티로신 키나제 수용체 B(tyrosine kinase receptor B)의 작용제(agonist)이면서 뇌 유래 신경 영양 인자(brain-derived neurotrophic factor)의 모방체(mimetic)로 잘 알려진 7,8-dihydroxyflavone(7,8-DHF)은 다양한 식물에서 발견되는 천연 폴리페놀 화합물인 플라보노이드의 일종이다(Gudasheva 등, 2019; Paul 등, 2021; Yang과 Zhu, 2022). 7,8-DHF의 특성으로 그동안 많은 연구에서 알츠하이머병, 파킨슨병, 우울증 및 기억 장애 등을 포함한 신경 장애 개선 효능의 우수함이 입증되었으며, 이는 강력한 항염증 및 항산화 활성과도 깊은 연관이 있다(Emili 등, 2022; Fang 등, 2022b; Hashimoto, 2018; Lim과 Cengiz, 2022; Paul 등, 2021; Yang과 Zhu, 2022).

아울러 7,8-DHF는 여러 유형의 암세포 증식을 억제하며, 세포주기의 흐름을 정지시키고 침윤성 차단 및 세포사멸(apoptosis) 유도를 통하여 항암 활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 예를 들어, Park 등(2012)의 연구에서 7,8-DHF가 U937 인체 단핵구 백혈병 세포에서 세포주기 진행에 관여하는 양성 조절인자인 cyclin의 발현과 retinoblastoma protein의 인산화를 억제하면서 cyclin-dependent kinase(Cdk) 억제제인 p27의 발현 증가를 통하여 세포주기 G1 정지와 세포사멸을 유도하였음을 보고한 바 있다. 인체 구강 편평암 세포에서도 7,8-DHF가 p27뿐만 아니라 p21의 발현을 증가시키면서 G1 정지 및 세포사멸을 유도하였으며, 여기에는 세포의 과증식과 종양 형성 및 전이에 핵심적으로 관여하는 전사 인자인 Sp1의 활성화가 관여함이 밝혀졌다(Lee 등, 2015). 반면, 흑색종 암세포에서 7,8-DHF는 발암 과정에 밀접하게 관여하는 것으로 알려진 ganglioside GD3 및 그 합성 효소의 발현 수준은 감소시키고, Cdk 억제제인 p21의 발현을 증가시키면서 G2/M기 세포주기 정지, 침윤성 억제 및 세포사멸 효과를 나타내었다(Ju 등, 2023).

한편, 세포사멸 유도 기전 관련 초기 선행 연구에 의하면 인체 백혈병 세포에서 7,8-DHF에 의한 세포사멸 유도에는 세포 죽음 수용체(death receptor) 관련 단백질 수준의 상향 조절과 미토콘드리아 손상을 동반한 세포사멸 경로 활성화가 보고된 바 있다(Park 등, 2013). 전형적인 세포사멸 유도 과정은 크게 외인성 경로와 내인성 경로(extrinsic 및 intrinsic apoptosis)로 구분되는데, 외인성 경로는 세포 죽음 리간드(death ligand)와 수용체의 결합에 따른 신호로 개시되며, 외인성 경로는 미토콘드리아의 손상에 따른 cytochrome c 세포질의 유리에 의하여 촉진된다(Lossi, 2022; Pfeffer와 Singh, 2018). 따라서 Park 등(2013)의 결과는 7,8-DHF가 외인성 및 내인성 경로의 동시 활성에 의하여 세포사멸이 이루어졌음을 보여주는 결과이다. 그리고 세포 내 신호 전달계와 연계된 세포사멸 기전 연구에서, Park 등(2013)은 mitogen-activated protein kinase(MAPK) 중에서 7,8-DHF에 의한 extracellular-regulated kinase(ERK)와 c-Jun N-terminal kinase(JNK)의 활성이 세포사멸의 주요 세포 내 신호전달 조절자로 매개되었음을 제안하였다. 이와 유사한 연구가 Zhao 등(2021)에 의하여 인체 골육종 세포에서 수행된 바 있으며, 세포증식 핵심 조절자인 phosphoinositide 3-kinase(PI3K)의 하류 인자인 Akt의 불활성화가 7,8-DHF 유도 세포사멸에 동반되었음을 보고하였으나, 7,8-DHF에 의한 암세포 세포사멸에서 MAPK 및 PI3K/Akt 신호전달 경로의 역할은 제시하지 못하였다.

본 연구에서는 7,8-DHF에 의한 항암 활성의 추가적인 기전 연구를 위하여 인체 간암 HepG2 세포의 증식에 미치는 7,8-DHF의 영향을 조사하였다. 본 연구 결과에 의하면 HepG2 세포에서 7,8-DHF에 의한 세포사멸 유도에는 미토콘드리아 손상을 동반한 외인성 및 내인성 세포사멸 경로 활성, MAPK 및 PI3K/Akt 경로와 함께 에너지 대사 조절 인자인 AMP-activated protein kinase(AMPK) 또한 관여하였음을 알 수 있었다.

세포배양, 7,8-DHF 처리 및 세포 생존율 분석

본 연구에 사용된 HepG2 세포는 American Type Culture Collection에서 구입하였으며, 선행 방법에 준하여 배양하였다(Park 등, 2016). 7,8-DHF는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 dimethyl sulfoxide(Sigma-Aldrich)에 녹여 stock 용액을 제조하였으며, 세포배양용 배지에 적정 농도로 희석하여 48시간 동안 처리하였다(Kang 등, 2015). 세포 괴사 억제제(necrostatin-1, NEC; Sigma-Aldrich), pan-caspase 억제제(carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-[O-methyl]-fluoromethylketone, z-VAD-fmk; Sigma-Aldrich), ERK 억제제(PD98059, Calbiochem), JNK 억제제(SP600125, JNK; Cell Signaling Technology), p38 MAPK 억제제(SB203580, Cell Signaling Technology), AMPK 억제제(compound C, CC; Sigma-Aldrich) 및 PI3K 억제제(LY294002, Cell Signaling Technology)는 세포독성이 없는 범위의 농도를 선택하여, 7,8-DHF를 세포에 48시간 처리하기 1시간 전에 처리하였다. 세포 생존율은 선행 방법에 준하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma-Aldrich) 분석법으로 평가하였다(Kang 등, 2015).

세포사멸 유도 분석

다양한 조건에서 배양된 HepG2 세포에 유발된 세포사멸 여부를 평가하기 위하여 처리가 끝난 세포를 선행 방법에 준하여 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Thermo Fisher Scientific) 염색 후 형광 현미경(Carl Zeiss) 하에서 핵의 형태 변화를 관찰하거나(Kim 등, 2018), Fluorescein Isothiocyanate Annexin V Apoptosis Detection kit(BD Biosciences)을 이용한 유세포 분석기(BD Biosciences)를 통하여 세포사멸의 정도를 정량적으로 분석하였다(Hwangbo 등, 2024). 아울러 세포에서 분리된 DNA를 agarose gel 전기영동으로 분리하여 ethidium bromide(Sigma-Aldrich)로 염색하여 단편화 여부를 관찰하였다(Park 등, 2019).

단백질 분리 및 immunoblotting

단백질 발현을 위한 immunoblotting을 수행하기 위하여 세포의 총단백질은 RIPA lysis and extraction buffer(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분리하였으며, 미토콘드리아 및 세포질 분획은 Mitochondria isolation kit for culture cells(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분리하였다. Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 이용하여 단백질을 정량화 후 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하고 nitrocellulose membranes(Amersham Bioscience)로 전이시킨 후 해당 단백질의 1차 및 2차 항체를 이용하여 반응시켰다. 이어서 enhanced chemiluminescence assay kit(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 단백질의 발현 정도를 분석하였다(Kim 등, 2018). 본 연구에 사용된 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. 및 Cell Signaling Technology, Inc.에서 구입하였으며, 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc.에서 구입하였다.

Caspase 활성 및 ATP 함량 분석

HepG2 세포에 7,8-DHF 처리에 따른 3가지 caspase의 활성 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 R&D Systems, Inc.에서 구입한 caspase enzyme-linked immunosorbent assay kit을 사용하였으며, 세포질 adenosine triphosphate(ATP) 생산은 ATP 분석 키트(Abcam)를 사용하여 측정하였다. 각 제조업체의 지침에 따라 caspase의 활성과 ATP 수준은 microplate reader(BioTek)를 사용하여 405 nm 및 570 nm에서 측정하였다.

미토콘드리아 활성 분석

7,8-DHF 처리에 따른 HepG2 세포의 미토콘드리아 기능 손상의 여부를 분석하기 위하여 정상 미토콘드리아 thiol기에 결합하는 MitoTracker^® Red 염색을 수행하였으며, 미토콘드리아 막전위(mitochondrial membrane potential, MMP)의 변화를 분석하기 위하여 5,5,6,6′-tetrachloro-1, 1′,3,3′ tetraethylbenzimi-dazoylcarbocyanine iodide(JC-1, Sigma-Aldrich) 염색을 적용하였다. 이를 위하여 각 제조사에서 제시한 실험 방법에 준하여 준비된 세포를 Mito Tracker^® Red(Thermo Fisher Scientific) 및 JC-1으로 염색하였다. MitoTracker^® Red 염색 후 DAPI를 이용하여 핵을 추가로 염색하였으며, 형광 현미경 하에서 Mito Tracker^® Red의 형광 이미지를 분석하였다. 그리고 JC-1으로 염색된 세포는 세포 분석기를 이용하여 JC-1 응집체(aggregates) 및 단량체(monomers)의 비율을 측정하였다(Hwangbo 등, 2024).

통계 분석

GraphPad Prism Statistical Software(GraphPad Software)를 사용하여 실험 결과의 통계를 분석하였으며, 평균±표준편차(standard deviation)로 나타내었다. One-way analysis of variance와 Tukey’s post-hoc test를 사용하여 실험 그룹 사이의 차이를 조사하였고, P-value가 0.05 미만의 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

HepG2 세포에서 7,8-DHF 처리에 의한 세포 생존율 억제 및 세포사멸 유도

7,8-DHF가 HepG2 세포의 생존에 미치는 영향을 조사하기 위하여 MTT 분석을 수행하였다. Fig. 1A의 결과에서 알 수 있듯이 7,8-DHF의 처리 농도가 100 μM 이하에서는 유의적인 세포 생존율 감소가 관찰되지 않았지만, 150 μM 이상 처리군에서 농도 증가에 따라 유의적인 세포독성이 관찰되었다. HepG2 세포에서 7,8-DHF의 세포독성에 대한 감수성이 인체 악성 흑색종 세포(SK-MEL-2 및 G-361 세포), 골육종 세포(U2OS 및 143B 세포), 구강 편평암 세포(HN22 및 HSC4 세포), 백혈병 세포(U937 세포)에 비하여 다소 낮았지만(Ju 등, 2023; Lee 등, 2015; Park 등, 2013; Zhao 등, 2021), 다른 유형의 간암 세포인 HUH-7 세포에서는 유사하였다(Abuşoğlu 등, 2023). 따라서 HepG2 세포에의 7,8-DHF에 의한 세포 생존율의 억제가 세포사멸 유도와 관련이 있는지를 조사하기 위하여 먼저 DAPI 염색을 통하여 핵의 형태 변화와 DNA 단편화 여부를 조사하였으며, 150 μM 이상 처리군에서 전형적인 세포사멸이 유도된 세포에서 관찰되는 염색질의 응축에 따른 세포 사멸체와 DNA 단편화 현상이 현저히 증가하였다(Fig. 1B~1D). 따라서 7,8-DHF 처리에 따른 HepG2 세포의 생존율 감소는 세포사멸 유도와 관련성이 높음을 알 수 있었으며, 이는 다양한 암세포에서 관찰된 선행 연구의 결과와 유사하였다(Abuşoğlu 등, 2023; Ju 등, 2023; Lee 등, 2015; Park 등, 2013; Sim 등, 2016; Zhao 등, 2021).

Fig 1. Inhibition of proliferation and induction of apoptosis by 7,8-DHF in HepG2 cells. (A∼D) Cells were cultured in medium containing the indicated concentrations of 7,8-DHF for 48 h. (E, F) Cells were pretreated with z-VAD-fmk (100 μM) and NEC (200 μM) for 1 h and then grown for 48 h in a medium containing 7,8-DHF (200 μM). (A, E) After treatment, cell viability was measured by the MTT assay. (B) Morphological changes in apoptotic cells were observed through 4′,6-diamidino-2-phenylindole staining. Arrows indicate apoptotic bodies with condensed chromatin. (C, F) Cells were double stained with Annexin V and PI, and analyzed using flow cytometry (C). In the graph, each column represents the mean±SD percentage of PI-positive and Annexin V-positive cells (F). (D) Fragmented DNA was separated by agarose gel electrophoresis and then stained with ethidium bromide. ^*P<0.05 compared to untreated group; ^#P<0.05 compared to 7,8-DHF-treated group; NS, not significant compared to 7,8-DHF treatment group.

7,8-DHF 처리에 의한 HepG2 세포의 죽음 유도가 세포 괴사(necrosis)가 아닌 세포사멸에 의한 것임을 입증하기 위하여 세포 괴사 억제제(NEC)가 함유된 배지에서 7,8-DHF를 처리한 결과, 7,8-DHF 처리에 의한 HepG2 세포의 생존율 억제와 세포사멸 유도에는 변화가 없었다(Fig. 1E, 1F). 또한 몇몇 선행 연구에서 7,8-DHF의 항암 활성에 caspase의 활성이 관여할 가능성이 보고된 바 있기 때문에(Abuşoğlu 등, 2023; Ju 등, 2023; Lee 등, 2015; Park 등, 2013), 이를 확인하기 위하여 pan-caspase 억제제(z-VAD-fmk)를 사용하였다. Fig. 1E 및 1F에 나타낸 결과와 같이 z-VAD-fmk가 존재하는 조건에서는 7,8-DHF에 의한 세포 생존율 억제와 세포사멸 유도가 유의적으로 차단되었다. 따라서 본 연구 결과는 7,8-DHF 처리에 의한 HepG2 세포의 죽음 유도는 세포 괴사가 아닌 caspase 의존적 세포사멸에 의한 것임을 알 수 있었다.

HepG2 세포에서 7,8-DHF 처리에 의한 외인성 내인성 세포사멸 조절 인자들의 발현 변화

이상에서 확인된 7,8-DHF에 의한 HepG2 세포의 세포사멸 유도에 관여하는 유전자들의 발현 변화를 조사하기 위하여, 먼저 외인성 세포사멸 경로 유도의 핵심 인자인 Fas (CD95)와 Fas ligand(FasL, CD95L)의 발현에 미치는 7, 8-DHF의 영향을 조사하였다. FasL은 tumor necrosis family(TNF) super-family의 구성원이며, 이 막 횡단 리간드는 주로 Fas 발현 세포에서 강력한 세포사멸 유도제로 작용한다(Devel 등, 2022; Haymour 등, 2023). Fig. 2A에 제시한 immunoblotting 결과에서 알 수 있듯이, 7,8-DHF의 처리 농도가 증가할수록 Fas뿐만 아니라 FasL의 발현도 증가하였다. Fas/FasL system과 더불어 외인성 세포사멸에 관여하는 또 따른 주요 경로가 TNF-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) 세포사멸 경로이며, TRAIL은 암세포의 사멸 수용체(death receptor, DR)인 DR4(TRAIL-R1) 및 DR5(TRAIL-R2)와 결합하여 세포 내 세포사멸 cascade를 개시한다(Maji 등, 2024; Thapa 등, 2020). Fas 및 FasL과 유사하게 7,8-DHF가 처리된 세포에서 DR4, DR5 및 TRAIL의 발현이 대조군에 비하여 다소 증가하는 경향성을 보였다.

Fig 2. Effect of 7,8-DHF on the levels of apoptosis-regulatory proteins in HepG2 cells. (A, B) Total proteins were isolated from cells treated with the indicated concentrations of 7,8-DHF for 48 h. Expression changes of indicated proteins were then investigated using corresponding antibodies. Equal loading was confirmed with actin. (C) The degree of caspase activity was measured using the lysate of cells treated with 7,8-DHF for 48 h. The activity of each caspase was presented as a relative value of the untreated control group. ^*P<0.05 compared to corresponding untreated group.

한편 Bcl-2 family에 속하는 단백질은 미토콘드리아 의존적인 내인성 세포사멸 경로의 핵심 조절자로서 미토콘드리아 외막의 투과성을 조절하여 세포사멸 유도 여부를 결정한다. 이들 중 Bax는 세포사멸 촉진 조절자로서 미토콘드리아 전압 의존성 음이온 채널(mitochondrial voltage-dependent anion channel)의 개방을 증가시키며, 이로 인해 MMP가 손실되고 cytochrome c가 미토콘드리아에서 세포질로 방출된다(Zhou 등, 2024). 세포질에서 cytochrome c는 세포사멸 유도를 위한 caspase cascade를 활성화한다. 반면, Bcl-2는 항세포사멸 조절자로서 Bax의 기능을 차단하여 세포사멸 유도를 억제한다(King 등, 2023; Wolf 등, 2022). 따라서 Bax/Bcl-2 발현의 비율 변화는 내인성 세포사멸 유도에 핵심 요소로 작용한다. 본 연구 결과에 의하면 7,8-DHF는 HepG2 세포에서 Bax의 발현을 증가시킨 반면, Bcl-2의 발현은 억제하였다(Fig. 2B).

Caspase cascade의 활성은 내인성 및 외인성 세포사멸 유도에 모두 관여하며, 그중 caspase-9와 caspase-8은 각각 내인성과 외인성 세포사멸 개시자로 작용한다. 그들의 활성은 효과기 caspase에 해당하는 caspase-3 또는 caspase-7을 활성화하며, 효과기 caspase는 poly(ADP-ribose) polymerase를 포함한 세포 생존에 필요한 세포 내 다양한 단백질을 분해하여 세포사멸을 종결짓는다(Flores-Romero 등, 2020; Yuan과 Ofengeim, 2024). Fig. 1E 및 1F의 결과에서 7,8-DHF 처리에 의한 HepG2 세포의 세포사멸은 caspase 의존적 현상이었기에 이를 확인하기 위하여 caspase-3, -8 및 -9의 발현에 미치는 7,8-DHF의 영향을 조사한 결과, 비록 그들의 활성형 발현의 검출은 어려웠지만, 세 가지 caspase의 활성은 모두 7,8-DHF 처리 농도의 증가에 따라 그들의 활성도 증가하였다(Fig. 2B, 2C). 따라서 HepG2 세포에서 7,8-DHF 처리에 의한 세포사멸 유도에는 내인성 및 외인성 세포사멸 유도 경로가 동시에 활성화됨을 알 수 있었다.

HepG2 세포에서 7,8-DHF 처리에 의한 미토콘드리아 기능 손상의 유도

7,8-DHF 처리에 의한 HepG2 세포의 세포사멸 유도에 내인성 세포사멸 유도 경로 활성화와 더불어 미토콘드리아 기능 손상이 동반되었음을 의미한다(Bock과 Tait, 2020; Wolf 등, 2022). 이를 확인하기 위하여 정상적인 기능을 유지하는 미토콘드리아를 표지하는 세포 투과성 probe인 Mito Tracker^®를 사용하였다(Zhang 등, 2019). Fig. 3A와 같이 정상 배지에서 배양된 HepG2 세포에서는 붉은색으로 표시된 미토콘드리아가 세포 전체에서 광범위하게 검출되었지만, 7,8-DHF가 처리된 세포에서는 붉은색의 형광이 현저히 감소하거나 검출이 되지 않았다. 이러한 현상이 MMP의 소실에 의한 것임을 입증하기 위하여 JC-1 염료를 추가로 사용하였다. JC-1은 친유성 및 양이온 염료(lipophilic 및 cationic dye)로서 건강한 세포에서 JC-1은 에너지가 공급되고 음전하를 띤 미토콘드리아에 들어가 축적되어 자발적으로 적색 형광성 JC-1 응집체를 형성하지만, 손상된 미토콘드리아에서는 단량체로 존재한다(Sivandzade 등, 2019). JC-1 염색에 따른 유세포 분석의 결과에 의하면, 7,8-DHF가 처리되지 않은 세포에 비하여 7,8-DHF가 처리된 세포에서 JC-1 단량체의 비율이 현저하게 증가하였다(Fig. 3B, 3C). 아울러 세포 내 ATP 함량을 분석한 결과에서도 7,8-DHF가 처리된 세포에서 유의적으로 ATP 함량이 감소하였으며(Fig. 3D), 이는 미토콘드리아 기능 손상에 따른 전자전달계에서의 산화적 인산화 경로가 손상되었기 때문으로 추정된다(Vercellino와 Sazanov, 2022). 이상의 결과는 HepG2 세포에서 7,8-DHF에 의한 세포사멸은 미토콘드리아의 기능 손상과 밀접한 연관성이 있음을 보여준다.

Fig 3. Induction of mitochondrial dysfunction by 7,8-DHF in HepG2 cells. Cells were grown for 48 h in medium containing the indicated concentrations of 7,8-DHF. (A) Cells were stained with MitoTracker Red and representative images were acquired under a fluorescence microscope. (B, C) MMP was assessed by flow cytometry using the JC-1 dye (B) and the frequency of cells with JC-1 monomers, indicating MMP loss, was quantified (C). (D) Cells were treated with 7,8-DHF for 48 h and ATP production was assessed by an ATP assay kit. (E) After cytoplasmic and mitochondrial fractions were isolated, the expression of cytochrome c was evaluated by immunoblot-ting. Cytochrome c oxidase subunit IV and actin were probed as loading controls for each fraction. ^*P<0.05 compared to untreated group.

MMP의 소실은 미토콘드리아에서 세포질로 cytochrome c의 유출을 촉진하는 원인으로 작용하기 때문에 세포사멸 유도 측면에서 미토콘드리아의 외막과 내막 사이에 존재하는 cytochrome c는 내인성 세포사멸의 개시 인자로서 핵심적인 역할을 한다(Zhou 등, 2024). 따라서 7,8-DHF가 처리된 HepG2 세포에서 cytochrome c가 세포질로 전이되었는지를 확인하기 위하여 정상 배지 및 7,8-DHF가 함유된 배지에서 배양된 세포들의 미토콘드리아와 세포질 단백질을 분리하여 cytochrome c의 발현을 조사하였다. Fig. 3E에 나타낸 immunoblotting의 결과에 의하면 7,8-DHF의 처리 농도가 증가할수록 세포질 분획에서의 cytochrome c 발현이 증가하였으나, 미토콘드리아 분획에서는 점차 감소하였다. 이러한 현상은 인체 백혈병 세포에서 관찰된 것(Park 등, 2013)처럼 7,8-DHF가 처리된 HepG2 세포에서 미토콘드리아 기능 손상에 따른 MMP 소실에 의한 것임을 의미하며, 세포질로 전이된 cytochrome c는 내인성 세포사멸 개시에 기여하였을 것이다.

HepG2 세포에서 7,8-DHF 처리에 의한 세포사멸 유도에 미치는 세포 내 신호 전달계의 역할

세포의 운명 조절에는 MAPK, AMPK, PI3K/Akt 등을 포함한 다양한 세포 내 신호 전달계가 관여한다(Cao 등, 2021; Gupta 등, 2021). Zhao 등(2021)의 결과에 의하면 7,8-DHF 처리에 의한 인체 골육종 세포의 세포사멸 유도 과정에서 MAPK 중에서 p38 MAPK는 비활성화된 반면, ERK와 JNK의 활성은 증가하였다. 그러나 그들은 7,8-DHF 처리에 따른 MAPK의 서로 다른 반응에 대한 역할을 규명하지는 못하였다. 본 연구 결과에 의하면 7,8-DHF가 처리된 HepG2 세포에서 ERK가 활성화되었음을 의미하는 인산화(p-ERK)가 7,8-DHF 처리 1시간부터 증가하기 시작하여 4시간 이후부터는 감소하였다(Fig. 4A). 그리고 p-JNK도 이와 유사한 경향성을 보였지만 인산화의 정도는 상대적으로 미비하였으며, p-p38 MAPK는 7,8-DHF 처리 2시간부터 증가하였다가 점차 감소하였다. 따라서 7,8-DHF 처리에 따른 서로 다른 경향성을 보이는 MAPK의 역할을 규명하기 위하여 각 kinase의 활성 억제제를 사용하였다. 먼저 ERK 억제제인 PD98059가 존재하는 조건에서는 7,8-DHF에 의해 감소된 HepG2 세포의 세포 생존율이 유의적으로 차단되면서 세포사멸은 감소하였다(Fig. 4D, 4E). 그러나 p38 MAPK 및 JNK 억제제인 SB203580과 SP600125는 7,8-DHF 처리에 의한 세포 생존율의 저하와 세포사멸의 증가에 유의적인 영향을 미치지 못하였다. 따라서 이 결과는 HepG2 세포에서 ERK의 활성화가 7,8-DHF에 의한 세포독성과 관련되어 있음을 의미하는 것이다.

Fig 4. Role of MAPK, AMPK, and PI3K/Akt signaling in 7,8-DHF-induced cytotoxicity in HepG2 cells. Cells were treated with 200 μM 7,8-DHF for the indicated times (A∼C) or treated with 200 μM 7,8-DHF after 1 h pretreatment with inhibitors of each signaling and cultured for 48 h (D, E). (A∼C) The expression levels of total or phosphorylated proteins of the indicated proteins were evaluated by immunoblotting. (D, E) The degree of apoptosis and cell survival rate were evaluated through flow cytometry and MTT analysis, respectively. ^*P<0.05 compared to untreated group; ^#P<0.05 compared to 7,8-DHF-treated group; NS, not significant.

AMPK는 ATP가 고갈되어 AMP/ATP 비율이 증가하는 경우 활성화되는 항상성 유지에 센서 역할을 하는 효소이다. AMPK가 활성화되면 지방산 산화와 해당 과정 등을 유도하여 에너지를 생산하는 과정이 촉진되는 반면, 지방산 또는 콜레스테롤 합성에 필요한 AMPK 하류 인자인 acetyl-CoA carboxylase(ACC)와 같은 효소의 불활성화를 통해 ATP를 소비하는 과정은 차단된다(Fang 등, 2022a; Yun 등, 2022). 7,8-DHF에 의한 암세포의 세포사멸 유도에 미토콘드리아의 기능 저하가 연관되었다는 선행 보고(Ju 등, 2023; Park 등, 2013)에서 AMPK 신호계의 활성화가 관련성에 대한 추측이 가능함에도 AMPK의 역할에 관한 연구는 현재까지 이루어진 바 없다. Fig. 4B에 의하면 7,8-DHF의 처리 시간이 증가할수록 인산화된 AMPK와 ACC의 발현이 증가하여 AMPK 신호계가 활성화되었음을 알 수 있었으며, 이는 Fig. 3에 나타낸 미토콘드리아 기능 소실에 따른 ATP 고갈의 결과일 것으로 예상된다. HepG2 세포에서 7,8-DHF에 의한 AMPK 활성화의 역할을 조사하기 위하여 AMPK 억제제인 CC를 전처리한 경우, 7,8-DHF에 의한 HepG2 세포의 생존율 감소와 세포사멸의 유도 효과가 억제되었다(Fig. 4D, 4E). 따라서 이는 AMPK 경로의 활성이 7,8-DHF에 의한 HepG2 세포의 세포독성 유도에 최소한 관여함을 시사하는 결과이다.

한편 PI3K/Akt 신호계는 세포의 생존과 증식에 필요한 핵심적인 경로로 다양한 암세포의 증식억제를 위한 주요한 표적으로 인식되고 있다(Gellhaus 등, 2023; Leiphrakpam과 Are, 2024; Sadrkhanloo 등, 2023). 7,8-DHF에 의한 인체 골육종 세포의 세포사멸 유도에서 PI3K/Akt 신호계가 관여한다는 것이 Zhao 등(2021)에 의해 처음 제안되었지만, 그들의 결과는 7,8-DHF가 처리된 골육종 세포에서 Akt의 인산화가 억제되었다는 보고에 국한되어 있으며, PI3K/Akt 신호계가 어떤 역할을 하는지에 관한 연구는 이루어진 바 없다. 본 연구의 결과에 의하면, 7,8-DHF의 처리 시간이 경과할수록 Akt 뿐만 아니라 Akt의 상위 조절인자인 PI3K의 인산화가 점진적으로 억제되었다(Fig. 4C). 아울러, 7,8-DHF에 의한 PI3K/Akt 신호계의 불활성화가 HepG2 세포의 세포독성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 PI3K 억제제인 LY294002를 전처리하였을 경우, 7,8-DHF에 의한 세포사멸과 세포 생존율 억제는 더욱 증가하였다(Fig. 4D, 4E). 따라서 HepG2 세포에서 7,8-DHF에 의한 PI3K/Akt 신호계의 활성 저하는 세포 생존 억제에 기여하였음을 의미한다.

본 연구 결과를 종합하면 7,8-DHF에 의한 HepG2 간암 세포의 세포사멸 유도에는 caspase 의존적 세포사멸의 주요한 2가지 경로인 외인성 및 내인성 경로의 활성이 모두 관여하였음을 알 수 있다. 비록 외인성 경로와 연계된 내인성 경로의 연계 과정은 불확실하지만, 미토콘드리아의 기능 손상은 최소한 내인성 경로의 활성화에 기여하였을 것으로 추정된다(Fig. 5). Zhao 등(2021)은 인체 골육종 세포에서 7,8-DHF에 의한 세포사멸 유도에 활성 산소(reactive oxygen species, ROS)의 생성이 관여한다고 보고한 바 있으나, ROS의 생성이 미토콘드리아의 기능 손상에 따른 것인지는 불명확하다. 미토콘드리아는 ROS 생성의 주요 세포 내 소기관이면서, ROS에 취약하기도 하다. 따라서 7,8-DHF에 의해 생성되는 ROS의 원천이 미토콘드리아일 가능성이 높으며, 이에 대한 추가 연구가 요구된다. 한편, 7,8-DHF에 의한 ATP 생성의 억제는 미토콘드리아 손상 유도에 따른 것이며, 이는 AMPK가 활성화에 기여하였을 가능성이 높다. 실제로, AMPK의 활성을 인위적으로 차단하였을 경우 HepG2 간암 세포에서 7,8-DHF의 세포독성이 완화되었다는 결과는 이를 지지해 준다. 아울러 MAPK와 PI3K/Akt 신호계는 세포증식에 핵심적으로 작용하기 때문에 이들 경로가 7,8-DHF의 항암 활성에 관여한다는 사실은 다양한 세포 내 신호계가 7,8-DHF에 의하여 조절되고 있음을 보여주는 것이다(Fig. 5). 따라서 본 연구의 결과는 향후 동물실험을 통하여 추가로 수행할 7,8-DHF의 항암 활성을 이해할 수 있는 기초자료로 활용될 것이다. 아울러 식품 소재로서 7,8-DHF가 암의 예방뿐만 아니라 다양한 인체 질환의 치료에 활용될 수 있는 생리활성 분자로서의 가능성에 대한 연구 또한 병행되어야 할 것이다. 실제로 지난 10년 동안 180건 이상의 전임상 연구에서 다양한 병리의 동물 모델에서 7,8-DHF의 효능을 조사한 바 있다(Emili 등, 2022). 본 연구 결과는 지금까지 얻어진 7,8-DHF의 효능에 대한 추가 자료로써 기여할 수 있을 것이다.

Fig 5. Summary of the anti-cancer activity of 7,8-DHF on hepatocellular carcinoma HepG2 cells.

7,8-DHF은 다양한 식물에서 발견되는 천연 폴리페놀 화합물인 플라보노이드의 일종으로 다양한 종류의 암세포 증식을 억제하는 효과도 있는 것으로 보고되었다. 그러나 이 플라보노이드의 항암 활성과 관련된 분자생물학적 기전에 대한 연구는 아직 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 7,8-DHF의 새로운 항암 기전을 규명하기 위해 7,8-DHF가 HepG2 인간 간암 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 본 연구 결과에 따르면 7,8-DHF에 의한 HepG2 세포의 생존 억제는 괴사가 아닌 caspase 의존성 세포사멸과 직접적인 관련이 있는 것으로 나타났다. 이러한 현상은 7,8-DHF 처리에 의한 사멸 수용체 및 Bcl-2 계열 단백질의 발현 변화와 caspase cascade의 활성 증가로 입증하였다. 또한 7,8-DHF 처리로 인해 MitoTracker Red 형광 강도가 약화되었고, 미토콘드리아 막전위가 손실되었으며, ATP 함량 감소와 함께 세포질로 cytochrome c 방출이 증가하여 7,8-DHF의 항암 활성이 미토콘드리아 기능 장애와 관련되어 있음을 보여주었다. 아울러 7,8-DHF에 의해 유발된 HepG2 세포의 세포사멸에는 세포 내 신호 전달계 중에서 ERK 및 AMPK의 활성화 및 PI3K/Akt의 불활성화는 HepG2 세포에서 7,8-DHF에 의한 세포독성 유도에 기여하였다. 따라서 본 연구의 결과는 7,8-DHF의 항암 활성 메커니즘에 대한 새로운 기전을 제공하고 향후 동물실험을 통해 기초자료로 활용될 것이다.

이 연구는 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단의 지원(No. RS-2023-00213236)을 받아 수행되었습니다.