식품뿐 아니라 산업적으로도 다양한 용도를 갖는 전분은 주로 옥수수 및 밀 등의 곡물과 감자, 카사바, 고구마 등의 서류로부터 생산되고 있으며, 이 중 옥수수로부터 전분을 생산하는 것이 작물 재배 시의 재생산성이 우수하고(한번 재배에 약 800배 종자 번식 가능), 경작의 용이성, 광범위한 재배 지역, 상대적으로 큰 직경의 알곡, 긴 저장성, 높은 전분 함량, 가공의 용이성 및 낮은 원료비 등 다양한 측면에서 큰 장점이 있어 효율적인 생산방법으로 평가되고 있다(Lee, 1997). 게다가 전체 전분 생산량의 약 50%가 옥수수로부터 생산되고 있는 만큼, 최근 옥수수 유래 전분의 산업적 활용에 대해 많은 연구자의 관심이 집중되고 있다(Palanisamy 등, 2020; Yu와 Moon, 2022).

옥수수 전분의 제조 시 목적 재료인 전분 외에도 다양한 종류의 부산물, 즉 전분 분리를 위한 아황산 침지 공정에서 발생하는 옥수수 침지액(corn steep liquor, CSL)과 추출 과정 중 제거된 배아 및 과피가 발생한다. 이 중 CSL에는 옥수수의 가용성 물질의 대부분이 용출되며 이를 농축시켜 CSL 제품이 만들어지는데, 이 중에는 다량의 옥수수 유래 탄수화물, amino acids, peptides, 비타민, minerals 및 phytic acid 등이 함유되어 있다고 알려져 있다(Hull 등, 1996; Liggett와 Koffler, 1948). 따라서 한때 CSL 중 존재하는 영양성분을 활용하여 미생물의 성장을 위한 배지성분(유기질소원)으로 사용하기도 하였으나, 그 절대량이 매우 적은 실정이다(Maddipati 등, 2011; Utrilla 등, 2012; Xi 등, 2013). 또한 CSL을 사료로 활용하는 방안도 고려되고 있지만 CSL은 점도가 매우 높아 취급이 불편하고, 이를 사료로 이용하는 데 필요한 글루텐피드의 절대량이 부족하여 소량만이 이용되고 있으며, 발생한 CSL의 대부분은 폐수로 버려지므로 이는 심각한 공해의 요인으로 대두되고 있다. 과거 옥수수 전분 공장에서는 경비를 들여 해양에 투기하기도 하였으나, 2016년 이후 법률적으로 해양 폐기가 전면 금지됨에 따라 옥수수 전분 가공 부산물의 처리 또는 새로운 이용 방안 모색이 시급히 요청되고 있다.

최근 신종플루, 메르스(MERS), 중증급성호흡기증후군(SARS) 및 코로나19 등으로 이어지는 신규 감염병의 발생으로, 건강 유지의 수단으로 면역계 증진에 관한 관심과 연구가 집중되고 있다. 특히 천연물로부터 분리한 다당류에는 대식세포 증식 활성(macrophage activity), 자연살해세포 활성(NK cell activity), 항암 활성(anti-tumor activity) 등의 면역증강 활성이 보고되고 있으며(Lee 등, 2014; Park 등, 2013), 따라서 이들을 면역증진 활성 기능성 식품 소재로 활용하고자 하는 시도들이 계속 이루어지고 있다(Park 등, 2009; Wasser, 2002). 면역계 중 선천면역은 항원에 비의존적이고 빠르게 일어나는 반응으로, 보체계(complement system) 활성화와 대식세포, 자연살해세포 등의 면역세포들이 관여한다(Lee와 Gray, 1988). 후천면역은 선천면역계를 통과한 항원들에 특이적으로 작용하는 면역체계로, 이는 다시 체액성 면역(humoral immunity)과 세포성 면역(cellular immunity)으로 나뉘고, 체액성 면역은 B cell에서 생성되는 항체에 의한 반응이며, 세포성 면역은 cytotoxic T cell, helper T cell, regulatory T cell 등이 관여하는 반응이다. 이러한 면역체계는 다양한 종류의 cytokine에 의해 긴밀한 상호 활성화와 엄밀한 제어(cytokine network)를 통해 이루어진다고 알려져 있다(Oh, 2005; Park 등, 2015).

옥수수 전분 부산물에 관한 연구는 옥수수 과피의 오일 성분인 phytosterol의 콜레스테롤 저하 활성(Wilson 등, 2000)과 ferulic acid의 항산화(Ohta 등, 1994) 등의 생리활성 연구가 있으며, 배아 중 존재하는 arabinoxylan 함량 및 기능에 관한 연구가 기 보고된 바 있으나(Kale 등, 2013; Lopez 등, 1999), CSL에 함유된 다당에 대한 생리 활성 연구는 거의 전무한 실정이다.

따라서 본 연구는 전분 가공 부산물인 CSL을 대상으로 에탄올 분획 방법을 활용하여 다당을 분리, 정제하고 이들이 갖는 면역 활성 및 활성 본체의 구조적 특성을 규명함으로써 옥수수 전분 가공 부산물 유래 다당을 기능성 소재를 개발하기 위한 기초자료를 제공하고자 하였다.

실험 재료

본 연구에서 사용한 재료는 국내산 찰옥수수 전분 가공 시 생산된 CSL로, (주)산돌식품으로부터 제공받았다. CSL은 원재료로부터 전분의 용이한 분리를 위해 이용되는 아황산 침지 공정에서 얻어진 침지액으로 60 Brix로 농축한 제품을 공여받아 본 실험에 이용하였다.

시약 및 실험동물

본 실험에서 다당의 정제에 사용된 Sephadex G-100은 GE Healthcare Bio-Sciences사로부터 구입하였으며, 투석에 사용된 dialysis tubing bag(MW cut-off 12,400)은 Sigma사로부터 구입하였다. 분자량 측정에 사용된 표준물질 Pullulan series(P-800, 400, 200, 100, 50, 20, 10, 5)는 일본의 Showa Denko사로부터 구입하여 사용하였다. 동물세포 배양에 사용된 RPMI-1640과 Dulbecco’s modified Eagle’s medium 배지, fetal bovine serum, penicillin/streptomycin, fungizone 등은 Welgene사에서 구입하였고, 세포증식능의 측정에 사용한 EZ-cytox는 Dogen사로부터 구입하여 사용하였다. 면역 활성 대조군으로 사용된 lipopolysaccharide from E.coli O127:B8(LPS)은 Sigma사의 제품을 사용하였으며, 이외에도 본 실험에 사용된 모든 시약은 1급 이상의 시판 분석용 제품이 사용되었다.

또한 본 실험에 사용된 실험동물인 BALB/c 마우스(6 weeks, female)는 새론바이오에서 구입해 일주일간 적응 기간을 거친 후 실험동물로 사용하였다. 사육 조건은 습도 55~70%, 23±1°C를 유지하고, 물과 사료를 자유 급식 형태로 공급하였다. 인공조명의 조건에서 1일 12시간씩(오전 9시~오후 9시) 명암 교대하였으며, 모든 과정은 경기대학교 동물윤리위원회의 허가(2022-004)를 거쳐 규정에 따라 진행하였다.

전분 부산물 유래 조다당의 분리 및 정제

CSL(60 Brix)을 최종농도 약 20 Brix가 되도록 약 3배 희석하고 최종 부피의 4배 에탄올을 첨가하여 24시간 방치 후 원심분리(6,774×g, 4°C, 30 min)하여 침전물을 회수하여 소량의 물에 용해시켰다. 이를 회전감압 농축장치를 이용하여 농축하였고 동결 건조(FreeZone 12 Liter, Labconco)하여 조다당 획분인 corn starch byproduct polysaccharide(CBP-0)를 얻었다. CBP-0은 증류수에 용해하고, 여기에 동일부피의 에탄올을 가하여 침전(50% 에탄올 침전)시킨 후 원심분리하여 침전물 및 상등액을 회수하였다(Kim 등, 2016; Lee 등, 2015). 침전물은 소량의 물에 용해하고 상등액은 회전감압 농축장치를 이용하여 재차 농축한 후 동결 건조하여 침전물 CBP1P와 상등액 CBP1S를 얻었다. 이때 상대적 고분자 획분인 CBP1P는 재차 증류수에 용해한 후 가한 증류수의 절반에 해당하는 부피의 에탄올을 가하여 침전(33% 에탄올 침전)을 유도하고 원심분리와 동결건조를 거쳐 침전획분 CBP0.5P와 상등액 획분 CBP0.5S로 분획하였다. CBP0.5S 획분은 재차 정제하기 위해 소량 물에 용해 후 50 mM ammonium formate buffer(pH 5.5)로 평형화된 Superdex^TM 200 GL column을 이용하여, high performance size exclusion chromatography를 행하였다. 용출액은 30 s/fraction씩 120개의 획분으로 분획 후, 각 획분은 중성당 및 단백질 함량 분석실험을 거쳐 분자량이 상이한 2개의 획분 CBP0.5S-I 및 CBP0.5S-Ⅱ로 최종 정제하였다(Fig. 1).

Fig 1. Isolation and purification procedure of immune-stimulating polysaccharides from starch byproduct.

일반 분석 방법

다당의 일반성분을 분석하기 위해 galactose를 표준물질로 하여 phenol-sulfuric acid 법(DuBois 등, 1956)으로 중성당의 함량을 측정하였고, galacturonic acid를 표준물질로 하여 m-hydroxybiphenyl 법(Blumenkrantz와 Asboe-Hansen, 1973)으로 산성당의 함량을 측정하였으며, bovine serum albumin을 표준물질로 하여 Bradford 법(Bradford, 1976)으로 단백질의 함량을, 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid(KDO)를 표준물질로 하여 thiobarbituric acid 법(Karkhanis 등, 1978)으로 TBA-positive material의 함량을 각각 정량 분석하였다.

구성당 분석

구성당의 분석을 위해 Albersheim 등의 방법(Jones와 Albersheim, 1972)을 활용하여 가수분해 후 각각을 alditol acetate로 유도체화 후 gas chromatography(GC)를 이용하여 분석하였다. 다당 시료에 2 M의 trifluoroacetic acid를 121°C, 90분간 반응시켜 가수분해 후, 1 mL의 1 M의 NH₄OH 용액에 용해하여 10 mg의 NaBH₄로 4시간 동안 환원시켰다. Acetic acid를 가하여 잔존 NaBH₄를 제거한 후 메탄올을 가하면서 반복 건조함으로써 과량의 acetic acid를 제거, 각 구성당에 상당하는 alditol로 전환하였다. 이후 각각의 alditol에 1 mL의 acetic anhydride를 가하고 121°C, 30분 동안 반응시켜 alditol acetate로 전환한 후, 이를 chloroform/H₂O 2상 용매계로 분리, 추출 및 건조 후 acetone 소량에 용해하여 GC 분석에 사용하였다. Alditol acetate 유도체의 GC 분석은 SP-2380 capillary column(Supelco)이 장착된 GC(ACME-6100, Young-Lin Co.) 장비를 이용하여 분석하였다. 한편, 각 구성당의 동정과 정량은 다수의 단당 표준물질을 동일 방법으로 유도체화하여 얻어진 chromatogram의 retention time과 표준곡선으로부터 환산하였다. 또한 구성당의 mol%는 peak의 면적비, flame ionization detector에 대한 반응계수 및 각 구성당의 alditol acetate 유도체의 분자량으로부터 계산하였다.

대식세포 활성능

BALB/c 마우스에 5% thioglycollate medium 1 mL를 복강 주사하여 72시간 동안 유도된 macrophage를 회수하여 세척 후, 세포 수(2.5×10⁶ cells/mL in RPMI 1640 medium)로 조정하여 대식세포 현탁액을 조제하고 96-well microplate에 100 μL를 가하였다. 여기에 최종 농도에 맞도록 phosphate-buffered saline에 용해된 다당 시료 용액을 분주하고, 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 후 600×g, 4°C에서 5분간 원심분리하여 세포 배양 상등액을 회수하고 상등액 중에 유도된 cytokine의 함량을 측정하였다. Macrophage에 의해 생산된 interleukin(IL)-6, IL-12 및 tumor necrosis factor(TNF)-α의 함량은 sandwich ELISA kit(Pharmingen)을 구입하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다(Salki 등, 1988).

전분 분해 효소 glucoamylase에 의한 가수분해

표준시료 soluble starch 및 CSL로부터 분리한 다당체 CBP0.5S 10 mg을 각각 ammonium formate buffer(pH 4.8) 1 mL에 용해한 후 glucoamylase(Fluka, from Aspergillus niger) 5 mg을 가하여 50°C에서 12시간 동안 처리하였다. 이후 효소 처리로 전분 또는 CBP0.5S로부터 유리된 환원당(포도당)의 상대적 함량을 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) 법을 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였으며, 이것의 색강도를 비교 분석하였다.

전분 가공 부산물에서 분리한 다당의 결합 구조 분석

옥수수 전분 부산물 유래 정제 다당 CBP0.5S-I 시료의 결합 구조 양식을 결정하기 위한 변형된 메틸화 분석(methylation analysis) 방법(Hakomori, 1964; Kim 등, 2017)을 이용하여 실시하였다. 다당 시료 1 mg을 dimethyl sulfoxide에 녹인 후, methylsulfinyl carbanion과 반응하여 polyalkoxide로 전환한 후 iodomethane(CH₃I)을 첨가하여 methyl화 시켰으며, 이를 partially methylated alditol acetate로 전환하여 GC-MS로 분석하였다. GC-MS 분석 조건은 SP2380 capillary column을 장착한 Agilent 6890N GC system과 5973N mass spectrophotometer를 이용하여 최적온도 조건[60°C(1 min), 60°C→180°C(30°C/min), 180°C→250°C(1.5°C/min), 250°C(5 min)]에서 splitless injection mode(1/20)로 분석하였으며, carrier gas로 He을 사용하고 flow rate를 1.5 mL/min으로 조정하였다. 메틸화된 시료의 유도체는 GC-MS를 이용한 fragment ion 분석과 GC의 relative retention time을 조합하여 동정하였으며 각 피크의 molar %는 peak의 면적값 및 molecular response factor로부터 환산하여 측정하였다.

통계 처리

실험 결과는 IBM SPSS Statistics 21(IBM Co.)을 이용하여 통계 처리하였으며, 측정 항목에 대한 평균(mean)과 표준편차(standard deviation)로 나타내었다. 시료 간 유의차 및 처리 농도 간 유의성은 ANOVA test 후 P<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test 일원배치 분산분석을 통해 구체적인 사후 검증을 거쳐 기재하였다.

옥수수 전분 가공 부산물로부터 다당의 분리

본 연구에서는 면역 활성 다당체의 규명을 목적으로 옥수수 전분 가공 부산물인 CSL로부터 조다당 획분을 분리하고자 하였다. 제공된 CSL은 20 Brix로 희석하고 80% 에탄올 침전법을 이용하여 고분자의 다당만을 회수, 세척 및 동결건조를 거쳐 조다당 CBP-0을 얻었다. CSL 유래 조다당 CBP-0의 일반화학적 특성을 분석한 결과, 중성당이 70.7±0.4%로 대부분을 차지하였으며, 산성당 0.9±0.3%, 단백질 26.4±0.9%가 검출되었다(Table 1). CBP-0을 가수분해한 후 alditol acetate 유도체로 전환하여 구성당을 분석한 결과, CBP-0은 glucose(46.8%), arabinose(11.6%), xylose(7.0%)가 높은 비율로 함유되어 있었으며, 그 외 mannose와 galactose가 미량 검출되었다.

Table 1 . Chemical properties of the polysaccharide fractions, CBP-0, CBP0.5S, CBP0.5S-I, and CBP0.5S-II, obtained from the starch byproduct.

Chemical properties (%)	CBP-0	CBP0.5S	CBP0.5S-I	CBP0.5S-II
Neutral sugar	70.7±0.4	99.8±1.3	94.6±0.6	61.5±0.5
Uronic acid	0.9±0.3	0.2±0.2	5.4±0.1	11.2±0.1
Protein	26.4±0.9	－	－	24.3±4.1
KDO1)-like materials	－	－	－	3.0±0.1
Component sugar (mol%)
Rhamnose	－	0.9±0.0	0.6±0.0	2.4±0.2
Fucose	－	0.1±0.0	－	－
Arabinose	11.64±0.7	1.6±0.0	1.6±0.0	4.4±0.3
Xylose	7.04±0.5	0.5±0.0	1.1±0.0	－
Mannose	1.00±0.1	2.6±0.0	12.0±0.0	1.5±0.0
Galactose	4.24±0.0	2.6±0.0	17.2±0.1	5.2±0.0
Glucose	46.78±0.5	77.3±0.1	72.2±0.1	47.7±0.4
Glucuronic acid＋galacturonic acid	0.90±0.3	0.2±0.2	5.4±0.1	11.2±0.1

¹⁾KDO: 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid..

조다당 CBP-0은 저분자와 고분자의 다당으로 분리하기 위해 50% 에탄올 용액에 침전시킨 후, 상대적으로 고분자의 다당인 침전물 CBP1P를 얻었으며, CBP1P는 재차 분자량별로 분획하기 위해 CBP1P에 33% 에탄올 용액(증류수:에탄올=1:0.5)을 이용하여 침전시킨 후 침전물은 소량의 물에 용해하고, 상등액은 농축, 동결 건조하여 침전물 CBP0.5P와 상등액 CBP0.5S를 얻었다(Fig. 1).

전분가공부산물 유래 다당의 대식세포의 cytokine 생산 증진 활성

선천면역계에 속하는 macrophage는 체내에 침투한 바이러스 및 이물질에 대한 탐식작용(phagocytosis)을 하며, 이들을 제거하는 과정에서 다양한 cytokine을 분비하여 면역반응을 조절한다(Kim 등, 2016). 또한 후천면역세포에 항원을 제시하는 등 후천면역의 작용에도 필수적인 역할을 수행한다고 알려져 있다. 한편, LPS는 그람 음성 세균이 만들어내는 내독소로, 그람 음성 세균의 세포벽에 존재하며 toll like receptor와 반응하여 macrophage를 활성화, 미생물 감염에 대한 2차 면역반응의 조절 능력을 갖는 IL-6, IL-12 및 TNF-α와 같은 cytokine을 생산하는 것으로 알려져 있다(Beutler, 2004). IL-6는 선천면역과 후천면역 모두에서 기능을 하는 다기능(multifunctional) cytokine의 일종으로, 면역반응 초기에 생성되는 주요 반응 매개 물질이며, 면역반응, 급성기 반응 물질의 생성을 촉진, 혈소판의 활성화를 통해 조혈작용을 활성화하고, 내분비계와 신경기관 등에 영향을 준다고 알려져 있다(Kim 등, 2012; Schepetkin과 Quinn, 2006). 또한 B 세포에 작용하여 성장을 촉진하고 T 세포 또는 간세포에 co-stimulator로 작용함으로써, T 세포증식 분화 과정을 유도하고 B 세포의 분화를 유도하는 항체 생산을 촉진한다. IL-12는 세포 내 미생물에 대한 초기 선천면역반응의 주요 매개 인자이며, 세포매개면역을 유도하는 인자로 작용한다. 게다가 B-림프구(B-lymphocyte), 수지상세포(dendritic cell), NK 세포 등의 활성 조절을 통해 암세포를 선택적으로 사멸시키는 데 중요한 역할을 하며, T 세포에 의한 IFN-γ의 생성을 자극하기도 한다(Parihar 등, 2002). TNF-α는 급성 염증반응의 주된 매개자로 작용하며 특정 종양세포에 대해 세포독성과 항바이러스성 작용을 하고, 출혈성 괴사를 일으키는 것으로 알려져 있다(Jang 등, 2021; Parameswaran과 Patial, 2010).

옥수수 가공 부산물 유래 다당 시료의 자극에 의한 macrophage의 cytokine 생산능을 in vitro 상에서 측정한 결과, CBP0.5P 및 CBP0.5S는 IL-6, IL-12 및 TNF-α 모두 높은 활성을 보였다(Fig. 2). 특히 CBP0.5S 획분의 경우 고농도뿐만 아니라 저농도에서도 상대적으로 우수한 활성이 확인됨에 따라 CSL 유래 다당의 주요 활성이 CBP0.5S에서 기인한 것으로 사료되었다.

Fig 2. Effect of CBP0.5P, CBP0.5S, CBP0.5S-I, and CBP0.5S-Ⅱ on cytokine production by murine peritoneal macrophages in vitro. Murine peritoneal macrophages (2.5×10⁶ cells/mL) were treated with various concentrations of samples for 24 h. The medium and LPS (1 μg/mL) represent the negative and positive controls, respectively. NC, negative control; PC, positive control; LPS, lipopolysaccharide. Means with different letters (a-f) indicate significant differences at P<0.05 by Duncan’s multiple range test (n=3).

CSL 유래 CBP0.5S 획분의 화학적 특성

CSL 유래 다당의 주요 활성이 존재하는 것으로 확인된 CBP0.5S 획분의 일반 화학적 특성을 분석하였다. 또한 CBP0.5S는 Table 1에 나타난 바와 같이 중성당 99.8%, 산성당 0.2%로 이루어진 다당체이며, 단백질과 KDO 물질은 검출되지 않았다. 이후 CBP0.5S 획분은 alditol acetate 유도체로 전환한 후 구성당을 분석한 결과, 본 다당은 glucose(77.3%)가 대부분을 차지하고 있었으며, 그 외 galactose(2.6%), mannose(2.6%) 등이 미량 검출되었다. 본 결과를 통해 CBP0.5S가 주로 glucan 형태로 존재한다는 것을 추정할 수 있었다. CBP0.5S 획분이 높은 glucose 함량을 보임에 따라, 이들 획분이 CSL로부터 분리한 다당임을 고려할 때 전분 형태로 존재할 가능성을 배제할 수 없었다. 따라서 이를 확인하기 위해 전분의 α-1,4 결합과 α-1,6 결합을 모두 분해할 수 있는 효소 glucoamylase를 처리하였다. 그 결과, 동일 농도에서 효소 처리한 soluble starch의 환원당 수치가 약 2.5배 증가한 반면, CBP0.5S의 경우에는 효소 처리에 의한 O.D(optical density)값의 변화가 거의 없음이 확인됨에 따라 CBP0.5S는 전분이 아닌 다른 형태 glucan 다당(예, β-glucan 또는 특이 결합 양식의 α-glucan)으로 존재할 것으로 추정되었다(Fig. 3).

Fig 3. Color changes of soluble starch and CBP0.5S by glucoamylase treatment (A) and production of reducing sugars by enzymatic hydrolysis (B). The same concentration of soluble starch and CBP0.5S were treated by glucoamylase. The level of reducing sugar was measured by colorimetric quantification at 570 nm. It was performed by 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay.

CSL 유래 CBP0.5S 획분의 정제 및 화학적 특성

전분 부산물인 CSL에서 분리한 획분 중 CBP0.5S가 면역 활성이 우수하다고 평가되었으며 특히 이들이 특이 다당 형태로 존재할 가능성이 제시되었으므로, CBP0.5S는 50 mM ammonium formate buffer(pH 5.5)로 평형화된 Superdex^TM 200 GL column을 이용해 정제 과정을 행하고 이를 확인하고자 하였다. 그 결과, CBP0.5S는 분자량이 상이한 CBP0.5S-I과 CBP0.5S-II로 분획 되었으며(Fig. 4A), 이를 옥수수 전분 가공 부산물의 활성 본체 규명과 구조 분석을 위한 실험에 사용하고자 하였다. CBP0.5S로부터 정제한 CBP0.5S-I 및 CBP0.5S-II의 일반 화학적 특성을 확인한 결과, CBP0.5S-I은 중성당 94.6%, 산성당 5.4%로 구성되어 있었으며, 단백질과 KDO 물질은 검출되지 않았다. CBP 0.5S-II는 중성당 61.5%, 단백질 24.3%가 대부분으로 구성되어 있었으며, 산성당 11.2%, KDO 3.0%가 소량 검출되었다. 또한, CBP0.5S-I은 HPLC 상에서 단일 피크로 용출되었으며 분자량은 410 kDa으로 확인되었다(Fig. 4B). 한편, CBP0.5S-I을 가수분해하여 alditol acetate 유도체로 전환한 후 구성당을 분석한 결과(Table 1), CBP0.5S-I은 glucose와 galactose를 각각 72.2%, 17.2%의 높은 비율로 함유하며, 그 외 기타 구성당을 소량 함유하고 있었다. 이러한 결과를 통해 CBP0.5S-I이 특이 구조의 glucan 형태로 존재할 가능성이 강력히 시사되었다.

Fig 4. Gel filtration of CBP0.5S fraction on the column of Superdex^TM 200 GL (A) and elution pattern of CBP5S-I in Asahi-Pak GS-520＋GS-320＋GS-220 linked columns (B). HPLC was equipped with Superdex^TM 200 GL column and Asahi-Pak GS-520＋GS-320＋GS-220 linked columns. It was performed with 50 mM ammonium formate buffer (pH 5.5) as an isocratic mobile phase.

정제 다당의 대식세포 cytokine 분비능

옥수수 가공 부산물 유래 정제 다당 시료에 의한 macrophage의 cytokine 분비능을 in vitro 상에서 측정한 결과, 활성 정제 다당 CBP0.5S-I 및 CBP0.5S-II 모두 1,000 μg/mL에서 IL-6, IL-12 및 TNF-α 생산을 높은 비율로 유도하였지만 CBP0.5S-I 획분의 경우에는 저농도에서도 상대적으로 우수한 활성을 보였다(Fig. 2). 이러한 결과들을 종합하여 볼 때 CBP0.5S의 활성 본체는 CBP0.5S-I에 주로 존재함을 확인하였으며, 이를 대상으로 이후 결합 구조 양식을 분석하였다.

전분 가공부산물 유래 정제 다당의 결합 구조 분석

일반적으로 하나의 결합 방법으로 연결된 단백질(peptide 결합) 또는 핵산(phosphor-diester 결합)과 달리, 다당의 경우 구성당이 다수 결합된 고분자 물질로 구성당 간에 (1→1), (1→2), (1→3), (1→4) 및 (1→6) 결합이 가능하며, α 및 β의 anomer 형태가 존재할 수 있고 측쇄를 소유할 수도 있으므로(Lee와 Gray, 1988), 이러한 결합의 다양성으로 인해 다당의 구조 규명은 극도로 복잡하고 어려운 것으로 알려져 있다(Ridley 등, 2001). 다당의 구조분석에 있어서 가장 중요한 분석으로 알려진 methylation analysis는 결합에 참여하고 있지 않는 탄소의 hydroxyl기를 methylation 하여 단당으로 가수분해하여 환원 과정을 통해 구성당을 개환한 후, 남아있는 hydroxyl기를 acetylation 하여 만들어진 유도체를 GS-MS로 분석해 다당의 결합 위치를 확인하는 매우 복잡한 방법이다. 정제도와 수율 및 면역 활성에서 우수하게 나타났던 고분자 정제 다당 CBP0.5S-I을 이용해 methylation analysis를 통한 구조 분석 결과, CBP0.5S-I은 총 10종의 당쇄가 결합에 참여하고 있었으며 glucose 결합 및 galactose 결합이 높은 비율로 확인되었다(Fig. 5). 특히, glucose 잔기의 경우 기존에 알려진 glucose 결합 양식과는 다르게 2-linked Glcp와 3-linked Glcp 및 3,4-linked Glcp가 높은 비율로 존재하는 사실로부터 glucose로 이루어진 주쇄(main chain)는 1→2 결합, 1→3 결합으로 연결된 형태로 존재함을 추정할 수 있었으며, 1→2 결합 또는 1→3 결합을 이루고 있는 glucose의 C4 위치에서 다시 한 가닥의 측쇄(side chain)가 뻗어져 나감을 추정할 수 있었다(Table 2). 한편, 소량 함께 존재하는 galactan은 주로 1→6 결합의 galactose 주쇄에 낮은 비율로 C2 위치에서 측쇄를 갖는 구조임을 알 수 있었다. 이들 추정구조는 Fig. 6에 도식화한 바와 같다. 이상의 결과로부터 옥수수 전분가공부산물 유래 면역 활성 다당은 새로운 특이 결합 양식을 소유한 glucan으로 확인되었다.

Table 2 . Glycosidic linkage composition of CBP0.5S-I analyzed by methylation analysis.

Glycosyl residue	Peak No. in Fig. 5	Deduced glycosidic likage	Mol%
			CBP0.5S-I
Galalctose	2	erminal-Galp	1.1
	5	6-Galp	13.0
	10	2,6-Galp	1.3
Glucose	1	Terminal-Glcp	17.2
	3	3-Glcp	15.3
	4	2-Glcp	28.5
	6	3,4-Glcp	15.1
	7	2,3-Glcp	2.1
	8	2,4-Glcp	0.5
	9	3,6-Glcp	0.5

Fig 5. Total ion chromatograms and fragment ion patterns of four characteristic linkages of GC-MS for glycosidic linkage analysis of CBP0.5S-I purified from CSL. CSL: corn steep liquor.

Fig 6. Proposed structure of an immuno-stimulating polysaccharide, CBP0.5S-I purified from corn steep liquor. Squares with dotted lines indicate a characteristic linkage in CBP0.5S-I.

CSL은 옥수수 습식 제분 산업에서 발생하는 주요 부산물로써, 최근까지 발생량의 대부분이 재활용되지 않고 해양 폐기되고 있는 자원이다. 본 연구에서는 CSL로부터 새로운 생리활성 다당 소재를 개발하기 위해 순차적인 에탄올 침전법에 따라 다당을 분리하였으며, 이들의 면역 활성과 구조적 특성을 조사하였다. CSL로부터 80% 에탄올 침전을 통해 조다당(CBP-0)을 분리한 후, 50% 및 33% 에탄올 용액을 이용한 연속 침전을 통해 CBP0.5S 및 CBP0.5P 획분으로 분리하였다. CBP0.5S를 대식세포에 처리했을 때 IL-6, IL-12 및 TNF-α 등의 면역 활성 사이토카인의 생산을 농도 의존적으로 증진시켰다. CBP0.5S는 Superdex^TM 200 GL column을 이용한 겔 여과를 통해 CBP0.5S-I 및 -II로 정제하였으며, 이 중 CBP0.5S-I이 강력한 대식세포 활성화 경향을 보였다. CBP0.5S-I은 단일 피크로 용출되었으며 분자량은 410 kDa이었다. 이들은 주로 glucose(72.2%)와 galactose (17.2%)로 구성되어 있었으며, 높은 glucose 함량에 기인하여 β-glucan 다당으로 최초 추정되었다. 그러나 메틸화 분석 결과, CBP0.5S-I은 말단이 2-, 3-, 및 3,4-결합으로 연결된 고도로 분지된 특이 결합 양식의 특성을 나타냈으며, 이러한 결과는 CSL 중 존재하는 특이 결합 함유 glucan이 대식세포 활성화에 기여할 수 있음을 강력히 시사하였다.

본 연구는 2022학년도 경기대학교 학술연구비(일반 연구과제)지원에 의해 수행되었습니다.