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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(9): 921-927

Published online September 30, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.9.921

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Immunostimulatory Effects of Ficus carica Fruit Extracts on LPS-Induced Inflammation of HT-29 Cells

Yanghee You1 , Sang-Mi Kang1, and Somi Lee2

1Industry-Academy Cooperation Foundation and Microbiome Based Well-Aging Research Center, Dongshin University
2Fruit Research Institute, J eollanamdo Agricultural Research and Extension Services

Correspondence to:Yanghee You, Industy-Academy Cooperation Foundation, Dongshin University, 102-9, Dongshindae-gil, Naju-si, Jeonnam 58245, Korea, E-mail: yyhyewha@gmail.com

Received: June 18, 2024; Revised: August 14, 2024; Accepted: August 16, 2024

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

In this study, the radical scavenging and protective immune response activities of hot-water (FCFH) and stirring-water (FCFS) extracts of the Ficus carica fruit were evaluated. The properties of the extracts were measured with respect to their phenolic components, radical scavenging properties, immune cytokine expression levels, and mucine mRNA expression on the lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation of HT-29 cells. The FCFH exhibited higher levels of total phenolic and flavonoid components compared to the FCFS. The FCFH had relatively higher radical scavenging capability as assessed by the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) assays as compared to the FCFS. The FCFH modulated the level of LPS-induced inflammatory cytokines, interleukin (IL)-6, IL-8, IL-10, and cyclooxygenase-2 in the HT-29 cells. Also, mucin 2 and mucin 5AC, protector proteins of the gut barrier and regulators of intestinal homeostasis, were up-regulated by the FCFH treatment of the HT-29 cells. These results indicate that the FCFH exerts immunostimulation and barrier gene expression in LPS-induced inflammation of human colon HT-29 cells. These findings may provide a scientific basis for investigating the protective immune response to the inflammation human intestine cells.

Keywords: Ficus carica fruit extract, immunostimulatory, antioxidant, HT-29 cell, cytokine

생체조직의 방어로 나타나는 염증반응은 염증 매개 물질에 의해 발적, 발열, 종창, 동통 등의 증상을 유도하고, 염증 상태가 질병의 상태를 악화시키거나 신규 질병의 원인이 되기도 한다(McInnes와 Gravallese, 2021). 외인성 물질에 대한 방어 작용으로 나타나는 면역반응은 염증반응으로 나타난다. 급성염증은 세균의 침입, 미생물, 손상된 조직에서 발생하며, 급성 염증이 지속적으로 나타나 분해되거나 제거되지 않은 미생물과 감염물질이 존재하거나 지속적으로 자가면역 반응이 나타나는 경우에 만성 염증으로 발전된다(Rabson 등, 2005).

인체는 생명을 유지하기 위해 산소가 필요하며, 산소를 활용하는 대사과정에서 활성산소종(reactive oxigen species, ROS)은 필수적으로 발생한다. ROS는 체내에서 효소 및 비효소적 항산화계의 도움으로 균형을 유지하게 된다. 체내의 ROS가 과도한 생성 상태, 즉 산화 스트레스 상태에서는 세포나 조직의 손상이나 면역 반응의 붕괴를 가져올 수 있고, 이들은 염증성 질환으로 발전할 수 있다. 여러 연구를 통해 ROS의 과도한 생성은 항산화제 보조 섭취로 균형을 유지할 수 있고 질병 예방에 기여할 수 있음이 보고된 바 있다. 특히 천연 식물체에 함유량이 높은 폴리페놀성 화합물들은 ROS를 제거하는 효과를 보여주었으며, 다양한 역학 연구들에서 폴리페놀이 풍부한 식이가 ROS에 의한 질병의 발병을 예방하는 것으로 제시된 바 있다(Brambilla 등, 2008; Stocker, 1999).

장의 염증은 장에 염증이 생기는 질병으로 다양한 연령에 걸쳐 나타날 수 있고, 다양한 장 구조 속에서 발생할 수 있다. 장의 염증에 대한 임상 증상은 경미하게 또는 심하게 나타나며, 심한 경우에는 쇼크에 빠지고 전해질 손상으로 경련까지 나타나는 것으로 발전하기도 한다. 장의 염증은 음식에 의한 경미한 염증, 중독에 의한 염증, 바이러스 감염에 의한 염증까지 원인은 매우 다양하다.

병원균의 내독소로 작용하는 lipopolysaccharide(LPS)는 그람 음성세균의 막구조물이며, 다당류와 소량의 단백질 및 인지질로 구성되어 있다. LPS는 세포와 조직에서 사이토카인의 분비와 여러 전사인자의 조절에 관여한다. 또한 LPS의 과도한 자극으로 염증성 사이토카인들의 분비뿐만 아니라 염증성 활성산소들의 생성을 촉진하여 염증반응을 유도하는 연구의 실험 모델의 유도제로 사용되어 왔다(Morris 등, 2022).

염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)은 서구화된 식생활의 증가와 항생제 사용 등의 증가로 매년 그 유병율이 증가하고 있고, 그 원인으로 장내 세균 등의 환경적 영향 및 면역 반응 이상 등이 알려져 있다. 최근 IBD와 유사한 설사, 혈변, 복통, 체중감소, 심한 피로감 등의 증상을 호소하나 염증을 동반하지 않는 것으로 해석되고 있는 과민성장증후군(inflammatory bowel syndrome, IBS)의 빈도 또한 높아지고 있다. 염증을 동반하는 IBD의 치료에는 5-aminosalicylic acid, 스테로이드제제, 면역억제제 등이 사용되고 있으나, 이들의 치료와 예방에 도움을 줄 수 있는 천연물 및 식품 소재들의 발굴과 연구가 꾸준히 추진되고 있다(Lee, 2011; Shin 등, 2015; Yang 등, 2015).

무화과(Ficus carica L.)는 아열대성 낙엽활엽수로 뽕나무과(Moraceae)에 속하며 전 세계적으로 600여 종이 알려져 있고, 미국, 이탈리아, 터키, 스페인, 포르투갈 등의 지역에서 재배되고 있다. 국내에는 봉래시, 승정 도우핀 품종이 주로 생식용으로 재배되고 있다. 식용 과일로 전 세계적으로 재배되며, 전통적으로 소화제, 내분비계, 호흡기계와 관련하여 널리 사용되어 왔다(Badgujar 등, 2014). 2021년 국내 무화과 재배면적이 증가하고 있으나, 고차가공 제품을 위한 무화과 소재화 연구가 제한적으로 수행되어 있어 소재화 발굴 연구의 필요성이 제기되었다. 이에 본 연구에서는 전라남도에서 재배・생산되는 무화과 열매 추출물을 이용하여 LPS 처리에 의한 염증 유도 세포모델에서의 면역 사이토카인의 발현 변화를 확인하였다.

실험 재료

본 연구에서는 2023년 전라남도 영암군에서 재배된 무화과나무 열매를 전라남도 농업기술원 과수연구소에서 제공받아 사용하였다. 무화과 열매는 추출 전까지 -70°C 냉동고에 보관하였다. 무화과 열매의 추출물은 열매를 0.5 cm 두께의 편으로 동결건조기(Bondiro DC1316, Ilshin Lab Co.)로 건조하였고, 분쇄기로 분쇄하여 -20°C의 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다. 무화과 열매 분말을 추출 용기에 넣고 중량 20배(w/v)의 물을 첨가하였다. 무화과 열매 열수 추출물은 100°C에서 3시간 동안 환류 추출한 후 여과지(Whatman No. 1)를 사용하여 2회 흡입 여과하였다. 무화과 열매 교반 물 추출물은 25°C에서 12시간 동안 stirring 추출한 후 여과지(Whatman No. 1)를 사용하여 2회 흡입 여과하였다. 각 여과액은 감압농축기(EYELA SB1200B, Tokyo Rikakikai Co.)로 농축하였고, 농축액은 동결 건조하여 열수 추출물(FCFH)과 교반 물 추출물(FCFS)을 획득하였다. FCFH는 40.7 g/100 g, FCFS는 12.9 g/100 g의 양으로 회수되었다. 이들 추출물은 -20°C에 보관하면서 본 연구의 시료로 사용하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

Folin-Ciocalteu’s phenol(Sigma-Aldrich Co.) 시약을 이용한 총 폴리페놀 함량은 앞서 문헌에 제시된 방법을 활용하여 측정하였다(Lee 등, 2012a, 2012c). 추출물 1 mL를 25 mL volumetric 플라스크에 넣고 증류수 9 mL를 첨가한 후 1 mL의 Folin-Ciocalteu’s phenol 시약을 넣고 잘 섞어 상온에 5분간 방치하였다. 7% Na2CO3(Sigma-Aldrich Co.)를 10 mL 넣고 총량이 25 mL가 되도록 증류수를 첨가한 후 23°C에서 90분간 방치하고 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 총 폴리페놀 함량은 tannic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용한 표준곡선식을 이용하여 산출하였고 3회 반복 실험한 후 그 평균값을 %로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량은 시료 내의 카테콜 구조가 알루미늄 분자와의 복합체를 형성하여 나타내는 붉은색의 복합체를 아질산염하에서 측정하는 방법을 활용하였다. 추출물 1 mL에 4 mL의 증류수를 첨가하고 5% NaNO2 0.3 mL를 넣어 잘 혼합하고, 상온에 5분간 세워둔 후 10% AlCl3(Duksan Co.) 0.3 mL를 첨가하였다. 상온에 6분간 방치한 후 1 M NaOH(Duksan Co.) 2 mL를 넣고, 증류수를 2.4 mL 넣어 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 총 플라보노이드 함량은 catechin hydrate로 작성된 표준곡선식을 이용하여 산출하였고 3회 반복 실험한 후 그 평균값으로 제시하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성 측정

DPPH 라디칼 소거 활성은 무화과 추출물을 용매에 녹인 후 추출물 0.4 mL를 취하여 0.3 mM DPPH를 제조하여 0.4 mL와 혼합하였다. 상온에서 30분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 scavenging activity(%)=[(용매의 흡광도-시료의 흡광도)/용매의 흡광도]×100으로 계산하였고 3회 반복 측정한 후 그 평균값으로 제시하였다.

ABTS 라디칼 소거 활성 측정

7 mM ABTS 용액과 100 mM 황산칼륨(Duksan Co.)을 혼합하여 암소에서 24시간 반응시킨 후 20:1로 희석하여 ABTS 반응액을 준비하였다. 무화과 물 추출물은 용매에 녹여 준비한 후 추출물 80 μL에 7 mM ABTS 용액 720 μL를 첨가한 3분 후 735 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성은 scavenging activity(%)=[(대조군의 흡광도-시료의 흡광도)/대조군의 흡광도]×100으로 계산하였고 3회 반복 측정한 후 그 평균값을 제시하였다.

HT-29 세포 배양

HT-29 세포는 American Type Culture Collection에서 구입하였고, RPMI 1640 배양액에 10% fetal bovine serum을 첨가하고, 100 μL/mL penicillin-streptomycin(Sigma-Aldrich Co.)을 처리하여 37°C, 5% CO2의 조건에서 배양하였다.

세포독성

96-Well plate에 HT-29 세포를 8×103으로 seeding 하였다. 24시간 후에 농도별로 무화과추출물을 처리한 후 0.2 mg/mL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma-Aldrich Co.) 시약을 2시간 동안 반응시킨 후 상층액을 제거하고 200 μL의 dimethyl sulfoxide를 처리하여 형성된 formazan을 용출한 후 ELISA reader(Versamax, Molecular Device)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(Carmichael 등, 1987). 세포 생존율은 추출물을 처리하지 않은 control을 기준으로 다음의 식을 활용하여 계산하였다. Cell viability(%)=100×추출물 처리군의 흡광도/control의 흡광도.

RT-PCR

6-Well plate에 HT-29 세포를 25×104으로 seeding 하였다. 24시간 후에 무화과 추출물을 2시간 전처리한 후 LPS 400 ng/mL를 2시간 처리하였다. 세포를 Trizol 용매에 용해시켜 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 정량하고 cDNA 합성 후 interleukin-8(IL-8), interleukin-6(IL-6), interleukin-10(IL-10), cyclooxygenase(COX-2), mucin 2(MUC2), mucin 5AC(MUC5AC)의 발현 정도를 real-time PCR system(CronoSTAR 96, Takara Clontech)으로 분석하였다. 분석에 사용한 프라이머는 다음과 같다. 5′-GAGAGTGATTGAGAGTGGACCAC-3′(F: IL-8), 5′-CACAACCCTCTGCACCCAGTTT-3′(R: IL-8), 5′-AGACAGCCACTCACCTCTTCAG-3′(F: IL-6), 5′-TTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTG-3′(R: IL-6), 5′-TCTCCGAGATGCCTTCAGCAGA-3′(F: IL-10), 5′-TCAGACAAGGCTTGGCAACCCA-3′(R: IL-10), 5′-CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG-3′(F: COX-2), 5′-GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA-3′(R: COX-2), 5′-ACTCTCCACACCCAGCATCATC-3′(F: MUC2), 5′-GTGTCTCCGTATGTGCCGTTGT-3′(R: MUC2), 5′-CCACTGGTTCTATGGCAACACC-3′(F: MUC5AC), 5′-GCCGAAGTCCAGGCTGTGCG-3′(R: MUC5AC).

통계 처리

본 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 추출물별 차이 유무는 Student’s t-test를 활용하였고, 세포 실험의 처리군 비교는 one-way ANOVA로 분석한 뒤 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성을 검정하였다(P<0.05).

총 폴리페놀 함량 및 플라보노이드 함량

추출물들의 생리활성물질 중 페놀류와 플라보노이드류는 높은 항염 및 항산화 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 최근 생리적인 기능성에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다(Al-Khayri 등, 2022; Cho와 Choi, 2015; Gonzalez 등, 2011; Joung 등, 2007; Liu 등, 2023; Yang 등, 2009). 무화과 열매 추출물의 폴리페놀성 화합물 함량을 측정한 결과 FCFH는 7.48±0.03 mg TA Eq/g, FCFS는 4.05±0.01 mg TA Eq/g으로 나타났다(Table 1). 무화과 열매 추출물의 플라보노이드 함량의 측정 결과 FCFH는 0.08±0.01 mg catechin Eq/g, FCFS는 0.06±0.01 mg catechin Eq/g으로 나타났으며, FCFH가 상대적으로 높은 함량을 나타내었다.

Table 1 . Total phenolic acid, total flavonoid, and total polysaccharide contents of Raphanus sativus water extract

ExtractsTotal phenolic content (mg TA Eq/g)Total flavonoid contents (mg Catechin Eq/g)
FCFH7.48±0.03*0.08±0.01*
FCFS4.05±0.010.06±0.01

FCFH: hot-water extract from Ficus carica fruit. FCFS: stirring-water from Ficus carica fruit.

Data are presented as mean±SD. *P<0.05.



DPPH 라디칼 소거 활성

DPPH 라디칼 소거 능력은 시료가 함유한 전자공여능(electron donating ability)에 의해 측정된다. DPPH는 매우 안정된 자유라디칼로 517 nm에서 광흡수를 나타내는 보라색 화합물로 유기용매에서 매우 안정되고, 항산화 활성 중 proton-radical scavenger에 의해 탈색되기 때문에 다양한 천연소재로부터 항산화 활성을 검색하는 데 주로 이용되고 있다(Lee 등, 2005). 무화과 열매 추출물들의 DPPH 라디칼 소거 활성은 Table 2에 제시하였다. 1,000 μg/mL의 농도에서 소거 활성은 FCFH는 72.8±0.2%, FCFS는 47.5±0.2%로 측정되었다.

Table 2 . DPPH anion radical and ABTS cation radical scavenging activity in extracts from Ficus carica fruit (%)

ExtractsDPPH anion radical scavenging activityABTS cation radical scavenging activity
FCFH72.8±0.2*94.7±0.1*
FCFS47.5±0.258.6±0.2

FCFH: hot-water extract from F. carica fruit. FCFS: stirring-water extract from F. carica fruit. Concentration of extracts is 1,000 μg/mL on DPPH. Concentration of extracts is 800 μg/mL on ABTS. Data are presented as mean±SD. *P<0.05.



ABTS 라디칼 소거 활성 측정

ABTS는 비교적 안정된 자유라디칼로써 DPPH 방법과 함께 항산화 활성을 검색하는 데 많이 이용되고 있다. 또한 lipophilic 또는 hydrophilic 항산화 물질의 측정에 적용 가능한 방법으로 이 방법에 의한 항산화 활성은 ABTS 라디칼을 억제하거나 소거하는 것으로 이루어진다. 각 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 Table 2와 같다. 각 추출물의 800 μg/mL의 농도에서 소거 활성은 FCFH는 94.7±0.1%, FCFS는 58.6±0.2%로 측정되었다.

세포 독성

MTT를 살아있는 세포에 처리하면 mitochondria에 있는 reductase에 의해 환원되어 formazan crystal을 형성하게 되며, 이를 측정하여 세포 생존율을 판단하는 데 사용한다(Carmichael 등, 1987; Han 등, 2011). 본 연구에서 각 추출물을 대상으로 세포에서 염증 작용 영향을 확인하기 위해 0, 400, 600, 800 μg/mL 농도의 추출물을 준비하고 24시간 동안 처리하였다. 각 농도에서 FCFH와 FCFS는 세포 생존율이 100%로 나타났다(Fig. 1).

Fig. 1. Cytotoxicity of Ficus carica fruit extracts in HT-29 cell. FCFH: hot-water extract from Ficus carica fruit, FCFS: stirring-water extract from Ficus carica fruit. Data are presented as mean±SD.

사이토카인의 발현

본 실험에서 LPS 처리에 따라 증가한 염증반응을 유도한 전염증성 사이토카인 IL-6, IL-8, COX-2 유전자의 발현은 FCFH 처리에 따라 LPS 처리군과 비교하여 0.4배, 0.7배, 0.2배 감소하였으며, 항염증 IL-10의 유전자 발현율은 LPS 처리군과 비교하여 2.3배 증가하는 것을 확인하였다. 장상피세포의 보호 당단백질인 mucin의 발현율은 MUC2와 MUC5AC의 발현율을 평가한 결과, MUC2의 발현은 LPS 처리에 따라 감소하였고, FCFH 처리에 따라 LPS 처리군과 비교하여 0.2배 발현율이 증가하였다. MUC5AC의 발현은 LPS 처리에 따라 감소하였고, FCFH와 FCFS 처리를 통해 LPS 처리군과 비교하여 7.2배와 4.2배 증가하였다(Fig. 2).

Fig. 2. Cytokine mRNA level on LPS-stimulated of HT-29 cell. (A) Interleukin-6 (IL-6), (B) interleukin-8 (IL-8), (C) cyclooxygenase (COX-2), (D) interleukin-10 (IL-10). Control: vehicle treatment on HT-29 cells. LPS: 400 ng/mL LPS on 24 h, FCFH: 600 μg/mL hot-water extract from Ficus carica fruit, FCFS: 600 μg/mL stirring-water extract from F. carica fruit. Data are presented as mean±SD. *vs. Control, P<0.05; #vs. LPS, P<0.05.

LPS 자극에 의해 세포 내 발현된 iNOS는 과량의 NO를 생성하게 되며, 대식세포의 과도한 활성화, 박테리아 파괴와 같은 면역 반응을 나타내며, 염증을 나타내는 중요 지표인 전염증성 사이토카인들의 분비를 조절하고 다른 염증 매개체의 유도, 면역반응의 조절에 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Jang 등, 2016; Lee 등, 2012b; Yun 등, 2008).

Polymerase chain reaction(PCR)은 두 개의 합성 oligonucleotide(primer)를 이용하여 목적 DNA의 부분을 특이적으로 증폭하는 방법으로, quantitative PCR을 활용하여 추출물을 처리한 세포에서 항염증 및 장벽보호 유전자 부위의 증폭량을 평가한다. 염증성 사이토카인은 외부 자극원인 LPS에 빠르게 반응하여 혈액, 조직 내 사이토카인과 면역원성 세포를 유도하여 면역 방어를 마련하는 역할을 하고 있다. 이들의 과발현과 전사체들의 유도 작용은 급성, 만성염증 질환의 치료에 유용하게 활용될 수 있는 항염증제 및 면역조절제의 특징을 규명하는 데 활용되고 있다. 본 연구에서 사용한 IL-6의 경우 T 세포와 대식세포의 작용을 유도하며, IL-10의 경우 사이토카인의 생산을 억제하고 단핵세포의 기능을 나타내어 항염증성 특징을 나타낸다(Kim 등, 2021; Park과 Song, 2007). 사이토카인 IL-8은 세포에 염증이 발생하면 호중구 및 백혈구 세포를 염증 반응 부위로 이동시키는 역할과 식균작용을 유도하는 것으로 알려져 있다(De Gregorio 등, 2022). FCFH의 전처리군에서 동일한 LPS 염증을 유도하였을 때 IL-8의 발현량을 증가시켰다. 본 연구에서 LPS 처리로 염증성 발현이 증가한 COX-2는 FCFH의 처리에 따라 대장암 세포에서 감소하였다. 염증성 장 질환 및 염증성 대장암에서 COX-2의 발현 증가는 대장염을 악화시키는 것으로 보고된 바 있다(Park과 Song, 2007). 또한 대장암 세포에서 장 점막 항상성을 유지하는 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다(Ternet과 Kiel, 2021). LPS 처리에 의한 미세아교세포에서 COX-2와 IL-6 발현 감소는 본 연구 결과와 유사하였고, 클라라 세포 연구에서도 유사하게 나타났다(Britt 등, 2012; Zhu 등, 2018). 이들의 연구 결과를 살펴보았을 때 무화과 열매 물 추출물의 처리는 STAT3 signaling에 작용하여 항염증성 약물과 유사한 자극 효과를 나타내었으며, 이 결과로 FCFH는 염증성 장세포의 보호효과를 가질 수 있을 것으로 추정해 볼 수 있었다.

장의 자극 물질로부터 장벽을 보호하고 장내 미생물 항상성을 조절하여 보호하는 역할을 하는 뮤신 단백질의 발현 유전자는 현재까지 12개가 보고되고 있다. MUC2와 MUC5AC는 장점막, 기도점막, 생식기 점막에서 발현량이 높은 겔상 분비 점액성 단백질이다(Hsu 등, 2017; Hu 등, 2022; Wang 등, 2013). 본 연구에서 HT-29 세포에서 두 단백질의 유전자 MUC2와 MUC5AC 발현을 확인하여 Fig. 3에 제시하였다. LPS 염증이 유도된 HT-29 세포의 유전자 발현을 살펴보았을 때 FCFH의 처리가 두 개의 장점막 보호 유전자의 발현을 높이는 작용을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 3. Mucin mRNA expression level on LPS-stimulated of HT-29 cell. (A) Mucine 2 (MUC2), (B) mucine 5AC (MUC5AC). Control: vehicle treatment on HT-29 cells. LPS: 400 ng/mL LPS on 24 h. FCFH: 600 μg/mL hot-water extract from Ficus carica fruit. FCFS: 600 μg/mL stirring-water extract from F. carica fruit. Data are presented as mean±SD. *vs. Control, P<0.05; #vs. LPS, P<0.05.

무화과 열매에서 scopoletin과 같은 coumarin 계열, cyanidin-3-O-glucoside와 같은 anthocyanin 계열, stilbenes와 같은 hydrocarbon의 페놀성 물질과 플라보노이드류 성분이 무화과 열매의 항산화, 항염증, 면역 조절자의 역할을 한다고 보고된 바 있다(Badgujar 등, 2014). 본 연구에서 두 추출물의 페놀성 화합물과 플라보노이드성 화합물을 분석한 결과를 통해, 무화과 열매 열수 추출물 내의 페놀성 화합물과 플라보노이드류의 성분이 면역 자극 효과를 갖는 것으로 추정할 수 있었다. 향후 같은 추출물에서의 항산화 활성을 갖는 후보물질의 분자수준의 분석을 통해 무화과 열매 열수 추출물의 면역 자극 효과를 갖는 물질을 규명할 수 있을 것으로 판단된다.

이들의 결과를 통해 무화과 열매 열수 추출물의 폴리페놀성 물질의 함량과 라디칼 소거 활성을 확인하였다. HT-29 세포의 LPS-유도 염증반응에서 IL-6, IL-8, COX-2 면역세포 유도에 작용하는 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하였으며, IL-10과 같은 항염증성 사이토카인의 발현을 높이는 작용을 확인하였다. 장세포의 장점막 분비성 보호 물질인 뮤신의 발현에 작용하는 MUC2와 MUC5AC 발현을 유효하게 증가시키는 면역성 자극 효과를 나타내어 장 건강에 유효한 작용을 나타낼 수 있음을 확인하였다. 향후 무화과 열매 열수 추출물이 포함하는 물질들의 면역성 자극의 조절 작용 및 이들의 생리활성 물질의 규명 연구가 진행될 예정이다.

본 연구는 무화과 열매 열수 추출물과 교반 물 추출물의 항산화 및 항염증 효과를 평가하였다. 무화과 열매 열수 추출물은 교반 물 추출물과 비교하여 상대적으로 높은 페놀성 물질 함량과 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 또한, 무화과 열매 열수 추출물의 염증반응 유도에 따른 면역반응의 작용을 확인하고 장 건강 후보 소재로써의 활성을 평가하기 위해 HT-29 장세포에서 각 추출물을 처리하여 장세포에서 발현되는 항염증, 면역 매개체 유도, 장벽 보호의 활성을 나타내는 유전자의 발현율을 비교하였다. 무화과 열매 열수 추출물에서 항염증성 및 면역 매개체 유도 사이토카인(IL-6, IL-8, COX-2, IL-10)의 유전자의 발현과 장벽보호물질인 뮤신의 유전자 MUC2와 MUC5AC의 발현이 상승하는 것으로 나타내었다. 본 연구 결과를 통해 LPS 유도 염증성 HT-29 장세포에서 무화과 열매 열수 추출물이 면역 자극 및 장벽 보호 유전자 발현의 조절 가능성을 제시하였다. 이의 결과는 무화과 열매의 장세포에서 면역성 생리활성을 연구하는 기초자료로 활용할 수 있으리라 생각된다.

이 연구는 전라남도농업기술원 과수연구소의 「지역농업연구기반 및 전략작목육성 연구사업」(과제번호: RS-2022-RD010379)의 재원을 지원을 받아 수행되었으며, 2021년도 과학기술정보통신부 「2021년도 마이크로바이옴 기반 스마트 웰에이징 기술개발」 사업(No.2021-DD-UP-0380), 「2022년 바이오의료기술개발」 사업(2022M3A9B6017813)의 도움을 받아 수행된 연구입니다.

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(9): 921-927

Published online September 30, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.9.921

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Lipopolysaccharide로 유도한 HT-29 세포의 염증반응에서 무화과 열매 추출물의 면역 자극 효과

유양희1․강상미1․이소미2

1동신대학교 산학협력단 및 마이크로바이옴웰에이징사업단
2전라남도농업기술원 과수연구소

Received: June 18, 2024; Revised: August 14, 2024; Accepted: August 16, 2024

Immunostimulatory Effects of Ficus carica Fruit Extracts on LPS-Induced Inflammation of HT-29 Cells

Yanghee You1 , Sang-Mi Kang1, and Somi Lee2

1Industry-Academy Cooperation Foundation and Microbiome Based Well-Aging Research Center, Dongshin University
2Fruit Research Institute, J eollanamdo Agricultural Research and Extension Services

Correspondence to:Yanghee You, Industy-Academy Cooperation Foundation, Dongshin University, 102-9, Dongshindae-gil, Naju-si, Jeonnam 58245, Korea, E-mail: yyhyewha@gmail.com

Received: June 18, 2024; Revised: August 14, 2024; Accepted: August 16, 2024

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

In this study, the radical scavenging and protective immune response activities of hot-water (FCFH) and stirring-water (FCFS) extracts of the Ficus carica fruit were evaluated. The properties of the extracts were measured with respect to their phenolic components, radical scavenging properties, immune cytokine expression levels, and mucine mRNA expression on the lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation of HT-29 cells. The FCFH exhibited higher levels of total phenolic and flavonoid components compared to the FCFS. The FCFH had relatively higher radical scavenging capability as assessed by the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) assays as compared to the FCFS. The FCFH modulated the level of LPS-induced inflammatory cytokines, interleukin (IL)-6, IL-8, IL-10, and cyclooxygenase-2 in the HT-29 cells. Also, mucin 2 and mucin 5AC, protector proteins of the gut barrier and regulators of intestinal homeostasis, were up-regulated by the FCFH treatment of the HT-29 cells. These results indicate that the FCFH exerts immunostimulation and barrier gene expression in LPS-induced inflammation of human colon HT-29 cells. These findings may provide a scientific basis for investigating the protective immune response to the inflammation human intestine cells.

Keywords: Ficus carica fruit extract, immunostimulatory, antioxidant, HT-29 cell, cytokine

서 론

생체조직의 방어로 나타나는 염증반응은 염증 매개 물질에 의해 발적, 발열, 종창, 동통 등의 증상을 유도하고, 염증 상태가 질병의 상태를 악화시키거나 신규 질병의 원인이 되기도 한다(McInnes와 Gravallese, 2021). 외인성 물질에 대한 방어 작용으로 나타나는 면역반응은 염증반응으로 나타난다. 급성염증은 세균의 침입, 미생물, 손상된 조직에서 발생하며, 급성 염증이 지속적으로 나타나 분해되거나 제거되지 않은 미생물과 감염물질이 존재하거나 지속적으로 자가면역 반응이 나타나는 경우에 만성 염증으로 발전된다(Rabson 등, 2005).

인체는 생명을 유지하기 위해 산소가 필요하며, 산소를 활용하는 대사과정에서 활성산소종(reactive oxigen species, ROS)은 필수적으로 발생한다. ROS는 체내에서 효소 및 비효소적 항산화계의 도움으로 균형을 유지하게 된다. 체내의 ROS가 과도한 생성 상태, 즉 산화 스트레스 상태에서는 세포나 조직의 손상이나 면역 반응의 붕괴를 가져올 수 있고, 이들은 염증성 질환으로 발전할 수 있다. 여러 연구를 통해 ROS의 과도한 생성은 항산화제 보조 섭취로 균형을 유지할 수 있고 질병 예방에 기여할 수 있음이 보고된 바 있다. 특히 천연 식물체에 함유량이 높은 폴리페놀성 화합물들은 ROS를 제거하는 효과를 보여주었으며, 다양한 역학 연구들에서 폴리페놀이 풍부한 식이가 ROS에 의한 질병의 발병을 예방하는 것으로 제시된 바 있다(Brambilla 등, 2008; Stocker, 1999).

장의 염증은 장에 염증이 생기는 질병으로 다양한 연령에 걸쳐 나타날 수 있고, 다양한 장 구조 속에서 발생할 수 있다. 장의 염증에 대한 임상 증상은 경미하게 또는 심하게 나타나며, 심한 경우에는 쇼크에 빠지고 전해질 손상으로 경련까지 나타나는 것으로 발전하기도 한다. 장의 염증은 음식에 의한 경미한 염증, 중독에 의한 염증, 바이러스 감염에 의한 염증까지 원인은 매우 다양하다.

병원균의 내독소로 작용하는 lipopolysaccharide(LPS)는 그람 음성세균의 막구조물이며, 다당류와 소량의 단백질 및 인지질로 구성되어 있다. LPS는 세포와 조직에서 사이토카인의 분비와 여러 전사인자의 조절에 관여한다. 또한 LPS의 과도한 자극으로 염증성 사이토카인들의 분비뿐만 아니라 염증성 활성산소들의 생성을 촉진하여 염증반응을 유도하는 연구의 실험 모델의 유도제로 사용되어 왔다(Morris 등, 2022).

염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)은 서구화된 식생활의 증가와 항생제 사용 등의 증가로 매년 그 유병율이 증가하고 있고, 그 원인으로 장내 세균 등의 환경적 영향 및 면역 반응 이상 등이 알려져 있다. 최근 IBD와 유사한 설사, 혈변, 복통, 체중감소, 심한 피로감 등의 증상을 호소하나 염증을 동반하지 않는 것으로 해석되고 있는 과민성장증후군(inflammatory bowel syndrome, IBS)의 빈도 또한 높아지고 있다. 염증을 동반하는 IBD의 치료에는 5-aminosalicylic acid, 스테로이드제제, 면역억제제 등이 사용되고 있으나, 이들의 치료와 예방에 도움을 줄 수 있는 천연물 및 식품 소재들의 발굴과 연구가 꾸준히 추진되고 있다(Lee, 2011; Shin 등, 2015; Yang 등, 2015).

무화과(Ficus carica L.)는 아열대성 낙엽활엽수로 뽕나무과(Moraceae)에 속하며 전 세계적으로 600여 종이 알려져 있고, 미국, 이탈리아, 터키, 스페인, 포르투갈 등의 지역에서 재배되고 있다. 국내에는 봉래시, 승정 도우핀 품종이 주로 생식용으로 재배되고 있다. 식용 과일로 전 세계적으로 재배되며, 전통적으로 소화제, 내분비계, 호흡기계와 관련하여 널리 사용되어 왔다(Badgujar 등, 2014). 2021년 국내 무화과 재배면적이 증가하고 있으나, 고차가공 제품을 위한 무화과 소재화 연구가 제한적으로 수행되어 있어 소재화 발굴 연구의 필요성이 제기되었다. 이에 본 연구에서는 전라남도에서 재배・생산되는 무화과 열매 추출물을 이용하여 LPS 처리에 의한 염증 유도 세포모델에서의 면역 사이토카인의 발현 변화를 확인하였다.

재료 및 방법

실험 재료

본 연구에서는 2023년 전라남도 영암군에서 재배된 무화과나무 열매를 전라남도 농업기술원 과수연구소에서 제공받아 사용하였다. 무화과 열매는 추출 전까지 -70°C 냉동고에 보관하였다. 무화과 열매의 추출물은 열매를 0.5 cm 두께의 편으로 동결건조기(Bondiro DC1316, Ilshin Lab Co.)로 건조하였고, 분쇄기로 분쇄하여 -20°C의 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다. 무화과 열매 분말을 추출 용기에 넣고 중량 20배(w/v)의 물을 첨가하였다. 무화과 열매 열수 추출물은 100°C에서 3시간 동안 환류 추출한 후 여과지(Whatman No. 1)를 사용하여 2회 흡입 여과하였다. 무화과 열매 교반 물 추출물은 25°C에서 12시간 동안 stirring 추출한 후 여과지(Whatman No. 1)를 사용하여 2회 흡입 여과하였다. 각 여과액은 감압농축기(EYELA SB1200B, Tokyo Rikakikai Co.)로 농축하였고, 농축액은 동결 건조하여 열수 추출물(FCFH)과 교반 물 추출물(FCFS)을 획득하였다. FCFH는 40.7 g/100 g, FCFS는 12.9 g/100 g의 양으로 회수되었다. 이들 추출물은 -20°C에 보관하면서 본 연구의 시료로 사용하였다.

총 폴리페놀 함량 측정

Folin-Ciocalteu’s phenol(Sigma-Aldrich Co.) 시약을 이용한 총 폴리페놀 함량은 앞서 문헌에 제시된 방법을 활용하여 측정하였다(Lee 등, 2012a, 2012c). 추출물 1 mL를 25 mL volumetric 플라스크에 넣고 증류수 9 mL를 첨가한 후 1 mL의 Folin-Ciocalteu’s phenol 시약을 넣고 잘 섞어 상온에 5분간 방치하였다. 7% Na2CO3(Sigma-Aldrich Co.)를 10 mL 넣고 총량이 25 mL가 되도록 증류수를 첨가한 후 23°C에서 90분간 방치하고 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 총 폴리페놀 함량은 tannic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용한 표준곡선식을 이용하여 산출하였고 3회 반복 실험한 후 그 평균값을 %로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량은 시료 내의 카테콜 구조가 알루미늄 분자와의 복합체를 형성하여 나타내는 붉은색의 복합체를 아질산염하에서 측정하는 방법을 활용하였다. 추출물 1 mL에 4 mL의 증류수를 첨가하고 5% NaNO2 0.3 mL를 넣어 잘 혼합하고, 상온에 5분간 세워둔 후 10% AlCl3(Duksan Co.) 0.3 mL를 첨가하였다. 상온에 6분간 방치한 후 1 M NaOH(Duksan Co.) 2 mL를 넣고, 증류수를 2.4 mL 넣어 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 총 플라보노이드 함량은 catechin hydrate로 작성된 표준곡선식을 이용하여 산출하였고 3회 반복 실험한 후 그 평균값으로 제시하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성 측정

DPPH 라디칼 소거 활성은 무화과 추출물을 용매에 녹인 후 추출물 0.4 mL를 취하여 0.3 mM DPPH를 제조하여 0.4 mL와 혼합하였다. 상온에서 30분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 scavenging activity(%)=[(용매의 흡광도-시료의 흡광도)/용매의 흡광도]×100으로 계산하였고 3회 반복 측정한 후 그 평균값으로 제시하였다.

ABTS 라디칼 소거 활성 측정

7 mM ABTS 용액과 100 mM 황산칼륨(Duksan Co.)을 혼합하여 암소에서 24시간 반응시킨 후 20:1로 희석하여 ABTS 반응액을 준비하였다. 무화과 물 추출물은 용매에 녹여 준비한 후 추출물 80 μL에 7 mM ABTS 용액 720 μL를 첨가한 3분 후 735 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성은 scavenging activity(%)=[(대조군의 흡광도-시료의 흡광도)/대조군의 흡광도]×100으로 계산하였고 3회 반복 측정한 후 그 평균값을 제시하였다.

HT-29 세포 배양

HT-29 세포는 American Type Culture Collection에서 구입하였고, RPMI 1640 배양액에 10% fetal bovine serum을 첨가하고, 100 μL/mL penicillin-streptomycin(Sigma-Aldrich Co.)을 처리하여 37°C, 5% CO2의 조건에서 배양하였다.

세포독성

96-Well plate에 HT-29 세포를 8×103으로 seeding 하였다. 24시간 후에 농도별로 무화과추출물을 처리한 후 0.2 mg/mL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma-Aldrich Co.) 시약을 2시간 동안 반응시킨 후 상층액을 제거하고 200 μL의 dimethyl sulfoxide를 처리하여 형성된 formazan을 용출한 후 ELISA reader(Versamax, Molecular Device)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(Carmichael 등, 1987). 세포 생존율은 추출물을 처리하지 않은 control을 기준으로 다음의 식을 활용하여 계산하였다. Cell viability(%)=100×추출물 처리군의 흡광도/control의 흡광도.

RT-PCR

6-Well plate에 HT-29 세포를 25×104으로 seeding 하였다. 24시간 후에 무화과 추출물을 2시간 전처리한 후 LPS 400 ng/mL를 2시간 처리하였다. 세포를 Trizol 용매에 용해시켜 total RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 정량하고 cDNA 합성 후 interleukin-8(IL-8), interleukin-6(IL-6), interleukin-10(IL-10), cyclooxygenase(COX-2), mucin 2(MUC2), mucin 5AC(MUC5AC)의 발현 정도를 real-time PCR system(CronoSTAR 96, Takara Clontech)으로 분석하였다. 분석에 사용한 프라이머는 다음과 같다. 5′-GAGAGTGATTGAGAGTGGACCAC-3′(F: IL-8), 5′-CACAACCCTCTGCACCCAGTTT-3′(R: IL-8), 5′-AGACAGCCACTCACCTCTTCAG-3′(F: IL-6), 5′-TTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTG-3′(R: IL-6), 5′-TCTCCGAGATGCCTTCAGCAGA-3′(F: IL-10), 5′-TCAGACAAGGCTTGGCAACCCA-3′(R: IL-10), 5′-CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG-3′(F: COX-2), 5′-GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA-3′(R: COX-2), 5′-ACTCTCCACACCCAGCATCATC-3′(F: MUC2), 5′-GTGTCTCCGTATGTGCCGTTGT-3′(R: MUC2), 5′-CCACTGGTTCTATGGCAACACC-3′(F: MUC5AC), 5′-GCCGAAGTCCAGGCTGTGCG-3′(R: MUC5AC).

통계 처리

본 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 추출물별 차이 유무는 Student’s t-test를 활용하였고, 세포 실험의 처리군 비교는 one-way ANOVA로 분석한 뒤 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유의성을 검정하였다(P<0.05).

결과 및 고찰

총 폴리페놀 함량 및 플라보노이드 함량

추출물들의 생리활성물질 중 페놀류와 플라보노이드류는 높은 항염 및 항산화 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 최근 생리적인 기능성에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다(Al-Khayri 등, 2022; Cho와 Choi, 2015; Gonzalez 등, 2011; Joung 등, 2007; Liu 등, 2023; Yang 등, 2009). 무화과 열매 추출물의 폴리페놀성 화합물 함량을 측정한 결과 FCFH는 7.48±0.03 mg TA Eq/g, FCFS는 4.05±0.01 mg TA Eq/g으로 나타났다(Table 1). 무화과 열매 추출물의 플라보노이드 함량의 측정 결과 FCFH는 0.08±0.01 mg catechin Eq/g, FCFS는 0.06±0.01 mg catechin Eq/g으로 나타났으며, FCFH가 상대적으로 높은 함량을 나타내었다.

Table 1 . Total phenolic acid, total flavonoid, and total polysaccharide contents of Raphanus sativus water extract.

ExtractsTotal phenolic content (mg TA Eq/g)Total flavonoid contents (mg Catechin Eq/g)
FCFH7.48±0.03*0.08±0.01*
FCFS4.05±0.010.06±0.01

FCFH: hot-water extract from Ficus carica fruit. FCFS: stirring-water from Ficus carica fruit..

Data are presented as mean±SD. *P<0.05..



DPPH 라디칼 소거 활성

DPPH 라디칼 소거 능력은 시료가 함유한 전자공여능(electron donating ability)에 의해 측정된다. DPPH는 매우 안정된 자유라디칼로 517 nm에서 광흡수를 나타내는 보라색 화합물로 유기용매에서 매우 안정되고, 항산화 활성 중 proton-radical scavenger에 의해 탈색되기 때문에 다양한 천연소재로부터 항산화 활성을 검색하는 데 주로 이용되고 있다(Lee 등, 2005). 무화과 열매 추출물들의 DPPH 라디칼 소거 활성은 Table 2에 제시하였다. 1,000 μg/mL의 농도에서 소거 활성은 FCFH는 72.8±0.2%, FCFS는 47.5±0.2%로 측정되었다.

Table 2 . DPPH anion radical and ABTS cation radical scavenging activity in extracts from Ficus carica fruit (%).

ExtractsDPPH anion radical scavenging activityABTS cation radical scavenging activity
FCFH72.8±0.2*94.7±0.1*
FCFS47.5±0.258.6±0.2

FCFH: hot-water extract from F. carica fruit. FCFS: stirring-water extract from F. carica fruit. Concentration of extracts is 1,000 μg/mL on DPPH. Concentration of extracts is 800 μg/mL on ABTS. Data are presented as mean±SD. *P<0.05..



ABTS 라디칼 소거 활성 측정

ABTS는 비교적 안정된 자유라디칼로써 DPPH 방법과 함께 항산화 활성을 검색하는 데 많이 이용되고 있다. 또한 lipophilic 또는 hydrophilic 항산화 물질의 측정에 적용 가능한 방법으로 이 방법에 의한 항산화 활성은 ABTS 라디칼을 억제하거나 소거하는 것으로 이루어진다. 각 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 Table 2와 같다. 각 추출물의 800 μg/mL의 농도에서 소거 활성은 FCFH는 94.7±0.1%, FCFS는 58.6±0.2%로 측정되었다.

세포 독성

MTT를 살아있는 세포에 처리하면 mitochondria에 있는 reductase에 의해 환원되어 formazan crystal을 형성하게 되며, 이를 측정하여 세포 생존율을 판단하는 데 사용한다(Carmichael 등, 1987; Han 등, 2011). 본 연구에서 각 추출물을 대상으로 세포에서 염증 작용 영향을 확인하기 위해 0, 400, 600, 800 μg/mL 농도의 추출물을 준비하고 24시간 동안 처리하였다. 각 농도에서 FCFH와 FCFS는 세포 생존율이 100%로 나타났다(Fig. 1).

Fig 1. Cytotoxicity of Ficus carica fruit extracts in HT-29 cell. FCFH: hot-water extract from Ficus carica fruit, FCFS: stirring-water extract from Ficus carica fruit. Data are presented as mean±SD.

사이토카인의 발현

본 실험에서 LPS 처리에 따라 증가한 염증반응을 유도한 전염증성 사이토카인 IL-6, IL-8, COX-2 유전자의 발현은 FCFH 처리에 따라 LPS 처리군과 비교하여 0.4배, 0.7배, 0.2배 감소하였으며, 항염증 IL-10의 유전자 발현율은 LPS 처리군과 비교하여 2.3배 증가하는 것을 확인하였다. 장상피세포의 보호 당단백질인 mucin의 발현율은 MUC2와 MUC5AC의 발현율을 평가한 결과, MUC2의 발현은 LPS 처리에 따라 감소하였고, FCFH 처리에 따라 LPS 처리군과 비교하여 0.2배 발현율이 증가하였다. MUC5AC의 발현은 LPS 처리에 따라 감소하였고, FCFH와 FCFS 처리를 통해 LPS 처리군과 비교하여 7.2배와 4.2배 증가하였다(Fig. 2).

Fig 2. Cytokine mRNA level on LPS-stimulated of HT-29 cell. (A) Interleukin-6 (IL-6), (B) interleukin-8 (IL-8), (C) cyclooxygenase (COX-2), (D) interleukin-10 (IL-10). Control: vehicle treatment on HT-29 cells. LPS: 400 ng/mL LPS on 24 h, FCFH: 600 μg/mL hot-water extract from Ficus carica fruit, FCFS: 600 μg/mL stirring-water extract from F. carica fruit. Data are presented as mean±SD. *vs. Control, P<0.05; #vs. LPS, P<0.05.

LPS 자극에 의해 세포 내 발현된 iNOS는 과량의 NO를 생성하게 되며, 대식세포의 과도한 활성화, 박테리아 파괴와 같은 면역 반응을 나타내며, 염증을 나타내는 중요 지표인 전염증성 사이토카인들의 분비를 조절하고 다른 염증 매개체의 유도, 면역반응의 조절에 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Jang 등, 2016; Lee 등, 2012b; Yun 등, 2008).

Polymerase chain reaction(PCR)은 두 개의 합성 oligonucleotide(primer)를 이용하여 목적 DNA의 부분을 특이적으로 증폭하는 방법으로, quantitative PCR을 활용하여 추출물을 처리한 세포에서 항염증 및 장벽보호 유전자 부위의 증폭량을 평가한다. 염증성 사이토카인은 외부 자극원인 LPS에 빠르게 반응하여 혈액, 조직 내 사이토카인과 면역원성 세포를 유도하여 면역 방어를 마련하는 역할을 하고 있다. 이들의 과발현과 전사체들의 유도 작용은 급성, 만성염증 질환의 치료에 유용하게 활용될 수 있는 항염증제 및 면역조절제의 특징을 규명하는 데 활용되고 있다. 본 연구에서 사용한 IL-6의 경우 T 세포와 대식세포의 작용을 유도하며, IL-10의 경우 사이토카인의 생산을 억제하고 단핵세포의 기능을 나타내어 항염증성 특징을 나타낸다(Kim 등, 2021; Park과 Song, 2007). 사이토카인 IL-8은 세포에 염증이 발생하면 호중구 및 백혈구 세포를 염증 반응 부위로 이동시키는 역할과 식균작용을 유도하는 것으로 알려져 있다(De Gregorio 등, 2022). FCFH의 전처리군에서 동일한 LPS 염증을 유도하였을 때 IL-8의 발현량을 증가시켰다. 본 연구에서 LPS 처리로 염증성 발현이 증가한 COX-2는 FCFH의 처리에 따라 대장암 세포에서 감소하였다. 염증성 장 질환 및 염증성 대장암에서 COX-2의 발현 증가는 대장염을 악화시키는 것으로 보고된 바 있다(Park과 Song, 2007). 또한 대장암 세포에서 장 점막 항상성을 유지하는 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다(Ternet과 Kiel, 2021). LPS 처리에 의한 미세아교세포에서 COX-2와 IL-6 발현 감소는 본 연구 결과와 유사하였고, 클라라 세포 연구에서도 유사하게 나타났다(Britt 등, 2012; Zhu 등, 2018). 이들의 연구 결과를 살펴보았을 때 무화과 열매 물 추출물의 처리는 STAT3 signaling에 작용하여 항염증성 약물과 유사한 자극 효과를 나타내었으며, 이 결과로 FCFH는 염증성 장세포의 보호효과를 가질 수 있을 것으로 추정해 볼 수 있었다.

장의 자극 물질로부터 장벽을 보호하고 장내 미생물 항상성을 조절하여 보호하는 역할을 하는 뮤신 단백질의 발현 유전자는 현재까지 12개가 보고되고 있다. MUC2와 MUC5AC는 장점막, 기도점막, 생식기 점막에서 발현량이 높은 겔상 분비 점액성 단백질이다(Hsu 등, 2017; Hu 등, 2022; Wang 등, 2013). 본 연구에서 HT-29 세포에서 두 단백질의 유전자 MUC2와 MUC5AC 발현을 확인하여 Fig. 3에 제시하였다. LPS 염증이 유도된 HT-29 세포의 유전자 발현을 살펴보았을 때 FCFH의 처리가 두 개의 장점막 보호 유전자의 발현을 높이는 작용을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

Fig 3. Mucin mRNA expression level on LPS-stimulated of HT-29 cell. (A) Mucine 2 (MUC2), (B) mucine 5AC (MUC5AC). Control: vehicle treatment on HT-29 cells. LPS: 400 ng/mL LPS on 24 h. FCFH: 600 μg/mL hot-water extract from Ficus carica fruit. FCFS: 600 μg/mL stirring-water extract from F. carica fruit. Data are presented as mean±SD. *vs. Control, P<0.05; #vs. LPS, P<0.05.

무화과 열매에서 scopoletin과 같은 coumarin 계열, cyanidin-3-O-glucoside와 같은 anthocyanin 계열, stilbenes와 같은 hydrocarbon의 페놀성 물질과 플라보노이드류 성분이 무화과 열매의 항산화, 항염증, 면역 조절자의 역할을 한다고 보고된 바 있다(Badgujar 등, 2014). 본 연구에서 두 추출물의 페놀성 화합물과 플라보노이드성 화합물을 분석한 결과를 통해, 무화과 열매 열수 추출물 내의 페놀성 화합물과 플라보노이드류의 성분이 면역 자극 효과를 갖는 것으로 추정할 수 있었다. 향후 같은 추출물에서의 항산화 활성을 갖는 후보물질의 분자수준의 분석을 통해 무화과 열매 열수 추출물의 면역 자극 효과를 갖는 물질을 규명할 수 있을 것으로 판단된다.

이들의 결과를 통해 무화과 열매 열수 추출물의 폴리페놀성 물질의 함량과 라디칼 소거 활성을 확인하였다. HT-29 세포의 LPS-유도 염증반응에서 IL-6, IL-8, COX-2 면역세포 유도에 작용하는 전염증성 사이토카인의 발현을 억제하였으며, IL-10과 같은 항염증성 사이토카인의 발현을 높이는 작용을 확인하였다. 장세포의 장점막 분비성 보호 물질인 뮤신의 발현에 작용하는 MUC2와 MUC5AC 발현을 유효하게 증가시키는 면역성 자극 효과를 나타내어 장 건강에 유효한 작용을 나타낼 수 있음을 확인하였다. 향후 무화과 열매 열수 추출물이 포함하는 물질들의 면역성 자극의 조절 작용 및 이들의 생리활성 물질의 규명 연구가 진행될 예정이다.

요 약

본 연구는 무화과 열매 열수 추출물과 교반 물 추출물의 항산화 및 항염증 효과를 평가하였다. 무화과 열매 열수 추출물은 교반 물 추출물과 비교하여 상대적으로 높은 페놀성 물질 함량과 라디칼 소거 활성을 나타내었다. 또한, 무화과 열매 열수 추출물의 염증반응 유도에 따른 면역반응의 작용을 확인하고 장 건강 후보 소재로써의 활성을 평가하기 위해 HT-29 장세포에서 각 추출물을 처리하여 장세포에서 발현되는 항염증, 면역 매개체 유도, 장벽 보호의 활성을 나타내는 유전자의 발현율을 비교하였다. 무화과 열매 열수 추출물에서 항염증성 및 면역 매개체 유도 사이토카인(IL-6, IL-8, COX-2, IL-10)의 유전자의 발현과 장벽보호물질인 뮤신의 유전자 MUC2와 MUC5AC의 발현이 상승하는 것으로 나타내었다. 본 연구 결과를 통해 LPS 유도 염증성 HT-29 장세포에서 무화과 열매 열수 추출물이 면역 자극 및 장벽 보호 유전자 발현의 조절 가능성을 제시하였다. 이의 결과는 무화과 열매의 장세포에서 면역성 생리활성을 연구하는 기초자료로 활용할 수 있으리라 생각된다.

감사의 글

이 연구는 전라남도농업기술원 과수연구소의 「지역농업연구기반 및 전략작목육성 연구사업」(과제번호: RS-2022-RD010379)의 재원을 지원을 받아 수행되었으며, 2021년도 과학기술정보통신부 「2021년도 마이크로바이옴 기반 스마트 웰에이징 기술개발」 사업(No.2021-DD-UP-0380), 「2022년 바이오의료기술개발」 사업(2022M3A9B6017813)의 도움을 받아 수행된 연구입니다.

Fig 1.

Fig 1.Cytotoxicity of Ficus carica fruit extracts in HT-29 cell. FCFH: hot-water extract from Ficus carica fruit, FCFS: stirring-water extract from Ficus carica fruit. Data are presented as mean±SD.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 921-927https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.9.921

Fig 2.

Fig 2.Cytokine mRNA level on LPS-stimulated of HT-29 cell. (A) Interleukin-6 (IL-6), (B) interleukin-8 (IL-8), (C) cyclooxygenase (COX-2), (D) interleukin-10 (IL-10). Control: vehicle treatment on HT-29 cells. LPS: 400 ng/mL LPS on 24 h, FCFH: 600 μg/mL hot-water extract from Ficus carica fruit, FCFS: 600 μg/mL stirring-water extract from F. carica fruit. Data are presented as mean±SD. *vs. Control, P<0.05; #vs. LPS, P<0.05.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 921-927https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.9.921

Fig 3.

Fig 3.Mucin mRNA expression level on LPS-stimulated of HT-29 cell. (A) Mucine 2 (MUC2), (B) mucine 5AC (MUC5AC). Control: vehicle treatment on HT-29 cells. LPS: 400 ng/mL LPS on 24 h. FCFH: 600 μg/mL hot-water extract from Ficus carica fruit. FCFS: 600 μg/mL stirring-water extract from F. carica fruit. Data are presented as mean±SD. *vs. Control, P<0.05; #vs. LPS, P<0.05.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 921-927https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.9.921

Table 1 . Total phenolic acid, total flavonoid, and total polysaccharide contents of Raphanus sativus water extract.

ExtractsTotal phenolic content (mg TA Eq/g)Total flavonoid contents (mg Catechin Eq/g)
FCFH7.48±0.03*0.08±0.01*
FCFS4.05±0.010.06±0.01

FCFH: hot-water extract from Ficus carica fruit. FCFS: stirring-water from Ficus carica fruit..

Data are presented as mean±SD. *P<0.05..


Table 2 . DPPH anion radical and ABTS cation radical scavenging activity in extracts from Ficus carica fruit (%).

ExtractsDPPH anion radical scavenging activityABTS cation radical scavenging activity
FCFH72.8±0.2*94.7±0.1*
FCFS47.5±0.258.6±0.2

FCFH: hot-water extract from F. carica fruit. FCFS: stirring-water extract from F. carica fruit. Concentration of extracts is 1,000 μg/mL on DPPH. Concentration of extracts is 800 μg/mL on ABTS. Data are presented as mean±SD. *P<0.05..


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