이오 통계 방식을 적용하여 예측모델 구축을 시도하여, 이를 통해 크리핑 로즈마리의 미용 식품 소재 및 기능성 화장품으로의 활용 가능성을 확인하고자 하였다.

실험 재료

본 연구에서 사용된 크리핑 로즈마리는 경기도 시흥시에 소재한 도희씨네 정원에서 2023년 10월에 구매하여 줄기, 잎, 순 부분을 수확하여 45°C dry oven(FO600M, Jeiotech)에서 건조한 후 40 mesh로 분쇄하여 분말로 제조한 후 4°C에 보관하면서 시료로 사용하였다.

크리핑 로즈마리 추출물 제조

시료의 최적 추출 조건을 설정하기 위해 추출용매로 distilled water(DW)와 에탄올 등, 두 개의 용매를 사용해 추출을 진행하였으며, 열수 추출의 경우 DW 200 mL와 크리핑 로즈마리 건조 분말 1 g을 넣고 가열해서 100 mL가 될 때까지 끓인 후 18시간 이상 진탕 배양기(WIS-20, Daihan Scientific)에서 200 rpm으로 교반 추출하였으며, 에탄올 추출은 에탄올 용액 10~100% 농도별로 100 mL에 크리핑 로즈마리 건조 분말 1 g을 넣고 4°C의 조건으로 18시간 이상 200 rpm으로 교반 추출했다. 이후 3,243×g에서 30분간 원심분리기(FLETA 40, HANIL Science)를 이용해 원심분리한 후 Whatman No. 1 필터(Whatman Inc.)를 포함한 감압여과기(EYELA A-3S, Tokyo Rikakikai)를 이용해 여과하였다. 여과액은 감압농축기(Buchi Rotavapor R-200, Buchi Labotechnik AG)로 농축하여 25~400 µg/mL의 phenolic 농도로 제조하여 시료로 사용하였다.

Total phenolic compounds(TPC) 측정

크리핑 로즈마리의 TPC는 Folin과 Denis(1912)의 방법에 따라 측정하였다. 시료 1 mL에 100% 에탄올 1 mL와 DW 5 mL를 첨가하고, 1 N Folin reagent 0.5 mL를 넣어 vortex mixer(VM-10, Daihan Scientific)로 vortexing하여 5분 동안 방치한 후 종료 시약인 5% Na₂CO₃ 1 mL를 첨가하였다. 이를 vortexing 후 1시간 동안 암실에 방치하고 spectrophotometer(Optizen 3220UV, Mecasys)를 이용해 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. TPC 함량은 표준물질인 gallic acid를 이용한 표준곡선(y=0.008x-0.0413, R²=0.9917)을 통해 양을 산출하였다.

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성 측정

DPPH 라디칼 소거 활성은 Blois(1958)의 방법에 따라 측정하였다. 시료 추출액 1 mL에 60 µg/mL DPPH 용액 3 mL를 첨가하여 vortexing 한 후에 15분간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 positive control로 butylated hydroxytoluen(BHT)을 사용하였으며, DPPH 라디칼 소거 효과는 (대조구의 흡광도-반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 값을 산출하였다.

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 라디칼 소거 효과 측정

ABTS 라디칼 소거 효과는 Fellegrini 등(1999)의 방법에 따라 측정하였다. ABTS solution을 7 mM ABTS와 140 mM K₂S₂O₈를 일정 비율로 혼합해 라디칼을 생성한 후, 734 nm의 흡광도에서 0.68~0.72가 되도록 조정하였다. ABTS solution 4 mL와 시료 추출액 200 μL를 흔들어 섞어 1분 30초 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 BHT를 사용하였으며, ABTS 라디칼 소거 효과는 (1-반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 값을 산출하였다.

Antioxidant protection factor(PF) 효과 측정

PF 효과는 Andarwulan과 Shetty(1999)의 방법에 따라 측정하였다. β-carotene 50 mg과 chloroform 50 mL의 혼합액을 농축한 후 linoleic acid 100 μL, Tween 40 920 μL, H₂O₂ 880 μL와 DW 250 mL를 첨가하고 균질화하여 emulsion을 제조하였다. 시료 추출액 100 μL와 emulsion 5 mL를 혼합하여 30분간 50°C에서 반응시킨 후 냉각한 다음 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 BHT를 사용하였으며, PF값은 반응구의 흡광도/대조구의 흡광도를 사용하여 값을 산출하였다.

Thiobarbituric acid reactive substance(TBARs) 저해 효과 측정

TBARs 저해 효과는 Buege와 Aust(1978)의 방법에 따라 측정하였다. 5% linolic acid를 1% Tween 40에 혼합하여 hand mixer로 섞은 emulsion 용액을 50°C water bath에서 12시간 이상 반응시켰다. 100 mL stock solution에 TBA reagent 4 mL를 첨가해 끓는 물에서 15분간 중탕한 뒤 10분 동안 냉각하였다. 냉각 후 20분간 원심분리하고 10분간 상온에서 방치한 후 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 positive control로 BHT를 사용하였으며, TBARs 저해 효과는 (1-반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100을 사용하여 값을 산출하였다.

Tyrosinase 저해 효과 측정

Tyrosinase 저해 효과는 Hearing과 Jiménez(1987)의 방법에 준하여 측정하였다. 농도별 시료 추출액 100 μL에 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 2.3 mL와 substrate인 1.5 mM L-tyrosine 용액 400 μL를 넣고, 250 U/mL mushroom tyrosinase(Sigma-Aldrich Co.) 100 μL를 첨가한 혼합액을 37°C에서 20분간 반응시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 kojic acid를 사용하였다. Tyrosinase 저해율(%)은 (1-반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 값을 산출하였다.

Elastase 저해 효과 측정

Elastase 저해 효과는 Kraunsoe 등(1996)의 방법에 준하여 측정하였다. 농도별 시료 추출액 100 μL에 0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 1 mL와 0.8 mM N-suc-(Ala)₃-p-nitroanilide인 substrate 100 μL를 첨가한 혼합액에 porcine pancreatic elastase 100 μL를 넣고 섞어 20분간 37°C에서 반응시킨 후 5분간 냉각하여 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 (-)epigallocatechin-3-gallate(EGCG)를 사용하였으며, elastase 저해 효과는 (1-반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100을 사용하여 값을 산출하였다.

Collagenase 저해 효과 측정

Collagenase 저해 효과는 Wunsch와 Heindrich(1963)의 방법에 준하여 측정하였다. 농도별 시료액 100 μL와 4 mM CaCl₂/0.1 M Tris-HCl buffer(pH 7.5) 0.15 mL를 첨가한 용액에 0.4 mM 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg 0.25 mL를 첨가하고 collagenase 0.15 mL를 넣어 혼합한 후 25°C에서 20분간 반응시켰다. 이 혼합액에 6% citric acid 500 μL를 첨가하여 반응을 정지시키고 ethyl acetate 1.5 mL를 첨가하여 1분간 vortexing 한 후 농도별 용액의 상등액만을 취해 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 EGCG를 사용하였고, collagenase 저해 효과는 (대조구의 흡광도-반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100을 사용하여 값을 산출하였다.

Hyaluronidase 저해 효과 측정

Hyaluronidase 저해 효과는 Dorfman과 Ott(1948)의 방법에 준하여 측정하였다. 시료액 500 μL에 enzyme buffer(pH 6.9) 5 mL로 녹인 enzyme(hyaluronidase from Ovine tests 1,000 U) 0.5 mL와 0.3 M sodium phosphate buffer(pH 5.3) 0.5 mL를 혼합하고 38°C water bath에 5분 방치한 후 0.3 M sodium phosphate buffer로 녹인 substrate(0.4% hyaluronic acid)를 첨가하여 38°C water bath에 45분 반응시키고 종료 시약인 albumin 용액 5 mL를 넣어 5분 반응시킨 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 tannic acid를 사용하였고, hyaluronidase 저해 효과는 (1-반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100을 사용하여 값을 산출하였다.

Astringent 효과 측정

Astringent 효과는 Lee 등(2002)의 방법에 준하여 측정하였다. 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질 hemoglobin을 사용하여 원심분리 용기에 시료와 hemoglobin 용액을 2:1의 비율로 넣어서 혼합한 후 35,000×g에서 원심분리기(FO600M, Jeiotech)로 분리하여 혈액 단백질을 가라앉히고, 576 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 tannic acid를 사용하였고, astringent 효과는 (대조구의 흡광도-반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100을 사용하여 값을 산출하였다.

유의성 통계 처리

본 실험은 모두 3회 반복하여 측정하였고, 모든 실험 결과는 평균±표준편차(mean±standard deviation)로 표현하였다. 자료의 통계 처리는 SPSS 22 for Windows(Statistical Package for Social Science) 프로그램을 이용하였다. 시료 간의 유의차는 t-test를 실시하여 P<0.05 수준에서 비교 분석하였으며, 분산분석(ANOVA)과 Duncan의 다중범위검정(Duncan’s multiple range test)을 실시하여 P<0.05 수준에서 비교 분석하였다.

SVR 통계 프로그램을 이용한 생리활성 효과 예측 분석

생리활성별 저해 활성의 예측은 Harris 등의 방법(Hearst 등, 1998)에 따라 SVR을 사용하였으며, 이용된 커널은 비선형 데이터에 적합할 수 있도록 radial basis function(RBF) 기법을 이용하여 효능예측 그래프를 작성하였다. 즉, SVR에 사용된 regression type으로는 eps-regression을 사용하였으며, hyperparameter의 설정을 위해 eps-regression에서 모델이 사용할 오차 허용 범위를 결정하는 값인 epsilon 값은 0.1부터 1.0까지 0.1 단위로 탐색한 결과, 최적값이 0.1로 판정되어 0.1로 설정하였다. 커널의 폭을 결정하는 gamma 값은 SVM 함수에서 제공하는 값을 0.1부터 1.0까지 0.1 단위로 탐색한 결과, 최적값이 1.0으로 판정되어 1.0으로 설정하였으며, 오분류의 정도를 조절하는 cost 값은 0.1부터 1.0까지 0.01 단위로 탐색한 결과 최적값이 1.0으로 판정되어 1.0으로 설정하였다. Train과 test용 데이터 분할의 경우 분석용 데이터를 8:2의 비율로 나누어 5-fold cross validation(CV)을 통해 데이터를 5가지 fold로 나누어 교차 검정을 하여 모델의 일반화 성능을 높였다. 5-Fold CV를 통한 평균제곱근오차(root mean squared error) 값은 5가지 fold의 평균값을 계산하여 5.668698의 우수한 결과가 나왔다.

크리핑 로즈마리 추출물의 TPC 함량 비교

식물에 함유된 페놀성 물질은 다양한 식물종에서 발견되며, 산화 스트레스, 심혈관 질환, 당뇨병, 천식, 신경퇴행성 질환 및 노화에 대한 보호 능력 등 다양한 건강상의 이점을 가지는 것으로 밝혀졌다(Niedzwiecki 등, 2016). 본 연구에서는 크리핑 로즈마리 추출물에서 생리활성을 가지는 것으로 추측되는 TPC 함량을 정량하였다. 용매로 열수(DW)와 에탄올을 사용하여 추출한 추출물의 TPC 함량을 비교한 결과, Fig. 1과 같이 70% 에탄올 추출물에서 TPC 함량이 29.56 mg/g으로 가장 높게 나타났으며, 열수 추출물은 23.03 mg/g으로 나타났다. 이는 추출에 사용된 에탄올의 농도에 따라 용매의 다양한 polarity에 의해 추출물 내의 총 페놀성 물질의 함량이 다르게 용출되기 때문으로 판단되며, 대부분의 식물성 소재에서는 에탄올 용매를 사용할 경우 60~80% 범위에서 최대의 용출량을 나타내게 된다. 이러한 결과에 따라 높은 TPC 함량을 나타낸 70% 에탄올과 DW를 용매로 사용해 추출물을 제조하여 실험을 진행하였다.

Fig 1. Total phenolics content of creeping rosemary. Values are presented as mean±standard deviation (n=3). Means with the letters (a-f) above the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test.

크리핑 로즈마리 추출물의 항산화 효과

분자 내 형성되어있는 자유라디칼의 수소 또는 전자 공여에 의한 소거 정도는 항산화 활성의 지표가 된다. DPPH는 안정한 라디칼 상태로 존재하며, 산화 방지제의 수소 원자 전달 메커니즘을 통해 라디칼이 환원되거나 상쇄되면 보라색을 띠는 상태에서 안정적인 담황색 DPPH 분자로 색이 변화하는 원리를 이용하여 항산화 활성을 측정하는데 사용된다(Sirivibulkovit 등, 2018). DPPH 라디칼 소거 활성 측정을 통해 크리핑 로즈마리의 항산화 활성을 측정한 결과, Fig. 2A와 같이 열수 추출물 25~100 μg/mL의 농도에서 각각 82.51~83.78% 효과를 나타내었다. 동일한 농도에서 70% 에탄올 추출물은 85.75~90.13%로 측정되었으며, 이는 positive control로 사용된 BHT가 각 농도에서 36.32~72.64%의 효과를 나타낸 것에 비해 크리핑 로즈마리의 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성이 높다는 것을 확인하였다. Chae 등(2011)에 따르면 채진목 열매 추출물의 DPPH 소거능이 100 μg/mL에서 71.6%로 나타났다. 이상의 결과로 본 실험에 사용된 크리핑 로즈마리의 추출물이 DPPH 라디칼의 80% 이상의 소거 활성을 나타내어 우수한 산화 억제 효과가 있음을 확인하였다. SVR 기법의 예측모델을 활용하여 DPPH의 저해 활성 발현을 위한 최적조건을 탐색한 결과 Fig. 2B에서와 같이 크리핑 로즈마리 추출물을 저농도로 처리했을 때부터 100 μg 처리 시까지 저해 활성이 증가하다가, 그 이상의 농도에서는 오히려 저해 활성이 감소하는 것으로 예측되었다. 따라서 DPPH의 저해를 위해서 적용 농도는 100 μg까지 사용하는 것이 가장 효율적인 것으로 예측되었다.

Fig 2. Antioxidant activities of DPPH radical scavenging activity (A), ABTS radical scavenging activity (C), Antioxidant protection factor (E), and TBARs inhibition activity (G) and predicted DPPH radical scavenging activity (B), ABTS radical scavenging activity (D), antioxidant protection factor (F), and TBARs inhibition activity (H) using esp-RBF SVR program of creeping rosemary. Values are presented as mean±standard deviation (n=3). Means with the letters (a-d) (A-D) (α-δ) on the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test. The phenolic concentration was calculated by converting it to the standard material gallic acid. DW: water extract, 70%E: 70% ethanol extract. BHT: butylated hydroxytoluen.

ABTS 라디칼 소거 활성은 ABTS 자유라디칼이 항산화 활성이 있는 물질과 반응하면 양이온 라디칼이 소거되면서 청록색에서 무색으로 탈색되는 원리를 이용하여 항산화 활성을 측정하는 방법이다(Um과 Ryu, 2022). 크리핑 로즈마리 추출물의 ABTS 소거 활성은 Fig. 2C와 같이 열수 추출물 25~100 μg/mL 농도에서 42.58~99.90%의 효과를 나타내었고, 70% 에탄올 추출물은 동일 농도에서 43.39~100.50%의 효과를 나타내었다. Positive control로 사용된 BHT가 각각 22.10~68.55%의 효과를 나타낸 것에 비해 크리핑 로즈마리의 활성이 뛰어남을 확인하였다. Lee와 Kim(2021)의 연구에 따르면, 생강잎, 줄기, 뿌리의 ABTS 라디칼 저해능은 100 μg/mL에서 약 30~50%가량의 효과를 나타내었다. 이와 비교하여 크리핑 로즈마리의 추출물의 ABTS 소거능이 우수함을 확인하였으며, SVR 기법의 예측모델을 활용하여 ABTS의 저해 활성 발현을 위한 최적조건을 탐색한 결과, Fig. 2D와 같이 크리핑 로즈마리의 물과 에탄올 추출물은 50~100 μg의 농도에서 거의 유사한 활성을 나타내다가 100 μg에서 최적의 생리활성을 나타내었으며, 더 높은 농도에서는 오히려 활성이 감소하는 것으로 예측되었다. Positive control로 사용한 BHT의 경우 100 μg의 농도에 확연하게 높은 활성을 나타내다가 더 높은 첨가 농도에서는 활성이 떨어지는 것으로 예측되었다. 따라서 ABTS의 저해를 위해서 크리핑 로즈마리 추출물의 적용 농도는 100 μg까지 사용하는 것이 가장 효율적인 것으로 예측되었다. 추출물의 DPPH와 ABTS 라디칼의 저해 활성이 다르게 나타나는데, 이는 페놀성 물질이 각 라디칼의 기질에 선택적으로 반응하며, 이로 인해 자유 라디칼의 수소 또는 전자 공여에 의한 소거 기능과 양이온 라디칼의 소거 기능이 차이 나는 것으로 판단하였다.

지용성 물질의 항산화력을 측정하기 위해 PF를 측정한 결과, Fig. 2E와 같이 열수 추출물은 25~100 μg/mL의 농도에서 1.30~1.83 PF 효과를 나타냈으며, 70% 에탄올 추출물은 각각의 농도에서 1.60~1.84의 PF 효과를 나타냈다. 이때 positive control로 사용된 BHT는 1.76~1.96의 PF값을 나타내었다. 이는 농도 의존적으로 시료 추출물의 PF값이 유의하게 증가했음을 나타내었다. Lim 등(2018)에 의하면 야생 곰취잎의 PF는 200 μg/mL에서 열수 추출물은 1.02 PF, 에탄올 추출물은 0.74 PF를 나타내었다. 이를 통해 저농도에서도 크리핑 로즈마리의 지용성 물질의 항산화 효과가 우수한 것으로 확인하였으며, SVR 기법의 예측모델을 활용하여 PF 활성 발현을 위한 최적조건을 탐색한 결과, Fig. 2F와 같이 크리핑 로즈마리 추출물을 100 μg 처리 시 최대의 효과를 나타내며, 100 μg 이상의 농도에서는 오히려 활성이 감소하는 것으로 예측되었다. 따라서 PF를 위한 크리핑 로즈마리 추출물의 적용 농도는 100 μg까지 사용하는 것이 가장 효율적인 것으로 예측되었다.

TBARs는 자유라디칼 생성과 함께 발생하는 지질의 과산화적 손상을 측정하여 산화 스트레스를 정량화하는 방법이다. 지질에 대한 자유라디칼 손상은 malondialdehyde(MDA)의 생성을 초래하고 고온 및 산도의 조건에서 MDA는 TBA와 반응하여 짙은 색을 띠는 발색반응을 하며, 이러한 원리로 시료에 대한 지질 과산화 손상 억제 정도를 정량화하여 항산화 활성을 측정할 수 있다. 측정 결과, Fig. 2G와 같이 열수 추출물은 25~100 μg/mL의 농도에서 24.10~90.15% 효과를 나타내었으며, 70% 에탄올 추출물은 67.66~87.72%의 효과를 나타내었다. Positive control로는 BHT를 사용하였으며 95.24~96.98% 효과를 나타내었다. 이때 positive control보다는 낮지만 열수 추출물과 에탄올 추출물 모두 농도 의존적으로 유의하게 증가했음을 나타내었다. 특히 고농도에서 열수 추출물은 70% 에탄올 추출물보다 활성이 뛰어남을 확인하였다. SVR 기법의 예측모델을 활용하여 TBARs의 저해 활성 발현을 위한 최적조건을 탐색한 결과, Fig. 2H와 같이 크리핑 로즈마리 추출물의 경우 70~100 μg 처리하였을 때 TBARs에 대한 최적의 효과를 나타내는 것으로 예측되었으며, 더 높은 농도에서는 오히려 저해 활성이 감소하는 것으로 예측되었다. 따라서 TBARs의 저해를 위해서 적용 농도는 70 μg 정도 사용하는 것이 효율적인 방안이라고 판단되었다.

크리핑 로즈마리 추출물의 tyrosinase 저해 효과 비교

사람의 피부색과 머리카락의 색이 결정되는 많은 요인이 있지만, 그중 멜라닌 색소 침착이 가장 중요한 요인으로 밝혀졌다. 형성된 멜라닌은 각질세포로 이동하여 피부색을 나타내며 자외선과 같은 자극으로부터 피부를 보호하지만, 과도하게 생성될 경우 피부노화 증상을 야기한다. 멜라닌 합성은 tyrosine을 DOPA로 전환하고, 이를 DOPA quinone으로 산화시키는 과정에 관여하는 tyrosinase에 의해 생합성된다(Chang, 2009). 따라서 멜라닌 합성에 관여하는 주요 효소인 tyrosinase에 대한 저해 활성을 통해 미백 활성을 확인할 수 있다. 크리핑 로즈마리 추출물의 tyrosinase 저해 효과는 Fig. 3A와 같이 열수 추출물 저농도에서는 효과를 보이지 않지만, 100~400 μg/mL의 농도에서 0.29~15.35%의 효과를 보였다. 같은 농도의 에탄올 추출물에서는 8.21~38.86%의 효과를 나타내었다. 이는 positive control인 kojic acid에 비해 효과가 다소 낮으나 열수 추출물, 에탄올 추출물 모두 농도가 증가할수록 미백 효과를 보이고 있음을 확인할 수 있다. Kim 등(2019)의 연구에 의하면 노루궁뎅이버섯 에탄올 추출물이 phenolic 200 μg/mL의 농도에서 16.8%의 저해 활성을 나타내었고, 이상의 결과와 비교하였을 때 크리핑 로즈마리가 약 1.2배의 뛰어난 미백 기능성을 가졌다고 판단되었다. 또한 SVR 기법의 예측모델을 활용하여 tyrosinase의 저해 활성 발현을 위한 최적 조건을 탐색한 결과, Fig. 3B에서 제시한 바와 같이 에탄올 추출물 100 μg 처리를 시작으로 저해 활성이 증가하기 시작하여 400 μg까지 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 그 이상의 농도에서는 저해 활성이 감소하는 것으로 예측되었다. 즉, tyrosinase 저해능을 위한 70% 에탄올 추출물의 최적 농도는 400 μg인 것으로 예측된다.

Fig 3. Tyrosinase inhibition rate (A) and predicted tyrosinase inhibition using esp-RBF SVR program (B) of creeping rosemary. Values are presented as mean±standard deviation (n=3). Means with the letters (a-c) (A-C) (α-δ) on the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test. The phenolic concentration was calculated by converting it to the standard material gallic acid. DW: water extract, 70%E: 70% ethanol extract.

크리핑 로즈마리 추출물의 elastase 저해 효과 비교

Elastin은 피부의 주요 하중을 지지하는 구성요소인 콜라겐 섬유 사이에 흩어져 있다. 이는 조직 간의 네트워크를 형성하며 피부의 기계적 활동에 관여하는 역할을 한다. Elastase는 elastin과 같은 피부의 탄력 섬유를 분해하는 역할을 하며, 피부 탄력 감소를 유발하여 주름 형성의 원인이 된다(Tsuji 등, 2001). 이러한 메커니즘을 억제하기 위해 크리핑 로즈마리 추출물의 elastase 저해 효과를 알아본 결과, Fig. 4A와 같이 열수 추출물 50~400 μg/mL의 농도에서 13.45~22.59%의 효과를 나타내었다. 동일 농도에서 에탄올 추출물은 9.64~38.87%의 효과를 나타내었다. 이는 positive control인 EGCG가 34.51~69.94% 저해 효과를 나타내는 것에 비해 낮지만, 농도 의존적으로 열수와 에탄올 추출물의 저해 효과가 나타났음을 알 수 있었다. Um과 Ryu (2022)에 따르면 허브의 일종인 chocomint 추출물의 elastase 저해 활성이 73.23%로 보고되었으며, 이와 비교하여 다소 활성이 약하지만 크리핑 로즈마리 추출물에서도 elastase 저해 효능을 확인할 수 있었다. SVR 기법의 예측모델을 활용하여 elastase의 저해 활성을 위한 최적 조건을 탐색한 결과, Fig. 4B와 같이 크리핑 로즈마리 물 추출물의 경우 150~420 μg의 농도구간에서 저해 활성의 차이는 크게 나타나지 않은 것으로 예측되었고, 에탄올 추출물의 경우 저농도 구간에서부터 저해 활성이 증가하기 시작하여 400 μg 처리 시 최적의 저해 활성을 나타내며, 더 높은 농도에서는 오히려 저해 활성이 감소하는 것으로 예측되었다. 따라서 elastase의 저해를 위해서 적용 농도는 400 μg까지 사용하는 것이 가장 효율적인 것으로 예측되었다.

Fig 4. Elastase inhibition rate (A) and predicted elastase inhibition using esp-RBF SVR program (B) of creeping rosemary. Values are presented as mean±standard deviation (n=3). Means with the letters (a,b) (A-C) (α-δ) on the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test. The phenolic concentration was calculated by converting it to the standard material gallic acid. DW: water extract, 70%E: 70% ethanol extract. EGCG: (-)epigallocatechin-3-gallate.

크리핑 로즈마리 추출물의 collagenase 저해 효과 비교

피부의 섬유아세포에서 생성되는 세포외 기질의 중요한 구성성분의 단백질인 collagen은 피부, 치아, 뼈 대부분의 유기물질을 형성한다. 세포 사멸과 같은 내적요인, 유해환경 등의 외적의 요인들로 인해 collagenase의 활성이 증가하면 collagen이 분해되어 피부 주름을 생성할 수 있다(Perlish 등, 1988). 크리핑 로즈마리 추출물의 collagenase 저해 효과는 Fig. 5A와 같이, 50~400 μg/mL의 농도에서 열수 추출물은 12.23~45.38%의 효과를 나타냈고, 에탄올 추출물은 11.03~29.59%로 collagenase 저해 효과가 농도 의존적으로 높아지는 것을 확인하였다.

Fig 5. Collagenase inhibition rate (A) and predicted collagenase inhibition using esp-RBF SVR program (B) of creeping rosemary. Values are presented as mean±standard deviation (n=3). Means with the letters (a-b) (A-C) (α-γ) on the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test. The phenolic concentration was calculated by converting it to the standard material gallic acid. DW: water extract, 70%E: 70% ethanol extract. EGCG: (-)epigallocatechin-3-gallate.

Positive control인 EGCG는 100~400 μg/mL에서 12.73~52.35%의 저해 활성을 나타내었다. Kang 등(2018)의 연구에서는 들깨박 추출물의 100 mg/mL 농도에서 26.7%의 collagenase 저해 효과를 보고하였다. 이와 비교하여 크리핑 로즈마리의 collagenase 저해 활성이 더 우수하며, 피부 주름의 완화제로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단되었다. SVR 기법의 예측모델을 활용하여 collagenase의 저해 활성 발현을 위한 최적 조건을 탐색한 결과, Fig. 5B와 같이 크리핑 로즈마리 물 추출물의 경우 약 320 μg의 처리 농도에서 최적의 저해 활성을 나타내며, 에탄올 추출물의 경우 400 μg 처리하였을 때 최적의 저해 활성을 나타내는 것으로 예측되었다. 따라서 collagenase의 저해를 위해서 크리핑 로즈마리의 적용 농도는 물 추출물은 320 μg, 에탄올 추출물은 400 μg을 사용하는 것이 가장 효율적인 것으로 예측되었다.

크리핑 로즈마리 추출물의 hyaluronidase 저해 효과 비교

세포 외 기질의 주성분인 hyaluronic acid는 신체 조직 재생 과정의 핵심 역할 중 하나이다. 대부분의 hyaluronic acid 특성은 분자 크기에 따라 특성이 달라지는데, 저분자 형태는 전염증성 분자이지만 고분자로 존재할 때는 항염증 및 면역억제 특성을 나타낸다. Hyaluronidase는 체내 고분자의 hyaluronic acid를 분해하는 효소로, hyaluronidase의 활성 저해는 항염증 및 항알레르기 효과를 기대할 수 있다(Litwiniuk 등, 2016). 크리핑 로즈마리의 hyaluronidase 저해 효과는 Fig. 6A와 같이 열수 추출물 50~400 μg/mL 농도에서 19.27~100.56%의 효과를 나타내었으며, 동일 농도에서 에탄올 추출물은 10.71~59.59%의 저해 활성이 확인되었으며, 열수 추출물에서 매우 높은 저해 효과가 나타남을 확인하였다. Positive control로 사용된 tannic acid는 동일 농도에서 64.10~97.26%의 항염증 효과를 나타내었다. Kim과 Lee(2014)에 따르면 초고압 처리한 강황잎 초고압 물 추출물의 1 mg/mL에서 hyaluronidase 저해 효과는 44.48%로 나타났다고 보고하였다. 이와 비교하면 크리핑 로즈마리의 효능이 더 우수하였고, 특히 열수 추출물에서 피부 항염증 활성에 대해 매우 높은 효능을 확인할 수 있었다. SVR 기법의 예측모델을 활용하여 hyaluronidase의 저해 활성 발현을 위한 최적조건을 탐색한 결과, Fig. 6B와 같이 크리핑 로즈마리 물 추출물의 경우 최적 적용 농도가 200 μg으로 예측되었고, 에탄올 추출물의 경우 410 μg 처리 시 저해 활성이 최적효과를 나타내는 것으로 예측되었다. 따라서 hyaluronidase의 저해를 위한 크리핑 로즈마리의 적용 농도는 물 추출물 200 μg, 에탄올 추출물 410 μg을 적용하는 것이 가장 효율적인 것으로 예측되었다.

Fig 6. Hyaluronidase inhibition rate (A) and predicted hyaluronidase inhibition using esp-RBF SVR program (B) of creeping rosemary. Values are presented as mean±standard deviation (n=3). Means with the letters (a-c) (A-D) (α-γ) on the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test. The phenolic concentration was calculated by converting it to the standard material gallic acid. DW: water extract, 70%E: 70% ethanol extract.

크리핑 로즈마리 추출물의 모공축소(수렴작용) 측정

피부의 단백질이 고분자 페놀성 물질과 가교결합을 형성하면 피부와 모공이 수축되는데 이러한 현상을 수렴작용이라 한다. 이러한 수렴작용은 피부와 점막표면에 피막을 형성해 보호하고, 조직을 조밀하게 하여 세포막의 투과성을 감소시킨다. 모공축소 효과는 헤모글로빈 단백질과 수렴제의 결합 정도에 따라 효과를 확인할 수 있으며, 야생 곰취잎 에탄올 추출물에서 모공 축소 효능을 보고한 Lim 등(2018)의 연구에서 50 μg/mL의 농도에서 49% 이상의 수렴 효과를 확인하였다. Fig. 7에 제시된 바와 같이 크리핑 로즈마리 열수 추출물에서는 효과가 보이지 않았으나, 에탄올 추출물에서는 400 μg/mL의 농도에서 13.14%의 수렴 효과를 확인하였으며, 이러한 결과는 VR 기법을 활용한 예측 모델상에서도 동일하게 예측되었다.

Fig 7. Astringent effect (A) and predicted astringent effect using esp-RBF SVR program (B) of creeping rosemary. Values are presented as mean±standard deviation (n=3). Means with the letters (a, A) on the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test. The phenolic concentration was calculated by converting it to the standard material gallic acid. DW: water extract, 70%E: 70% ethanol extract.

본 연구에서는 크리핑 로즈마리(creeping rosemary)의 잎, 가지를 증류수와 70% 에탄올을 용매로 사용해 추출하여 항산화와 미백, 주름, 항염증에 관여하는 효소 저해 활성을 비교하였다. 각각의 용매의 최적 추출조건에서 증류수는 23.03 mg/g, 70% 에탄올은 29.56 mg/g의 TPC를 함유하는 것으로 나타났다. 항산화 효과를 측정한 결과, 열수와 에탄올 추출물의 DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성은 최대 농도인 100 μg/mL에서 83.71%, 90.13% 및 99.90%, 100.50%의 효과를 나타내었다. Antioxidant protection factor의 경우 열수 추출물은 1.30~1.83 값을 나타내었고, 에탄올 추출물은 1.60~1.84로 우수한 PF값을 나타내었다. TBARs의 경우 열수와 에탄올 추출물 모두 최고 농도에서 90%에 근접한 값을 확인하였다. 크리핑 로즈마리 추출물의 tyrosinase 저해 효과는 400 μg/mL에서 38.86%로 에탄올 추출물의 미백 활성이 우수한 것으로 확인되었다. 주름 개선 효과와 관련된 elastase와 collagenase 저해 활성은 열수와 에탄올 추출물의 400 μg/mL에서 각각 22.59%, 38.87% 및 45.38%, 29.59%의 효과를 나타내 주름 개선 효과가 우수한 것으로 확인되었다. 모공의 수렴작용에 관여하는 astringent는 70% 에탄올 추출물에서 13.14%의 효과가 나타났다. 항염증에 관련된 hyaluronidase 저해 효과는 50~400 μg/mL의 물과 에탄올 추출물에서 각각 19.27~100.56%, 10.71~59.59%의 활성을 보여 열수 추출물의 항염증 효과가 매우 뛰어남을 확인하였다. SVR 기법의 예측모델을 활용하여 생리활성을 위한 최적조건을 탐색한 결과, DPPH, ABTS, PF의 최적 저해농도는 100 μg이며, TBARs 저해 최적농도는 70 μg인 것으로 예측되었다. Tyrosinase와 elastase 저해를 위한 최적농도는 각각 400 μg과 200 μg인 것으로 예측되었다. Collagenase와 hyaluronidase 저해를 위한 최적농도는 물 추출물의 경우 각각 320 μg과 200 μg이며, 에탄올 추출물의 경우 두 효소 모두 400 μg 정도로 예측되었다. 또한 수렴효과 발현을 위한 최적 농도는 400 μg으로 예측되었다. 위의 결과에 따르면 크리핑 로즈마리 열수 추출물은 특히 항염증, 주름 저해 활성이 있으며, 에탄올 추출물의 경우 미백, 수렴작용, 주름 저해 효과가 우수하게 나타나 크리핑 로즈마리의 추출물은 기능성 화장품 원료 및 미용 식품 소재로의 활용이 가능할 것으로 기대되었다.