Ex) Article Title, Author, Keywords
Online ISSN 2288-5978
Ex) Article Title, Author, Keywords
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(10): 1007-1013
Published online October 31, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.10.1007
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
Ji Yeong Kim , Seulgi Kim , and In Guk Hwang
Department of Agrofood Resources, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration
Correspondence to:In Guk Hwang, Department of Agrofood Resources, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, 166, Nongsaengmyeong-ro, Iseo-myeon, Wanju-gun, Jeonbuk 55365, Korea, E-mail: ighwang79@korea.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
β-Cryptoxanthin (β-CRX) is a carotenoid that has received increasing attention due to its high availability and functionality in the human body. Unlike other vegetables and fruits, β-CRX is particularly abundant in citrus fruits. Therefore, the objective of this study was to validate an analytical method for β-CRX and determine its content in domestic citrus varieties. The results demonstrated that Gungcheon-josaeng, Harye-josaeng, and Hongjin-josaeng exhibited significantly higher levels of content compared to other varieties. The β-CRX content of the Gungcheon-josaeng samples (n=37) collected from Jeju-si and Seogwipo-si exhibited an average content of 1,259 and 1,230 μg/100 g FW, respectively, with no significant difference observed between the contents of the samples from the two regions. Although β-CRX is an important functional compound in mandarin, which belongs to the citrus family, data on the β-CRX content of citrus grown in Korea are scarce. Therefore, further research is needed to establish the production conditions of high β-CRX-containing citrus. This study will serve as a basis for future research.
Keywords: citrus, Satsuma Mandarin, Gungcheon-josaeng, β-cryptoxanthin, UPLC
감귤(
β-CRX는 하나의 β 고리에 수산기가 있는 (3R)-β,β-caroten-3-ol 구조로 되어 있어 β-carotene의 monohydroxyl 유도체로 알려져 있다(Jiao 등, 2019). 이로 인해 β-CRX는 β-carotene과 유사한 화학적 구조와 생리활성을 가지나, 식물 노화 및 과일 숙성 동안 에스테르화가 유발되어 α-carotene, β-carotene 같은 주요 카로티노이드보다 생체이용률이 더 높다고 보고되어 있다. 일본 식품성분표준표에 따르면 β-CRX 고함유 식품으로는 고추, 피망, 감, 파프리카, 감귤 순으로 높다고 보고되어 있다(MEXT, 2015). 또한 Holden 등(1999)의 카로티노이드 데이터베이스에 의하면 감귤은 포도, 복숭아, 라즈베리, 사과, 토마토 등과 비교하였을 때 월등히 높은 β-CRX 함량을 나타냈으며, Jiao 등(2019)은 다른 카로티노이드와 달리 β-CRX는 몇몇 과일과 채소에만 풍부하며, 이 중 감귤은 β-CRX 고함유 식품으로 보고하였다. Yamaguchi 등(2006)은 감귤 섭취의 골 형성 자극 및 골 흡수 저해에 대한 임상 효과를 밝혔고, Tanaka 등(2012)은 감귤의 항암효과를 보고한 바 있는데, 이들은 감귤의 β-CRX 성분으로부터 기인하였음을 규명하였다. 최근 Kim 등(2021c)은 체계적 문헌 고찰과 메타분석을 통해 β-CRX의 골다공증 위험 감소 효과를 보고한 바 있다. 또한, 농산물의 기능성 표시를 허용한 일본의 경우 감귤의 기능성 관여 성분으로 β-CRX를 선정하였고 현재 뼈 건강 유지 도움 기능성을 표기하여 판매하고 있다.
현재 일본 및 세계 각국에서는 감귤의 플라보노이드류, 카로티노이드류 등 감귤의 기능 성분 함량 정보 구축 연구를 진행하고 있으나(Chung 등, 2000), 우리나라의 경우 다생산・다소비 과일임에도 불구하고 감귤의 주요 기능성분인 β-CRX 성분 함량 정보 구축 연구가 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 감귤 품종(9종)과 재배 지역별 궁천조생 품종의 β-CRX 함량 정보를 제공하고자 하였다. 또한 β-CRX 함량 분석 결과의 정확성과 신뢰성을 확보하고자 분석법 검증을 시행하였다.
본 연구에 사용된 감귤 품종 9종(궁천조생, 하례조생, 흥진조생, 유라조생, 일남1호, 신예감, 황금향, 천혜향, 한라봉)은 2019년 제주도에서 구매하여 사용하였다. 이 중 β-CRX 함량이 높고 국내 재배량이 많은 궁천조생 감귤 품종을 대상으로 2020년에 제주시 소재 9개 농가와 서귀포시 소재 28개 농가에서 구입하여 분석용 시료로 사용하였다. 감귤 시료는 껍질을 제거한 다음 동결 건조하여 분쇄(Ninja 1000 Watts, Hai Xin Technology Company)하였고 최종 30 mesh 체를 통과시킨 후 균질화하여 -20°C에서 보관하여 사용하였다. β-CRX는 Extrasynthese에서 구입하였고, 그 밖의 시약은 analytical 및 HPLC 등급을 사용하였다.
감귤의 β-CRX 함량 분석을 위한 추출물 제조를 위해 건강기능식품공전 시험법을 참고하였으며, 시료 0.20±0.05 g을 50 mL conical tube에 넣고 추출용매인 6% pyrogallol ethanol 용액을 10 mL 가한 후 80°C의 water bath(Daihan Scientific)에서 150 rpm으로 15분간 추출하였다. 10분간 냉각 후 추출액에 검화용매인 80% KOH 용액 3 mL를 넣고 water bath(150 rpm)에서 15분간 비누화 반응 후 10분간 냉각하였다. 반응이 정지된 샘플에 증류수 5 mL와 n-hexane 10 mL를 넣어 추출 후 1,750×
UPLC 분석 조건은 Kim 등(2021b)의 조건을 사용하였다. UPLC는 Waters ACQUITYTM Ultra Performance LC(Waters)를 사용하였고 컬럼은 HALO® C30(160A, 2.7 μm, 3.0×150 mm, Halo Advanced Materials Technology)을 사용하였다. 이동상은 A 용매(메탄올)와 B 용매(에탄올)를 gradient 조건으로 흘려주었고, gradient 조건은 20분간 2%에서 40% B용매로 변경하여 분석하였다. 유속은 0.65 mL/min으로 하였고, 시료 5 μL를 주입하여 UV detector로 471 nm에서 분석하였다.
본 연구실 조건으로 신뢰성 있는 분석을 수행하기 위해 특이성(specificity), 직선성(linearity), 검출한계(limits of detection, LOD), 정량한계(limits of quantification, LOQ), 정밀성(precision)을 분석하여 분석법의 유효성을 검증하고자 하였다. 특이성은 감귤 추출물과 표준용액에서 해당 성분에 대한 머무름시간(retention time) 및 UV spectrum 패턴이 일치하는 것을 확인하였다. 또한, 분리된 β-CRX의 피크가 다른 화합물의 간섭 없이 분리됨을 확인하였다(Fig. 1). 직선성 검증을 위해 β-CRX를 1.17, 2.33, 4.66, 9.33, 18.65 μg/mL 농도로 단계 희석하여 6회 반복 측정하였다. 피크 면적과 시료 농도 데이터를 이용하여 검량선을 작성하고 linear regression equation(y=ax+b; y: peak 면적, x: 시료 농도, a: 직선의 기울기, b: y 절편)을 구하였으며 산출된 상관계수(R2)를 확인하여 직선성을 검토하였다. 직선성 검증을 통해 얻은 검량선의 기울기 평균값과 y 절편에 대한 표준편차를 이용하여 검출한계와 정량한계를 계산하였다.
정량한계(LOQ)=10×y 절편의 표준편차/검량선 기울기의 평균값
검출한계(LOD)=3.3×y 절편의 표준편차/검량선 기울기의 평균값
정밀성은 정해진 조건에서 여러 번 반복하여 얻어진 측정치 간의 일치도의 근접성(분산 정도)을 나타낸다. 이를 측정하기 위해 일내(intra-day) 분석은 1일 6구간 분석하였고 일간(inter-day) 분석은 1일 1구간 6일간 분석하여 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 통해 정밀성을 확인하였다.
모든 실험은 3회 반복하였으며, 통계분석은 SPSS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, ver. 27, SPSS Inc.)과 R studio(R version 4.3.3)를 이용하였다. 각 측정군의 평균과 표준편차를 산출하고, 차이 유무를 one-way analysis of variance(ANOVA)로 분석한 뒤 시료 간의 유의적 차이가 나타난 경우, Tukey 방법으로 사후 검정을 실시하였다. 또한 재배 지역 간 β-CRX 함량의 유의적 차이를 분석하기 위해 독립 표본
감귤의 β-CRX 분석을 위해 선정한 UPLC 분석법을 검증하기 위해 특이성, 직선성, 검출한계, 정량한계 및 정밀성을 분석하였다. 특이성 검증을 위해 궁천조생 추출물과 β-CRX의 UPLC chromatogram을 비교하였을 때 다른 물질의 간섭 없이 β-CRX가 선택적으로 분리되었고 머무름시간이 일치하는 것을 확인하였다(Fig. 1). 직선성은 감귤 내 β-CRX 농도가 포함되는 구간으로 선정하여 검량선을 분석하였고 그 결과 linear regression equation은 y=55,921x+4,487.7이었으며 상관계수(R2)는 0.9998을 나타내어 우수한 수준의 직선성을 확인하였다(Table 1). 검출한계와 정량한계를 확인하기 위해 위 과정에서 도출된 검량선의 기울기와 y 절편을 이용하여 계산한 결과, 검출한계는 0.82 μg/mL, 정량한계는 2.49 μg/mL로 나타났다. Pinheiro-Sant’Ana 등(2019)이 수행한 HPLC-DAD-APCI-MS 장비를 활용한 β-CRX 분석법 검증 결과, 검출한계와 정량한계는 각각 0.10 및 0.33 ppm 수준으로 본 실험 결과에 비해 낮은 검출한계와 정량한계를 보였다. 이는 분석에 활용한 검출기의 종류와 감도에 의한 차이일 것으로 판단된다. 정밀도를 분석하기 위해 일내 및 일간 분석을 실시한 결과, 일내 및 일간 분석의 RSD 값은 4.33%, 7.94%로 확인되었다. 식품의약품안전평가원에 따르면 일반 실험실 method validation의 정밀도 판정기준은 RSD 값이 ±20%일 때 만족한다고 명시되어 있으며, 식품분야 method validation은 일내 및 일간 분석의 RSD 값이 ±20%일 때 만족한다고 명시되어 있다(NIFDS, 2015). 전체적인 분석법 검증 결과를 보았을 때 식품의약품안전평가원 기준에 적합하였기에 선정된 분석법을 이용하여 감귤 샘플의 β-CRX 함량 분석을 진행하였다.
Table 1 . Validation parameters of the developed UPLC analysis for β-CRX
β-CRX | ||
---|---|---|
Regression equation | y=55,921x+4,487.7 | |
Correlation coefficient (R2) | 0.9998 | |
LOD1) (μg/mL) | 0.82 | |
LOQ2) (μg/mL) | 2.49 | |
Intra-day (n=6) | Mean±SD (μg/100 g, FW) | 2,151.02±93.07 |
RSD3) (%) | 4.33 | |
Inter-day (n=6) | Mean±SD (μg/100 g, FW) | 2,207.57±175.32 |
RSD (%) | 7.94 |
1)Limit of detection.
2)Limit of quantification.
3)Relative standard deviation.
감귤 품종 간 β-CRX 함량을 분석하기 위해 9품종을 샘플링 하였으며, 조생종인 궁천조생, 하례조생, 흥진조생, 극조생인 유라조생, 일남1호, 그리고 만감류인 신예감, 황금향, 천혜향, 그리고 한라봉을 분석하였다(Table 2). β-CRX 분석 결과 조생종 품종인 궁천조생과 하례조생, 흥진조생의 β-CRX 함량이 유의적으로(
Table 2 . Content of β-CRX from citrus varieties
Cultivar group | Sample name | Scientific name | Abbr. | β-CRX (μg/100 g, FW) |
---|---|---|---|---|
Satsuma mandarin | Gungcheon-josaeng Harye-josaeng Heungjin-josaeng Yura-josaeng Ilnam 1 ho | Citrus unshiu ‘Miyagawa-wase’ Citrus unshiu ‘Harye-josaeng’ Citrus unshiu ‘Okitsu-wase’ Citrus unshiu ‘Yuja-wase’ Citrus unshiu ‘Nichinan no.1’ | GJ HJ HG YJ IJ | 1,937.32±98.79a1) 2,036.02±89.46a 1,963.23±38.80a 1,709.15±95.36b 1,206.45±7.13c |
Tangor | Shinyegam Hwanggeumhyang Cheonhyehyang Hallabong | Citrus spp. ‘Shinyegam’ Citrus hybrid ‘Beni madonna’ Citrus hybrid ‘Setoka’ Citrus hybrid ‘Shiranuhi’ | SG HH CH HB | 624.02±5.39e 842.23±79.71d 752.30±86.23d 472.27±3.67f |
1)Statistical analyses were performed by Tukey’s method. Values are the mean±SD of three replication.
제주시(9개 농가)와 서귀포시(28개 농가) 소재 감귤 재배 농가로부터 궁천조생 품종을 샘플링하여 β-CRX 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같다. 제주시에서 재배된 감귤의 β-CRX 함량은 940~1,773 μg/100 g FW 범위로 나타났고, 평균 함량은 1,259.79 μg/100 g FW였다. 서귀포시에서 재배된 감귤의 β-CRX 함량은 635~1,938 μg/100 g FW였으며, 평균 함량은 1,230.53 μg/100 g FW였다. 감귤 재배 농가 간 β-CRX 함량 변이는 큰 것으로 나타났으며, β-CRX 함량이 1,000 μg/100 g FW 미만은 8개 농가, 1,000~1,500 μg/100 g FW 범위는 21개 농가, 1,500 μg/100 g FW 초과는 8개 농가가 분포되어 있었다. 농산물의 영양・기능 성분의 함량 변이 발생원인 중 하나는 재배 지역이며, 우리나라의 대표적인 과일인 복숭아와 사과의 경우 재배 지역에 따른 영양・기능 성분 함량 차가 나타난 것으로 보고된 바 있다(Kim 등, 2021a, 2021b). 우리나라의 경우 대부분의 감귤류가 제주시와 서귀포시로부터 재배되기 때문에 두 지역 간의 유의적인 함량 차이가 나타날 것으로 추정되었으나 본 분석 결과, 서귀포시와 제주시 농가에 따른 β-CRX 함량의 유의적인 함량 차이는 없는 것으로 확인되었다.
Table 3 . Content of β-CRX from Gungcheon-josaeng in farms of Jeju-si and Seogwipo-si
City | Farm name | β-CRX (μg/100 g, FW) | RSD | |
---|---|---|---|---|
Jeju | JJ1 JJ2 JJ3 JJ4 JJ5 JJ6 JJ7 JJ8 JJ9 | 1,499.84±86.04b1) 1,314.86±39.93bcd 1,369.15±32.36bc 940.79±38.02e 1,146.22±35.79cde 1,098.74±19.98de 1,146.95±63.45cde 1,047.65±2.63e 1,773.94±128.70a | 5.74 3.04 2.36 4.04 3.12 1.82 5.53 0.25 7.26 | <0.001 |
Mean | 1,259.79±258.67 | |||
Seogwipo | SG1 SG2 SG3 SG4 SG5 SG6 SG7 SG8 SG9 SG10 SG11 SG12 SG13 SG14 SG15 SG16 SG17 SG18 SG19 SG20 SG21 SG22 SG23 SG24 SG25 SG26 SG27 SG28 | 1,787.92±64.26ab 1,561.58±84.00bcd 1,578.64±30.86bcd 1,365.01±95.91defgh 1,530.97±39.47cde 1,038.54±25.18ij 1,158.39±92.83ghi 1,301.50±99.37efgh 1,167.08±7.81ghi 1,444.98±85.93cde 1,303.97±81.30efgh 1,174.07±54.45fghi 1,418.62±116.92cdef 1,938.16±93.33a 808.34±2109jk 1,407.17±18.70cdefg 1,119.32±35.51hi 1,633.82±10.76bc 823.24±3.10jk 708.69±0.41k 1,311.12±102.00efgh 1,298.12±32.96efgh 1,639.00±6.89bc 635.76±41.57k 646.82±38.05k 768.59±25.09k 698.97±44.65k 1,186.45±49.92fghi | 3.59 5.38 1.95 7.03 2.58 2.42 8.01 7.64 0.67 5.95 6.23 4.64 8.24 4.82 2.61 1.33 3.17 0.66 0.38 0.06 7.78 2.54 0.42 6.54 5.88 3.26 6.39 4.21 | <0.001 |
Mean | 1,230.53±359.25 | |||
Total | 0.7502) |
1)The differences in β-CRX content among the samples from each region were analyzed using the Tukey’s method.
2)The statistical significance of the β-CRX content between the two cities was performed by independent
37개의 궁천조생 품종 시료 재배지의 위도, 경도, 고도에 따른 β-CRX 함량을 산점도로 시각화한 결과는 Fig. 2와 같다. 가로축은 경도, 세로축은 위도이며, 재배지의 고도가 높을수록 각 점의 색상을 진하게 표기하였으며, β-CRX 함량이 많을수록 점의 크기를 크게 나타내었다. 37개의 농가 중 9개가 제주시에, 28개가 서귀포시에 위치하여 도표상의 점들이 주로 하단에 분포해 있다. 제주시 지역 9개 농가의 평균 위도는 33.46°N, 서귀포시 지역 28개 농가의 평균 위도는 33.29°N으로 제주시 지역 농가가 유의적으로 더 높게 나타났다(
NIAS(2022)의 작물별 비료사용처방에 따르면 감귤 재배를 위한 적합 토양 화학성 조건은 pH 산도(1:5) 5.5~6.5, 유기물 21~50 g/kg(화산회토양인 4067의 경우 101~150 g/kg), 유효인산은 200~300 mg/kg, 교환성 칼륨 0.50~0.70 cmolc/kg이며, 토양 검정 결과에 따라 사용하는 토양개량제 및 퇴비의 종류와 양을 달리해야 한다고 보고하였다. Bojović과 Stojanović(2005)의 연구에서는 비료 사용 여부와 종류 따른 밀의 클로로필(chlorophyll)과 카로티노이드 함량을 조사하였으며, 비료를 사용하지 않아 비옥도가 낮은 토양에서는 두 함량이 모두 낮았으나 질소와 인산 함유 비료에서 높은 함량을 보였다. 제주 지역 내에서의 궁천조생 감귤의 β-CRX 함량 차이는 재배 지역의 지리적 위치보다 토양화학 성분이나 시비량 및 종류 차이일 수 있음을 암시한다.
Kato 등(2004)에 따르면 감귤류는 식이성 β-CRX의 풍부한 공급원이며, 온주밀감의 총 카로티노이드 중 80% 이상을 차지한다고 밝혔다. 또한 β-CRX는 다른 주요 카로티노이드보다 생체 이용률이 높은 것으로 알려져 있기에(Sugiura 등, 2014), 건강기능식품 소재로서 감귤류의 이용성을 증진시키기 위해 감귤류의 β-CRX 함량 정보 구축이 이루어져야 할 것으로 생각된다. 또한, 기능 성분 함량 변이에 관한 선행 연구 자료들을 토대로 재배 품종, 재배 조건, 지역 등에 따른 국내산 감귤류의 β-CRX 함량 변이 분석이 필요할 것으로 생각되며, 궁천조생 이외의 품종과 다른 시트러스과 작물로 연구 범위를 넓힌 후 국내산 소재의 β-CRX 데이터베이스를 구축한다면 국내산 감귤류의 우수성을 알리고 경쟁력을 높일 수 있을 것으로 생각된다.
본 연구는 감귤류의 β-CRX 함량 정보 구축을 위해 우리나라에서 재배되는 조생종인 궁천조생, 하례조생, 흥진조생과 극조생인 유라조생, 일남1호, 그리고 만감류인 신예감, 황금향, 천혜향, 한라봉을 샘플링 후 분석법을 선정하였다. 또한 우리나라의 대표적인 감귤 품종인 궁천조생을 제주시와 서귀포시로부터 샘플링하여 β-CRX 함량을 분석하였다. 신뢰성 있는 분석을 진행하기 위해 분석법 검증을 실시한 결과, 우수한 직선성과 특이성을 확인하였으며 검출한계와 정량한계는 각각 0.82, 2.49 μg/mL로 나타났다. 정밀성 분석을 위한 일내 및 일간 분석의 RSD 값은 4.33%, 7.94%로 확인하였으며, 모든 수치는 식품의약품안전평가원의 기준에 충족하여 본 분석법의 신뢰성 확보 후 분석을 진행하였다. 9종의 품종으로부터 β-CRX 함량을 분석한 결과, 만감류보다 조생종 품종의 β-CRX 함량이 높음을 확인하였으며, 특히 궁천조생, 하례조생, 흥진조생이 유의적으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 추가로 제주시 9개 농가와 서귀포시 28개 농가로부터 재배된 궁천조생 품종 감귤의 β-CRX 함량을 분석하였다. 그 결과 제주시와 서귀포시 궁천조생의 평균 β-CRX 함량은 각각 1,259.79와 1,230.53 μg/100 g FW로 지역 간 β-CRX 함량은 비슷하였다. 검증된 분석법으로 수행되어 본 데이터의 신뢰도가 확보되었기에 이를 토대로 재배 지역의 토양화학 성분과 시비량 등 추가적인 연구를 진행한다면 추후 감귤류의 카로티노이드 데이터베이스로 활용하고 β-CRX 함유 감귤 재배를 위한 토양 조건을 확립할 수 있을 것이다.
본 연구는 2022년도 농촌진흥청 연구사업(과제번호: PJ01514402)에 의해 이루어진 것임.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(10): 1007-1013
Published online October 31, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.10.1007
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
김지영․김슬기․황인국
농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부
Ji Yeong Kim , Seulgi Kim , and In Guk Hwang
Department of Agrofood Resources, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration
Correspondence to:In Guk Hwang, Department of Agrofood Resources, National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration, 166, Nongsaengmyeong-ro, Iseo-myeon, Wanju-gun, Jeonbuk 55365, Korea, E-mail: ighwang79@korea.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
β-Cryptoxanthin (β-CRX) is a carotenoid that has received increasing attention due to its high availability and functionality in the human body. Unlike other vegetables and fruits, β-CRX is particularly abundant in citrus fruits. Therefore, the objective of this study was to validate an analytical method for β-CRX and determine its content in domestic citrus varieties. The results demonstrated that Gungcheon-josaeng, Harye-josaeng, and Hongjin-josaeng exhibited significantly higher levels of content compared to other varieties. The β-CRX content of the Gungcheon-josaeng samples (n=37) collected from Jeju-si and Seogwipo-si exhibited an average content of 1,259 and 1,230 μg/100 g FW, respectively, with no significant difference observed between the contents of the samples from the two regions. Although β-CRX is an important functional compound in mandarin, which belongs to the citrus family, data on the β-CRX content of citrus grown in Korea are scarce. Therefore, further research is needed to establish the production conditions of high β-CRX-containing citrus. This study will serve as a basis for future research.
Keywords: citrus, Satsuma Mandarin, Gungcheon-josaeng, β-cryptoxanthin, UPLC
감귤(
β-CRX는 하나의 β 고리에 수산기가 있는 (3R)-β,β-caroten-3-ol 구조로 되어 있어 β-carotene의 monohydroxyl 유도체로 알려져 있다(Jiao 등, 2019). 이로 인해 β-CRX는 β-carotene과 유사한 화학적 구조와 생리활성을 가지나, 식물 노화 및 과일 숙성 동안 에스테르화가 유발되어 α-carotene, β-carotene 같은 주요 카로티노이드보다 생체이용률이 더 높다고 보고되어 있다. 일본 식품성분표준표에 따르면 β-CRX 고함유 식품으로는 고추, 피망, 감, 파프리카, 감귤 순으로 높다고 보고되어 있다(MEXT, 2015). 또한 Holden 등(1999)의 카로티노이드 데이터베이스에 의하면 감귤은 포도, 복숭아, 라즈베리, 사과, 토마토 등과 비교하였을 때 월등히 높은 β-CRX 함량을 나타냈으며, Jiao 등(2019)은 다른 카로티노이드와 달리 β-CRX는 몇몇 과일과 채소에만 풍부하며, 이 중 감귤은 β-CRX 고함유 식품으로 보고하였다. Yamaguchi 등(2006)은 감귤 섭취의 골 형성 자극 및 골 흡수 저해에 대한 임상 효과를 밝혔고, Tanaka 등(2012)은 감귤의 항암효과를 보고한 바 있는데, 이들은 감귤의 β-CRX 성분으로부터 기인하였음을 규명하였다. 최근 Kim 등(2021c)은 체계적 문헌 고찰과 메타분석을 통해 β-CRX의 골다공증 위험 감소 효과를 보고한 바 있다. 또한, 농산물의 기능성 표시를 허용한 일본의 경우 감귤의 기능성 관여 성분으로 β-CRX를 선정하였고 현재 뼈 건강 유지 도움 기능성을 표기하여 판매하고 있다.
현재 일본 및 세계 각국에서는 감귤의 플라보노이드류, 카로티노이드류 등 감귤의 기능 성분 함량 정보 구축 연구를 진행하고 있으나(Chung 등, 2000), 우리나라의 경우 다생산・다소비 과일임에도 불구하고 감귤의 주요 기능성분인 β-CRX 성분 함량 정보 구축 연구가 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 감귤 품종(9종)과 재배 지역별 궁천조생 품종의 β-CRX 함량 정보를 제공하고자 하였다. 또한 β-CRX 함량 분석 결과의 정확성과 신뢰성을 확보하고자 분석법 검증을 시행하였다.
본 연구에 사용된 감귤 품종 9종(궁천조생, 하례조생, 흥진조생, 유라조생, 일남1호, 신예감, 황금향, 천혜향, 한라봉)은 2019년 제주도에서 구매하여 사용하였다. 이 중 β-CRX 함량이 높고 국내 재배량이 많은 궁천조생 감귤 품종을 대상으로 2020년에 제주시 소재 9개 농가와 서귀포시 소재 28개 농가에서 구입하여 분석용 시료로 사용하였다. 감귤 시료는 껍질을 제거한 다음 동결 건조하여 분쇄(Ninja 1000 Watts, Hai Xin Technology Company)하였고 최종 30 mesh 체를 통과시킨 후 균질화하여 -20°C에서 보관하여 사용하였다. β-CRX는 Extrasynthese에서 구입하였고, 그 밖의 시약은 analytical 및 HPLC 등급을 사용하였다.
감귤의 β-CRX 함량 분석을 위한 추출물 제조를 위해 건강기능식품공전 시험법을 참고하였으며, 시료 0.20±0.05 g을 50 mL conical tube에 넣고 추출용매인 6% pyrogallol ethanol 용액을 10 mL 가한 후 80°C의 water bath(Daihan Scientific)에서 150 rpm으로 15분간 추출하였다. 10분간 냉각 후 추출액에 검화용매인 80% KOH 용액 3 mL를 넣고 water bath(150 rpm)에서 15분간 비누화 반응 후 10분간 냉각하였다. 반응이 정지된 샘플에 증류수 5 mL와 n-hexane 10 mL를 넣어 추출 후 1,750×
UPLC 분석 조건은 Kim 등(2021b)의 조건을 사용하였다. UPLC는 Waters ACQUITYTM Ultra Performance LC(Waters)를 사용하였고 컬럼은 HALO® C30(160A, 2.7 μm, 3.0×150 mm, Halo Advanced Materials Technology)을 사용하였다. 이동상은 A 용매(메탄올)와 B 용매(에탄올)를 gradient 조건으로 흘려주었고, gradient 조건은 20분간 2%에서 40% B용매로 변경하여 분석하였다. 유속은 0.65 mL/min으로 하였고, 시료 5 μL를 주입하여 UV detector로 471 nm에서 분석하였다.
본 연구실 조건으로 신뢰성 있는 분석을 수행하기 위해 특이성(specificity), 직선성(linearity), 검출한계(limits of detection, LOD), 정량한계(limits of quantification, LOQ), 정밀성(precision)을 분석하여 분석법의 유효성을 검증하고자 하였다. 특이성은 감귤 추출물과 표준용액에서 해당 성분에 대한 머무름시간(retention time) 및 UV spectrum 패턴이 일치하는 것을 확인하였다. 또한, 분리된 β-CRX의 피크가 다른 화합물의 간섭 없이 분리됨을 확인하였다(Fig. 1). 직선성 검증을 위해 β-CRX를 1.17, 2.33, 4.66, 9.33, 18.65 μg/mL 농도로 단계 희석하여 6회 반복 측정하였다. 피크 면적과 시료 농도 데이터를 이용하여 검량선을 작성하고 linear regression equation(y=ax+b; y: peak 면적, x: 시료 농도, a: 직선의 기울기, b: y 절편)을 구하였으며 산출된 상관계수(R2)를 확인하여 직선성을 검토하였다. 직선성 검증을 통해 얻은 검량선의 기울기 평균값과 y 절편에 대한 표준편차를 이용하여 검출한계와 정량한계를 계산하였다.
정량한계(LOQ)=10×y 절편의 표준편차/검량선 기울기의 평균값
검출한계(LOD)=3.3×y 절편의 표준편차/검량선 기울기의 평균값
정밀성은 정해진 조건에서 여러 번 반복하여 얻어진 측정치 간의 일치도의 근접성(분산 정도)을 나타낸다. 이를 측정하기 위해 일내(intra-day) 분석은 1일 6구간 분석하였고 일간(inter-day) 분석은 1일 1구간 6일간 분석하여 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 통해 정밀성을 확인하였다.
모든 실험은 3회 반복하였으며, 통계분석은 SPSS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, ver. 27, SPSS Inc.)과 R studio(R version 4.3.3)를 이용하였다. 각 측정군의 평균과 표준편차를 산출하고, 차이 유무를 one-way analysis of variance(ANOVA)로 분석한 뒤 시료 간의 유의적 차이가 나타난 경우, Tukey 방법으로 사후 검정을 실시하였다. 또한 재배 지역 간 β-CRX 함량의 유의적 차이를 분석하기 위해 독립 표본
감귤의 β-CRX 분석을 위해 선정한 UPLC 분석법을 검증하기 위해 특이성, 직선성, 검출한계, 정량한계 및 정밀성을 분석하였다. 특이성 검증을 위해 궁천조생 추출물과 β-CRX의 UPLC chromatogram을 비교하였을 때 다른 물질의 간섭 없이 β-CRX가 선택적으로 분리되었고 머무름시간이 일치하는 것을 확인하였다(Fig. 1). 직선성은 감귤 내 β-CRX 농도가 포함되는 구간으로 선정하여 검량선을 분석하였고 그 결과 linear regression equation은 y=55,921x+4,487.7이었으며 상관계수(R2)는 0.9998을 나타내어 우수한 수준의 직선성을 확인하였다(Table 1). 검출한계와 정량한계를 확인하기 위해 위 과정에서 도출된 검량선의 기울기와 y 절편을 이용하여 계산한 결과, 검출한계는 0.82 μg/mL, 정량한계는 2.49 μg/mL로 나타났다. Pinheiro-Sant’Ana 등(2019)이 수행한 HPLC-DAD-APCI-MS 장비를 활용한 β-CRX 분석법 검증 결과, 검출한계와 정량한계는 각각 0.10 및 0.33 ppm 수준으로 본 실험 결과에 비해 낮은 검출한계와 정량한계를 보였다. 이는 분석에 활용한 검출기의 종류와 감도에 의한 차이일 것으로 판단된다. 정밀도를 분석하기 위해 일내 및 일간 분석을 실시한 결과, 일내 및 일간 분석의 RSD 값은 4.33%, 7.94%로 확인되었다. 식품의약품안전평가원에 따르면 일반 실험실 method validation의 정밀도 판정기준은 RSD 값이 ±20%일 때 만족한다고 명시되어 있으며, 식품분야 method validation은 일내 및 일간 분석의 RSD 값이 ±20%일 때 만족한다고 명시되어 있다(NIFDS, 2015). 전체적인 분석법 검증 결과를 보았을 때 식품의약품안전평가원 기준에 적합하였기에 선정된 분석법을 이용하여 감귤 샘플의 β-CRX 함량 분석을 진행하였다.
Table 1 . Validation parameters of the developed UPLC analysis for β-CRX.
β-CRX | ||
---|---|---|
Regression equation | y=55,921x+4,487.7 | |
Correlation coefficient (R2) | 0.9998 | |
LOD1) (μg/mL) | 0.82 | |
LOQ2) (μg/mL) | 2.49 | |
Intra-day (n=6) | Mean±SD (μg/100 g, FW) | 2,151.02±93.07 |
RSD3) (%) | 4.33 | |
Inter-day (n=6) | Mean±SD (μg/100 g, FW) | 2,207.57±175.32 |
RSD (%) | 7.94 |
1)Limit of detection..
2)Limit of quantification..
3)Relative standard deviation..
감귤 품종 간 β-CRX 함량을 분석하기 위해 9품종을 샘플링 하였으며, 조생종인 궁천조생, 하례조생, 흥진조생, 극조생인 유라조생, 일남1호, 그리고 만감류인 신예감, 황금향, 천혜향, 그리고 한라봉을 분석하였다(Table 2). β-CRX 분석 결과 조생종 품종인 궁천조생과 하례조생, 흥진조생의 β-CRX 함량이 유의적으로(
Table 2 . Content of β-CRX from citrus varieties.
Cultivar group. | Sample name. | Scientific name. | Abbr.. | β-CRX (μg/100 g, FW). |
---|---|---|---|---|
Satsuma mandarin. | Gungcheon-josaeng. Harye-josaeng. Heungjin-josaeng. Yura-josaeng. Ilnam 1 ho. | Citrus unshiu ‘Miyagawa-wase’. Citrus unshiu ‘Harye-josaeng’. Citrus unshiu ‘Okitsu-wase’. Citrus unshiu ‘Yuja-wase’. Citrus unshiu ‘Nichinan no.1’. | GJ. HJ. HG. YJ. IJ. | 1,937.32±98.79a1). 2,036.02±89.46a. 1,963.23±38.80a. 1,709.15±95.36b. 1,206.45±7.13c. |
Tangor. | Shinyegam. Hwanggeumhyang. Cheonhyehyang. Hallabong. | Citrus spp. ‘Shinyegam’. Citrus hybrid ‘Beni madonna’. Citrus hybrid ‘Setoka’. Citrus hybrid ‘Shiranuhi’. | SG. HH. CH. HB. | 624.02±5.39e. 842.23±79.71d. 752.30±86.23d. 472.27±3.67f. |
1)Statistical analyses were performed by Tukey’s method. Values are the mean±SD of three replication..
제주시(9개 농가)와 서귀포시(28개 농가) 소재 감귤 재배 농가로부터 궁천조생 품종을 샘플링하여 β-CRX 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같다. 제주시에서 재배된 감귤의 β-CRX 함량은 940~1,773 μg/100 g FW 범위로 나타났고, 평균 함량은 1,259.79 μg/100 g FW였다. 서귀포시에서 재배된 감귤의 β-CRX 함량은 635~1,938 μg/100 g FW였으며, 평균 함량은 1,230.53 μg/100 g FW였다. 감귤 재배 농가 간 β-CRX 함량 변이는 큰 것으로 나타났으며, β-CRX 함량이 1,000 μg/100 g FW 미만은 8개 농가, 1,000~1,500 μg/100 g FW 범위는 21개 농가, 1,500 μg/100 g FW 초과는 8개 농가가 분포되어 있었다. 농산물의 영양・기능 성분의 함량 변이 발생원인 중 하나는 재배 지역이며, 우리나라의 대표적인 과일인 복숭아와 사과의 경우 재배 지역에 따른 영양・기능 성분 함량 차가 나타난 것으로 보고된 바 있다(Kim 등, 2021a, 2021b). 우리나라의 경우 대부분의 감귤류가 제주시와 서귀포시로부터 재배되기 때문에 두 지역 간의 유의적인 함량 차이가 나타날 것으로 추정되었으나 본 분석 결과, 서귀포시와 제주시 농가에 따른 β-CRX 함량의 유의적인 함량 차이는 없는 것으로 확인되었다.
Table 3 . Content of β-CRX from Gungcheon-josaeng in farms of Jeju-si and Seogwipo-si.
City. | Farm name. | β-CRX. (μg/100 g, FW). | RSD. | |
---|---|---|---|---|
Jeju. | JJ1. JJ2. JJ3. JJ4. JJ5. JJ6. JJ7. JJ8. JJ9. | 1,499.84±86.04b1). 1,314.86±39.93bcd. 1,369.15±32.36bc. 940.79±38.02e. 1,146.22±35.79cde. 1,098.74±19.98de. 1,146.95±63.45cde. 1,047.65±2.63e. 1,773.94±128.70a. | 5.74. 3.04. 2.36. 4.04. 3.12. 1.82. 5.53. 0.25. 7.26. | <0.001. |
Mean. | 1,259.79±258.67. | |||
Seogwipo. | SG1. SG2. SG3. SG4. SG5. SG6. SG7. SG8. SG9. SG10. SG11. SG12. SG13. SG14. SG15. SG16. SG17. SG18. SG19. SG20. SG21. SG22. SG23. SG24. SG25. SG26. SG27. SG28. | 1,787.92±64.26ab. 1,561.58±84.00bcd. 1,578.64±30.86bcd. 1,365.01±95.91defgh. 1,530.97±39.47cde. 1,038.54±25.18ij. 1,158.39±92.83ghi. 1,301.50±99.37efgh. 1,167.08±7.81ghi. 1,444.98±85.93cde. 1,303.97±81.30efgh. 1,174.07±54.45fghi. 1,418.62±116.92cdef. 1,938.16±93.33a. 808.34±2109jk. 1,407.17±18.70cdefg. 1,119.32±35.51hi. 1,633.82±10.76bc. 823.24±3.10jk. 708.69±0.41k. 1,311.12±102.00efgh. 1,298.12±32.96efgh. 1,639.00±6.89bc. 635.76±41.57k. 646.82±38.05k. 768.59±25.09k. 698.97±44.65k. 1,186.45±49.92fghi. | 3.59. 5.38. 1.95. 7.03. 2.58. 2.42. 8.01. 7.64. 0.67. 5.95. 6.23. 4.64. 8.24. 4.82. 2.61. 1.33. 3.17. 0.66. 0.38. 0.06. 7.78. 2.54. 0.42. 6.54. 5.88. 3.26. 6.39. 4.21. | <0.001. |
Mean. | 1,230.53±359.25. | |||
Total. | 0.7502). |
1)The differences in β-CRX content among the samples from each region were analyzed using the Tukey’s method..
2)The statistical significance of the β-CRX content between the two cities was performed by independent
37개의 궁천조생 품종 시료 재배지의 위도, 경도, 고도에 따른 β-CRX 함량을 산점도로 시각화한 결과는 Fig. 2와 같다. 가로축은 경도, 세로축은 위도이며, 재배지의 고도가 높을수록 각 점의 색상을 진하게 표기하였으며, β-CRX 함량이 많을수록 점의 크기를 크게 나타내었다. 37개의 농가 중 9개가 제주시에, 28개가 서귀포시에 위치하여 도표상의 점들이 주로 하단에 분포해 있다. 제주시 지역 9개 농가의 평균 위도는 33.46°N, 서귀포시 지역 28개 농가의 평균 위도는 33.29°N으로 제주시 지역 농가가 유의적으로 더 높게 나타났다(
NIAS(2022)의 작물별 비료사용처방에 따르면 감귤 재배를 위한 적합 토양 화학성 조건은 pH 산도(1:5) 5.5~6.5, 유기물 21~50 g/kg(화산회토양인 4067의 경우 101~150 g/kg), 유효인산은 200~300 mg/kg, 교환성 칼륨 0.50~0.70 cmolc/kg이며, 토양 검정 결과에 따라 사용하는 토양개량제 및 퇴비의 종류와 양을 달리해야 한다고 보고하였다. Bojović과 Stojanović(2005)의 연구에서는 비료 사용 여부와 종류 따른 밀의 클로로필(chlorophyll)과 카로티노이드 함량을 조사하였으며, 비료를 사용하지 않아 비옥도가 낮은 토양에서는 두 함량이 모두 낮았으나 질소와 인산 함유 비료에서 높은 함량을 보였다. 제주 지역 내에서의 궁천조생 감귤의 β-CRX 함량 차이는 재배 지역의 지리적 위치보다 토양화학 성분이나 시비량 및 종류 차이일 수 있음을 암시한다.
Kato 등(2004)에 따르면 감귤류는 식이성 β-CRX의 풍부한 공급원이며, 온주밀감의 총 카로티노이드 중 80% 이상을 차지한다고 밝혔다. 또한 β-CRX는 다른 주요 카로티노이드보다 생체 이용률이 높은 것으로 알려져 있기에(Sugiura 등, 2014), 건강기능식품 소재로서 감귤류의 이용성을 증진시키기 위해 감귤류의 β-CRX 함량 정보 구축이 이루어져야 할 것으로 생각된다. 또한, 기능 성분 함량 변이에 관한 선행 연구 자료들을 토대로 재배 품종, 재배 조건, 지역 등에 따른 국내산 감귤류의 β-CRX 함량 변이 분석이 필요할 것으로 생각되며, 궁천조생 이외의 품종과 다른 시트러스과 작물로 연구 범위를 넓힌 후 국내산 소재의 β-CRX 데이터베이스를 구축한다면 국내산 감귤류의 우수성을 알리고 경쟁력을 높일 수 있을 것으로 생각된다.
본 연구는 감귤류의 β-CRX 함량 정보 구축을 위해 우리나라에서 재배되는 조생종인 궁천조생, 하례조생, 흥진조생과 극조생인 유라조생, 일남1호, 그리고 만감류인 신예감, 황금향, 천혜향, 한라봉을 샘플링 후 분석법을 선정하였다. 또한 우리나라의 대표적인 감귤 품종인 궁천조생을 제주시와 서귀포시로부터 샘플링하여 β-CRX 함량을 분석하였다. 신뢰성 있는 분석을 진행하기 위해 분석법 검증을 실시한 결과, 우수한 직선성과 특이성을 확인하였으며 검출한계와 정량한계는 각각 0.82, 2.49 μg/mL로 나타났다. 정밀성 분석을 위한 일내 및 일간 분석의 RSD 값은 4.33%, 7.94%로 확인하였으며, 모든 수치는 식품의약품안전평가원의 기준에 충족하여 본 분석법의 신뢰성 확보 후 분석을 진행하였다. 9종의 품종으로부터 β-CRX 함량을 분석한 결과, 만감류보다 조생종 품종의 β-CRX 함량이 높음을 확인하였으며, 특히 궁천조생, 하례조생, 흥진조생이 유의적으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 추가로 제주시 9개 농가와 서귀포시 28개 농가로부터 재배된 궁천조생 품종 감귤의 β-CRX 함량을 분석하였다. 그 결과 제주시와 서귀포시 궁천조생의 평균 β-CRX 함량은 각각 1,259.79와 1,230.53 μg/100 g FW로 지역 간 β-CRX 함량은 비슷하였다. 검증된 분석법으로 수행되어 본 데이터의 신뢰도가 확보되었기에 이를 토대로 재배 지역의 토양화학 성분과 시비량 등 추가적인 연구를 진행한다면 추후 감귤류의 카로티노이드 데이터베이스로 활용하고 β-CRX 함유 감귤 재배를 위한 토양 조건을 확립할 수 있을 것이다.
본 연구는 2022년도 농촌진흥청 연구사업(과제번호: PJ01514402)에 의해 이루어진 것임.
Table 1 . Validation parameters of the developed UPLC analysis for β-CRX.
β-CRX | ||
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Regression equation | y=55,921x+4,487.7 | |
Correlation coefficient (R2) | 0.9998 | |
LOD1) (μg/mL) | 0.82 | |
LOQ2) (μg/mL) | 2.49 | |
Intra-day (n=6) | Mean±SD (μg/100 g, FW) | 2,151.02±93.07 |
RSD3) (%) | 4.33 | |
Inter-day (n=6) | Mean±SD (μg/100 g, FW) | 2,207.57±175.32 |
RSD (%) | 7.94 |
1)Limit of detection..
2)Limit of quantification..
3)Relative standard deviation..
Table 2 . Content of β-CRX from citrus varieties.
Cultivar group. | Sample name. | Scientific name. | Abbr.. | β-CRX (μg/100 g, FW). |
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Satsuma mandarin. | Gungcheon-josaeng. Harye-josaeng. Heungjin-josaeng. Yura-josaeng. Ilnam 1 ho. | Citrus unshiu ‘Miyagawa-wase’. Citrus unshiu ‘Harye-josaeng’. Citrus unshiu ‘Okitsu-wase’. Citrus unshiu ‘Yuja-wase’. Citrus unshiu ‘Nichinan no.1’. | GJ. HJ. HG. YJ. IJ. | 1,937.32±98.79a1). 2,036.02±89.46a. 1,963.23±38.80a. 1,709.15±95.36b. 1,206.45±7.13c. |
Tangor. | Shinyegam. Hwanggeumhyang. Cheonhyehyang. Hallabong. | Citrus spp. ‘Shinyegam’. Citrus hybrid ‘Beni madonna’. Citrus hybrid ‘Setoka’. Citrus hybrid ‘Shiranuhi’. | SG. HH. CH. HB. | 624.02±5.39e. 842.23±79.71d. 752.30±86.23d. 472.27±3.67f. |
1)Statistical analyses were performed by Tukey’s method. Values are the mean±SD of three replication..
Table 3 . Content of β-CRX from Gungcheon-josaeng in farms of Jeju-si and Seogwipo-si.
City. | Farm name. | β-CRX. (μg/100 g, FW). | RSD. | |
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Jeju. | JJ1. JJ2. JJ3. JJ4. JJ5. JJ6. JJ7. JJ8. JJ9. | 1,499.84±86.04b1). 1,314.86±39.93bcd. 1,369.15±32.36bc. 940.79±38.02e. 1,146.22±35.79cde. 1,098.74±19.98de. 1,146.95±63.45cde. 1,047.65±2.63e. 1,773.94±128.70a. | 5.74. 3.04. 2.36. 4.04. 3.12. 1.82. 5.53. 0.25. 7.26. | <0.001. |
Mean. | 1,259.79±258.67. | |||
Seogwipo. | SG1. SG2. SG3. SG4. SG5. SG6. SG7. SG8. SG9. SG10. SG11. SG12. SG13. SG14. SG15. SG16. SG17. SG18. SG19. SG20. SG21. SG22. SG23. SG24. SG25. SG26. SG27. SG28. | 1,787.92±64.26ab. 1,561.58±84.00bcd. 1,578.64±30.86bcd. 1,365.01±95.91defgh. 1,530.97±39.47cde. 1,038.54±25.18ij. 1,158.39±92.83ghi. 1,301.50±99.37efgh. 1,167.08±7.81ghi. 1,444.98±85.93cde. 1,303.97±81.30efgh. 1,174.07±54.45fghi. 1,418.62±116.92cdef. 1,938.16±93.33a. 808.34±2109jk. 1,407.17±18.70cdefg. 1,119.32±35.51hi. 1,633.82±10.76bc. 823.24±3.10jk. 708.69±0.41k. 1,311.12±102.00efgh. 1,298.12±32.96efgh. 1,639.00±6.89bc. 635.76±41.57k. 646.82±38.05k. 768.59±25.09k. 698.97±44.65k. 1,186.45±49.92fghi. | 3.59. 5.38. 1.95. 7.03. 2.58. 2.42. 8.01. 7.64. 0.67. 5.95. 6.23. 4.64. 8.24. 4.82. 2.61. 1.33. 3.17. 0.66. 0.38. 0.06. 7.78. 2.54. 0.42. 6.54. 5.88. 3.26. 6.39. 4.21. | <0.001. |
Mean. | 1,230.53±359.25. | |||
Total. | 0.7502). |
1)The differences in β-CRX content among the samples from each region were analyzed using the Tukey’s method..
2)The statistical significance of the β-CRX content between the two cities was performed by independent
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