조릿대(Sasa borealis (Hack.) Makino & Shibata)는 벼과(Poaceae) 조릿대속(Sasa)에 속하는 식물로 제주도와 울릉도를 제외한 전국의 산지에서 서식하는 상록활엽관목이다. 조릿대의 동속근연 식물로는 대한민국의 특정 지역에만 서식하는 신이대(Sasa coreana Nakai), 제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai), 섬조릿대(Sasa kurilensis (Rupr.) Makino), 갓대(S. borealis var. chiisanensis (Nakai) T. Lee), 섬대(S. borealis var. gracilis (Nakai) T. Lee)가 있다. 조릿대는 전국의 산 중턱 이하의 숲속에서 군락을 이루어 서식하는 식물로, 예로부터 다양한 질병에 적용하는 대표적인 민간생약 중 하나로서 채집이 용이하여 식/의약품원료로의 개발 가치가 높은 천연자원이다.

조릿대는 감기환자의 열을 내리기 위해 이의 잎을 끓여 마시는 민간생약으로 구전되고 있다. 동의보감에는 조릿대 및 동속식물의 잎을 고죽엽(苦竹葉)이라 하여 청열(淸熱), 척열(滌熱) 등의 효능으로 열을 내리는 한약 처방인 죽엽석고탕에 사용되는 것으로 기록되어 있다. 또한, 이 식물의 푸른 잎을 따서 달여 즙을 받아먹으면 소갈(消渴)이 멎는다고 기록되어 있다. 조릿대는 고지혈증 및 고혈압 등 대사성질환에 효능이 있으며(Hwang과 Han, 2007; Ko 등, 2006) 항암작용, 살균작용 및 항진균작용에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다(Ko, 2008). 조릿대의 전통적인 효능 중 가장 빈번하게 언급되는 효능은 소갈증(消渴症)에 관한 것이다. 소갈증은 현대인의 대표적인 대사성질환인 당뇨병에 해당하는 병증이다.

최근 조릿대 잎 추출물이 당뇨병 개선효능이 있다는 약리학적 지표가 보고되고 있다(Jeong 등, 2007; Ko 등, 2006; Nam 등, 2013; Yun 등, 2010). 조릿대잎 추출물은 지방전구세포로 분화시킨 3T3-L1 섬유아세포에 대한 인슐린 작용을 향상시켜 혈당 강하 작용을 보이고 있으며 α-glucosidase 및 α-amylase의 작용을 농도 의존적으로 억제하여 식후혈당 반응을 감소시킨다고 알려져 있다(Han과 Hwang, 2007). 또한, 조릿대잎 추출물은 고지방식으로 비만을 유도한 생쥐의 체중증가 및 지방축적증가를 억제할 수 있으며, 염증성 사이토카인 분비조절을 통하여 인슐린 저항성을 향상시킬 수 있음을 보고하였다(Yang 등, 2010).

조릿대잎의 화학성분으로는 리그난계 화합물인 syringaresinol과 플라본계 화합물인 tricin 및 그의 배당체(Jeong 등, 2007), isoorientin 및 apigenin 배당체 등의 플라보노이드 성분이 함유되어 있다고 알려져 있다(Park 등, 2007; Park과 Lim, 2009). 또한 테르펜계 화합물로 friedelin과 3-hydroxyglutinol이 함유되어 있음이 보고되어 있다(Lee 등, 2007). Friedelin은 friedelane계 triterpene으로 가시오가피 및 화살나무에도 함유된 성분이다(Huang 등, 2011; Zhai 등, 2016). Friedelin을 함유한 생약의 공통된 약효는 당뇨 개선이며 friedelin 단일성분이 2형 당뇨에 관련된 약리학적 지표에 대해 개선 효과가 있음이 입증된 바 있다. 보고에 의하면 friedelin이 경구투여된 랫트의 당내성과 혈중포도당 수준을 유의하게 경감시키며 당뇨에 의한 체중감소도 억제하는 것으로 나타났다(Sunil 등, 2021). 이때 혈청 내 인슐린의 농도는 정상과 거의 동일한 수준으로 유지되었으며 당뇨병 개선 단백질 GLUT4, p-Akt, AMPK와 그의 m-RNA 발현 수치도 골격근과 간에서 현저하게 개선되는 것으로 보고되어 있다(Sunil 등, 2021). 조릿대에 함유된 lupenone은 당뇨유발 생쥐의 당내성 지표와 공복혈당 및 요단백질의 수준을 유의하게 낮추며 당뇨병환자에서 유발되는 신경병증의 생물학적 지표를 크게 개선하는 것으로 알려져 있다(Wu 등, 2023; Xu 등, 2018).

본 연구자 등은 질량검출기를 이용한 가스크로마토그래피법(GC/MS)으로 조릿대잎의 비극성 화합물을 연구하는 중 D:A-friedooleanane계 화합물인 friedelin과 lupane계 화합물인 lupenone이 높은 농도로 조릿대의 비극성 추출물에 존재함을 발견하였다. 우리는 민간 또는 한방에서 언급되는 조릿대잎의 당뇨 개선효능이 조릿대잎에 함유된 friedelin과 lupenone에 영향을 받는 것으로 예상하고 이를 입증하기 위해 다양한 용매들에 의해 추출된 조릿대잎 추출물들의 당뇨 개선효능과 추출물들에 함유된 friedelin과 lupenone의 연관성을 검토하였다.

식물재료

본 실험에 사용한 조릿대는 전북 대둔산 인근에 자생하는 조릿대 잎을 8월에 채취하여 충남대 약대 배기환 교수가 동정하였다. 채취된 조릿대 잎을 약 0.5 cm 크기로 절단하여 60°C에서 열풍 건조한 후 조말로 분쇄한 시료를 밀폐용기에 보관하여 사용하였다.

시약 및 기구

조릿대잎으로부터 목적물질을 추출하기 위한 용매는 공업용(DUKSAN)으로 헥산, 초산에틸, 아세톤, 에탄올을 사용하였다. 증류수는 삼차 증류수를 사용하였으며 표준물질 분리를 위한 고정상은 Silicagel 60, 230~400 mesh(DUKSAN)를 사용하였다. 가스크로마토그래피를 위해 제조한 시료의 용매는 공업용 초산에틸을 증류하여 사용하였으며 이동상으로 사용된 He 가스는 초고순도(99.999%, DIG Airgas)를 사용하였다.

항당뇨 활성 검사용 시료 제조

조릿대잎 건조분말 100 g을 삼각플라스크에 넣고 증류수 500 mL를 가한 후 3시간 동안 끓여서 추출하였다. 물 추출액은 열수 상태에서 여과지를 통하여 여과하고 감압 농축하여 나온 추출액을 70°C에서 열풍 건조하여 조릿대잎 열수 추출물 분말상으로 제조하였다. 그리고 조릿대잎 건조분말 100 g을 환류플라스크에 담고 초산에틸 500 mL를 가한 후 3시간 동안 환류 추출하였다. 초산에틸 추출액을 여과하고 감압 농축하여 나온 추출액을 70°C에서 열풍 건조하여 조릿대잎 초산에틸 추출물을 제조하였다.

항당뇨 활성 측정

각 시료의 항당뇨 활성은 마우스를 이용한 동물모델에서 측정하였으며(Ighodaro 등, 2017), 동물실험은 건양대학교 동물실험윤리위원회의 규정을 준수하여 수행하였다(승인번호: P-23-47-A-01). 각 군당 5마리씩의 ICR 마우스(수컷, 7주령, Raon Bio Ltd.)를 준비하고, alloxan(Sigma-Aldrich)을 70 mg/kg의 양으로 정맥에 주사하여 당뇨를 유발하였다. 각 시료는 alloxan 투여 7시간 후부터 1일 1회 총 5일간 80 mg/kg으로 경구투여하였다. 혈당은 alloxan 투여 후 0, 3, 6, 10일째에 꼬리로부터 부분 채혈하여 G Care Blood Glucose Monitoring System(Green Cross Ltd.)으로 측정하였다.

경구 당부하 검사(oral glucose tolerance test, OGTT)

OGTT는 alloxan 투여 10일째의 마우스를 이용하여 측정하였다. 당뇨 마우스에 2 g/kg의 포도당을 경구투여한 후, 15, 30, 90, 120분 후의 혈당을 측정하였다. 혈당 측정은 항당뇨 활성 측정과 동일한 방법으로 하였다.

통계학적 처리

실험 결과의 통계처리는 Student’s two-tailed t test를 이용하여, 시료를 처리하지 않은 당뇨 마우스에 대한 유의성을 통해 수행하였다. 통계처리 결과는 P<0.05, P<0.01, P<0.001로 표시하였다.

Friedelin과 lupenone 분리정제

조릿대 잎으로부터 friedelin의 함량을 평가하기 위한 friedelin 표준물질은 다음과 같이 제조하였다. 60°C에서 열풍 건조한 조릿대잎 80 g을 분쇄하여 2 L 용량의 둥근플라스크에 넣고 메탄올 1 L를 가한 후 12시간 환류 추출하여 냉각 후 여과하였다. 이와 같은 추출조작을 동일 시료에 대하여 2회 반복하여 얻은 추출액을 합한 후 감압 농축하여 메탄올 추출물 20 g을 얻었다. 메탄올 추출물(20 g)에 0.5 L 증류수를 가하여 흔들어 증류수 현탁액을 만들고 분액깔때기에 옮겼다. 증류수 현탁액에 0.5 L의 초산에틸을 가한 후 흔들어 증류수 현탁액로부터 초산에틸 가용부를 얻었다. 초산에틸 추출조작을 2회 반복 실시하여 그 추출액을 합한 후 감압 농축하여 초산에틸 추출물(5 g)을 얻었다. 초산에틸 추출물(5 g)을 20 g의 실리카겔에 코팅한 후 실리카겔(200 g)이 채워진 유리컬럼(3×30 cm)에 가하고 헥산/아세톤(90:10→0:100, 각 500 mL씩 용출, 10%씩 단계적 상승)을 이동상으로 하여 10개의 분획물(Fr. 1~Fr. 10)을 얻었다. 10개의 분획물 1 mL를 취해 가스크로마토그래피를 실시하여 목적 화합물인 friedelin이 가장 많이 함유된 분획물(Fr. 3, 1.0 g)을 실리카겔(60 g)이 채워진 유리컬럼(1.5×25 cm)에 가하고 헥산/초산에틸(85:15)로 용출하여 나온 여러 분획을 가스크로마토그래피로 확인하였다. Friedelin의 함량이 농후한 분획을 합치고 농축한 후 초산에틸/메탄올로 재결정하여 흰색의 침상결정(100 mg)을 얻었다.

Lupenone 표준물질은 friedelin 분리법과 동일하게 수행되었으며 최종적으로 헥산/초산에틸(85:15)로 용출하여 단리한 분획들을 가스크로마토그래피로 확인하여 lupenone이 농후하게 함유된 용출액을 합하여 회전농축기로 감압 농축하고 80°C에서 진공 건조하여 lupenone 농축물(200 mg)을 얻었다.

조릿대 잎 함량시험용 시료 전처리법

Friedelin 및 lupenone 분석시료는 조릿대잎 분말 시료와 조릿대잎 용매 추출물로 각각 제조하였다. 조릿대잎 분말 시료의 전처리법은 다음과 같다. 음건한 조릿대잎을 조말로 분쇄하여 항량으로 만든 시료 분말 1 g을 정확하게 달아 15 mL 기밀용기에 넣고 10 mL의 초산에틸을 채운 후 80°C 수욕에서 24시간 추출한다. 원심분리하여 얻은 상징액을 취하고 남은 잔사에 10 mL의 초산에틸을 가하고 80°C 수욕에서 24시간 추출한다. 이 액을 여과하여 원심분리하여 얻은 상징액을 합하여 감압 농축하여 10 mL 초산에틸 용액을 만든다. 이 용액 1 mL를 취하여 0.5 μm 막여과하여 나온 여과액을 조릿대잎 함량시험용 시료 용액으로 사용하였다. 조릿대잎 용매 추출물의 시료 전처리법은 조릿대 분말 각 1 g을 밀폐용기에 넣고 헥산, 초산에틸, 아세톤, 에탄올, 증류수 각 10 mL를 가하여 80°C 수욕에서 24시간 추출하여 상온으로 식힌 후 여과하여 농축한 각 농축액을 초산에틸에 정량적으로 용해한다. 이 용액 1 mL를 취하여 0.5 μm 막여과기를 통과하여 나온 용액을 조릿대잎 용매 추출물의 함량시험용 시료 용액으로 사용하였다.

Friedelin과 lupenone GC-MS 분석법

GC-MS에 의해 시료에서 분리되는 friedelin과 lupenone 피크의 분리능 인자는 R>1.5를 충족하도록 분석조건을 설정하였다. 분석에 사용된 가스크로마토그래피는 Agilent Technologies GC(7890A GC System, 7683B Injector)를 사용하였으며 검출은 EIMS 질량검출기(5975C inert MSD with triple-axis detector, Agilent Technologies)를 사용하였다. 컬럼은 HP-5MS(19091S-433): 30 m×250 μm, 0.25 μm(Agilent)를 사용하였다. 이동상은 순도 99.999%의 He을 1 mL/min의 유속으로 하였으며 칼럼 온도는 200⟶325°C로 30분간 4°C/min 상승시켜 분석하였다. 주입부는 heater 325°C, pressure 16 psi, total flow 54 mL/min, septum purge flow 3 mL/min, split ratio 50/1, injection volume 5 μL이며 검출부의 이온화 방법과 에너지는 EI로 70 eV였다.

조릿대 잎의 friedelin과 lupenone 분석 유효성 검증

Friedelin과 lupenone의 분석 특이성: 실시된 분석법에 의한 크로마토그래피에서 보이는 friedelin과 lupenone 피크의 분석 특이성은 시료에 함유된 성분과 그에 해당하는 표준물질의 머무름시간과 해당 피크의 질량스펙트럼을 비교하여 입증하였다.

Friedelin과 lupenone 검량선의 직선성: Friedelin과 lupenone 표준물질을 순도 보정하여 각각 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 mg/mL 농도로 제조하였다. 이때 용매는 초산에틸을 사용하였다. 이렇게 제조된 표준용액을 각 농도당 3회 GC/MS를 실시하여 나온 표준물질 피크의 면적을 최소자승법으로 직선의 식을 구하여 직선구간을 설정하였다. 각 직선의 y절편 평균과 기울기의 표준편차를 이용하여 검출한계 및 검량한계를 구하였다.

Friedelin과 lupenone 정량분석법의 정밀성: 조릿대 잎에서의 friedelin과 lupenone 정량분석 정밀성은 세 가지 농도로 전처리한 시료의 일내 정밀성으로 검증하였다. 조말로 분쇄한 후 항량으로 건조한 조릿대 잎을 0.5, 1.0, 1.5 g씩 정확하게 무게를 달아 15 mL 밀폐용기에 넣고 초산에틸 10 mL를 가한 후 80°C 수욕에서 24시간 추출하였다. 각 농도당 3개의 시료를 제조하여 가스크로마토그래피를 실시해 얻은 피크의 면적을 검량식에 대입하여 시료 1 g에 함유된 각 성분 함량의 상대표준편차가 5% 이내로 측정될 때 실시된 분석법이 정밀한 것으로 평가하였다.

Friedelin과 lupenone 정량분석법의 정확성: 조릿대 잎에서의 friedelin과 lupenone 정량분석 정확성은 회수율로 검증하였다. 조릿대 잎 분말 시료 1 g을 정확히 달아 15 mL 밀폐용기에 넣고 friedelin과 lupenone을 각 시료에 0, 0.1, 0.2, 0.3 mg을 첨가하고 초산에틸 10 mL를 가한 후 80°C 수욕에서 24시간 추출하였다. 각 농도당 3개의 시료를 제조하여 가스크로마토그래피를 실시해 얻은 피크의 면적을 검량식에 대입하여 나온 분석성분의 함량 중 소량 첨가한 성분량의 회수율로 분석법의 정확성을 평가하였다. 회수율은 첨가량의 95~105% 검출될 때 실시된 분석법의 정확성이 입증되는 것으로 평가하였다.

각 용매에 대한 friedelin과 lupenone의 용출률: 조릿대잎으로부터 friedelin과 lupenone을 용이하게 추출하는 용매를 찾기 위해 헥산, 초산에틸, 아세톤, 에탄올 및 증류수에 대한 용출률 시험을 하였다. 조릿대잎 분말 10 g을 정확하게 달아 500 mL 추출 용기에 넣은 후 각 용액 100 mL를 정확하게 가한 후 80°C 수욕에서 24시간 추출하였다. 각 추출액을 상온으로 식힌 후 여과하여 나온 추출액을 감압 농축한 후 70°C에서 24시간 건조한 후 각 추출물의 무게를 달았다. 이때 증류수 추출물은 상온으로 냉각 시 침전이 발생하므로 냉각하지 않고 여과하였다. 각 용매 추출물 100 mg을 10 mL 부피플라스크에 넣고 초산에틸을 가하여 녹이고 표선을 맞춘 후 이 액 1 mL를 취하여 막여과하여 나온 용액을 조릿대 추출물 중 friedelin 및 lupenone 함량시험 시료 용액으로 하였다.

조릿대 추출물의 항당뇨 활성

조릿대 물 추출물과 초산에틸 추출물의 항당뇨 활성은 ICR 마우스에 alloxan 투여 후 혈당의 증가에 대한 억제 효과를 통해 측정하였다. 그 결과, 조릿대 추출물은 모두 혈당을 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다(Fig. 1). 특히 조릿대 초산에틸 추출물은 당뇨유발 3일째부터 물 추출물보다 높은 혈당 억제 효과를 보였으며, 10일째에는 거의 정상 수준까지 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이는 조릿대 초산에틸 추출물이 혈당의 억제에 있어서 매우 빠르게 작용하며, 그 억제 효과가 오랜 시간 지속되는 것을 의미한다.

Fig 1. Effect of the extracts of Sasa borealis on alloxan-induced diabetic mice. Statistical significance was evaluated by Student’s two-tailed t-test. ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001.

조릿대 추출물의 경구 당부하(OGTT) 억제

Alloxan 처리 10일째에 경구 당부하 검사(OGTT)를 실시하였다. 당뇨유발 마우스는 포도당 투여 30분째에 가장 높은 혈당치를 나타내며 그 이후로는 혈당치가 점차 감소하였다. 조릿대 추출물에 있어서는 초산에틸 추출물이 혈당 증가를 유의하게 억제하여, 거의 정상 마우스 수준의 당부하 억제 효과를 나타내었다(Fig. 2).

Fig 2. Inhibitory effect of the extracts of Sasa borealis on glucose tolerance in oral glucose tolerance test (OGTT). OGTT was carried out 10 days after alloxan treatment. Statistical significance was evaluated by Student’s two-tailed t-test. ^*P<0.05, ^***P<0.001.

하지만 조릿대 물 추출물은 당부하를 억제하는 경향을 보이기는 하나, 통계학적 유의성은 인정되지 않았다. Fig. 1에서 혈당을 억제하는 결과를 보인 조릿대 물 추출물이 OGTT에서 유의한 억제 효과를 나타내지 않은 것은, 조릿대 물 추출물과 초산에틸 추출물이 각기 다른 기전에 의해 혈당을 조절하는 작용을 할 가능성을 시사하는 것으로 사료된다. 즉 초산에틸 추출물의 항당뇨 효과는 당부하 억제 혹은 인슐린 저항성을 억제하는 작용이 중요한 기전이지만, 물 추출물은 당부하 억제가 아닌 다른 기전을 통해 혈당을 억제한다는 것을 의미한다.

조릿대잎의 friedelin과 lupenone 분리 및 구조 동정

정량분석 표준물질로 friedelin과 lupenone은 본 연구자가 고안한 실험방법으로 분리정제 하여 용이하게 취할 수 있었다. 메탄올에 의해 백색 침상결정으로 석출된 friedelin과 다소 불순한 상태로 농축된 lupenone을 가스크로마토그래피 하여 화학구조와 순도를 확인하였다. 화학구조의 동정은 EI-MS 스펙트럼상의 이온조각(Fig. 3B, C)들을 Wiley 7n.1 데이터베이스와 대조하여 friedelin(match quality 95%)과 lupenone(match quality 94%)으로 동정하였으며 분리한 각 성분의 순도는 총 이온크로마토그래피에서 나타난 해당 정제물질의 불순물과 목적물질들의 피크를 normalization 하여 friedlin은 99.17%, lupenone은 83.96%로 확정하였다.

Fig 3. GC-MS chromatogram of Sasa borealis leaves ethyl acetate extract. (A) Retention time of friedelin and lupenone, (B) EI-mass spectrum at 24.9 min, (C) EI-mass spectrum at 22.7 min.

분석법 유효성 검증

조릿대잎 분말 시료의 크로마토그램에서 friedelin과 lupenone 피크는 해당 표준물질들의 머무름시간 및 각 피크의 EI-MS spectrum이 일치하는 것을 통해 특이성을 확인하였다. 크로마토그램에서 각

물질의 머무름시간은 friedelin이 24.9 min, M⁺은 426.3 m/z, lupenone은 22.7 min, M⁺은 424.2 m/z이며, 분리능 인자는 1.5 이상으로 이웃한 성분들로부터 간섭을 받지 않고 분리되었다(Fig. 3).

각 분석성분의 검량선에 대한 직선성 및 검출한계, 정량한계는 다음과 같다. Friedelin과 lupenone 표준용액을 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 mg/mL의 농도로 제조하여 실험방법에 주어진 크로마토그래피 조건으로 분석하여 각 농도와 감응 면적에 대하여 검량선을 작성하였다(Fig. 4). 정확한 농도는 표준물질의 순도로 보정하여 계산하였다. 이때 friedelin 검량선의 결정계수(R²)는 0.9993으로 비교적 양호한 직선성을 나타내는 것을 확인하였다. Friedelin 농도가 1.0 mg/mL에서는 직선성이 유지되지 않았으므로 1.0 mg/mL 농도는 검량선에서 제외하였다. 이때 검출한계는 21.1 μg/mL였으며 정량한계는 63.9 μg/mL였다(Fig. 4A). Lupenone 검량선의 결정계수(R²)는 0.9981로 비교적 양호한 직선성을 나타내는 것을 확인하였다. 검출한계는 7.27 μg/mL였고 정량한계는 22.0 μg/mL였다(Fig. 4B). 따라서 조릿대 시료에 함유된 friedelin과 lupenone의 정량분석은 각 성분의 직선성이 유지되는 농도 범위 내에서 검출될 수 있도록 조릿대잎 시료의 농도를 예측하여 제조할 수 있었다.

Fig 4. Calibration curves of friedelin and lupenone for linearity verification. (A) Calibration curve of friedelin, limit of detection: 21.1 μg/mL, limit of quantitation: 63.9 μg/mL. (B) Calibration curve of lupenone, limit of detection: 7.27 μg/mL, limit of quantitation: 22.0 μg/mL.

분석법의 정밀성은 일간 정밀성으로 증명하였다(Table 1). 분석대상물질 각 무게(0.5, 1.0, 1.5 g)당 3회 반복하여 정확하게 달고 실험방법에 제시된 시료 전처리 방법으로 분석용액을 제조하였다. 각 시료 용액을 크로마토그래피 하여 얻은 분석성분의 농도에 대한 상대표준편차로 정밀성을 평가하였다. 시료의 농도는 분석성분의 검량 범위에 해당하는 농도를 예측하여 제조하였으며 각 농도당 3회 시료를 제조하여 friedelin과 lupenone을 동시 측정하였다. 그 결과 각 시료에 대한 friedelin과 lupenone 농도 값의 상대표준편차가 대부분 5% 이내로 정밀하게 측정됨을 확인하였다. 단, lupenone의 경우 시료량 1 g에서 상대표준편차 5.1%를 나타내어 정밀성이 다소 부족함을 보였다.

Table 1 . Repeatability test to verify analysis method precision.

	Sample (g)1)	Trial 1 (mg/g)	Trial 2 (mg/g)	Trial 3 (mg/g)	Average (mg/g)	SD2) (mg/g)	RSD (%)3)
Friedelin	0.5	2.864	2.711	2.626	2.734	0.120	4.4
	1.0	2.723	2.862	2.816	2.800	0.071	2.5
	1.5	2.941	2.851	2.780	2.857	0.081	2.8
Lupenone	0.5	1.463	1.600	1.513	1.526	0.069	4.6
	1.0	1.549	1.426	1.568	1.514	0.077	5.1
	1.5	1.494	1.513	1.495	1.495	0.025	1.7

¹⁾The sample used was Sasa borealis leaves powder weighed precisely to 5 decimal places. Each result was derived from an independent experiment on the same sample..

²⁾Standard deviation..

³⁾Relative standard deviation..

분석법의 정확성은 회수율로 검증하였다(Table 2). Friedelin과 lupenone에 대한 함량을 알고 있는 조릿대 시료 1 g에 각 분석성분의 0%, 10%, 15%, 20%에 해당하는 양의 friedelin과 lupenone 표준물질을 소량 첨가하였다. 표준물질이 소량 첨가된 각 검체를 시료 전처리법으로 조제한 후 크로마토그래피 하여 얻은 분석성분의 농도에 해당 표준성분 첨가량의 검출농도를 회수율로 환산하여 함량분석법이 목적 성분의 함량을 정확하게 표현하는지를 회수율로 검증하였다. 각 검체 시료에 첨가된 표준성분의 회수율은 friedelin과 lupenone 모두 97~103% 범위에서 검출되는 것이 확인되었다.

Table 2 . Recovery test to verify analysis method accuracy.

	Added (mg/g)1)	Trial 1 mg/g (recovery %)2)	Trial 2 mg/g (recovery %)	Trial 3 mg/g (recovery %)	Average mg/g (recovery %)
Friedelin	0	2.622	3.125	2.456	2.734
	0.99	3.659(95.6)	3.664(96.1)	3.740(103.7)	3.688(98.5)
	1.98	4.783(96.1)	4.659(105.6)	4.753(97.2)	4.731(102.9)
	2.98	5.835(103.7)	5.603(98.2)	5.666(99.3)	5.701(100.1)
Lupenone	0	1.541	1.523	1.429	1.498
	0.83	2.318(98.8)	2.338(101.2)	2.308(97.6)	2.321(99.2)
	1.68	3.168(99.4)	3.148(98.2)	3.158(98.8)	3.158(98.8)
	2.52	4.038(100.8)	4.008(99.6)	4.148(105.9)	4.498(101.9)

¹⁾Weight of standard substance added per gram of Sasa borealis leaves powder weighed precisely to 5 decimal places. Each result was derived from an independent experiment on the same sample..

²⁾Percentage difference between the result and theoretical values of the analytes..

조릿대잎 용매 추출률과 friedelin과 lupenone의 함량

조릿대잎 분말 중 friedelin과 lupenone의 함유량은 각 0.28%와 0.15%인 것으로 분석되었다(Table 1). 조릿대잎 분말의 용매 용출률을 알기 위해 헥산, 초산에틸, 아세톤, 에탄올 및 증류수에 대한 용출률 시험을 하였다(Table 3). 그 결과 조릿대잎 분말에 대하여 위에 언급한 용매 순서대로 3.1%, 4.5%, 3.6%, 12.8%, 11.2%에 해당하는 양이 추출되었다. 각 추출용매가 friedelin과 lupenone을 추출하는 정도를 판단하기 위해 각 용매 추출물에 함유된 목적 화합물의 함량을 분석하였다. 조릿대잎 분말의 헥산 추출물에는 friedelin 4.2%와 lupenone 2.2%가 함유되어 있었으며, 초산에틸 추출물에는 friedelin 4.4%와 lupenone 3.0%가 함유되어 있었다. 조릿대잎 중에 함유된 friedelin을 가장 많이 추출하는 용매는 초산에틸로, 분말 시료로부터 66%에 해당하는 양이 추출되었다. 조릿대잎 중에 함유된 lupenone을 가장 많이 추출하는 용매는 에탄올로 분말 시료에서 103%, 즉 거의 모든 lupenone을 추출하는 것으로 나타났으며 friedelin 추출률도 초산에틸 추출률과 유사한 62%로 나타났다. 이러한 결과는 friedelin이 초산에틸과 에탄올에 용이하게 추출됨을 확인할 수 있었고, lupenone은 에탄올에 특히 잘 추출되는 것을 알 수 있었다. 아세톤 추출물에는 friedelin 2.6%와 lupenone 1.7%가 함유되어 있었으며, 에탄올 추출물에는 friedelin 1.5%와 lupenone 1.6%가 함유된 것으로 나타났다. 그러나 증류수 추출물에는 friedelin 0.03%와 lupenone 0.01%가 함유되어 조릿대잎을 물로 추출할 때 목적 화합물이 거의 추출되지 않음을 알 수 있었다. 목적 화합물의 농축률은 초산에틸이 가장 높았다. 그러므로 목적 화합물을 고농도로 함유한 추출물을 제조하기 위해서는 초산에틸을 사용하는 것이 바람직한 것으로 사료된다.

Table 3 . Extraction rates of Sasa borealis leaves powder by type of solvent and the contents of friedelin and lupenone in the extracts (unit:%).

Solvent	Extraction rate1)	Friedelin in extracts		Lupenone in extracts
		Content2)	Extraction rate3)	Content2)	Extraction rate3)
Hexane	3.1	4.2	43.8	2.2	33.8
Ethyl acetate	4.5	4.4	66.1	3.0	66.6
Acetone	3.6	2.6	31.6	1.7	31.0
Ethyl alcohol	12.8	1.5	62.3	1.6	103.7
Water	11.2	0.03	0.3	0.01	0.15

¹⁾S. borealis leaves powder 10 g, the extraction solvent was 50 mL, and the extract was refluxed for 12 h, filtered, and concentrated under reduced pressure..

²⁾Each extract 0.1 g was dissolved in 10 mL methanol and analyzed..

³⁾Ratio of analyte extracted by solvent to the content of analyte (friedelin: 2.8 mg/g, lupenone: 1.5 mg/g, Table 1) contained in S. borealis leaves powder..

조릿대 중 friedelin과 lupenone 함량과 당뇨 개선효능 상관성

Friedelin과 lupenone은 다양한 연구를 통해 당뇨병증 개선 효과를 나타내는 성분으로 효능이 입증되어 있다. 특히, friedelin을 공통으로 함유하는 가시오가피(Huang 등, 2011) 및 화살나무(Zhai 등, 2016)가 조릿대(Nam 등, 2013)와 마찬가지로 2형 당뇨에 대한 개선 효과를 보여주고 있다는 연구자료를 통해 friedelin이 해당 생약 재료들의 당뇨 개선효능에 기여하는 중요 성분임을 추측하였다. 우리는 조릿대에 함유된 friedelin과 lupenone의 농도가 당뇨 개선효능에 영향을 미친다는 사실을 입증하기 위해 두 화합물이 높은 농도로 함유된 조릿대 초산에틸 추출물과 농도가 희박한 열수 추출물에 대하여 당뇨 개선효능 검사와 friedelin과 lupenone의 함량 분석을 실시하였다. 초산에틸을 추출용매로 사용할 때 조릿대잎에서 friedelin이 약 66% 정도 추출되며 lupenone도 동일한 수준으로 추출되었다(Table 3). 결과적으로 초산에틸 추출물에는 friedelin으로 조릿대잎 원재료에 대해 10배 이상 농축되는 것으로 나타났다. 초산에틸 추출물은 당뇨 개선효능 검사 결과 높은 혈당 억제 효과(Fig. 1)와 당부하 억제능(Fig. 2)을 나타내었다. 조릿대잎 열수 추출물의 friedelin과 lupenone의 함유량은 지극히 낮은 수준이었으며 당뇨 개선효능 및 당부하 억제능 또한 초산에틸 추출물보다 현저히 낮은 수준으로 나타났다. 따라서 조릿대잎의 당뇨 개선효능에 기여하는 성분은 friedelin 및 lupenone일 가능성이 큼을 알 수 있었다.

조릿대잎의 당뇨 개선효능 성분을 밝히기 위해 조릿대잎 초산에틸 추출물과 열수 추출물에 대하여 당뇨 개선 활성 실험을 실시하였다. 그 결과 조릿대잎 초산에틸 추출물이 당뇨유발 마우스에 대하여 강한 혈당 억제와 당부하 억제 효과를 나타내었다. 또한, 조릿대 함유 성분 중 당뇨 및 당뇨병증 개선효능이 있다고 보고된 friedelin과 lupenone에 대하여 가스크로마토그래피를 실시하여 함량을 평가하였다. 조릿대잎 분말에는 friedelin 0.28%와 lupenone 0.15%가 함유되어 있었다. 조릿대잎 분말 초산에틸 추출물에는 friedelin 4.4%와 lupenone 3.0%가 함유되어 있었으며, 열수 추출물에는 friedelin 0.03%, lupenone 0.01%가 함유된 것으로 나타났다. Friedelin과 lupenone의 함량이 높은 초산에틸 추출물이 강한 당뇨 개선 효과를 나타내는 것으로 보아 조릿대잎 초산에틸 추출물에 함유된 friedelin과 lupenone이 조릿대잎 추출물의 당뇨 개선 효과에 영향을 줄 수 있는 것으로 사료된다.

본 연구의 동물실험에 수고하신 건양대학교 유영춘 교수께 감사드립니다.