간은 혈액 응고 인자 fibrinogen을 생성하여 지혈을 돕고, 체내에 흡수된 비타민 A, D, B군과 철, 아연, 구리와 같은 무기질을 저장하여 대사 활동에 필요한 영양소를 공급한다(Deng 등, 2019; Lee 등, 2006). 또한, 해독, 단백질 합성, 담즙 생성 및 담석 예방과 같은 다양한 역할을 한다. 그러나 급격한 산업화에 따른 공해물질, 바이러스와 스트레스, 흡연, 음주 등의 요인으로 간질환의 발병률이 증가하고 있다(Kim, 2013). 간질환의 주요 유형에는 지방간, 간 섬유증, 간염, 간경변증 및 간암이 있으며, 특히 간 섬유증은 지속적인 염증 및 상처 치유 반응을 특징으로 하는 만성적인 간질환이다(Lee 등, 2021; Parola와 Pinzani, 2019). 간 섬유증은 반복되는 염증 반응 과정에서 간 성상세포(hepatic stellate cell, HSC)의 과도한 활성화로 인해 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 생성이 비정상적으로 늘어나면서 간세포에 collagen이 침착되어 발생하며, 일반적으로 가역적인 상태이다(Bataller와 Brenner, 2001). 그러나 이와 같은 상태가 지속되면 문맥압항진증, 간경화, 간부전, 간암 등 불가역적인 상태로 진행될 수 있다(Guo 등, 2024; Kisseleva와 Brenner, 2007; Yao 등, 2023). 따라서 간 섬유화 치료가 중요시 여겨지고 있다. 이에 thioacetamide(TAA)로 유발된 간 섬유화에서 산화적 스트레스와 지질 과산화를 효과적으로 억제하는 천연 소재에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

치자(Gardenia fructus)는 꼭두서니과에 속하는 치자나무의 열매이다. ≪신농본초경≫에 처음 기록되었으며, 해독, 해열, 진통, 부기 완화 효능이 있어 오랫동안 한약의 재료로 사용되었다(Chen 등, 2023; Kim 등, 2019). 또한 crocin, crocetin, terpene, organic acid 등 다양한 생리 활성 성분을 함유하며(Lv 등, 2024), 항균(Yim 등, 1999), 항염증(Koo 등, 2006), 항산화(Lim 등, 2008), 이담 및 이뇨(Wu 등, 2009)에 대한 효능이 입증되었다. 조구등(Uncaria rhynchophylla)은 꼭두서니과에 속하는 동속 근연식물로, 한방에서는 가시가 달린 어린 가지를 사용하며 고혈압과 동맥경화 치료제로 사용된다(Han 등, 2000). 주요 약리성분은 rhynchophylline과 isorhynchophylline을 포함한 alkaloid로, 진정 및 진경 작용을 통해 현기증과 두통 등 신경성 질환을 완화하며, polyphenol의 일종인 catechin이 함유되어 있어 혈압 상승 억제와 항산화에 도움을 준다(Tang과 Eisenbrand, 1992; Yamanaka 등, 1983). 치자와 조구등은 각각 단일 약재로써 TAA로 유발한 간 섬유화 동물 모델에 대한 간 보호 효과가 보고된 바 있다(Choi 등, 2021; Shin 등, 2021). 이에 치자와 조구등 복합물이 산화적 스트레스 완화 및 섬유증 개선에 효과가 있을 것으로 예상하여 실험을 진행하였으며, 유의한 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.

시료 추출

본 실험에서 사용한 치자와 조구등은 옹기한약국에서 구입하였으며, 생약 규격집에 맞추어 관능검사 후 약전규격에 적합한 것으로 정선하여 사용하였다. 치자와 조구등은 각각 100 g, 300 g에 10배수의 증류수를 넣고 열탕 추출기(Daewoong Bio, Inc.)를 사용하여 100°C에서 2시간 동안 끓여 추출하였다. 추출액은 여과 후 회전식 감압 농축기(Buchi Labortechnik AG)를 사용하여 농축하였고, 이후 동결건조기(Ilshin Biobase)로 건조하여 파우더 형태로 만들었다. 수율은 각각 치자 24.6%, 조구등 3.1%다.

시약

실험에 사용한 TAA, gallic acid, Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, quercetin, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), potassium persulfate, 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, phenyl methyl sulfonyl fluoride(PMSF)는 Sigma Aldrich Co.에서 구입하였다. Sodium carbonate와 potassium acetate는 Daejung Chemicals & Metals에서 구입하였고, aluminium chloride와 L-ascorbic acid는 Alfa Aesar에서 구입하였으며, Pierce^TM bicinchoninic acid protein assay kit은 Thermo Fisher Scientific에서 구입하여 사용하였다. Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에서 구입하였고, nitrocellulose membranes와 enhanced chemiluminescence(ECL) western blotting detection reagents는 Amersham GE Healthcare에서 구입하였다. 1차 항체인 gp91^phox, p22^phox, p47^phox, cyclooxygenase-2(Cox-2), matrix metalloproteinase-2(MMP-2), interleukin-1β(IL-1β), tissue inhibitor of metalloproteinases-2(TIMP-2), collagen type I alpha-1 chain(COL1A1), NF-κBp65, β-actin, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH), histone H3는 Santa Cruz Biotechnology Inc.에서 구입하였으며, 2차 항체는 GeneTex Inc.에서 구입하였다.

총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin Ciocalteu’s 방법으로 측정하였고(Ainsworth와 Gillespie, 2007), 총 플라보노이드 함량은 aluminium chloride 비색법으로 측정하였다(Rama 등, 2013). In vitro 실험에 사용된 세 가지 샘플은 치자 추출물, 조구등 추출물, 치자와 조구등의 1:2 복합물이다.

총 폴리페놀 함량을 측정하기 위해 각 샘플 100 μL와 10% Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, 7.5% sodium carbonate 400 μL를 e-tube에 넣고 혼합하여 30분 동안 차광 반응시켰다. 이후 microplate reader(Infinite M200 pro, Tecan)를 사용하여 765 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid를 사용하여 각 추출물의 총 폴리페놀[mg gallic acid equivalent(GAE)/g] 함량을 산출하였다. 총 플라보노이드 함량을 측정하기 위해 각 샘플 100 μL와 증류수 560 μL, 10% aluminium chloride solution 20 μL 및 1 M potassium acetate solution 20 μL를 e-tube에 넣고 혼합하여 30분 동안 차광 반응시켰다. 이후 microplate reader를 사용하여 415 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin을 사용하여 각 추출물의 총 플라보노이드[mg quercetin equivalents(QE)/g] 함량을 산출하였다.

DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성 분석

DPPH 자유라디칼 소거 활성은 Blois의 방법(1958)으로 측정하였고, ABTS 라디칼 소거 활성은 Re 등의 방법(1999)으로 측정하였다. In vitro 실험에 사용된 세 가지 샘플은 치자 추출물, 조구등 추출물, 치자와 조구등의 1:2 복합물이다.

DPPH 자유라디칼 소거 활성을 측정하기 위해 농도별로 희석한 샘플 100 μL와 60 μM DPPH 용액 100 μL를 96-well plate에 넣고 혼합한 후 30분 동안 차광 반응시켰다. 이후 microplate reader를 사용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 L-ascorbic acid를 사용하였으며, 추출물의 자유라디칼 소거 활성이 50%가 되는 농도를 IC₅₀값으로 표시하였다. ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하기 위해 7 mM ABTS 용액과 2.4 mM potassium persulfate를 혼합하여 약 16시간 이상 차광 반응시켜 ABTS⁺를 만든 후 30°C, 415 nm 파장에서 흡광도 0.70±0.02가 되도록 조절하였다. 농도별로 희석한 샘플 5 μL와 ABTS⁺ 95 μL를 96-well plate에 넣고 혼합한 후 15분 동안 차광 반응시킨 다음 microplate reader를 사용하여 30°C, 415 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 L-ascorbic acid를 사용하였으며, 추출물의 라디칼 소거 활성이 50%가 되는 농도를 IC₅₀값으로 표시하였다.

Real-time PCR

6-Well plate에 LX-2 cell(human hepatic stellate cell lines)을 2×10⁶ cells/well로 분주하고 하루 동안 배양한 후 무혈청 배지로 교체하였다. 교체한 배지에 배합비별로 희석한 치자와 조구등 복합물 200 μg/mL를 6시간 동안 전처리한 후 transforming growth factor β 1(TGFβ1)과 COL1A1을 10 μg/mL 농도로 처리하였다. 16시간 동안 유지한 후 TRIzol을 사용하여 mRNA를 분리하였다. 이후 Super Script^TM One-Cycle cDNA kit(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 mRNA를 cDNA로 합성한 다음 real-time PCR을 분석하였다. 유전자 전사 수준은 Power SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems^TM)를 사용하여 7500 Real Time PCR System(Thermo Fisher Scientific)을 통해 측정되었다. 사용된 primer의 염기 서열은 Table 1에 나열하였다.

Table 1 . Primer sequences used for real-time PCR analysis.

Gene.	Primer sequence.
TGFβ1.	Forward: GAC AAC GTC AGG TTC TGG CTC A. Reverse: CCG CCA CTT TCC TCT CCA AAC T.
COL1A1.	Forward: GAT TCC CTG GAC CTA AAG GTG C. Reverse: AGC CTC TCC ATC TTT GCC AGC A.
β-actin.	Forward: CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTT C. Reverse: AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T.

Immunofluorescence staining

35 mm 세포 배양 유리 접시에 LX-2 세포를 2×10⁵ cells/well로 분주하고 하루 동안 배양한 후 무혈청 배지로 교체하였다. 교체한 배지에 배합비별로 희석한 치자와 조구등 복합물 200 μg/mL를 6시간 동안 전처리한 후 TGFβ1을 10 μg/mL 농도로 처리하였다. 24시간 후 phosphate buffered saline(PBS)을 사용하여 2회 세척하였고, 실온에서 40분 동안 4% paraformaldehyde로 고정하였다. 이후 PBS를 사용하여 다시 2회 세척하고 tween이 0.05% 함유된 PBS에서 10분 동안 배양하였으며, 1시간 동안 2.5% N-hydroxysuccinimide를 사용하여 blocking하고 4°C에서 1차 항체인 αSMA와 COL3A1을 overnight 시켜 배양하였다. 다시 PBS로 2회 세척하고 2차 항체(αSMA, mouse; COL3A1, rabbit)를 1시간 30분 동안 37°C 인큐베이터에서 배양한 후 PBS로 세척하였다. 최종적으로 immunofluorescence (IF) 염색 이미지는 형광 필터가 장착된 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 관찰하였다.

실험동물 간 섬유화 유발 및 처치

본 실험에서는 대한바이오링크에서 7주령의 수컷 C57BL/6 mice를 구입하여 사용하였다. 물과 고형사료(Zeigler Bros., Inc.)를 충분히 공급하면서 conventional system으로 온도 22±2°C, 습도 50±5%, 12시간 명암 주기(light: dark cycle)가 유지되는 동물 사육실 환경 조건에 일주일 동안 적응시켰다. 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토와 효율적 관리를 위해 대구한의대학교 동물실험윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인(번호: DHU2024-002)을 받고 동물 관리 규정을 준수하여 실험을 시행하였다.

실험동물은 난괴법(randomized complete block design)으로 각 7마리씩 5개 그룹으로 나누었다. 실험군은 정상군(Normal), 대조군(Control), silymarin 50 mg/kg 경구 투여군(Sily), Gardenia fructus와 U. rhynchophylla 1:2 mixture(GU) 50 mg/kg 경구 투여군(GUL), GU 100 mg/kg 경구 투여군(GUH)으로 분류하였으며, 실험군은 적응기 후 8주 동안 매일 일정한 시간에 해당 약물을 경구 투여하였다. 또한 간 섬유화 유발을 위해 주 3회, 약물 투여 1시간 30분 후 TAA(1주 100 mg/kg, 2~3주 200 mg/kg, 4~8주 400 mg/kg)를 복강 투여하였다. 실험이 종료된 후 isoflurane(Isotroy 100, JSK)으로 흡입 마취하여 심장에서 혈액을 채취하고 간 조직을 적출하였다. 혈액은 원심분리기(LaboGene 1730R, LaboGene)를 사용하여 10분 동안 4°C, 1,508×g로 혈청을 분리하였으며, 분리한 혈청과 간 조직은 분석하기 직전까지 -80°C에 보관하였다.

혈청 및 간 조직 ELISA 분석

Glutamic oxaloacetic transaminase(GOT)와 glutamic pyruvic transaminase(GPT)는 Asanpharm Co., Ltd.의 assay kit을 사용하여 프로토콜에 따라 측정하였다. Bile acid는 Cell Biolabs, Inc.의 assay kit을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. Ammonia, MMP-9 및 TIMP-1은 Abcam Co.의 assay kit을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.

산화적 스트레스 및 지질 과산화 측정

Reactive oxygen species(ROS)는 Ali 등(1992)의 방법에 따라 측정하였다. 50 mM sodium phosphate buffer(pH 7.4), 1 mM EDTA와 혈청 및 간 조직을 혼합한 후 25 mM 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate를 첨가하여 UV-VIS microplate reader(Infinite F200 pro, Tecan)를 이용해 emission wavelength 530 nm와 excitation wavelength 486 nm에서 5분 간격으로 30분 동안 값을 측정하였다. Peroxynitrite(ONOO⁻)는 Kooy 등(1994)의 방법으로 측정하였다. 혈청 및 간 조직을 rhodamine buffer, 5 mM diethylenetriamine pentaacetate와 10 mM dihydrorhodamine 123(DHR123)를 혼합하여 만든 DHR123 buffer에 섞어 5분 동안 37°C에서 교반하였다. 이후 UV-VIS microplate reader를 이용해 emission wavelength 535 nm와 excitation wavelength 480 nm에서 5분 간격으로 30분 동안 값을 측정하였다. Malondialdehyde(MDA)는 Uchiyama와 Mihara의 방법(1978)으로 측정하였다. 간 조직과 0.67% thiobarbituric acid, 1% phosphoric acid를 e-tube에 넣고 혼합한 후 45분 동안 95°C에서 끓이고 buthanol을 첨가하였다. 이후 원심분리기를 사용하여 10분 동안 848×g로 분리하여 얻은 상층액을 microplate reader를 사용하여 540 nm 파장에서 측정하였다. 표준물질로는 1,1,3,3-tetramethoxypropane을 사용하였다.

간 조직 western blotting

간 조직의 세포질을 얻기 위해 10 mM hydroxyethyl piperazine ethane sulfonic acid(HEPES)(pH 7.8), 10 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol(DTT), 0.1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF로 만든 buffer A에 protease inhibitor cocktail을 첨가하여 간 조직에 넣고 tissue grinder(BioSpec Products, Inc.)로 분쇄한 후 30분 동안 얼음 위에서 정치시켰다. 이후 10% NP-40 용액을 첨가하고 원심분리기를 사용하여 2분 동안 4°C, 13,572×g로 세포질이 포함된 상층액을 분리하였으며, 남은 조직은 10% NP-40이 더해진 buffer A로 두 번 세척하였다. 핵을 얻기 위해 50 mM HEPES(pH 7.8), 50 mM KCl, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 1% glycerol로 만든 buffer C에 protease inhibitor cocktail을 첨가하여 간 조직에 넣고 재부유시킨 후 10분 간격으로 총 4번 vortex 하였다. 이후 원심분리기를 사용하여 10분 동안 4°C, 13,572×g로 핵이 포함된 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액은 분석하기 직전까지 -80°C에 보관하였다. 세포질에서 GAPDH, β-actin, gp91^phox, p22^phox, p47^phox, Cox-2, IL-1β, COL1A1, MMP-2 및 TIMP-2의 발현과 핵에서 histone H3, NF-κBp65의 발현을 측정하기 위해 10~12 μg의 단백질을 8~14% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel에 전기영동하여 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. Nitrocellulose membrane에 tween이 0.1% 함유된 PBS(PBS-T)를 사용하여 1:1,000으로 희석한 1차 항체를 노출시켜 4°C에서 overnight 시켰다. 이후 PBS-T로 세척하고 1:3,000으로 희석한 2차 항체를 노출시켜 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 마지막으로 항체가 처리된 nitrocellulose membrane을 다시 PBS-T로 세척하고 ECL 용액에 노출시켜 Sensi-Q2000 Chemidoc(Lugen Sci Co., Ltd.)을 사용하여 단백질 발현을 확인하였으며, ATTO Densitograph software(ATTO Corporation)로 정량하였다. 각각의 단백질 발현은 정상군의 발현 수준으로 나눈 후 상대적 비율로 나타내었다(fold of Normal).

조직 병리학적 관찰

간 조직을 10% neutral buffered formalin에 고정한 후 graded alcohol을 사용하여 탈수시키고 paraffin으로 포매하여 표본을 제작하였다. 이후 microtome을 사용하여 3 μm 두께로 조직 절편을 제작하고, 프로토콜에 따라 sirius red 염색을 진행하였다. 염색된 슬라이드는 Olympus BX51 microscope(Olympus Optical Co., Ltd.)를 사용하여 조직 병변을 관찰하였다.

통계분석

모든 실험은 SPSS version 26.0(IBM Corp)을 사용하여 one-way analysis of variance(ANOVA) test로 값을 분석한 후, least significant differences(LSD) test를 통해 사후검정을 시행하여 P<0.05 수준일 경우 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다. 모든 실험의 데이터 값들은 mean±standard error of mean으로 표시하였다.

총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량

샘플의 항산화 활성을 평가하기 위해 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 치자의 총 폴리페놀 함량은 36.39±0.16 mg GAE/g, 총 플라보노이드 함량은 29.10±0.17 mg QE/g으로 나타났다. 조구등의 총 폴리페놀 함량 함량은 172.92±0.24 mg GAE/g, 총 플라보노이드 함량은 24.94±1.22 mg QE/g으로 나타났다. 치자와 조구등 1:2 복합물의 총 폴리페놀 함량의 함량은 135.52±0.16 mg GAE/g, 총 플라보노이드 함량은 28.17±0.86 mg QE/g으로 나타났다(Table 2).

Table 2 . Total polyphenol and flavonoid contents.

	Total polyphenol. (mg GAE/g).			Total flavonoid. (mg QE/g).
Gardenia fructus. Uncaria rhynchophylla. GU2).	36.39±0.161). 172.92±0.24. 135.52±0.16.			29.10±0.17. 24.94±1.22. 28.17±0.86.

¹⁾The data were expressed as mean±SEM of three replications..

²⁾GU: Gardenia fructus and U. rhynchophylla 1:2 mixture..

DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성

라디칼은 다른 분자들과의 자유로운 반응을 통해 화학적 변화를 일으키며, 이러한 반응은 산화 스트레스가 발생하여 세포 손상과 질병을 유발할 수 있다(Ihde, 1967). 이에 DPPH와 ABTS 분석법을 통해 라디칼 소거 활성을 평가하였다(Wang 등, 2018). DPPH 자유라디칼 소거 활성을 측정한 결과, L-ascorbic acid 1.13±0.01 μg/mL, 치자 45.71±1.09 μg/mL, 조구등 6.50±0.26 μg/mL, 치자와 조구등 1:2 복합물 8.38±0.10 μg/mL로 나타났다. ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, L-ascorbic acid 4.53±0.12 μg/mL, 치자 94.54±0.50 μg/mL, 조구등 14.56±0.26 μg/mL, 치자와 조구등 1:2 복합물 24.96±0.61 μg/mL로 나타났다(Table 3).

Table 3 . DPPH and ABTS radical scavenging activities.

		DPPH. (IC501), μg/mL).	ABTS. (IC50, μg/mL).
L-ascorbic acid. Gardenia fructus. Uncaria rhynchophylla. GU3).		1.13±0.012). 45.71±1.09. 6.50±0.26. 8.38±0.10.	4.53±0.12. 94.54±0.50. 14.56±0.26. 24.96±0.61.

¹⁾The IC₅₀ were calculated from the % scavenging ability of each compound..

²⁾The data were expressed as mean±SEM of three replications..

³⁾GU: Gardenia fructus and U. rhynchophylla 1:2 mixture..

TGFβ1 및 COL1A1 mRNA 발현량

Real-time PCR은 단시간에 특정 유전물질을 선택적으로 증폭하는 분자생물학적 기술로써, 이를 통해 실험에 사용할 치자와 조구등의 적절한 배합 비율을 구하고자 LX-2 세포를 사용하여 TGFβ1과 COL1A1의 mRNA 발현을 확인하였다. TGFβ1은 세포의 분화, 증식, 사멸을 포함한 다양한 과정에 영향을 주며, 섬유아세포를 활성화하여 섬유화의 초기 단계를 촉진하고 유지하는 역할을 수행한다(Kang 등, 2013). Collagen-I과 -III는 ECM의 구성 요소이며 TGFβ1에 의해 유도된다(Smith-Cortinez 등, 2021). 기존 연구에서는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(human umbilical cord mesenchymal stem cells)가 LX-2 세포에서 TGFβ1과 COL1A1의 발현을 억제하여 간 섬유화의 진행을 저해할 수 있다는 결과가 보고되었다(Shi 등, 2024). Real-time PCR 분석 결과, TGFβ1과 COL1A1의 발현량이 1:2, 1:3, 1:4, 4:1의 배합 비율에서 Control에 비해 모두 30% 이상 유의하게 감소했다. 특히, TGFβ1의 경우 Control에 비해 1:2 비율에서 57.53%(P<0.01), 1:3 비율에서 87.21%(P<0.001), 1:4 비율에서 36.53%(P<0.05) 감소하였고, COL1A1의 경우 1:2 비율에서 83.28%(P<0.001), 1:3 비율에서 91.64%(P<0.001), 1:4 비율에서 74.60%(P<0.001) 감소했다. 결과적으로 1:2, 1:3, 1:4 배합 비율에서 우수한 억제 효과가 확인되었다(Fig. 1). 이는 TAA에 의해 유발된 collagen 축적을 억제하여 섬유화 진행을 저해할 수 있음을 시사한다.

Fig 1. Real-time PCR analysis to LX-2 cells expression levels. (A) TGFβ1 and (B) COL1A1. After treating each mixing ratio of Gardenia fructus and Uncaria rhynchophylla mixture (200 μg/mL) in LX-2 cells for 6 h and then TGFβ1 and COL1A1 (10 μg/mL) were incubated for 16 h. The expression levels of TGFβ1 and COL1A1 were determined by real-time PCR. The data were expressed as mean±SEM of four replications. Significance: ^##P<0.01, ^###P<0.001 vs. Normal, ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001 vs. Control.

αSMA와 COL3A1 활성 억제

IF staining은 다양한 유형의 세포에서 특정 항원을 검출하고 이를 시각적으로 국소화하는 면역화학 기술로써, 이를 통해 실험에 사용할 치자와 조구등의 적절한 배합비율을 구하고자 LX-2 세포를 사용하여 αSMA와 COL3A1에 대해 IF staining을 실시하였다(Im 등, 2019). 섬유아세포에서 발현되는 αSMA는 ECM인 COL3A1 등을 합성 및 분비하여 간 섬유화에서 발현이 증가하게 된다(Yang 등, 2023). 기존 연구에 따르면 phillygenin이 TGFβ1을 처리한 LX-2 세포에서 αSMA 발현을 감소시켜 HSC의 활성화를 억제하고, 이를 통해 간 섬유화의 진행을 억제한 것으로 보고되었다(Wang 등, 2024). 또한 급성 간 손상 질환 연구에서는 섬유아세포 성장 인자와 초상자성 철 나노분자를 결합한 물질이 LX-2 세포에서 collagen 발현을 억제하여 HSC의 활성화를 효과적으로 억제한 결과가 보고되었다(Kurniawan 등, 2020). 분석 결과, 1:2, 1:3, 1:4 비율에서 Control에 비해 모든 인자의 발현이 억제된 효과를 보였다. 특히 1:2 비율에서 세포의 구조가 잘 유지되면서 αSMA와 COL3A1의 발현이 현저히 억제된 것으로 나타났다. 이는 1:2의 배합 비율이 αSMA 세포 분화와 콜라겐 및 ECM 합성을 가장 안정적으로 억제하면서도 세포 기능을 유지할 수 있는 최적의 조건임을 보여준다. 이에 본 실험에서 치자와 조구등의 최적 배합비를 1:2로 선정하였다(GU)(Fig. 2).

Fig 2. Immunofluorescence staining analysis to LX-2 cells expression. (A) αSMA and (B) COL3A1. αSMA (red) and COL3A1 (green) were stained in DAPI-stained (blue) nuclei.

체중 변화량

간은 소화된 영양소를 저장 및 조절하여 에너지를 공급하고 독성 물질을 분해하여 체외로 배출한다. 또한 담즙을 생성하여 지방 소화를 돕고, 간 내 kupffer cell은 병원체를 중화시키고 제거하는 기능을 수행한다(Sauer 등, 2024). 그러나 TAA가 간 내에서 대사되면 kupffer cell이 과도하게 활성화되어 염증을 촉진하는 물질을 분비하는데, 이로 인해 간이 영양소 조절, 해독작용, 지방 소화 기능을 제대로 수행할 수 없다(Clark 등, 2003; Lee, 2001). 실험 시작일부터 실험 종료 직전까지 매일 일정한 시간에 체중을 측정하였고, 이에 따른 체중 변화량을 측정하였다. 체중 변화량 측정 결과, Normal군은 6.2±0.9 g 증가하였으며, Control군은 3.0±0.5 g, Sily는 2.6±0.5 g, GUL군은 2.8±0.4 g, GUH군은 2.6±0.5 g 감소하였다. Normal군 대비 Control군은 체중 변화량이 유의적으로 감소하였으며(P<0.001), 약물 투여군에서는 모두 Control군에 비해 체중 변화량이 감소하였으나 유의적인 차이는 보이지 않았다(Table 4). 이러한 결과는 TAA 유발로 인한 체중 감소가 약물 투여를 통해 완화된 것을 나타낸다. 따라서 GU 투여가 간 기능 저하를 완화하는 효과가 있는 것으로 확인할 수 있다.

Table 4 . Body weight change.

Group1).	Body weight (g).
	Initial.	Final.	Change.
Normal. Control. Sily. GUL. GUH.	24.0±0.4. 24.0±0.3. 23.9±0.5. 23.6±0.3. 24.1±0.4.	30.1±1.12). 21.0±0.6###3). 21.3±0.9. 20.9±0.4. 21.5±0.5.	6.2±0.9. −3.0±0.5###. −2.6±0.5. −2.8±0.4. −2.6±0.5.

¹⁾Normal, Normal group; Control, TAA-induced liver fibrosis and treated with distilled water group; Sily, TAA-induced liver fibrosis and treated with silymarin 50 mg/kg group; GUL, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and Uncaria rhynchophylla mixture 50 mg/kg group; GUH, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and U. rhynchophylla mixture 100 mg/kg group..

²⁾The data were expressed as mean±SEM (n=7/each group)..

³⁾Significance: ^###P<0.001 vs. Normal..

간 기능 및 독성 바이오마커 측정

GOT는 amino acid의 대사와 에너지 생성 과정에 기여하고, GPT는 단백질 대사와 glycogen 합성 과정에 영향을 미친다. 이 효소들은 주로 간세포의 mitochondria와 microsome에서 작용하며, 간세포가 손상되면 혈액으로 방출되어 혈청 내 수치가 상승한다(Kim, 2008). Ammonia는 간에서 단백질의 대사 과정 중에 생성되는 독성물질로, 과도하게 증가하면 HSC를 활성화시켜 간을 손상한다. 간은 ammonia를 요소로 변환하여 체외로 배출하는 기능을 하는데, 간이 손상되면 이러한 과정이 원활하게 이루어지지 못하여 혈중에 ammonia가 축적된다(Jamshidzadeh 등, 2017; Olde 등, 2009). 담즙산은 주로 간에서 생성되고 소장에서 분비되어 지방을 유화시켜 소화 및 흡수를 촉진하며, 다시 소장에서 재흡수되어 간으로 되돌아가는 장간 순환을 한다. 그러나 간세포의 기능이 손상되면 담즙산이 적절하게 생성되거나 배출되지 않아 소화 과정에 문제를 초래할 수 있으며, 순환이 원활하게 이루어지지 않아 혈중에 축적된다(Jin 등, 2024). 기존 연구에 따르면 치자의 주요 성분인 crocin은 peroxisome proliferator-activated receptor gamma 경로를 활성화시켜 NF-κB 등의 염증 경로를 억제하며, 이를 통해 산화 스트레스와 염증성 매개인자의 발현을 감소시켜 간을 보호하는 효과가 있다(Badavi 등, 2020). 또한, 조구등의 주요 성분인 플라보노이드는 항산화 및 항염증 효과를 통해 간 손상을 유발하는 산화 스트레스와 염증을 억제하여 간세포를 보호하는 역할을 한다고 보고된 바 있다(Cirmi 등, 2016). 비알코올성 지방간 질환 모델에서 치자 추출물 투여는 ALT와 AST 수치를 효과적으로 감소시켜 간 손상을 완화하였으며, 담즙산 대사에 관한 연구에서 저항성 전분 섭취가 암모니아와 담즙산 수치를 억제하여 간의 염증을 완화하고 기능을 개선하는 것으로 나타났다(Nam 등, 2014; Wang 등, 2023). 혈청 내에서 GOT, GPT, ammonia, bile acid의 수치를 측정하였다. GOT 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였으며(P<0.001), Control군 대비 모든 약물 투여군에서 유의한 감소 효과를 나타냈다(Sily, P<0.001; GUL, GUH, P<0.01)(Fig. 3A). GPT 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였으며(P<0.001), Control군 대비 모든 약물 투여군에서 유의한 감소 효과를 나타냈다(P<0.01)(Fig. 3B). Ammonia 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였으며(P<0.001), Control군 대비 Sily군은 유의하게 감소하였다(P<0.05). GU 투여군에서는 Control군 대비 고농도에서만 유의적인 효과를 보였다(P<0.05)(Fig. 3C). Bile acid 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였으며(P<0.001), Control군 대비 Sily군은 유의하게 감소하였다(P<0.01). GU 투여군에서는 Control군 대비 고농도에서만 유의적인 효과를 보였다(P<0.05)(Fig. 3D). 이러한 결과를 통해 GU 투여가 TAA 유발에 의한 간 손상을 완화하고 간 기능을 회복하는 효과가 있는 것으로 확인할 수 있다.

Fig 3. The GOT, GPT, ammonia, and bile acid levels in serum. (A) Serum GOT, (B) serum GPT, (C) serum ammonia, and (D) serum bile acid. Normal, Normal group; Control, TAA-induced liver fibrosis and treated with distilled water group; Sily, TAA-induced liver fibrosis and treated with silymarin 50 mg/kg group; GUL, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and Uncaria rhynchophylla mixture 50 mg/kg group; GUH, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and U. rhynchophylla mixture 100 mg/kg group. The data were expressed as mean±SEM (n=7/each group). Significance: ^###P<0.001 vs. Normal, ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001 vs. Control.

산화 스트레스 바이오마커 측정

ROS는 주로 세포 호흡 및 산화 대사 과정에서 생성되며, 간세포가 손상되면 ROS 생성이 증가한다. 과도한 ROS 생성은 산화 스트레스를 유발하여 세포 기능을 저하시키고 혈관 신생을 억제한다(Cichoż-Lach와 Michalak, 2014). 이로 인해 세포 손상, 염증 및 사멸을 초래할 수 있다(Lee 등, 2009). ONOO^-는 과산화수소와 아질산염이 반응하여 생성되는 산화성 화합물이다(Radi 등, 1991). 세포 내에서 자유라디칼로 작용하여 산화 스트레스를 유발하며, 이로 인해 간 조직 내 섬유 세포가 활성화된다(Pacher 등, 2007). MDA는 세포막의 구조를 손상하고 물질의 교환기능을 저해하여 세포 내부 환경을 변화시키고 염증 및 질병을 초래할 수 있다(Halliwell과 Chirico, 1993; Rezayian 등, 2019). 치자의 주요 성분인 crocin은 항산화 효소를 활성화시켜 ROS를 제거하고 ONOO^-의 활성을 억제하며 항산화 작용을 통해 MDA 생성을 억제하여 세포막을 보호한다고 알려져 있다(Bastani 등, 2022; Hernández-Cruz 등, 2023). 또한 조구등의 주요 성분인 alkaloid는 글루타치온과 같은 항산화제를 증가시켜 ROS를 중화시키고 ONOO^-를 감소시키며 염증 반응을 억제함으로써 MDA를 감소시킨다고 알려져 있다(Geetha와 Ramachandran, 2021). 심혈관 질환에 관한 선행 연구에 따르면, 약용 식물이 ROS와 ONOO^-의 생성 및 축적을 억제하여 산화 스트레스를 줄이고 염증 반응을 완화하며, MDA 수준을 감소시켜 세포막 손상을 방지하는 것으로 보고된다(Adegbola 등, 2017). 혈청 내 ROS 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였으며(P<0.001), Control군 대비 모든 약물 투여군에서 유의한 감소 효과를 나타냈다(Sily, P<0.01; GUL, GUH, P<0.05)(Fig. 4A). 혈청 내 ONOO^- 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였으며(P<0.001), Control군 대비 Sily군은 유의한 감소 효과를 보였다(P<0.01). GU 투여군에서는 Control군 대비 고농도에서만 유의적인 감소 효과를 보였다(P<0.05)(Fig. 4B). 간 조직 내 ROS 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였다(P<0.001). Control군 대비 Sily군은 유의하게 감소하였으며(P<0.05), GU 투여군에서는 고농도에서만 유의적인 감소 효과를 보였다(P<0.05)(Fig. 4C). 간 조직 내 ONOO^- 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였으며(P<0.001), Control군 대비 모든 약물 투여군에서 감소 효과를 나타냈다(Sily, P<0.001; GUL, GUH, P<0.01)(Fig. 4D). 간 조직 내 MDA 측정 결과, Normal군 대비 Control군 유의하게 증가하였다(P<0.001). Control군 대비 Sily군 36.96%(P<0.001), GUL 55.84%(P<0.001), GUH 53.70%(P<0.001) 감소하여 모든 약물 투여군에서 유의미한 효과를 보였으나 GU 투여군이 Sily군에 비해 더 높은 억제 효과를 보였다(Fig. 4E). 이러한 결과를 통해 GU 투여가 세포막과 단백질의 산화적 손상을 감소시키고 지질 과산화를 억제하여 세포막의 안정성을 증진시켜 세포 기능을 보호하고 염증 반응을 완화하는 효과가 있는 것으로 확인할 수 있다.

Fig 4. Oxidative stress biomarker levels in serum and liver tissue. (A) Serum ROS, (B) Serum ONOO⁻, (C) Liver tissue ROS, (D) Liver tissue ONOO⁻, and (E) Liver tissue MDA. Normal, Normal group; Control, TAA-induced liver fibrosis and treated with distilled water group; Sily, TAA-induced liver fibrosis and treated with silymarin 50 mg/kg group; GUL, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and Uncaria rhynchophylla mixture 50 mg/kg group; GUH, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and U. rhynchophylla mixture 100 mg/kg group. The data were expressed as mean±SEM (n=7/each group). Significance: ^###P<0.001 vs. Normal, ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001 vs. Control.

NADPH oxidase 단백질 발현량

NADPH oxidase의 구성 요소인 gp91^phox, p22^phox, p47^phox가 활성화되면 ROS를 생성하여 세포 내에서 산화 환원 반응에 영향을 미쳐 조직 손상 및 세포 사멸을 초래한다(Aoyama 등, 2012; Paik 등, 2014). 산화 스트레스는 체내 산화 관련 분자가 불균형한 상태를 의미하며, 산화 스트레스가 발생할 때 세포질 단백질인 p47^phox가 인산화되어 세포막 단백질인 p22^phox와 결합하고, gp91^phox와 함께 NADPH oxidase를 활성화한다(Cho 등, 2003). 기존 연구에 따르면 치자 열매의 주요 성분인 geniposide는 lipopolysaccharide(LPS)로 처리한 RAW264.7 세포에서 NADPH 산화효소의 활성을 억제함으로써 ROS 생성을 감소시켜 산화 스트레스 및 염증 반응을 완화한다(Zou 등, 2021). 또한 조구등은 간 섬유화 선행 연구에서 NADPH 산화효소의 발현을 억제하여 간 보호에 효과를 보였다(Choi 등, 2021). gp91^phox의 발현량 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였으며(P<0.001), Control군 대비 모든 약물 투여군에서 발현량이 유의적으로 감소하였다(Sily, P<0.01; GUL, P<0.01; GUH, P<0.001). 특히 GUH군에서 가장 높은 발현 억제 효과를 보였다(Fig. 5A). p22^phox의 발현량 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였으며(P<0.01), Control군 대비 GU 투여군에서만 농도 의존적으로 유의한 억제 효과를 보였다(P<0.05)(Fig. 5B). p47^phox의 발현량 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였으며(P<0.001), Control군 대비 GU 투여군에서만 유의한 억제 효과를 보였다(P<0.05)(Fig. 5C). 이러한 결과를 통해 GU 투여가 NADPH 산화효소 복합체의 활성화를 저하하여 산화 스트레스를 완화하는 효과가 있는 것으로 확인할 수 있다.

Fig 5. Protein expression of NADPH oxidase assayed by Western blotting. (A) gp91^phox, (B) p22^phox, and (C) p47^phox. Normal, Normal group; Control, TAA-induced liver fibrosis and treated with distilled water group; Sily, TAA-induced liver fibrosis and treated with silymarin 50 mg/kg group; GUL, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and Uncaria rhynchophylla mixture 50 mg/kg group; GUH, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and U. rhynchophylla mixture 100 mg/kg group. The data were expressed as mean±SEM (n=7/each group). Significance: ^##P<0.01, ^###P<0.001 vs. Normal, ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001 vs. Control.

염증 관련 단백질 발현량

NF-κBp65는 염증 반응 및 세포 사멸과 같은 과정에서 중요한 영향을 미치는 전사인자이다(Ngabire 등, 2018). NF-κBp65가 활성화되면 핵 내로 이동하여 염증성 사이토카인 Cox-2, IL-1β의 발현을 유도한다(Woo 등, 2018). 활성화된 Cox-2와 IL-1β는 ROS를 생성하여 조직을 손상한다(El Mansouri 등, 2011). Geniposide는 NF-κB 신호 전달 경로를 하향 조절하여 LPS 자극에 의해 증가한 염증성 사이토카인을 억제하고 염증 반응을 완화한다고 알려져 있다(Shi 등, 2014). 또한 조구등의 주요 성분인 rhynchophylline은 I-κBα의 인산화를 억제함으로써 NF-κB의 활성화를 저해하여 염증성 사이토카인의 발현을 감소시킨다(Cao 등, 2012). NF-κBp65의 발현량 측정 결과, Normal군 대비 Control군이 유의하게 증가하였으며(P<0.001), Control군 대비 Sily군은 유의하게 감소하였다(P<0.01). GU 투여군에서는 농도 의존적으로 유의한 감소 효과를 보였다(GUL, P<0.05; GUH, P<0.01)(Fig. 6A). Cox-2의 발현량 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였다(P<0.001). Control군 대비 Sily 25.84%(P<0.01), GUL 31.97%(P<0.001), GUH 42.35%(P<0.001) 감소하여 모든 약물 투여군에서 유의적인 효과를 나타냈다. 특히 GUH군에서 Sily군에 비해 Cox-2의 발현을 21.97% 탁월하게 억제하였다(P<0.05)(Fig. 6B). IL-1β의 발현량 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였으며(P<0.001), Control군 대비 Sily군은 유의하게 감소하였다(P<0.01). GU 투여군에서는 Control군 대비 농도 의존적으로 유의한 발현 억제 효과를 보였다(GUL, P<0.05; GUH, P<0.01)(Fig. 6C). 이러한 결과를 통해 GU 투여가 염증성 유전자와 사이토카인의 활성화를 감소시켜 염증으로 인한 조직 손상을 억제하는 효과가 있는 것으로 확인할 수 있다.

Fig 6. Protein expression of inflammation-related as assayed by western blotting. (A) NF-κBp65, (B) Cox-2, and (C) IL-1β. Normal, Normal group; Control, TAA-induced liver fibrosis and treated with distilled water group; Sily, TAA-induced liver fibrosis and treated with silymarin 50 mg/kg group; GUL, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and Uncaria rhynchophylla mixture 50 mg/kg group; GUH, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and U. rhynchophylla mixture 100 mg/kg group. The data were expressed as mean±SEM (n=7/each group). Significance: ^###P<0.001 vs. Nor-mal, ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001 vs. Control.

간 조직 내 MMP-9 및 TIMP-1 수준

ECM은 조직의 형태와 기능을 유지하는 데 중요한 기능을 한다. Matrix metalloproteinases(MMPs)는 ECM의 항상성을 조절하는 효소로, ECM에 축적된 단백질을 분해하여 세포 이동을 조절하고 염증을 억제한다. Tissue inhibitor of metalloproteinases(TIMPs)는 MMPs의 조절 인자로, HSC가 활성화되면서 증가하여 MMPs를 억제한다. 이로 인해 ECM에 축적된 단백질이 분해되지 못하고 간 섬유증과 같은 간질환을 초래한다(Hemmann 등, 2007; Roeb, 2018). Geniposide는 MMP의 발현을 증가시키고 TIMP의 발현을 억제함으로써 ECM의 분해 및 재구성을 촉진하여 세포 조직 재생에 도움을 준다(Liu 등, 2022). MMP-9 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 감소하였다(P<0.001). Control군 대비 모든 약물 투여군에서 유의적으로 증가하였으며, GU 투여군에서는 농도 의존적인 효과를 보였다(Sily, P<0.001; GUL, P<0.05; GUH, P<0.01)(Fig. 7A). TIMP-1 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였으며(P<0.001), 모든 약물 투여군에서 유의적으로 억제하는 효과가 나타났다(P<0.01)(Fig. 7B). 이러한 결과를 통해 GU 투여가 ECM 보호를 촉진하여 TAA 유발로 인한 조직 손상을 억제함으로써, 간 손상 및 염증 반응을 완화하는 효과가 있는 것으로 확인할 수 있다.

Fig 7. The MMP-9 and TIMP-1 levels in liver tissue. (A) Liver tissue MMP-9 and (B) Liver tissue TIMP-1. Normal, Normal group; Control, TAA-induced liver fibrosis and treated with distilled water group; Sily, TAA-induced liver fibrosis and treated with silymarin 50 mg/kg group; GUL, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and Uncaria rhynchophylla mixture 50 mg/kg group; GUH, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and Uncaria rhynchophylla mixture 100 mg/kg group. The data were expressed as mean±SEM (n=7/each group). Significance: ^###P<0.001 vs. Normal, ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001 vs. Control.

섬유화 관련 단백질 발현량

MMPs와 TIMPs는 상호작용하여 ECM의 구조와 기능을 유지하는데, 이들의 균형이 깨지면 조직이 손상되어 질병을 초래한다(Balta 등, 2018). MMPs는 질병과 관련된 ECM 분해를 매개하는 효소이며(Takahara 등, 1997), 특히 MMP-2는 collagen type I의 발현을 억제한다고 알려져 있다(Radbill 등, 2011). TIMPs는 MMPs의 기질 분해 활동을 억제함으로써 ECM이 과도하게 축적되어 간 섬유증과 같은 질환을 초래한다(Xu 등, 2020). 특히 TIMP-2는 MMP-2와 MMP-9를 억제하여 조직 재생, 발육, 혈관 생성 및 염증 발현에 영향을 준다(Latronico 등, 2016). 류마티스 관절염에 관한 선행 연구에 따르면 조구등이 collagen의 발현을 억제하여 면역 반응을 완화하고 간세포를 보호하는 효과가 보고되었다(Sofat 등, 2015). MMP-2/TIMP-2 ratio의 경우 Normal군 대비 Control군은 유의하게 감소하였으며(P<0.01), Control군 대비 모든 약물 투여군에서 유의적으로 증가하였다(Sily, P<0.05; GUL, P<0.01; GUH, P<0.05)(Fig. 8A). MMP-2의 발현량 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 감소하였으며(P<0.05), Control군 대비 Sily군은 유의하게 증가하였다(P<0.05). GU 투여군은 모두 Control군 대비 증가하는 경향을 보였다(Fig. 8B). TIMP-2의 발현량 측정 결과, Normal군 대비 Control군이 유의하게 증가하였다(P<0.01). Control군 대비 Sily 32.03%(P<0.01), GUL 35.29%(P<0.01), GUH 43.14%(P<0.001) 감소하여 모든 약물 투여군이 유의적인 효과를 나타냈으며, GU 투여군은 농도 의존적인 효과를 보였다(Fig. 8C). COL1A1의 발현량 측정 결과, Normal군 대비 Control군은 유의하게 증가하였으며(P<0.001), Control군 대비 모든 약물 투여군에서 유의한 감소 효과를 보였다(P<0.01)(Fig. 8D). 이러한 결과를 통해 GU 투여가 ECM의 재구성을 촉진하여 세포를 보호하고 세포 손상을 완화하는 효과가 있는 것으로 확인할 수 있다.

Fig 8. Protein expression of MMP-2, TIMP-2, and COL1A1 assayed by western blotting. (A) MMP-2/TIMP-2 ratio, (B) MMP-2, (C) TIMP-2, and (D) COL1A1. Normal, Normal group; Control, TAA-induced liver fibrosis and treated with distilled water group; Sily, TAA-induced liver fibrosis and treated with silymarin 50 mg/kg group; GUL, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and Uncaria rhynchophylla mixture 50 mg/kg group; GUH, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and U. rhynchophylla mixture 100 mg/kg group. The data were expressed as mean±SEM (n=7/each group). Significance: ^#P<0.05, ^##P<0.01, and ^###P<0.001 vs. Normal, ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001 vs. Control.

조직병리학적 관찰

Sirius red는 세포 내 collagen과 amyloid를 염색하며, 암, 혈관 및 대사성 질환에서 염증 수준을 관찰하기 위해 사용된다(Dapson 등, 2011). 간 조직을 염색하면 핵, 세포질, 근육 섬유는 노란색으로 염색되고, collagen과 amyloid는 붉은색으로 염색된다. Sirius red 염색을 실시한 결과 TAA 투여로 인해 간세포 사이 collagen이 과도하게 침착된 것을 확인하였으며, 침착된 collagen이 GU의 투여를 통해 확연하게 줄어든 것으로 나타났다(Fig. 9). 이러한 결과를 통해 GU 투여가 TAA 유발로 인한 collagen 축적을 억제하는 효과가 있는 것으로 확인할 수 있다.

Fig 9. Liver histological analysis. Sirius Red staining (original magnification ×200, magnification bar=100 μm). Normal, Nor-mal group; Control, TAA-induced liver fibrosis and treated with distilled water group; Sily, TAA-induced liver fibrosis and treated with silymarin 50 mg/kg group; GUL, TAA-induced liver fibrosis and treated with Gardenia fructus and Uncaria rhynchophylla mixture 50 mg/kg group; GUH, TAA-induced liver fibrosis and treated with Garde-nia fructus and U. rhynchophylla mixture 100 mg/kg group.

본 실험에서 in vitro를 통해 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 함량과 라디칼 소거능을 측정하여 치자와 조구등의 항산화 활성을 확인하였으며, real-time PCR 및 IF staining 분석을 통해 항염증 효과에 대한 치자와 조구등의 최적 배합비를 1:2로 선정하였다. TAA로 유발된 간 섬유화 마우스 모델에 GU를 투여하였을 때 TAA 투여로 증가한 MDA 수치를 감소시키고, NADPH oxidase의 발현을 조절하여 산화적 스트레스를 완화하였다. 또한, 간 조직 내 염증성 전사인자 NF-κBp65와 염증성 사이토카인 Cox-2, IL-1β 및 TIMPs 단백질 발현을 탁월하게 조절하여 간세포 내 축적된 collagen 섬유를 효과적으로 감소시켰다. 이러한 결과는 GU 투여가 간 섬유화를 개선할 수 있으며, 향후 간 섬유화에 대한 후보 소재로서의 가능성이 있음을 시사한다.

본 성과물은 한국연구재단을 통한 기초과학연구사업(No. 2018R1A5A2025272)의 재원을 받아 수행된 연구이다.