여주(Momoridica charantia L.)는 아마존, 동남아시아, 동아프리카 등의 열대지역에 서식하는 박목, 박과에 속하는 일년생 식물이다. 여주는 bitter melon이라 불릴 정도로 특유의 쓴맛이 있어 음식에 이용하기보다는 당뇨, 피부병, 야맹증, 류머티스, 황달 등을 치료하는 약재로 활용되어 왔다(Saeed 등, 2018). 여주에 함유된 알칼로이드, 사포닌, citruline, galacturonic acid, 식물스테롤 배당체 등으로 인해 독특한 쓴맛을 나타낸다(Divya 등, 2013; Grover와 Yadav, 2004). 또한 과실과 종자에 함유된 charantin은 지용성 물질로 췌장의 베타세포에 작용하여 인슐린 분비를 촉진하는 기능이 있어 혈당을 낮추는 항당뇨 효능이 있는 것으로 보고된다(Lee 등, 2012). 국내외 연구를 통해 여주는 강력한 항산화 효과, 항균 및 항암 작용이 있으며, 혈중 지질대사를 개선하고 신경세포 보호 효과, 조직손상 억제 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 여주가 지닌 생리활성에 대한 일반인들의 관심이 높아지면서 국내에서도 건강기능성 식품의 형태로 여주를 활용한 음료, 차, 환 등이 개발되었고, 여주를 일반 식품의 부재료로 첨가한 식품들이 일부 개발되었다. 여주 분말을 첨가한 요구르트(Park 등, 2018), 머핀(An, 2014), 양갱(Lee 등, 2015c), 막걸리(Cho 등, 2016), 간장(Hwang 등, 2017b), 된장(Hwang 등, 2017a), 설기떡(Yoon과 Lee, 2016)을 제조하여 품질특성, 생리활성 물질의 함량 및 항산화 활성을 측정한 연구가 진행된 바 있으나 여주즙을 제품개발에 활용한 사례는 거의 보고되지 않았다. 여주를 분말로 제조하기 위해서는 건조 및 분말화 작업 등 시간과 복잡한 절차가 필요한 반면, 즙은 신선한 여주를 착즙하는 과정만 거치므로 손쉽게 다양한 제품에 첨가할 수 있는 장점이 있다.

요구르트는 신선한 우유나 염소젖 등을 주원료로 하고 유산균을 첨가하여 발효 및 응고시킨 것으로, 전 세계적으로 널리 섭취되는 대중적인 건강식품 중 하나이다(Kim과 Ko, 1990). 요구르트는 발효과정을 거치면서 우유에 없는 인체에 유익한 프로바이오틱스 등의 미생물이 생성되고, 발효과정을 거치면서 생리활성 물질이 추가되어 풍부한 영양공급, 장내 환경 및 소화기 질병 개선, 면역체계 강화 등 건강에 좋은 효과를 준다(Savaiano와 Hutkins, 2021). 또한 요구르트를 꾸준히 섭취하면 심혈관 질환 및 당뇨병의 위험을 감소시키고 콜레스테롤 수치를 낮추며, 뇌 기능 향상을 통한 알츠하이머질환 예방에도 도움이 되는 것으로 보고된다(Kim 등, 2021; Savaiano와 Hutkins, 2021; Sung과 Choi, 2014). 플레인 요구르트 외에도 소비자의 취향과 기호도를 반영하여 딸기, 복숭아, 각종 베리류 등의 과일을 첨가한 제품들이 출시되었다. 또한 최근에는 건강 기능성을 강조한 오가피(Oh와 Kang, 2015), 참당귀잎(Kim 등, 2019), 삼백초(Lee 등, 2002), 레몬그라스(Kim과 Kang, 2017) 등과 같은 기능성을 지닌 식물을 분말 또는 추출물의 형태로 첨가한 다양한 요구르트 제품들이 개발되고 있다.

본 연구에서는 요구르트의 주재료인 우유와 탈지분유 대신 여주즙을 1~5% 비율로 첨가하여 요구르트를 제조한 후에 발효 특성, 이화학적 품질, 항산화물질의 함량 및 항산화 활성을 측정함으로써 요구르트 제조에 여주즙의 첨가 가능성을 탐색하였다.

실험재료 및 시약

여주는 천안 지역의 농장에서 수확한 것을 구입하여 사용하였다. 요구르트 제조에 사용한 우유(Seoul Milk), 탈지분유(Seoul Milk) 및 올리고당(CJ Cheiljedang)은 시중 마트에서 구입하였다. 케피어 스타터(TSI Inc.)는 온라인 쇼핑몰에서 구입하였다. Folin-Ciocalteu reagent, gallic acid, ascorbic acid, aluminum nitrate, FeCl₃, potassium acetate, aluminum nitrate, quercetin, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), FeSO₄･7H₂O(iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate), potassium persulfate는 Sigma-Aldrich Co.에서 구입하였으며, 그 외 시약들은 분석용 등급을 사용하였다.

여주즙 및 요구르트 제조

여주는 수돗물로 3회 세척한 후에 물기를 제거하고 주서기(Hurom 300)로 착즙하여 얻은 액을 요구르트 제조에 사용하였다. 요구르트는 선행 연구(Nguyen과 Hwang, 2016)를 참고하여 예비 실험 및 관능적 특성 검사를 거쳐 Table 1과 같은 비율로 제조하였다.

Table 1 . Formula for yogurt incorporated with various amount of bitter melon juice.

Ingredients (g)	Bitter melon juice1) (%)
	0	1	3	5
Bitter melon juice	0	5	15	25
Milk	450	445	435	425
Skim milk powder	50	50	50	50
Starter	2	2	2	2
Oligosaccharide	5	5	5	5
Total	507	507	507	507

¹⁾Bitter melon juice was added in amounts of 1, 3, and 5% of the combined weight of milk and skim milk powder..

우유와 탈지분유를 혼합하여 85°C에서 20분 동안 고압멸균기(LAC-5065SP, Lab Tech)로 살균한 후에 실온까지 냉각하고 액상 우유와 탈지분유를 합한 중량의 1%, 3%, 5%가 되도록 여주즙을 첨가하여 혼합하였다. 혼합물에 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis) 및 효모로 구성된 요구르트 스타터 분말을 주재료(우유, 탈지분유, 여주즙)의 0.4%를 접종하고 37°C로 세팅된 항온기(LIB-060E, Lab Tech)에서 24시간 동안 발효하였다. 발효 시간에 따른 요구르트의 품질특성을 관찰하기 위해 0, 3, 6, 12, 24시간별로 시료를 채취하여 각각의 품질특성을 분석하였다. 여주즙을 첨가하지 않고 제조한 요구르트를 대조군으로 하였다.

pH 및 산도

pH는 요구르트를 5배 희석하여 pH meter기(Orion 3 star Benchtop, Thermo Orion)로 측정하였다. 총산은 요구르트 5 mL에 증류수 20 mL를 첨가한 후 균질화한 다음 0.1 N NaOH로 pH 값이 8.2가 될 때까지 적정하고 젖산 함량으로 환산하여 백분율로 나타내었다.

가용성 고형물 및 점도

가용성 고형물은 디지털 당도계(PR-201α, Atago Co.)로 측정하였다. 요구르트의 점도는 점도계(Brookfield DV3T, AMETEK Brookfield Inc.)로 측정하였다. 시료 50 g을 용기에 취해 9번 spindle을 사용하여 10 rpm의 회전속도로 맞추어 10초 간격으로 2분간 작동시켜 측정하고 평균값으로 나타내었다.

유산균 수 측정

발효 시간별로 요구르트를 채취하여 0.85% 식염수로 10진 희석법에 의해 단계별로 희석한 후에 MRS 한천 배지(Difco, Becton Dickinson and Co.)에 도말하여 37°C에서 48시간 동안 발효하였다. 발효가 끝난 시료에 형성된 콜로니 수를 측정하고 희석배수를 곱하여 시료 mL당 유산균 수를 log colony forming unit(CFU/mL)으로 나타내었다.

색도 측정

요구르트의 색도는 색차계(Chrome Meter CR-300, Konica Minolta)로 명도(lightness, L^*값), 적색도(redness, a^*값), 황색도(yellowness, b^*값)를 측정하였다. 사용한 표준 백색판의 L^*, a^*, b^*값은 각각 97.10, +0.24, +1.75였다.

총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 클로로필 함량 측정

시료 5 g에 95% 에탄올 20 mL를 넣고 vortex mixer로 15초 동안 균질하게 혼합한 후 원심분리(13,500×g, 10 min) 하여 얻은 상등액으로 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 클로로필 함량을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법(Vasco 등, 2008)으로 측정하였다. 적절한 농도로 희석한 시료액과 2 N Folin 시약을 1:1로 혼합하여 실온에서 3분 동안 반응시킨 후에 3배의 2% sodium carbonate를 첨가하고 암소에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 혼합액의 흡광도를 760 nm에서 측정하고 gallic acid 표준곡선을 이용하여 각 시료 중에 함유된 총 폴리페놀 함량을 gallic acid equivalent(GAE)로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량은 Woisky와 Salatino 방법(1998)으로 측정하였다. 적절한 농도로 희석한 시료 추출액과 2% aluminium chloride 용액을 1:1로 혼합하여 15분간 실온 반응시켰다. 반응이 끝난 혼합액의 430 nm에서 흡광도를 측정하고 quercetin 표준곡선을 이용하여 시료 중에 함유된 총 플라보노이드 함량을 quercetin equivalent(QE)로 나타내었다.

총 클로로필 함량은 Moran(1982)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 0.1 g에 N,N-dimethylformamide를 5 mL 혼합하여 시료에 함유된 클로로필을 24시간 동안 추출하였다. 추출액은 원심분리(13,500×g, 10 min) 하여 상등액을 얻어 647 nm와 664 nm에서 각각의 흡광도를 측정하고 아래 식에 따라 총 클로로필 함량을 계산하였다.

총 클로로필(μg/mL)＝(20.27×A₆₄₇)+(7.07×A₆₆₄)

20.27과 7.07은 647 nm와 664 nm에서의 흡수계수(absorption coefficient)임

항산화 활성 측정

요구르트 시료 5 g에 95% 에탄올 20 mL를 넣고 vortex mixer로 15초 동안 균질하게 혼합한 후 원심분리(13,500×g, 10 min) 하여 얻은 상등액으로 DPPH 및 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(ABTS) 라디칼 소거 활성을 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 Cheung 등(2003)의 방법으로 측정하였다. 요구르트 추출액과 0.2 mM DPPH 용액을 각각 100 μL씩 혼합하여 37°C에서 30분간 반응시킨 후 분광광도계로 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아래 식에 따라 DPPH 라디칼 소거 활성을 계산하였다.

ABTS 라디칼 소거 활성은 Re 등(1999)의 방법으로 측정하였다. 실험 시작 하루 전에 7.0 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 암소에서 반응시켜 ABTS 양이온이 형성되도록 하였다. 시료 추출액과 ABTS 용액을 각각 100 μL씩 혼합하여 37°C에서 30분간 반응시킨 후 분광광도계로 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아래 식에 따라 ABTS 라디칼 소거 활성을 계산하였다.

통계분석

모든 측정은 3회 반복하여 평균(mean)±표준편차(standard deviation)로 나타내었고, 분석 결과에 대한 통계처리는 R-Studio(Version 3.5.1)를 이용하였다. ANOVA를 이용하여 각 처리군 간의 유의성을 확인한 후 P<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 이용하여 분석하였다.

요구르트의 pH 및 산도

요구르트의 제조를 위해 각 재료를 Table 1의 비율로 첨가하여 37°C에서 24시간 동안 발효하면서 pH와 총산도의 변화를 측정하고 Table 2에 제시하였다. 요구르트를 24시간 동안 발효하는 동안 대조군과 실험군의 pH가 모두 감소하였다. 여주즙을 첨가하지 않은 대조군의 초기 pH 값은 6.68±0.01이었고, 여주즙을 1~5% 첨가한 시료에서는 6.50±0.00~6.66±0.01로 대조군에 비해 낮은 pH 값을 나타냈으며, 여주즙 첨가량에 비례하여 초기 pH 값은 낮게 나타났다. 발효 3시간 후부터 pH가 감소하였고 발효가 24시간까지 지속됨에 따라 pH도 계속 낮아짐을 확인하였다. 여주즙을 3% 첨가한 요구르트의 경우 발효 6시간과 12시간 경과 후의 pH 값은 각각 5.75±0.01 및 4.99±0.00으로 발효 시간이 경과함에 따라 pH가 낮아졌다. 여주즙을 첨가하지 않은 대조군의 경우 24시간 발효 후의 pH 값은 4.39±0.00을 나타냈고, 여주즙을 1%, 3%, 5% 첨가한 요구르트의 pH 값은 각각 4.39±0.01, 4.34±0.00, 4.32±0.00으로 여주즙 첨가량이 많은 요구르트의 pH가 더 낮음을 확인하였다. 여주즙을 첨가하지 않은 대조군에 비해 여주즙을 첨가하여 제조한 요구르트의 pH 감소 속도가 더 빨랐고, 24시간 동안 발효한 최종 제품에서도 여주즙 농도에 비례하여 pH가 낮아짐을 확인하였다.

Table 2 . Changes of pH and total acidity during fermentation of yogurt containing various amounts of bitter melon juice.

	Fermentation time (h)	Bitter melon juice (%)
		0	1	3	5
pH	0	6.68±0.01aA1)2)	6.66±0.01bA	6.57±0.01cA	6.50±0.00dA
	3	6.42±0.01aB	6.41±0.01bB	6.40±0.01cB	6.35±0.03dB
	6	5.84±0.00aC	5.79±0.00bC	5.75±0.01cC	5.70±0.00dC
	12	5.05±0.01aD	5.05±0.01aD	4.99±0.00bD	4.96±0.01cD
	24	4.39±0.00aE	4.39±0.01aE	4.34±0.00bE	4.32±0.00cE
Total acidity (%)	0	0.05±0.01cE	0.05±0.00cE	0.08±0.01bE	0.11±0.02aE
	3	0.10±0.01dD	0.11±0.01cD	0.12±0.00bD	0.13±0.00aD
	6	0.38±0.00dC	0.40±0.01cC	0.41±0.00bC	0.42±0.01aC
	12	0.61±0.00dB	0.63±0.03cB	0.65±0.00bB	0.72±0.00aB
	24	0.95±0.03cA	0.99±0.03bA	0.99±0.03bA	1.06±0.03aA

Data were the mean±SD of triplicate experiment..

¹⁾Means with the different superscripts (a-d) within the same row are significantly different at P<0.05..

²⁾Means with the different superscripts (A-E) within the same column are significantly different at P<0.05..

요구르트는 발효과정을 거치면서 유산균에 의해 우유의 유당이 분해되어 젖산을 생성하므로 발효 시간이 길어짐에 따라 pH가 감소하는 것으로 사료된다. 또한 여주에는 클로로겐산을 포함한 약 0.11%의 유기산이 함유되어 있는데(Islam 등, 2011), 여주즙 첨가량이 증가함에 따라 유기산 함량이 증가하면서 요구르트의 pH도 감소한 것으로 사료된다. 선행 연구(Chamber, 1979; Kroger와 Weaver, 1973)에 따르면 요구르트의 적정 pH를 3.80~4.53의 범위로 보고하는데, 요구르트 제조 시 여주즙을 1~5%까지 첨가하여도 이 기준을 충족하는 것을 확인하였다.

총 산도는 24시간 발효하는 동안 증가하였으며, 발효 후 12시간부터 대조군과 여주즙 첨가 요구르트 사이의 차이가 더욱 뚜렷하게 나타나 요구르트를 24시간 동안 발효하는 동안 대조군과 실험군의 총 산도는 모두 증가하였다. 여주즙을 첨가하지 않은 대조군과 여주즙을 1% 첨가한 시료의 초기 산도는 모두 0.05±0.01%였고, 여주즙을 3% 및 5% 첨가한 시료에서는 0.08±0.01% 및 0.11±0.02%로 대조군과 여주즙 1% 첨가군에 비해 높은

산도 값을 나타냈다. 대조군의 경우 발효 3시간 후의 산도는 0.10±0.01%로 초기 시료에 비해 2배가량 증가하였고, 발효 시간이 24시간까지 지속됨에 따라 산도는 0.95±0.03%까지 확연히 증가함을 확인하였다. 여주즙을 1% 첨가한 요구르트의 경우 발효 6시간과 12시간 경과 후의 산도는 각각 0.40±0.01% 및 0.63±0.03%로 발효 시간이 길어짐에 따라 산도는 증가하였다. 요구르트를 24시간 동안 발효한 후에 확인한 대조군의 총 산도는 0.95±0.03%까지 증가하였고, 여주즙을 1%와 3% 첨가한 실험군의 산도는 모두 0.99±0.03%를 나타냈고, 여주즙 5% 첨가군에서는 1.06±0.03%의 산도를 나타내 대조군보다 높은 산도값을 보였다. 선행 연구(Kim 등, 1993; Lee 등, 1972; Pak 등, 2006)에 따르면 요구르트의 적정산도가 1.0~1.1%일 때 가장 좋은 품질을 나타내고, 한국인의 기호에 맞는 발효유의 적정산도라고 보고한 0.85~1.20%와 비교하여 볼 때, 요구르트 제조 시 여주즙을 1~5%까지 첨가하여도 이들 기준에 가장 부합한 것을 확인하였다.

요구르트의 가용성 고형물 및 점도

요구르트의 제조를 위해 각 재료를 혼합하여 37°C에서 24시간 동안 발효하면서 가용성 고형물과 점도의 변화를 측정한 결과는 Table 3과 같다. 요구르트를 24시간 동안 발효하는 동안 대조군과 실험군의 가용성 고형물은 감소하였다. 여주즙을 첨가하지 않은 대조군의 초기 가용성 고형물 함량은 23.60±0.14°Brix였고, 여주즙을 1~5% 첨가한 시료에서는 23.15±0.07~23.35±0.49°Brix로 대조군과 여주즙 첨가 시료 사이에는 통계적으로 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 대조군의 경우 요구르트 발효 3시간 후에는 23.55±0.07°Brix로 소폭 감소하였고, 발효 6시간과 12시간 후에는 가용성 고형물이 각각 20.60±0.00 및 16.50±0.45°Brix로 급격히 감소하였다. 여주즙을 1% 첨가한 요구르트의 경우 발효 6시간과 12시간 경과 후의 가용성 고형물은 각각 20.60±0.00 및 16.60±0.45°Brix로 발효 시간이 길어짐에 따라 가용성 고형물의 함량도 감소하였다. 여주즙을 첨가하지 않은 대조군의 경우 24시간 발효 후의 가용성 고형물은 14.80±0.17°Brix를 나타냈고, 여주즙을 1%, 3%, 5% 첨가한 실험군에서는 14.40±0.00 및 14.00±0.00°Brix를 나타냈다. Won 등(2018)은 시판되는 호상 요구르트 20종의 가용성 고형물을 분석한 결과 7.10~18.13°Brix로 보고하였는데, 본 실험에서 제조한 대조군과 여주즙 첨가 요구르트의 가용성 고형물과도 시판품과 유사한 가용성 고형물을 함유하고 있음을 확인하였다.

Table 3 . Changes of soluble solids and viscosity during fermentation of yogurt containing various amounts of bitter melon juice.

	Fermentation time (h)	Bitter melon juice (%)
		0	1	3	5
Soluble solids (°Brix)	0	23.60±0.14aA1)2)	23.15±0.07aA	23.35±0.49aA	23.30±0.28aA
	3	23.55±0.07aA	22.30±0.00bA	23.20±0.14bA	21.20±0.00bA
	6	20.60±0.00aA	20.60±0.00aA	20.50±0.14abA	20.05±0.35bA
	12	16.50±0.45aB	16.60±0.45aB	15.40±0.28bB	15.60±0.00bB
	24	14.80±0.17aC	14.40±0.00aC	14.40±0.00aC	14.00±0.00bC
Viscosity (cP)	0	22.01±2.25nsE	23.08±3.57E	23.14±3.93E	23.19±2.53E
	3	75.85±6.53nsD	77.54±5.96D	78.748±3.87D	79.35±4.67D
	6	217.73±18.62nsC	215.03±24.29C	212.50±24.53C	220.09±21.36C
	12	4,912.65±324.05nsB	4,997.74±265.21B	5,018.21±230.82B	4,918.62±291.33B
	24	8,741.67±615.32nsA	8,729.12±551.67A	8,892.14±463.24A	8,925.85±452.36A

Data were the mean±SD of triplicate experiment..

ns: not significant..

¹⁾Means with the different superscripts (a,b) within the same row are significantly different at P<0.05..

²⁾Means with the different superscripts (A-E) within the same column are significantly different at P<0.05..

발효하기 전 점도 값은 대조군과 실험군에서 22.01±2.25~23.19±2.53 cP로 매우 낮은 수치를 나타냈고, 대조군과 여주즙을 첨가한 실험군 사이의 통계적인 차이는 나타나지 않았다. 요구르트를 24시간 동안 발효하는 동안 대조군과 실험군의 점도는 모두 확연히 증가하였다. 발효 3시간 후부터 점도가 서서히 증가하기 시작하여 발효 24시간이 경과함에 따라 초기 점도에 비해 378.21~397.17배까지 증가하였다. 여주즙을 3% 첨가한 요구르트의 경우 발효 6시간과 12시간 경과 후의 점도는 각각 212.50±24.53 및 5,018.21±230.82 cP로 발효 시간이 길어짐에 따라 점도가 증가하였고, 이는 대조군의 점도와 비교할 때 통계적으로 차이가 없는 수치를 나타냈다. 요구르트를 24시간 동안 발효한 후에 확인한 대조군의 점도는 8.741.67±615.32 cP까지 증가하였고, 여주즙을 1~5% 첨가한 실험군의 점도는 8,729.12±551.67~8,925.85±452.36 cP를 나타냈고 대조군과 비교할 때 통계적인 차이를 보이지 않았다. 요구르트 제조 시 여주즙을 1~5% 첨가하여도 우유만으로 제조한 요구르트의 점도와 차이가 없었고, 이를 통해 1~5%의 여주즙 첨가는 요구르트의 점도 형성에 부정적인 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 점도는 요구르트의 커드 형성과 관련된 중요한 품질특성 중 하나로 발효 시간, 가용성 고형분의 함량, 단백질의 가수분해 정도, 사용 균주, 첨가한 부재료, 입자크기, 온도 등의 요인에 영향을 받는다(Lee와 Bae, 2017; Najgebauer-Lejko 등, 2020). 요구르트의 커드는 등전점에서 우유 단백질의 침전, protease에 의한 우유 단백질의 분해 및 응고, 유산균에 증가한 가용성 고형물의 응고 작용에 의해 복합적으로 형성되며, 요구르트의 안정성에 도움을 준다(Najgebauer-Lejko 등, 2020).

유산균 수

요구르트의 제조를 위해 37°C에서 24시간 동안 발효하면서 유산균 수의 변화를 측정한 결과는 Table 4와 같다. 요구르트 발효 전 유산균 수는 2.11±0.01 log CFU/mL로 대조군과 여주즙 첨가 시료 간의 차이는 나타나지 않았다. 발효 시간이 경과함에 따라 대조군과 여주즙 함유 시료 모두에서 유산균 수가 급격히 증가하였다. 3시간 발효 후 유산균 수치는 대조군에서 4.16±0.08 log CFU/mL로 나타났으며, 1% 및 3% 여주즙을 첨가한 요구르트는 각각 4.19±0.06 및 4.23±0.06 log CFU/mL로 대조군에 비해 높은 유산균 수치를 나타냈다. 여주즙을 5% 첨가한 시료에서는 4.19±0.07 log CFU/mL를 나타내 여주즙 3% 첨가군에 비해 유산균의 증식이 감소하였다. 요구르트의 발효가 6시간에서 24시간까지 길어짐에 따라 유산균 수는 지속적으로 증가하였다. 대조군에 비해 여주즙을 1~5% 첨가한 시료의 유산균 수가 더 빠르게 증가하였다. 24시간 동안 발효한 최종 제품의 경우 대조군에서는 8.89±0.17 log CFU/mL까지 증가하였고, 여주즙을 1~5% 첨가한 실험군에서도 8.92±0.20~8.95±0.17 log CFU/mL로 대조군과 비교할 때 유의성 있게 높은 수치를 나타냈다. 여주에는 비타민 C와 arginine, γ-aminobutyric acid, asparagine, alanine 등의 아미노산이 풍부하여(Lee, 2016) 유산균의 증식 및 성장에 긍정적인 영향을 준 것으로 사료된다. 여주즙 첨가량에 따른 유산균 수치를 비교하면 여주즙 5% 첨가군에 비해 1%와 3% 첨가군에서 더 높은 유산균 함량을 나타냈다. 선행 연구(Lee 등, 2015a)에서는 여주가 지닌 항균 활성도 보고되고 있는바, 요구르트 제조 시 여주즙을 우유 중량의 5% 이상 첨가하면 대조군에 비해서 유산균 수가 증가하였지만, 여주즙을 1~3% 첨가한 경우와 비교할 때 유산균 증식에 큰 도움을 주지 않는다는 사실을 확인하였다. 식품공전의 유가공품 기준 규격에 의하면 농후발효유의 총 유산균 기준은 8.0 log CFU/mL 이상이며(Hyun 등, 2020), 본 연구에서 24시간 발효를 거쳐 제조한 대조군과 실험군 요구르트들은 모두 이 기준을 충족하였다. 선행 연구에 따르면 곶감 추출물(Ko 등, 2008), 돼지감자 분말(Park 등, 2019), 흑미가루(Kang과 Kim, 2022)를 첨가하여 제조한 요구르트에서도 대조군에 비해 부재료를 첨가한 요구르트의 유산균 함량이 증가하여 본 연구와 유사한 결과를 나타냈다.

Table 4 . Changes of lactic acid bacteria count during fermentation of yogurt containing various amounts of bitter melon juice (log CFU/mL).

Fermentation time (h)	Bitter melon juice (%)
	0	1	3	5
0	2.11±0.01nsE1)	2.11±0.01E	2.11±0.01E	2.11±0.01E
3	4.16±0.08cD2)	4.19±0.06bD	4.23±0.06aD	4.19±0.07bD
6	7.95±0.13bC	7.99±0.14aC	7.99±0.13aC	7.98±0.12aC
12	8.37±0.19cB	8.45±0.17aB	8.45±0.18aB	8.43±0.18bB
24	8.89±0.17cA	8.94±0.18aA	8.95±0.17aA	8.92±0.20bA

Data were the mean±SD of triplicate experiment..

ns: not significant..

¹⁾Means with the different superscripts (A-E) within the same column are significantly different at P<0.05..

²⁾Means with the different superscripts (a-c) within the same row are significantly different at P<0.05..

색도

여주즙을 첨가하여 제조한 요구르트의 색도는 Table 5와 같다. 여주즙을 첨가하지 않고 제조한 대조군 요구르트의 밝기를 나타내는 명도는 58.53±0.57로 가장 높았고, 여주즙 함량이 1~5%로 증가함에 따라 명도는 58.35±0.64에서 53.84±0.35로 감소하였다. 적색도를 나타내는 a^*값은 여주즙을 첨가하지 않은 대조군에서 -1.73±0.05로 가장 낮은 값을 보였고, 여주즙 함량에 비례하여 -1.59±0.02에서 -1.28±0.03까지 소폭 증가하였다. 여주즙을 첨가하지 않고 제조한 요구르트의 황색도는 4.53±0.06으로 가장 낮았고, 여주즙을 1% 및 3% 첨가한 요구르트에서는 각각 5.14±0.10 및 5.23±0.02로 대조군에 비해 증가하였으며, 여주즙을 5% 첨가한 요구르트의 황색도는 5.40±0.20으로 가장 높은 값을 나타냈다. 여주 열매는 녹색 색소인 엽록소를 함유하며, 청록색을 나타내는 엽록소-a와 황록색을 나타내는 엽록소-b를 포함하고 있다(Lee 등, 2015b). 여주가 성숙함에 따라 엽록소 함량은 감소하고 카로티노이드가 증가한다(Lee 등, 2015b). 요구르트의 색도는 첨가한 여주즙에 포함된 클로로필과 카로티노이드 색소의 영향을 받아 여주즙 첨가량에 비례하여 명도는 감소하였고, 적색도와 황색도는 증가하는 경향을 낸 것으로 사료된다.

Table 5 . Color of yogurt containing various amounts of bitter melon juice.

Measurement	Bitter melon juice (%)
	0	1	3	5
Lightness (L*)	58.53±0.57a	58.35±0.64a	56.4±1.90b	53.84±0.35c
Redness (a*)	−1.73±0.05c	−1.59±0.02b	−1.30±0.05a	−1.28±0.03a
Yellowness (b*)	4.53±0.06d	5.14±0.10c	5.23±0.02b	5.40±0.20a

Data were the mean±SD of triplicate experiment..

¹⁾Means with the different superscripts (a-d) within the same row are significantly different at P<0.05..

총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 클로로필 함량

Table 6은 여주즙 함량을 달리하여 제조한 요구르트의 총 폴리페놀, 총 클로로필 및 총 플라보노이드 함량을 나타내었다. 총 폴리페놀 함량은 첨가한 여주즙 함량에 비례하여 증가하였다. 여주즙을 첨가하지 않은 플레인 요구르트는 99.89±5.86 μg GAE/g의 총 폴리페놀 함량을 보였고, 여주즙을 1% 및 3% 첨가한 요구르트에서는 각각 111.36±1.33 및 138.95±1.21 μg GAE/g의 총 폴리페놀 함량을 나타냈으며, 이는 대조군에 비해 1.11배 및 1.39배 증가한 수치였다. 여주즙을 5% 첨가한 요구르트의 총 폴리페놀은 165.95±1.82 μg GAE/g으로 대조군에 비해 1.66배 증가하였다. Kim 등(2017)은 70% 에탄올로 추출한 여주 추출물은 28.51 mg GAE/g의 총 폴리페놀과 3.95 mg CE/g의 플라보노이드가 함유되어 있음을 확인하였고, 여주에는 catechin, p-comaric acid, tannic acid, ferulic acid, gallic acid, caffeic acid와 같은 폴리페놀 화합물이 풍부하여 항산화 효능이 타 식물체에 비해 탁월한 것으로 보고되고 있다(Oh 등, 2017).

Table 6 . Total polyphenol, total flavonoid and total chlorophyll contents of yogurt containing various amounts of bitter melon juice.

Bitter melon juice (%)	Total polyphenols (μg GAE1)/g)	Total flavonoids (μg CE2)/g)	Total chlorophylls (μg/g)
0	99.89±5.86d3)	18.30±1.25d	－
1	111.36±1.33c	29.75±2.08bc	2.28±0.31c
3	138.95±1.21b	35.93±0.64b	4.06±0.36b
5	165.95±1.82a	40.80±0.77a	7.13±0.47a

Data were the mean±SD of triplicate experiment..

¹⁾GAE: gallic acid equivalent.

²⁾CE: catechin equivalent.

³⁾Means with the different superscripts (a-d) within the same column are significantly different at P<0.05..

총 플라보노이드 함량은 대조군에서 18.30±1.25 μg CE/g으로 가장 낮은 값을 나타냈고, 여주즙을 1% 및 3% 첨가한 요구르트에서 각각 29.75±2.08 및 35.93±0.64 μg CE/g의 함량을 나타냈으며, 이는 대조군에 비해 1.63배 및 1.96배 증가한 수치였다. 여주즙을 5% 첨가한 요구르트의 총 플라보노이드는 40.80±0.77 μg CE/g으로 대조군에 비해 2.23배 증가하였다.

총 클로로필은 여주즙을 첨가하지 않은 대조군에서는 검출되지 않았으나 여주즙 첨가 요구르트에서는 검출되었으며, 여주즙 첨가량에 비례하여 요구르트에 함유된 총 클로로필 함량도 증가하였다. 즉, 여주즙을 1%, 3%, 5% 첨가함에 따라 총 클로로필은 2.28±0.31, 4.06±0.36, 7.13±0.47 μg/g으로 나타났다. Lee 등(2015b)은 여주의 품종별로 엽록소 함량을 분석하였는데 재래종에는 건물 100 g당 29.7~152.3 mg이 함유되어 있으나, 개량종인 에라부와 드레곤 품종은 각각 164.9~247.2 및 502.0~553.5 mg이 함유되어 있으며, 열매가 성숙되어 갈수록 클로로필 함량은 감소한다고 보고하였다.

폴리페놀 화합물은 녹색식물의 광합성 작용에서 생성된 탄수화물의 일부가 변화된 2차 대사산물로 식물체에서 쓴맛, 떫은맛을 나타내지만, 체내에서 활성산소의 축적을 억제하는 강력한 항산화 작용과 DNA, 세포구성 단백질, 효소 등을 보호하는 효과가 있다. 또한 항암 및 항균 활성, 심장질환 예방을 포함한 다양한 생리활성을 나타낸다. 폴리페놀의 한 부류인 플라보노이드는 C6-C3-C6를 기본골격으로 하며 노란색 내지는 담황색을 나타내는 페놀계 화합물의 총칭으로 항산화 활성, 항암, 항염증, 항바이러스 활성이 우수한 것으로 알려져 있다(Liga 등, 2023). Boo 등(2009)의 연구에서 국내 재래종, 일본, 중국, 필리핀에서 널리 재배되고 있는 9개 여주 품종을 대상으로 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 분석한 결과, 국내 및 일본 품종이 필리핀이나 중국 품종에 비해 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 높은 것을 확인하였다. Cho 등(2016)의 연구에서도 여주 분말을 쌀 무게의 0.5~2%까지 첨가하여 제조한 막걸리에서도 여주분말 첨가량에 비례하여 폴리페놀 함량이 증가하는 것으로 나타나 본 연구 결과와 유사함을 확인하였다. 또한 발효 전에 비해 막걸리를 발효하는 7일 동안 폴리페놀 함량이 1.3~1.5배까지 증가하였는데, 이는 발효에 의해 증가한 미생물의 작용으로 결합형의 폴리페놀 물질들이 유리되었고 수용성 페놀 함량이 증가하였기 때문으로 사료된다.

항산화 활성 측정

여주즙 함량을 달리하여 제조한 요구르트의 항산화 활성을 Table 7에 나타내었다. 여주즙 함유 요구르트는 대조군에 비해 더 높은 항산화 활성을 나타냈다.

Table 7 . DPPH and ABTS radical scavenging activity of yogurt containing various amount of bitter melon juice.

Bitter melon juice (%)	DPPH radical scavenging activity (%)	ABTS radical scavenging activity (%)
0	38.53±2.40d1)	40.31±1.56d
1	51.76±4.29c	52.92±2.34c
3	59.03±2.89b	66.76±1.98b
5	67.65±2.67a	74.64±2.33a

Data were the mean±SD of triplicate experiment..

¹⁾Means with the different superscripts (a-d) within the same column are significantly different at P<0.05..

여주즙 첨가 요구르트의 DPPH 라디칼 소거 활성은 대조군에서 38.53±2.40%로 나타났고, 여주즙을 1%, 3%, 5% 첨가한 요구르트에서 각각 51.76±4.29%, 59.03±2.89%, 67.65±2.67%까지 증가하였으며, 이는 대조군 요구르트에 비해 약 1.34~1.76배 높은 활성을 나타냈다.

ABTS 라디칼 소거 활성의 경우 여주즙을 첨가하지 않은 요구르트에서 40.31±1.56%로 가장 낮았고, 여주즙 첨가량 비율에 따라 각각 52.92±2.34~74.64±2.33%로 대조군 요구르트에 비해 약 1.31~1.85배 높은 활성을 나타내어 여주즙 첨가량에 비례하여 ABTS 라디칼 소거 활성도 높아짐을 확인하였다.

여주에는 폴리페놀, 클로로필, 플라보노이드, 비타민 C 등의 강력한 항산화 활성을 나타내는 성분이 포함되어 있으며, 이들 항산화물질의 함량에 비례하여 전자공여능이 증가하는 것으로 보고되고 있다(Zold 등, 2024). 선행 연구에서도 여주를 첨가하여 제조한 머핀(An, 2014), 막걸리(Cho 등, 2016), 간장(Hwang 등, 2017b)에서도 여주 첨가량에 비례하여 항산화 활성이 증가하는 것으로 나타나 본 연구와 유사한 결과를 보였다. An(2014)의 연구에서도 머핀 제조 시 여주 분말을 밀가루 중량의 0~12%까지 첨가함에 따라 DPPH 라디칼 소거 활성이 41.35~74.91%까지 증가하였고, 이는 여주 분말을 첨가하지 않은 머핀에 비해 1.54~2.79배 증가한 수치였다. Cho 등(2016)의 연구에서도 막걸리 제조에 첨가한 여주분말 함량에 비례하여 DPPH 라디칼 소거 활성은 1.2~1.5배, ABTS 라디칼 소거 활성은 1.1~1.5배까지 증가하였고, 발효 초기에 비해 발효가 끝난 막걸리의 항산화 활성이 증가하였음을 확인하였다. 위의 결과들을 종합해 볼 때 요구르트 제조 시 여주즙 첨가량이 많아질수록 항산화물질 함량이 증가하고, 발효 중에 증가한 미생물이 유리형의 폴리페놀, 플라보노이드 물질들을 유리형으로 전환시켰으며, 이들에 의해 항산화 활성이 증가한 것으로 사료된다.

본 연구에서는 요구르트 제조에 여주즙 첨가 가능성을 탐색하기 위해 우유 대신 여주즙을 1%, 3%, 5%까지 첨가하여 24시간 동안 발효하면서 요구르트의 산도, pH, 가용성 고형분 및 유산균 증식 패턴을 측정하였고, 최종 완성된 요구르트를 대상으로 기능성 물질 함량과 항산화 활성을 측정하였다. 요구르트의 발효 시간과 첨가한 여주즙의 함량에 비례하여 대조군과 실험군 모두에서 pH는 감소하고 산도는 증가하였다. 점도는 요구르트의 발효 시간이 길어짐에 따라 증가하였으나, 여주즙 함량에 따른 차이는 나타나지 않았다. 유산균도 요구르트 발효 시간이 길어짐에 따라 급속히 증가하였고 대조군에 비해 여주즙을 1~5%까지 첨가한 실험군의 유산균 수치가 높음을 확인하였다. 24시간 동안 발효가 완료된 요구르트의 색도를 측정한 결과, 여주즙 첨가량에 비례하여 명도는 감소하였고 적색도와 황색도는 증가하였다. 요구르트의 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 클로로필 함량은 여주즙 첨가량에 비례하여 증가하였고, DPPH와 ABTS 라디칼 소거능과 환원력으로 측정한 항산화 활성도 여주즙 함량에 비례하여 증가하는 경향을 보였다. 이상의 결과를 통해 요구르트에 여주즙을 첨가하면 폴리페놀, 플라보노이드 및 클로로필 함량이 증가하며 이를 통해 항산화 활성을 높일 수 있을 것으로 사료된다. 요구르트의 산도, 점도, 유산균 증식 등을 고려할 때, 여주즙을 우유 중량 대비 1~5% 수준에서 첨가하면 여주가 지닌 기능적인 특성을 잘 활용한 요구르트의 제조가 가능할 것으로 사료된다.