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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(6): 608-617

Published online June 30, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.6.608

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Physicochemical Properties and Physiological Activities of Fermented Mentha piperita Extracts

Dong-Hyeon Kim and Hong-Sun Yook

Department of Food and Nutrition, Chungnam National University

Correspondence to:Hong-Sun Yook, Department of Food and Nutrition, Chungnam National University, 99, Daehak-ro, Yuseong-gu, Daejeon 34134, Korea, E-mail: yhsuny@cnu.ac.kr

Received: March 5, 2024; Revised: May 9, 2024; Accepted: May 9, 2024

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

This study examined the fermented Mentha piperita extracts obtained using various microorganisms (Bacillus subtilis, BS; Saccharomyces cerevisiae, SC; Levilactobacillus brevis, LB; Lacticaseibacillus casei, LC; Lactiplantibacillus plantarum, LP). The total polyphenol contents of the LP fermented extracts were 208.14±0.95 mg GAE/g, which showed the highest contents among the fermented extracts, but there was no significant difference from the LC fermented extracts. The total flavonoid contents of the LP fermented extracts was 109.66±1.73 mg CE/g, which showed the highest contents among the fermented extracts (P<0.05). The IC50 value of the LP fermented extracts was 0.054±0.005 mg/mL, which showed the highest DPPH radical scavenging activity comparable to ascorbic acid (P>0.05). The IC50 value of the LP fermented extracts was 0.403±0.011 mg/mL, which showed the highest ABTS radical scavenging activity among the fermented extracts (P<0.05). The FRAP value of the LP fermented extracts was 2.25±0.04 M/g, which showed the highest value among the fermented extracts (P<0.05). The EC50 value of the LP fermented extracts was 0.332±0.001 mg/mL, which showed the highest reducing power among the fermented extracts (P<0.05). The IC50 value of the LP fermented extracts was 1.695±0.043 mg/mL, which showed the highest nitrite scavenging activity among the fermented extracts, but there was no significant difference from that of the LC fermented extracts. The SC, LC, and LP fermented extracts were active against Enterobacter cloacae at 10 mg/disc concentrations.

Keywords: Mentha piperita, fermentation, physicochemical properties, physiological activities

발효(fermentation)는 미생물의 작용에 영향을 받아 유기물이 분해 혹은 변화하는 현상을 이용한 것으로 천연물이 가진 성분의 활용성을 증진하고 유용한 물질을 생산할 수 있어 오래전부터 식품 및 의약품 등 다양한 분야에서 자주 사용되는 방법이다. 발효는 방법과 조작이 간편하고 생산비용이 적으며 체내에서 흡수되지 않는 식물의 배당체 성분이 비배당체로 전환되어 생리 활성 물질의 체내 흡수 속도 및 흡수율이 증가하는 장점이 있다(Bae 등, 2004). 그리고 식품에 좋은 향미와 조직감을 부여하고 식품 소재의 보존성을 증대시키는 이점이 있어 식품 산업에서 식품의 기능성 증진을 위한 방법으로 이용되고 있다(Park 등, 2009a). Bacillus subtilis는 흔히 고초균이라고 불리며 주로 토양 속에서 발견되는 호기성균으로, 일반적으로 인체에 안전하다고 알려진 물질인 GRAS(generally recognized as safety)에 속하여 현재에도 광범위하게 사용되며, Bacillus 속 미생물은 amylase, protease, cellulase, glucosidase 등과 같은 널리 활용되고 있는 유용한 효소들을 생산하여 식품 산업에서 자주 이용되는 미생물이다(Yang 등, 2014). 우리나라에서는 오래전부터 미생물을 활용하여 발효식품을 제조하였으며 특히 B. subtilis를 활용하여 제조한 발효식품인 청국장은 콩에 함유된 항산화 물질 외에도 식이섬유, 인지질, saponin, phenolic acid, phytic acid, genistein, daidzein 등의 성분이 함유되어 동맥경화, 당뇨, 골다공증 및 성인병 예방에 효과가 있다고 보고되었다(Kim 등, 1999). 효모는 진핵세포를 가지고 있는 고등 미생물로서 일부 종을 제외한 대부분이 비병원성으로 알려져 있는데 오래전부터 식품, 주류의 발효와 효소 및 유기산 생성 등에 사용되었고, 생리학적 연구가 다각도로 진행되어 단백질, 지질, 비타민, nucleic acid 등의 대사산물 생성 및 분비 기작이 구명되었으며 다양한 유용 물질을 생산하기 위한 원료로 사용되고 있다(Kim 등, 2004). 유산균은 당류를 분해한 후 주로 젖산을 생산하는 미생물로서 다양한 미생물이 존재하는 사람의 장내에서 우세균으로 분포하며 체내 유익균의 성장은 촉진하고 유해균의 증식은 억제하는 생균 활성제(probiotics)의 역할과 더불어 위장 기능 개선, 체내 콜레스테롤 흡수 저해, 영양소의 흡수 및 이용률 증가 등 다양한 질병 예방의 효과와 생리 조절작용을 하는 것으로 보고되었다(Park 등, 2006). 그리고 유산균이 생산하는 lactic acid, acetic acid, formic acid, phenyllactic acid 등과 같은 다양한 대사산물은 식품에 있어서 부패균의 증식을 억제하고 기호도 및 저장성을 증대시키는 것으로 알려져 있다(Kim과 Lee, 2020). 그 외에도 유산균은 장내 균총 분포의 조절을 통해 면역 체계를 활성화하고 유해 세균, 바이러스, 독성 물질로부터 숙주를 보호하는 효과가 있으며 장관 내의 감염을 억제하여 미생물 균총의 유지와 과민성 대장 증후군, 유당불내증, 항종양 및 항암 등에 효과가 있다고 보고되었다(Bang 등, 2012).

페퍼민트(Mentha piperita)는 수생박하와 녹양박하의 교잡종인 박하속 식물로 원산지는 유럽과 중동으로 알려져 있으나 근래에 들어 수요가 점차 증가하여 오늘날에는 전 세계적으로 재배되고 있으며, 특유의 상쾌한 향과 맛으로 인해 사용되는 용도가 매우 광범위하다(Park과 Lee, 2015). 페퍼민트는 높이가 50~90 cm까지 자라는 다년생 식물로 잎은 타원형에 밝은 녹색을 띠며 가장자리에 미세하게 톱니 모양이 있고 꽃은 자줏빛 또는 연분홍빛을 띤다(Singh 등, 2015). 페퍼민트는 동서양에서 오래전부터 약용 및 향신료의 용도로 사용되었고, 페퍼민트 오일은 진경제, 방부제, 향료 등으로 이용되었으며 소화불량, 인후통, 메스꺼움, 감기 등과 같은 임상적인 치료에도 사용되었다(Sustrikova와 Salamon, 2004). 주요 성분으로는 menthol, menthone, isomenthone, limonene, rutin, ρ-coumaric acid, caffeic acid, chlorogenic acid, ferulic acid, tannin, rosmarinic acid 등이 함유되어 있으며 이러한 성분의 영향을 받아 항산화 활성 및 생리학적인 영역에서 효능을 나타낸다(Augspole 등, 2018; Benabdallah 등, 2016; Skalicka-Woźniak과 Walasek, 2014). 페퍼민트를 이용한 연구로는 페퍼민트 발효물의 기도 점액 유전자 억제 효능(Jee 등, 2021), 페퍼민트 물 추출물의 항궤양 효능(Zangeneh 등, 2019), 페퍼민트 오일의 상처 치유 효능(Modarresi 등, 2019) 등이 보고되었다. 페퍼민트는 항산화, 항궤양 및 여러 생리학적 연구에 대해서는 보고되었으나 페퍼민트를 미생물로 발효하여 특성을 연구한 사례는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 식품 산업에서 페퍼민트의 이용 가치를 증진하고자 생리 활성 물질이 풍부하게 함유된 페퍼민트를 유용한 미생물들을 활용하여 발효한 다음 이화학적 특성 및 생리 활성을 확인하였으며, 향후 페퍼민트 발효 추출물이 천연 항산화제, 건강 기능식품 등과 같은 새로운 산업원료 소재로서의 이용 가능성이 있는지 탐구하고자 하였다.

사용 균주

페퍼민트 발효에 사용된 균주는 Bacillus subtilis KACC 14549(BS), Saccharomyces cerevisiae KACC 48234(SC), Levilactobacillus brevis KACC 18270(LB), Lacticaseibacillus casei KACC 12413(LC), Lactiplantibacillus plantarum KACC 18510(LP)으로 농업유전자원센터에서 분양받아 사용하였다. BS는 nutrient broth(Difco Laboratories), SC는 YM broth(Difco Laboratories), LB, LC, LP는 Lactobacilli MRS broth(Difco Laboratories)에서 배양하였다. BS, SC는 30°C, LB, LC, LP는 37°C에서 24시간 주기로 3회 계대 배양하였고, 600 nm에서 측정한 흡광도 값이 0.4~0.6 범위 안에 들게 한 다음 발효 균주로 사용하였다.

페퍼민트 발효 추출물 제조

본 실험에 사용된 페퍼민트(이집트산)는 원물 형태의 건조된 페퍼민트를 2023년 8월에 구입하여 분말화한 다음 실험에 사용하였다. 페퍼민트 발효 추출물의 제조 과정은 증류수 500 mL에 glucose(Sigma-Aldrich Co.) 10 g, peptone(Life Technologies Corporation) 2.5 g을 넣고 121°C에서 15분 동안 가압 고온 멸균하여 실온에서 서서히 식힌 다음 페퍼민트 50 g과 미리 활성화한 5종의 발효 균주 10 mL를 주입하였다. BS, SC는 30°C, LB, LC, LP는 37°C에서 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 121°C에서 15분 동안 가압 고온 멸균하였다. 멸균된 배양액을 원심분리 및 여과(Whatman No. 4, GE Healthcare Life Sciences)한 후 동결 건조(FD8512, ilShinBioBase Co., Ltd.)하여 얻은 페퍼민트 발효 추출물을 실험에 사용하였다. 무발효 대조군은 페퍼민트 50 g을 500 mL의 증류수로 상온에서 24시간 추출한 다음 원심분리, 여과 및 동결 건조하여 얻은 추출물을 실험에 사용하였다.

페퍼민트 발효 추출물의 수율

페퍼민트 발효 추출물의 수율은 페퍼민트 발효 및 무발효 추출물을 동결 건조하여 용매를 모두 휘발시킨 건조 중량을 구한 다음 추출물 제조에 사용한 원료 중량에 대한 백분율로 나타내었다. 모든 실험에서 시료는 추출 용매로 용해하여 원하는 농도로 제조하여 사용하였다.

(%)=AB×100

A: 발효액을 동결 건조한 후 얻은 분말의 무게(g)

B: 추출물 제조에 사용한 원료 무게(g)

사용 균주에 따른 페퍼민트 발효액의 배양 특성

페퍼민트 발효액의 pH는 발효액을 24시간 동안 배양하고 멸균 및 여과한 다음 pH meter(K2000-pH, iSTEK Co.)를 이용하여 측정하였다. 혼탁도는 발효액을 24시간 동안 배양하고 멸균 및 여과한 다음 600 nm에서 흡광도를 측정하여 미생물의 발효 정도를 확인하였다. 생균수는 24시간 동안 배양한 발효액을 멸균한 증류수에 희석하여 BS, LB, LC, LP는 plate count agar(Difco Laboratories), SC는 potato dextrose agar(Difco Laboratories)에 분주한 다음 각각 37°C, 30°C에서 24시간 배양하여 측정하였다.

총 폴리페놀 함량

총 폴리페놀 함량은 Folin과 Denis(1912)의 방법을 참고하여 측정하였다. 시료 50 μL에 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent(Sigma-Aldrich Co.)와 증류수를 1:2의 비율로 섞은 혼합액 50 μL를 가하여 3분간 반응시키고 10% Na2CO3(Duksan Pure Chemical Co., Ltd.) 750 μL를 가하여 1시간 동안 암실에서 반응시킨 다음 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 표준물질로 사용하여 검량식을 작성한 다음 시료 1 g에 대한 mg gallic acid equivalents(GAE)로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량

총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(1999)의 방법을 참고하여 측정하였다. 시료 125 μL에 증류수 500 μL와 5% NaNO2(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 37.5 μL를 가하여 5분간 반응시켰다. 이후 10% AlCl3・6H2O(Junsei Chemical Co., Ltd.) 75 μL를 가하여 6분간 반응시키고 1 M NaOH(Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd.) 250 μL를 가하여 11분간 반응시킨 다음 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 catechin hydrate(Sigma-Aldrich Co.)를 표준물질로 사용하여 검량식을 작성한 다음 시료 1 g에 대한 mg catechin equivalents(CE)로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거 활성

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성은 Blois(1958)의 방법을 참고하여 측정하였다. 시료 100 μL에 0.2 mM DPPH(Sigma-Aldrich Co.) solution 100 μL를 가하여 암실에서 30분간 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료의 희석용매를 사용하여 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 비교하였으며, 결괏값은 시료를 첨가하지 않은 대조군에 대한 시료 첨가군의 감소한 흡광도를 백분율로 산출한 다음 50%의 소거 활성을 나타내는 시료 농도인 IC50값으로 나타내었다. 양성대조군으로는 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 사용하여 비교하였다.

ABTS 라디칼 소거 활성

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS) 라디칼 소거 활성은 Fellegrini 등(1999)의 방법을 참고하여 측정하였다. ABTS solution은 140 mM K2S2O8(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 88 μL에 증류수 5 mL를 가하고 ABTS diammonium salt tablet(Sigma-Aldrich Co.) 2알을 넣어 암실에서 12~16시간 반응시킨 다음, 95% 에탄올(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)과 혼합하여 734 nm에서 측정한 흡광도 값이 0.70±0.02가 되도록 조절하여 사용하였다. 시료에 ABTS solution 1 mL를 가하여 2분 30초간 암실에서 반응시킨 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료의 희석 용매를 사용하여 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 비교하였으며, 결괏값은 시료를 첨가하지 않은 대조군에 대한 시료 첨가군의 감소한 흡광도를 백분율로 산출한 다음 50%의 소거 활성을 나타내는 시료 농도인 IC50값으로 나타내었다. 양성대조군으로는 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 사용하여 비교하였다.

Ferric reducing antioxidant power(FRAP) 활성

FRAP 활성은 Benzie와 Strain(1996)의 방법을 참고하여 측정하였다. FRAP reagent는 300 mM acetate buffer (pH 3.6)와 40 mM HCl(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)에 용해한 10 mM TPTZ(Sigma-Aldrich Co.), 20 mM FeCl3・6H2O(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 각각 10:1:1의 비율로 섞고 37°C에서 10분간 반응시켜 제조하였다. 시료 30 μL에 증류수 90 μL와 FRAP reagent 900 μL를 가하여 37°C에서 10분간 반응시킨 다음 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 FeSO4・7H2O(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 표준물질로 사용하여 검량식을 작성한 다음 시료 1 g에 대한 FeSO4・7H2O의 M 함량으로 나타내었다.

환원력

환원력은 Oyaizu(1986)의 방법을 참고하여 측정하였다. 시료 1 mL에 200 mM phosphate buffer(pH 6.6) 1 mL와 1% potassium ferricyanide(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 1 mL를 가하고 50°C에서 20분간 반응시킨 다음 5분간 냉각시켰다. 이 혼합액에 10% trichloroacetic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 1 mL를 가하여 원심분리하고 상등액 0.5 mL, 증류수 0.5 mL, 0.1% ferric chloride(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 0.05 mL를 가하여 10분간 반응시킨 다음 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 시료의 흡광도 값으로 나타내었으며, 흡광도 값을 퍼센트(%)로 환산하여 흡광도 0~1의 범위를 0~100%의 범위로 보아 50%의 환원력을 나타내는 시료 농도인 EC50값으로 나타내었다. 양성대조군으로는 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 사용하여 비교하였다.

아질산염 소거 활성

아질산염 소거 활성은 Gray와 Dugan(1975)의 방법을 참고하여 측정하였다. 시료 100 μL에 1 mM NaNO2(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 100 μL, 0.2 M citrate buffer(pH 3.0) 800 μL를 가하고 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 혼합물 50 μL에 2% acetic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 100 μL, griess reagent 20 μL를 가하여 15분간 반응시킨 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 아래의 식을 이용하여 백분율로 산출한 다음 50%의 소거 활성을 나타내는 시료 농도인 IC50값으로 나타내었다. 양성대조군으로는 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 사용하여 비교하였다.

Nitrite scavenging activity (%)=1ACB×100

A: absorbance of 520 nm determined with sample

B: absorbance of 520 nm determined with distilled water instead of sample

C: absorbance of 520 nm determined with distilled water instead of griess reagent

항균 활성

항균 활성은 각 유해 균주를 대상으로 disc diffusion assay(Bauer 등, 1966)를 참고하여 측정하였다. 항균 활성 측정에 사용한 균주는 그람 양성균에 속하는 Bacillus cereus KCTC 1012, Bacillus subtilis KACC 14549, Staphylococcus aureus KCTC 3881과 그람 음성균에 속하는 Escherichia coli KCTC 2441, Enterobacter cloacae KCTC 1685, Salmonella enterica Typhimurium KCTC 2515, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1636의 총 7종을 생물자원센터와 농업유전자원센터에서 분양받아 사용하였다. 휴면 상태의 균주들을 Table 1의 조건으로 생육 배양하였고, 활성화된 각 균주를 nutrient agar(Difco Laboratories)에 100 μL씩 분주한 다음 멸균된 spreader로 도말하여 항균 실험용 평판배지를 준비하였다. 시료를 paper disc(8 mm)에 흡수시키고 용매를 휘발시킨 다음 평판배지 위에 밀착한 상태로 24시간 동안 30°C, 37°C에서 배양하였다. 이후 disc 주변에 생성된 생육 저해환(clear zone)의 직경(mm)을 측정하여 항균력을 비교하였다.

Table 1 . List of strains used for antibacterial experiments

StrainsMedia1)Temp. (°C)
Gram positive bacteriaBacillus cereusNA/NB30
Bacillus subtilisNA/NB30
Staphylococcus aureusNA/NB30
Gram negative bacteriaEscherichia coliNA/NB30
Enterobacter cloacaeNA/NB30
Salmonella enterica TyphimuriumNA/NB37
Pseudomonas aeruginosaNA/NB37

1)NA: nutrient agar, NB: nutrient broth.



통계 처리

모든 실험은 3회 이상 반복 측정하였으며 얻어진 결과는 SPSS 26.0(Statistical Package for the Social Science, SPSS Inc.)을 사용하여 평균과 표준편차로 나타내었다. 수율 측정을 제외한 각 측정값 간의 유의성 검증은 95% 유의수준(P<0.05)에서 분산분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test를 통하여 검증하였다.

페퍼민트 발효 추출물의 수율

다양한 미생물을 이용하여 발효한 페퍼민트 발효 추출물의 수율 측정 결과는 Table 2에 나타내었다. 발효 및 무발효군 중 BS 발효군이 35.68%로 가장 높은 수율을 나타내었고 무발효 대조군이 16.55%로 가장 낮은 수율을 나타내었다. 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 높은 수율을 나타내었는데 Ahn 등(2015)의 연구에 따르면 와송을 유산균 스타터로 발효하였을 때 미생물 대사에 영향을 받아 발효군의 수율이 무발효 대조군보다 증가하였다고 보고하였고, Lee와 Yook(2023)의 연구에 따르면 눈개승마를 다양한 미생물로 발효하였을 때 발효군의 수율이 무발효 대조군보다 높았으며 BS 발효군의 수율이 가장 높았다고 보고하여 미생물 발효에 영향을 받아 수율이 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 발효 이후 증가하는 수율은 효소 가수분해에 따른 폴리페놀 화합물, 유리 아미노산, lactic acid 등과 같은 대사산물 생성량 증가 및 에탄올 생성으로 불용성 성분의 추출 효과, 발효에 의한 세포 분해 효과 등에 의해 증가한다고 보고되었는데(Hwang 등, 2007; Park 등, 2012), 이에 영향을 받아 페퍼민트 발효군의 수율이 무발효 대조군보다 높은 것으로 사료된다.

Table 2 . The yield, pH value, turbidity, and viable cell count in the broth of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism

Microorganism1)Yield (%)pHTurbidity2)Viable cell count (log CFU/mL)
Control16.555.91±0.00a3)4)0.701±0.004e
BS35.685.56±0.01b0.954±0.003a6.15±0.04d
SC31.605.51±0.01c0.882±0.005b7.90±0.05b
LB29.085.13±0.01e0.871±0.002c7.63±0.07c
LC27.405.01±0.01f0.783±0.001d7.98±0.01b
LP26.585.18±0.01d0.874±0.005c8.68±0.11a

1)Control: non-fermented M. piperita, BS: Bacillus subtilis, SC: Saccharomyces cerevisiae, LB: Levilactobacillus brevis, LC: Lacticaseibacillus casei, LP: Lactiplantibacillus plantarum.

2)Turbidity measurement based on OD600 in the broth of M. piperita fermented by various microorganism.

3)Mean±SD (n=3).

4)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05).



페퍼민트 발효액의 배양 특성

유용한 미생물들을 이용하여 발효한 페퍼민트 발효액의 배양 특성 결과는 Table 2에 나타내었다. 일반적으로 미생물을 이용하여 발효 과정을 거치게 되면 효소 가수분해에 따른 다양한 대사산물이 생성되어 발효액의 pH에 영향을 미칠 수 있다고 알려져 있다(Park 등, 2023). pH 측정 결과, 발효군 중 LC 발효군이 5.01±0.01로 가장 낮고 BS 발효군이 5.56±0.01로 가장 높은 pH를 나타내었다(P<0.05). 모든 발효군의 pH는 5.01~5.56 사이의 범위를 나타내었고 무발효 대조군의 pH는 5.91±0.00으로 나타나 페퍼민트 발효 이후 pH는 유의적으로

감소하였다(P<0.05). Kim 등(2012b)의 연구에 따르면 효모로 발효한 막걸리의 경우 발효 기간 중 미생물의 작용으로 lactic acid, citric acid, malic acid, succinic acid 등 유기산 함량이 증가하였다고 보고하였고, Park과 Chang(2003)의 연구에 따르면 복분자 농축액을 유산균으로 발효하였을 때 acetic acid, lactic acid 등과 같은 대사산물이 발효 전보다 증가하여 유기산 함량의 증가 및 pH가 감소하였다고 보고하였다. 그리고 Jung과 Oh(2022)의 연구에 따르면 파인애플 착즙액을 유산균 스타터로 발효하였을 때 유기산 및 젖산 등과 같은 대사산물이 생성되어 pH가 감소하였다고 보고하여 발효 이후 pH가 감소한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 따라서 발효 과정 중 미생물이 생성하는 여러 대사산물에 영향을 받아 페퍼민트 발효액의 pH가 감소한 것으로 사료된다.

발효물 내 발효 균주의 생장이 진행될수록 부유 물질 및 대사산물이 생성되고 미생물 자체의 응집성이나 부유 물질량 정도에 따라 침전물질에 차이가 발생하며 그 생성량이 많을수록 혼탁도가 증가하게 되는데, 이때 발효물의 혼탁도를 OD600에서 측정함으로써 미생물의 생장을 간접적으로 확인할 수 있다(Alpen과 Mandel, 1960). 혼탁도 측정 결과 모든 시료의 혼탁도는 0.701~0.954 사이의 범위를 나타내었으며 무발효 대조군이 0.701±0.004로 가장 낮은 혼탁도를 나타내었고, BS 발효군이 0.954±0.003으로 가장 높은 혼탁도를 나타내어 페퍼민트 발효 이후 혼탁도는 유의적으로 증가하였다(P<0.05). Kang 등(2021)의 연구에 따르면 괴각을 다양한 미생물로 발효하였을 때 발효군의 혼탁도가 무발효 대조군보다 높았으며 미생물 발효에 영향을 받아 혼탁도가 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 따라서 미생물 대사 과정 중 생성되는 대사산물 및 침전물질 등에 영향을 받아 페퍼민트 발효액의 혼탁도가 증가한 것으로 사료된다.

페퍼민트 발효가 미생물의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위해 24시간 동안 발효하여 생균수를 측정한 결과 모든 시료의 생균수는 6.15~8.68 log CFU/mL 사이의 범위를 나타내었으며 LP 발효군이 8.68±0.11 log CFU/mL로 가장 높은 생균수를 나타내었고, BS 발효군이 6.15±0.04 log CFU/mL로 가장 낮은 생균수를 나타내었으며 다른 균주들에 비해 유산균으로 발효했을 때 비교적 높은 생균수를 나타내었다(P<0.05). 이상으로 페퍼민트 발효액의 pH, 혼탁도, 생균수를 측정한 결과를 미루어 보아 페퍼민트 발효가 잘 진행되었음을 확인하였고, 이 중 유산균을 사용하여 발효를 진행하였을 때 미생물이 자기 증식에 있어서 페퍼민트를 가장 효과적으로 이용하는 것으로 판단된다.

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

페퍼민트 발효 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정 결과는 Table 3에 나타내었다. 총 폴리페놀 함량 측정 결과 발효군 중에서 LP 발효군이 208.14±0.95 mg GAE/g으로 가장 높은 함량을 나타내었으나 LC(205.94±2.86 mg GAE/g) 발효군과 유의적인 차이는 나타나지 않았고(P>0.05), SC(192.74±0.00 mg GAE/g), LB(191.09±0.00 mg GAE/g), BS(186.14±2.86 mg GAE/g) 발효군 순으로 낮은 함량을 나타내었다. 무발효 대조군의 총 폴리페놀 함량은 186.69±2.52 mg GAE/g으로 BS 발효군과 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). BS 발효군을 제외한 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 총 폴리페놀 함량을 나타내었다(P<0.05). Yang 등(2019)의 연구에 따르면 꽃송이버섯을 유산균으로 발효하였을 때 무발효 대조군보다 총 폴리페놀 함량이 증가하였다고 보고하였다. 그리고 발효물의 HPLC 분석 결과 꽃송이버섯 추출물에 함유된 폴리페놀과 꽃송이버섯 발효물에 함유된 폴리페놀이 서로 다르며 Lactobacillus 균의 작용에 영향을 받아 발효 이후 chlorogenic acid와 ascorbic acid가 생성되었다고 보고하였다. 이를 통해 미생물 발효에 의한 효소 가수분해로 생성되는 폴리페놀 화합물에 영향을 받아 페퍼민트 발효군의 총 폴리페놀 함량이 증가한 것으로 사료된다.

Table 3 . Total polyphenol and flavonoid contents of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism

Microorganism1)Total polyphenol contents (mg GAE2)/g)Total flavonoid contents (mg CE3)/g)
Control186.69±2.52c4)5)87.07±1.13e
BS186.14±2.86c95.93±0.50c
SC192.74±0.00b97.79±0.43c
LB191.09±0.00b93.50±0.74d
LC205.94±2.86a106.80±1.13b
LP208.14±0.95a109.66±1.73a

1)Abbreviations: See the Table 2.

2)GAE: gallic acid equivalents.

3)CE: catechin equivalents.

4)Mean±SD (n=3).

5)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05).



총 플라보노이드 함량 측정 결과 발효군 중에서 LP 발효군이 109.66±1.73 mg CE/g으로 가장 높은 함량을 나타내었고(P<0.05), LC(106.80±1.13 mg CE/g), SC(97.79±0.43 mg CE/g), BS(95.93±0.50 mg CE/g), LB(93.50±0.74 mg CE/g) 발효군 순으로 낮은 함량을 나타내었으며 BS와 SC 발효군 간 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 무발효 대조군의 총 플라보노이드 함량은 87.07±1.13 mg CE/g으로 모든 시료 중 가장 낮은 함량을 나타내었다(P<0.05). 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 총 플라보노이드 함량을 나타내었다(P<0.05). Park 등(2009b)의 연구에 따르면 발효 더덕의 총 플라보노이드 함량이 무발효 대조군보다 약 5배 정도 높았다고 보고하여 발효 이후 총 플라보노이드 함량이 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 이는 식물 조직의 세포벽 성분과 결합 되어 있던 배당체 형태의 플라보노이드가 가수분해되어 비배당체로 전환된 것에 영향을 받아 페퍼민트 발효군의 총 플라보노이드 함량이 증가한 것으로 사료된다(Park 등, 2010).

DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성

페퍼민트 발효 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성 측정 결과는 50%의 라디칼 소거 활성을 나타내는 시료의 농도인 IC50값으로 나타내었으며 그 결괏값은 Table 4에 나타내었다. DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과 발효군 중에서 LP 발효군의 IC50값이 0.054±0.005 mg/mL로 가장 높은 라디칼 소거 활성을 나타내었고(P<0.05), LC(0.066±0.001 mg/mL), SC(0.068±0.001 mg/mL), LB(0.073±0.000 mg/mL), BS(0.074±0.001 mg/mL) 발효군 순으로 낮은 라디칼 소거 활성을 나타내었으며 BS와 LB, LB와 SC, SC와 LC 발효군 간 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 무발효 대조군의 IC50값은 0.077±0.002 mg/mL로 모든 시료 중 라디칼 소거 활성이 가장 낮았으나 BS, LB 발효군과 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). BS, LB 발효군을 제외한 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 라디칼 소거 활성을 보였다(P<0.05). Hwang 등(2016)의 연구에 따르면 갈색콩 두유를 젖산 발효하였을 때 발효가 진행됨에 따라 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였다고 보고하였고, 효소 활성에 의해 glycosides 및 malonyl glycosides 형태가 감소하면서 aglycone의 함량이 증가하였다고 보고하여 발효 이후 항산화 활성이 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 특히 LP 발효군의 경우 ascorbic acid와 비교하였을 때도 유의적인 차이가 나타나지 않아 비교적 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였는데, Hur 등(2014)의 연구에 따르면 LP 균주의 경우 일부 폴리페놀 화합물 중 tannin을 분해하는 대사 능력이 있고 tannin이 존재하는 환경에서 tannase를 생성한다고 알려져 있으며, 이 tannase는 hydrolysable tannin과 gallic acid ester의 가수분해 반응을 촉매하고 강력한 항산화제 중 하나인 propyl gallate의 합성을 위한 기질로 사용되어 항산화 활성을 증가시킬 수 있다고 보고하였다. 그리고 Rodríguez 등(2009)의 연구에 따르면 tannin이 LP 균주에 의해 분해되어 생성되는 최종 대사산물에는 gallic acid, pyrogallol 등의 항산화 물질이 함유되어 있다고 보고하였다. 페퍼민트에는 여러 폴리페놀 화합물이 존재하고 그중 tannin이 함유되었다고 보고되었는데(Benabdallah 등, 2016), tannin이 LP 균주의 영향을 받아 발효 이후 항산화 활성이 증가한 것으로 추정된다. 따라서 페퍼민트 발효 시 LP 균주를 사용하는 것이 항산화 활성 증대에 도움이 될 것으로 사료된다.

Table 4 . DPPH and ABTS radical scavenging activity of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism

Microorganism1)DPPH radical scavenging activity IC502) (mg/mL)ABTS radical scavenging activity IC50 (mg/mL)
Control0.077±0.002a3)4)0.449±0.016b
BS0.074±0.001a0.523±0.006a
SC0.068±0.001bc0.464±0.011b
LB0.073±0.000ab0.506±0.016a
LC0.066±0.001c0.430±0.003c
LP0.054±0.005d0.403±0.011d
Ascorbic acid0.054±0.005d0.117±0.002e

1)Abbreviations: See the Table 2.

2)Inhibitory activity was expressed as the mean of 50% inhibitory concentration of triplicate determines, obtained by interpolation of concentration inhibition curve.

3)Mean±SD (n=3).

4)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05).



ABTS 라디칼 소거 활성 측정 결과 발효군 중에서 LP 발효군의 IC50값이 0.403±0.011 mg/mL로 가장 높은 라디칼 소거 활성을 나타내었고(P<0.05), LC(0.430±0.003 mg/mL), SC(0.464±0.011 mg/mL), LB(0.506±0.016 mg/mL), BS(0.523±0.006 mg/mL) 발효군 순으로 낮은 라디칼 소거 활성을 나타내었으며, BS와 LB 발효군 간 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 무발효 대조군의 IC50값은 0.449±0.016 mg/mL로 SC 발효군과 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 페퍼민트 LP 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 라디칼 소거 활성을 보였는데 Kim 등(2022)의 연구에 따르면 양파 착즙액을 유산균으로 발효하였을 때 ABTS 라디칼 소거 활성이 증가하였다고 보고하여 발효 이후 항산화 활성이 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 이는 DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과와 마찬가지로 균주의 효소 가수분해 작용에 영향을 받아 항산화 활성이 증가한 것으로 추정되고, 유산균을 이용하여 제조한 페퍼민트 발효 추출물은 생리 활성, 기능성 등을 증진시킬 수 있음을 확인하였으며 페퍼민트 발효 시 LP 균주를 이용하는 것이 항산화 활성 증대에 도움이 될 것으로 사료된다.

FRAP 활성 및 환원력

페퍼민트 발효 추출물의 FRAP 활성 및 환원력 측정 결과는 Table 5에 나타내었다. FRAP 활성 측정 결과 발효군 중에서 LP 발효군이 2.25±0.04 M/g으로 가장 높은 활성을 나타내었고(P<0.05), LC(2.19±0.01 M/g), SC(2.01±0.00 M/g), LB(1.98±0.01 M/g), BS(1.85±0.03 M/g) 발효군 순으로 낮은 FRAP 활성을 나타내었으며, SC와 LB 발효군 간 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 무발효 대조군의 FRAP 활성은 1.73±0.04 M/g으로 모든 시료 중 가장 낮은 활성을 나타내었다(P<0.05). 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 FRAP 활성을 나타내었는데(P<0.05), Jang 등(2021)의 연구에 따르면 황백을 유산균으로 발효하였을 때 미생물 대사를 통해 생성된 대사산물에 영향을 받아 시간이 지남에 따라 FRAP 활성이 증가하였다고 보고하여 발효 이후 항산화 활성이 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 일반적으로 폴리페놀 성분의 항산화 능력은 주로 환원력에 기인하며 그 함량이 높을수록 항산화 활성이 증가한다고 보고되었는데(Holasova 등, 2002), 앞서 측정한 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 결과가 FRAP 활성 결과에 영향을 미치는 것으로 사료된다.

Table 5 . Ferric reducing antioxidant power (FRAP), reducing power and nitrite scavenging activity of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism

Microorganism1)FRAP value (M/g)Reducing power EC502) (mg/mL)Nitrite scavenging activity IC503) (mg/mL)
Control1.73±0.04a4)5)0.453±0.001a2.505±0.095a
BS1.85±0.03d0.432±0.000b2.245±0.145b
SC2.01±0.00c0.370±0.001c2.029±0.080c
LB1.98±0.01c0.374±0.003c1.887±0.084cd
LC2.19±0.01b0.354±0.002d1.823±0.048de
LP2.25±0.04a0.332±0.001e1.695±0.043e

Ascorbic acid0.066±0.000f0.538±0.002f

1)Abbreviations: See the Table 2.

2)Amount required for 50% effective of reducing power.

3)Inhibitory activity was expressed as the mean of 50% inhibitory concentration of triplicate determines, obtained by interpolation of concentration inhibition curve.

4)Mean±SD (n=3).

5)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05).



환원력 측정 결과는 50%의 환원력을 나타내는 시료의 농도인 EC50값으로 나타내었다. 환원력 측정 결과 발효군 중에서 LP 발효군의 EC50값이 0.332±0.001 mg/mL로 가장 높은 환원력을 나타내었고, LC(0.354±0.002 mg/mL), SC(0.370±0.001 mg/mL), LB(0.374±0.003 mg/mL), BS(0.432±0.000 mg/mL) 발효군 순으로 낮은 환원력을 나타내었으며 모두 유의적인 차이를 나타내었다(P<0.05). 무발효 대조군의 EC50값은 0.453±0.001 mg/mL로 모든 시료 중 가장 낮은 환원력을 나타내었다(P<0.05). 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 환원력을 나타내었는데(P<0.05), Lee와 Hong(2016)의 연구에 따르면 오디를 유산균으로 발효하였을 때 미생물 대사에 의한 생리 활성 물질의 생성으로 인해 환원력이 무발효 대조군보다 증가하였다고 보고하여 발효 이후 항산화 활성이 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 이는 앞서 측정한 FRAP 활성 결과와 유사한 경향을 나타내었으며 페퍼민트 발효군의 환원력이 무발효 대조군보다 높게 나타난 것은 발효 과정 중 미생물에 의해 고분자 화합물이 분해되어 폴리페놀 화합물 혹은 항산화 물질이 새롭게 생성되거나 증가함에 기인한 것으로 사료된다(Kim 등, 2019).

아질산염 소거 활성

페퍼민트 발효 추출물의 아질산염 소거 활성 측정 결과는 50%의 라디칼 소거 활성을 나타내는 시료의 농도인 IC50값으로 나타내었으며 그 결괏값은 Table 5에 나타내었다. 발효군 중에서 LP 발효군이 1.695±0.043 mg/mL로 가장 높은 소거 활성을 나타내었으나 LC(1.823±0.048 mg/mL) 발효군과 유의적인 차이는 나타나지 않았고(P>0.05), LB(1.887±0.084 mg/mL), SC(2.029±0.080 mg/mL), BS(2.245±0.145 mg/mL) 발효군 순으로 낮은 소거 활성을 나타내었으며, SC와 LB, LB와 LC 발효군 간 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 무발효 대조군의 IC50값은 2.505±0.095 mg/mL로 모든 시료 중 가장 낮은 소거 활성을 나타내었다(P<0.05). 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 라디칼 소거 활성을 나타내었는데(P<0.05), Choi 등(2009)의 연구에 따르면 양파를 유산균으로 발효하였을 때 무발효 대조군보다 아질산염 소거 활성이 높았다고 보고하여 발효 이후 아질산염 소거 활성이 증가한 본 연구 결과와 비슷한 경향을 나타내었다. Shin 등(2005)의 연구에 따르면 페놀성 화합물의 높은 함량은 아질산염 소거 활성과 관련이 있다고 보고하였으며, 앞서 측정한 페퍼민트 발효군의 높은 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과도 연관이 있는 것으로 사료된다. 니트로사민의 전구물질인 아질산염과 아민은 식품 내에 널리 존재하고 있고, 이를 함유한 음식물을 동시에 섭취하였을 때 체내에서 니트로사민이 생성될 수 있다. 따라서 페퍼민트 발효 시 아질산염 소거 활성을 통한 니트로사민 생성 억제 관여 및 니트로사민에 의해 동반되는 질병 억제에도 도움이 될 것으로 사료된다.

항균 활성

페퍼민트 발효 추출물의 항균 활성 측정 결과는 Table 6에 나타내었다. 무발효 대조군에서는 항균 활성이 나타나지 않았고, 발효군 중에서 SC, LC, LP 발효군에서 E. cloacae에 대한 생육 저해 활성을 나타내었다. Saeed 등(2006)의 연구에 따르면 페퍼민트 물 추출물의 경우 E. coli, S. Typhimurium, P. aeruginosa 균주에 대한 항균 활성이 나타나지 않았다고 보고하여 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 페퍼민트의 성분 중 항균 활성을 가진 성분은 menthol, menthone 및 그 유도체 등이라고 보고되었으며, 이러한 성분들은 유기용매 중 주로 에틸아세테이트층에서 추출된다고 보고되었다(Kaffenberger와 Doyle, 1990). 페퍼민트 무발효 대조군의 경우 추출 용매로 물을 사용하였기 때문에 본 실험에 사용되는 여러 균주에 대한 항균 활성이 나타나지 않은 것으로 사료된다. 페퍼민트 SC 발효군의 생육 저해환 크기는 10 mg/disc의 농도에서 그람 음성균인 E. cloacae에 대한 활성이 9.95±0.06 mm로 나타났고, LC 발효군은 같은 농도에서 8.94±0.09 mm, LP 발효군은 8.72±0.10 mm로 각각 나타났다. Kim 등(2012a)의 연구에 따르면 포도박을 유산균으로 발효하였을 때 그람 음성균인 E. coli, E. cloacae, S. enterica Typhimurium, P. aeruginosa에 대한 항균 활성을 나타내었다고 보고하여 발효 이후 항균 활성을 나타낸 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 이는 유산균이 생산하는 천연 항균 물질인 bacteriocin에 영향을 받은 것으로 판단되며, 유산균 발효 시 생성되는 물질인 diacetyl(2,3-butanedione)은 pH와 상호작용하여 병원성균을 포함하는 그람 음성균에 대한 생육 저해를 나타낸다고 보고되었는데(Ryu 등, 2011), 본 연구의 LC, LP 균주에서도 그람 음성균인 E. cloacae에 대한 생육 저해를 나타내어 유사한 경향을 나타내었다. Ryu 등(2011)의 연구에 따르면 유산균 발효액의 경우 식품 위해 미생물이 생성하는 물질로부터 보호 효과가 뛰어나 방부제 성분이나 유해 첨가물의 대체제 등으로 사용 가능하며 병원성 미생물의 생육을 저해함과 더불어 인체에 안전한 장점이 있어 식품 제조 과정 혹은 화장품, 생활용품 등 다양한 분야의 천연 항균 소재로서의 적용이 가능하다고 보고하였다.

Table 6 . Antibacterial activity of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism

MicroorganismSize of clear zone (mm)

Sample1)Fraction conc. (mg/disc)

5.010.0
Bacillus cereusControl2)
BS
SC
LB
LC
LP

Bacillus subtilisControl
BS
SC
LB
LC
LP

Staphylococcus aureusControl
BS
SC
LB
LC
LP

Pseudomonas aeruginosaControl
BS
SC
LB
LC
LP

Escherichia coliControl
BS
SC9.95±0.06a3)4)
LB
LC8.94±0.09b
LP8.72±0.10c

Enterobacter cloacaeControl
BS
SC
LB
LC
LP

Salmonella enterica TyphimuriumControl
BS
SC
LB
LC
LP

1)Abbreviations: See the Table 2.

2)Not detected.

3)Mean±SD (n=4).

4)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05).


본 연구에서는 유용한 미생물을 활용하여 페퍼민트를 발효한 후 균주별 배양 특성을 조사하고 미생물 간 항산화, 항염 및 항균 활성 등의 생리 활성을 비교하여 식품업계에서 페퍼민트 발효 추출물이 새로운 소재로서의 가능성이 있는지 탐구하고자 연구를 진행하였다. 페퍼민트 발효액의 수율을 측정한 결과 발효군의 수율은 26.58~35.68% 사이의 범위로 무발효 대조군(16.55%)보다 높은 수율을 나타내었고, pH를 측정한 결과 발효액의 pH는 5.01~5.56 사이의 범위로 무발효 대조군(5.91±0.00)보다 낮은 pH를 나타내었다. 혼탁도를 측정한 결과 발효군의 혼탁도는 0.783~0.954의 범위로 무발효 대조군(0.701±0.004)보다 높은 혼탁도를 나타내었고, 생균수를 측정한 결과 발효액의 생균수는 6.15~8.68 log CFU/mL 사이의 범위를 나타내었다. 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 LP 발효군이 208.14±0.95 mg GAE/g으로 발효군 중 가장 높은 총 폴리페놀 함량을 나타내었으나 LC 발효군(205.94±2.86 mg GAE/g)과 유의적인 차이는 나타나지 않았고(P>0.05), 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과 LP 발효군이 109.66±1.73 mg CE/g으로 발효군 중 가장 높은 총 플라보노이드 함량을 나타내었다(P<0.05). DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 발효군 중 LP 발효군의 IC50값이 0.054±0.005 mg/mL로 가장 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었으나 ascorbic acid(0.054±0.005 mg/mL)와 유의적인 차이는 나타나지 않았고(P>0.05), ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 LP 발효군의 IC50값이 0.403±0.011 mg/mL로 발효군 중 가장 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타내었다(P<0.05). FRAP 활성을 측정한 결과 LP 발효군이 2.25±0.04 M/g으로 발효군 중 가장 높은 FRAP 활성을 나타내었고, 환원력을 측정한 결과 LP 발효군의 EC50값이 0.332±0.001 mg/mL로 발효군 중 가장 높은 환원력을 나타내었다(P<0.05). 아질산염 소거 활성을 측정한 결과 LP 발효군의 IC50값은 1.695±0.043 mg/mL로 발효군 중 가장 높은 소거 활성을 나타내었으나 LC 발효군(1.823±0.048 mg/mL)과 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 항균 활성을 측정한 결과 페퍼민트 무발효 대조군에서 항균 활성이 나타나지 않았으나 페퍼민트 SC 발효군의 생육 저해환 크기는 10 mg/disc의 농도에서 그람 음성균인 E. cloacae에 대한 활성이 9.95±0.06 mm로 나타났고, LC 발효군은 같은 농도에서 8.94±0.09 mm, LP 발효군은 8.72±0.10 mm로 각각 나타났다. 이상의 연구 결과를 종합했을 때 발효에 사용한 여러 미생물 중 LP 균주를 이용하여 페퍼민트를 발효하였을 때 무발효 대조군보다 높은 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 나타냄과 동시에 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성, FRAP 활성, 환원력, 아질산염 소거 활성을 나타내었으며 그람 음성균에 대한 항균 활성도 나타내어 페퍼민트 LP 발효군 또한 우수한 생리 활성을 나타내는 것으로 생각된다. 따라서 페퍼민트를 물로 추출하여 이용하는 경우 LP 균주를 이용하여 발효하는 것이 도움 될 수 있으며 향후 천연 항산화제 및 건강기능식품 등의 분야에서 가치를 높이는데 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(6): 608-617

Published online June 30, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.6.608

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

페퍼민트 발효 추출물의 이화학적 특성 및 생리 활성

김동현․육홍선

충남대학교 식품영양학과

Received: March 5, 2024; Revised: May 9, 2024; Accepted: May 9, 2024

Physicochemical Properties and Physiological Activities of Fermented Mentha piperita Extracts

Dong-Hyeon Kim and Hong-Sun Yook

Department of Food and Nutrition, Chungnam National University

Correspondence to:Hong-Sun Yook, Department of Food and Nutrition, Chungnam National University, 99, Daehak-ro, Yuseong-gu, Daejeon 34134, Korea, E-mail: yhsuny@cnu.ac.kr

Received: March 5, 2024; Revised: May 9, 2024; Accepted: May 9, 2024

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

This study examined the fermented Mentha piperita extracts obtained using various microorganisms (Bacillus subtilis, BS; Saccharomyces cerevisiae, SC; Levilactobacillus brevis, LB; Lacticaseibacillus casei, LC; Lactiplantibacillus plantarum, LP). The total polyphenol contents of the LP fermented extracts were 208.14±0.95 mg GAE/g, which showed the highest contents among the fermented extracts, but there was no significant difference from the LC fermented extracts. The total flavonoid contents of the LP fermented extracts was 109.66±1.73 mg CE/g, which showed the highest contents among the fermented extracts (P<0.05). The IC50 value of the LP fermented extracts was 0.054±0.005 mg/mL, which showed the highest DPPH radical scavenging activity comparable to ascorbic acid (P>0.05). The IC50 value of the LP fermented extracts was 0.403±0.011 mg/mL, which showed the highest ABTS radical scavenging activity among the fermented extracts (P<0.05). The FRAP value of the LP fermented extracts was 2.25±0.04 M/g, which showed the highest value among the fermented extracts (P<0.05). The EC50 value of the LP fermented extracts was 0.332±0.001 mg/mL, which showed the highest reducing power among the fermented extracts (P<0.05). The IC50 value of the LP fermented extracts was 1.695±0.043 mg/mL, which showed the highest nitrite scavenging activity among the fermented extracts, but there was no significant difference from that of the LC fermented extracts. The SC, LC, and LP fermented extracts were active against Enterobacter cloacae at 10 mg/disc concentrations.

Keywords: Mentha piperita, fermentation, physicochemical properties, physiological activities

서 론

발효(fermentation)는 미생물의 작용에 영향을 받아 유기물이 분해 혹은 변화하는 현상을 이용한 것으로 천연물이 가진 성분의 활용성을 증진하고 유용한 물질을 생산할 수 있어 오래전부터 식품 및 의약품 등 다양한 분야에서 자주 사용되는 방법이다. 발효는 방법과 조작이 간편하고 생산비용이 적으며 체내에서 흡수되지 않는 식물의 배당체 성분이 비배당체로 전환되어 생리 활성 물질의 체내 흡수 속도 및 흡수율이 증가하는 장점이 있다(Bae 등, 2004). 그리고 식품에 좋은 향미와 조직감을 부여하고 식품 소재의 보존성을 증대시키는 이점이 있어 식품 산업에서 식품의 기능성 증진을 위한 방법으로 이용되고 있다(Park 등, 2009a). Bacillus subtilis는 흔히 고초균이라고 불리며 주로 토양 속에서 발견되는 호기성균으로, 일반적으로 인체에 안전하다고 알려진 물질인 GRAS(generally recognized as safety)에 속하여 현재에도 광범위하게 사용되며, Bacillus 속 미생물은 amylase, protease, cellulase, glucosidase 등과 같은 널리 활용되고 있는 유용한 효소들을 생산하여 식품 산업에서 자주 이용되는 미생물이다(Yang 등, 2014). 우리나라에서는 오래전부터 미생물을 활용하여 발효식품을 제조하였으며 특히 B. subtilis를 활용하여 제조한 발효식품인 청국장은 콩에 함유된 항산화 물질 외에도 식이섬유, 인지질, saponin, phenolic acid, phytic acid, genistein, daidzein 등의 성분이 함유되어 동맥경화, 당뇨, 골다공증 및 성인병 예방에 효과가 있다고 보고되었다(Kim 등, 1999). 효모는 진핵세포를 가지고 있는 고등 미생물로서 일부 종을 제외한 대부분이 비병원성으로 알려져 있는데 오래전부터 식품, 주류의 발효와 효소 및 유기산 생성 등에 사용되었고, 생리학적 연구가 다각도로 진행되어 단백질, 지질, 비타민, nucleic acid 등의 대사산물 생성 및 분비 기작이 구명되었으며 다양한 유용 물질을 생산하기 위한 원료로 사용되고 있다(Kim 등, 2004). 유산균은 당류를 분해한 후 주로 젖산을 생산하는 미생물로서 다양한 미생물이 존재하는 사람의 장내에서 우세균으로 분포하며 체내 유익균의 성장은 촉진하고 유해균의 증식은 억제하는 생균 활성제(probiotics)의 역할과 더불어 위장 기능 개선, 체내 콜레스테롤 흡수 저해, 영양소의 흡수 및 이용률 증가 등 다양한 질병 예방의 효과와 생리 조절작용을 하는 것으로 보고되었다(Park 등, 2006). 그리고 유산균이 생산하는 lactic acid, acetic acid, formic acid, phenyllactic acid 등과 같은 다양한 대사산물은 식품에 있어서 부패균의 증식을 억제하고 기호도 및 저장성을 증대시키는 것으로 알려져 있다(Kim과 Lee, 2020). 그 외에도 유산균은 장내 균총 분포의 조절을 통해 면역 체계를 활성화하고 유해 세균, 바이러스, 독성 물질로부터 숙주를 보호하는 효과가 있으며 장관 내의 감염을 억제하여 미생물 균총의 유지와 과민성 대장 증후군, 유당불내증, 항종양 및 항암 등에 효과가 있다고 보고되었다(Bang 등, 2012).

페퍼민트(Mentha piperita)는 수생박하와 녹양박하의 교잡종인 박하속 식물로 원산지는 유럽과 중동으로 알려져 있으나 근래에 들어 수요가 점차 증가하여 오늘날에는 전 세계적으로 재배되고 있으며, 특유의 상쾌한 향과 맛으로 인해 사용되는 용도가 매우 광범위하다(Park과 Lee, 2015). 페퍼민트는 높이가 50~90 cm까지 자라는 다년생 식물로 잎은 타원형에 밝은 녹색을 띠며 가장자리에 미세하게 톱니 모양이 있고 꽃은 자줏빛 또는 연분홍빛을 띤다(Singh 등, 2015). 페퍼민트는 동서양에서 오래전부터 약용 및 향신료의 용도로 사용되었고, 페퍼민트 오일은 진경제, 방부제, 향료 등으로 이용되었으며 소화불량, 인후통, 메스꺼움, 감기 등과 같은 임상적인 치료에도 사용되었다(Sustrikova와 Salamon, 2004). 주요 성분으로는 menthol, menthone, isomenthone, limonene, rutin, ρ-coumaric acid, caffeic acid, chlorogenic acid, ferulic acid, tannin, rosmarinic acid 등이 함유되어 있으며 이러한 성분의 영향을 받아 항산화 활성 및 생리학적인 영역에서 효능을 나타낸다(Augspole 등, 2018; Benabdallah 등, 2016; Skalicka-Woźniak과 Walasek, 2014). 페퍼민트를 이용한 연구로는 페퍼민트 발효물의 기도 점액 유전자 억제 효능(Jee 등, 2021), 페퍼민트 물 추출물의 항궤양 효능(Zangeneh 등, 2019), 페퍼민트 오일의 상처 치유 효능(Modarresi 등, 2019) 등이 보고되었다. 페퍼민트는 항산화, 항궤양 및 여러 생리학적 연구에 대해서는 보고되었으나 페퍼민트를 미생물로 발효하여 특성을 연구한 사례는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 식품 산업에서 페퍼민트의 이용 가치를 증진하고자 생리 활성 물질이 풍부하게 함유된 페퍼민트를 유용한 미생물들을 활용하여 발효한 다음 이화학적 특성 및 생리 활성을 확인하였으며, 향후 페퍼민트 발효 추출물이 천연 항산화제, 건강 기능식품 등과 같은 새로운 산업원료 소재로서의 이용 가능성이 있는지 탐구하고자 하였다.

재료 및 방법

사용 균주

페퍼민트 발효에 사용된 균주는 Bacillus subtilis KACC 14549(BS), Saccharomyces cerevisiae KACC 48234(SC), Levilactobacillus brevis KACC 18270(LB), Lacticaseibacillus casei KACC 12413(LC), Lactiplantibacillus plantarum KACC 18510(LP)으로 농업유전자원센터에서 분양받아 사용하였다. BS는 nutrient broth(Difco Laboratories), SC는 YM broth(Difco Laboratories), LB, LC, LP는 Lactobacilli MRS broth(Difco Laboratories)에서 배양하였다. BS, SC는 30°C, LB, LC, LP는 37°C에서 24시간 주기로 3회 계대 배양하였고, 600 nm에서 측정한 흡광도 값이 0.4~0.6 범위 안에 들게 한 다음 발효 균주로 사용하였다.

페퍼민트 발효 추출물 제조

본 실험에 사용된 페퍼민트(이집트산)는 원물 형태의 건조된 페퍼민트를 2023년 8월에 구입하여 분말화한 다음 실험에 사용하였다. 페퍼민트 발효 추출물의 제조 과정은 증류수 500 mL에 glucose(Sigma-Aldrich Co.) 10 g, peptone(Life Technologies Corporation) 2.5 g을 넣고 121°C에서 15분 동안 가압 고온 멸균하여 실온에서 서서히 식힌 다음 페퍼민트 50 g과 미리 활성화한 5종의 발효 균주 10 mL를 주입하였다. BS, SC는 30°C, LB, LC, LP는 37°C에서 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 121°C에서 15분 동안 가압 고온 멸균하였다. 멸균된 배양액을 원심분리 및 여과(Whatman No. 4, GE Healthcare Life Sciences)한 후 동결 건조(FD8512, ilShinBioBase Co., Ltd.)하여 얻은 페퍼민트 발효 추출물을 실험에 사용하였다. 무발효 대조군은 페퍼민트 50 g을 500 mL의 증류수로 상온에서 24시간 추출한 다음 원심분리, 여과 및 동결 건조하여 얻은 추출물을 실험에 사용하였다.

페퍼민트 발효 추출물의 수율

페퍼민트 발효 추출물의 수율은 페퍼민트 발효 및 무발효 추출물을 동결 건조하여 용매를 모두 휘발시킨 건조 중량을 구한 다음 추출물 제조에 사용한 원료 중량에 대한 백분율로 나타내었다. 모든 실험에서 시료는 추출 용매로 용해하여 원하는 농도로 제조하여 사용하였다.

(%)=AB×100

A: 발효액을 동결 건조한 후 얻은 분말의 무게(g)

B: 추출물 제조에 사용한 원료 무게(g)

사용 균주에 따른 페퍼민트 발효액의 배양 특성

페퍼민트 발효액의 pH는 발효액을 24시간 동안 배양하고 멸균 및 여과한 다음 pH meter(K2000-pH, iSTEK Co.)를 이용하여 측정하였다. 혼탁도는 발효액을 24시간 동안 배양하고 멸균 및 여과한 다음 600 nm에서 흡광도를 측정하여 미생물의 발효 정도를 확인하였다. 생균수는 24시간 동안 배양한 발효액을 멸균한 증류수에 희석하여 BS, LB, LC, LP는 plate count agar(Difco Laboratories), SC는 potato dextrose agar(Difco Laboratories)에 분주한 다음 각각 37°C, 30°C에서 24시간 배양하여 측정하였다.

총 폴리페놀 함량

총 폴리페놀 함량은 Folin과 Denis(1912)의 방법을 참고하여 측정하였다. 시료 50 μL에 Folin-Ciocalteu’s phenol reagent(Sigma-Aldrich Co.)와 증류수를 1:2의 비율로 섞은 혼합액 50 μL를 가하여 3분간 반응시키고 10% Na2CO3(Duksan Pure Chemical Co., Ltd.) 750 μL를 가하여 1시간 동안 암실에서 반응시킨 다음 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 표준물질로 사용하여 검량식을 작성한 다음 시료 1 g에 대한 mg gallic acid equivalents(GAE)로 나타내었다.

총 플라보노이드 함량

총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(1999)의 방법을 참고하여 측정하였다. 시료 125 μL에 증류수 500 μL와 5% NaNO2(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 37.5 μL를 가하여 5분간 반응시켰다. 이후 10% AlCl3・6H2O(Junsei Chemical Co., Ltd.) 75 μL를 가하여 6분간 반응시키고 1 M NaOH(Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd.) 250 μL를 가하여 11분간 반응시킨 다음 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 catechin hydrate(Sigma-Aldrich Co.)를 표준물질로 사용하여 검량식을 작성한 다음 시료 1 g에 대한 mg catechin equivalents(CE)로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거 활성

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활성은 Blois(1958)의 방법을 참고하여 측정하였다. 시료 100 μL에 0.2 mM DPPH(Sigma-Aldrich Co.) solution 100 μL를 가하여 암실에서 30분간 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료의 희석용매를 사용하여 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 비교하였으며, 결괏값은 시료를 첨가하지 않은 대조군에 대한 시료 첨가군의 감소한 흡광도를 백분율로 산출한 다음 50%의 소거 활성을 나타내는 시료 농도인 IC50값으로 나타내었다. 양성대조군으로는 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 사용하여 비교하였다.

ABTS 라디칼 소거 활성

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS) 라디칼 소거 활성은 Fellegrini 등(1999)의 방법을 참고하여 측정하였다. ABTS solution은 140 mM K2S2O8(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 88 μL에 증류수 5 mL를 가하고 ABTS diammonium salt tablet(Sigma-Aldrich Co.) 2알을 넣어 암실에서 12~16시간 반응시킨 다음, 95% 에탄올(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)과 혼합하여 734 nm에서 측정한 흡광도 값이 0.70±0.02가 되도록 조절하여 사용하였다. 시료에 ABTS solution 1 mL를 가하여 2분 30초간 암실에서 반응시킨 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료의 희석 용매를 사용하여 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정하여 비교하였으며, 결괏값은 시료를 첨가하지 않은 대조군에 대한 시료 첨가군의 감소한 흡광도를 백분율로 산출한 다음 50%의 소거 활성을 나타내는 시료 농도인 IC50값으로 나타내었다. 양성대조군으로는 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 사용하여 비교하였다.

Ferric reducing antioxidant power(FRAP) 활성

FRAP 활성은 Benzie와 Strain(1996)의 방법을 참고하여 측정하였다. FRAP reagent는 300 mM acetate buffer (pH 3.6)와 40 mM HCl(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)에 용해한 10 mM TPTZ(Sigma-Aldrich Co.), 20 mM FeCl3・6H2O(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 각각 10:1:1의 비율로 섞고 37°C에서 10분간 반응시켜 제조하였다. 시료 30 μL에 증류수 90 μL와 FRAP reagent 900 μL를 가하여 37°C에서 10분간 반응시킨 다음 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 FeSO4・7H2O(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 표준물질로 사용하여 검량식을 작성한 다음 시료 1 g에 대한 FeSO4・7H2O의 M 함량으로 나타내었다.

환원력

환원력은 Oyaizu(1986)의 방법을 참고하여 측정하였다. 시료 1 mL에 200 mM phosphate buffer(pH 6.6) 1 mL와 1% potassium ferricyanide(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 1 mL를 가하고 50°C에서 20분간 반응시킨 다음 5분간 냉각시켰다. 이 혼합액에 10% trichloroacetic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 1 mL를 가하여 원심분리하고 상등액 0.5 mL, 증류수 0.5 mL, 0.1% ferric chloride(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 0.05 mL를 가하여 10분간 반응시킨 다음 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 시료의 흡광도 값으로 나타내었으며, 흡광도 값을 퍼센트(%)로 환산하여 흡광도 0~1의 범위를 0~100%의 범위로 보아 50%의 환원력을 나타내는 시료 농도인 EC50값으로 나타내었다. 양성대조군으로는 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 사용하여 비교하였다.

아질산염 소거 활성

아질산염 소거 활성은 Gray와 Dugan(1975)의 방법을 참고하여 측정하였다. 시료 100 μL에 1 mM NaNO2(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 100 μL, 0.2 M citrate buffer(pH 3.0) 800 μL를 가하고 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 혼합물 50 μL에 2% acetic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.) 100 μL, griess reagent 20 μL를 가하여 15분간 반응시킨 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결괏값은 아래의 식을 이용하여 백분율로 산출한 다음 50%의 소거 활성을 나타내는 시료 농도인 IC50값으로 나타내었다. 양성대조군으로는 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 사용하여 비교하였다.

Nitrite scavenging activity (%)=1ACB×100

A: absorbance of 520 nm determined with sample

B: absorbance of 520 nm determined with distilled water instead of sample

C: absorbance of 520 nm determined with distilled water instead of griess reagent

항균 활성

항균 활성은 각 유해 균주를 대상으로 disc diffusion assay(Bauer 등, 1966)를 참고하여 측정하였다. 항균 활성 측정에 사용한 균주는 그람 양성균에 속하는 Bacillus cereus KCTC 1012, Bacillus subtilis KACC 14549, Staphylococcus aureus KCTC 3881과 그람 음성균에 속하는 Escherichia coli KCTC 2441, Enterobacter cloacae KCTC 1685, Salmonella enterica Typhimurium KCTC 2515, Pseudomonas aeruginosa KCTC 1636의 총 7종을 생물자원센터와 농업유전자원센터에서 분양받아 사용하였다. 휴면 상태의 균주들을 Table 1의 조건으로 생육 배양하였고, 활성화된 각 균주를 nutrient agar(Difco Laboratories)에 100 μL씩 분주한 다음 멸균된 spreader로 도말하여 항균 실험용 평판배지를 준비하였다. 시료를 paper disc(8 mm)에 흡수시키고 용매를 휘발시킨 다음 평판배지 위에 밀착한 상태로 24시간 동안 30°C, 37°C에서 배양하였다. 이후 disc 주변에 생성된 생육 저해환(clear zone)의 직경(mm)을 측정하여 항균력을 비교하였다.

Table 1 . List of strains used for antibacterial experiments.

StrainsMedia1)Temp. (°C)
Gram positive bacteriaBacillus cereusNA/NB30
Bacillus subtilisNA/NB30
Staphylococcus aureusNA/NB30
Gram negative bacteriaEscherichia coliNA/NB30
Enterobacter cloacaeNA/NB30
Salmonella enterica TyphimuriumNA/NB37
Pseudomonas aeruginosaNA/NB37

1)NA: nutrient agar, NB: nutrient broth..



통계 처리

모든 실험은 3회 이상 반복 측정하였으며 얻어진 결과는 SPSS 26.0(Statistical Package for the Social Science, SPSS Inc.)을 사용하여 평균과 표준편차로 나타내었다. 수율 측정을 제외한 각 측정값 간의 유의성 검증은 95% 유의수준(P<0.05)에서 분산분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test를 통하여 검증하였다.

결과 및 고찰

페퍼민트 발효 추출물의 수율

다양한 미생물을 이용하여 발효한 페퍼민트 발효 추출물의 수율 측정 결과는 Table 2에 나타내었다. 발효 및 무발효군 중 BS 발효군이 35.68%로 가장 높은 수율을 나타내었고 무발효 대조군이 16.55%로 가장 낮은 수율을 나타내었다. 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 높은 수율을 나타내었는데 Ahn 등(2015)의 연구에 따르면 와송을 유산균 스타터로 발효하였을 때 미생물 대사에 영향을 받아 발효군의 수율이 무발효 대조군보다 증가하였다고 보고하였고, Lee와 Yook(2023)의 연구에 따르면 눈개승마를 다양한 미생물로 발효하였을 때 발효군의 수율이 무발효 대조군보다 높았으며 BS 발효군의 수율이 가장 높았다고 보고하여 미생물 발효에 영향을 받아 수율이 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 발효 이후 증가하는 수율은 효소 가수분해에 따른 폴리페놀 화합물, 유리 아미노산, lactic acid 등과 같은 대사산물 생성량 증가 및 에탄올 생성으로 불용성 성분의 추출 효과, 발효에 의한 세포 분해 효과 등에 의해 증가한다고 보고되었는데(Hwang 등, 2007; Park 등, 2012), 이에 영향을 받아 페퍼민트 발효군의 수율이 무발효 대조군보다 높은 것으로 사료된다.

Table 2 . The yield, pH value, turbidity, and viable cell count in the broth of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism.

Microorganism1)Yield (%)pHTurbidity2)Viable cell count (log CFU/mL)
Control16.555.91±0.00a3)4)0.701±0.004e
BS35.685.56±0.01b0.954±0.003a6.15±0.04d
SC31.605.51±0.01c0.882±0.005b7.90±0.05b
LB29.085.13±0.01e0.871±0.002c7.63±0.07c
LC27.405.01±0.01f0.783±0.001d7.98±0.01b
LP26.585.18±0.01d0.874±0.005c8.68±0.11a

1)Control: non-fermented M. piperita, BS: Bacillus subtilis, SC: Saccharomyces cerevisiae, LB: Levilactobacillus brevis, LC: Lacticaseibacillus casei, LP: Lactiplantibacillus plantarum..

2)Turbidity measurement based on OD600 in the broth of M. piperita fermented by various microorganism..

3)Mean±SD (n=3)..

4)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..



페퍼민트 발효액의 배양 특성

유용한 미생물들을 이용하여 발효한 페퍼민트 발효액의 배양 특성 결과는 Table 2에 나타내었다. 일반적으로 미생물을 이용하여 발효 과정을 거치게 되면 효소 가수분해에 따른 다양한 대사산물이 생성되어 발효액의 pH에 영향을 미칠 수 있다고 알려져 있다(Park 등, 2023). pH 측정 결과, 발효군 중 LC 발효군이 5.01±0.01로 가장 낮고 BS 발효군이 5.56±0.01로 가장 높은 pH를 나타내었다(P<0.05). 모든 발효군의 pH는 5.01~5.56 사이의 범위를 나타내었고 무발효 대조군의 pH는 5.91±0.00으로 나타나 페퍼민트 발효 이후 pH는 유의적으로

감소하였다(P<0.05). Kim 등(2012b)의 연구에 따르면 효모로 발효한 막걸리의 경우 발효 기간 중 미생물의 작용으로 lactic acid, citric acid, malic acid, succinic acid 등 유기산 함량이 증가하였다고 보고하였고, Park과 Chang(2003)의 연구에 따르면 복분자 농축액을 유산균으로 발효하였을 때 acetic acid, lactic acid 등과 같은 대사산물이 발효 전보다 증가하여 유기산 함량의 증가 및 pH가 감소하였다고 보고하였다. 그리고 Jung과 Oh(2022)의 연구에 따르면 파인애플 착즙액을 유산균 스타터로 발효하였을 때 유기산 및 젖산 등과 같은 대사산물이 생성되어 pH가 감소하였다고 보고하여 발효 이후 pH가 감소한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 따라서 발효 과정 중 미생물이 생성하는 여러 대사산물에 영향을 받아 페퍼민트 발효액의 pH가 감소한 것으로 사료된다.

발효물 내 발효 균주의 생장이 진행될수록 부유 물질 및 대사산물이 생성되고 미생물 자체의 응집성이나 부유 물질량 정도에 따라 침전물질에 차이가 발생하며 그 생성량이 많을수록 혼탁도가 증가하게 되는데, 이때 발효물의 혼탁도를 OD600에서 측정함으로써 미생물의 생장을 간접적으로 확인할 수 있다(Alpen과 Mandel, 1960). 혼탁도 측정 결과 모든 시료의 혼탁도는 0.701~0.954 사이의 범위를 나타내었으며 무발효 대조군이 0.701±0.004로 가장 낮은 혼탁도를 나타내었고, BS 발효군이 0.954±0.003으로 가장 높은 혼탁도를 나타내어 페퍼민트 발효 이후 혼탁도는 유의적으로 증가하였다(P<0.05). Kang 등(2021)의 연구에 따르면 괴각을 다양한 미생물로 발효하였을 때 발효군의 혼탁도가 무발효 대조군보다 높았으며 미생물 발효에 영향을 받아 혼탁도가 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 따라서 미생물 대사 과정 중 생성되는 대사산물 및 침전물질 등에 영향을 받아 페퍼민트 발효액의 혼탁도가 증가한 것으로 사료된다.

페퍼민트 발효가 미생물의 생장에 미치는 영향을 확인하기 위해 24시간 동안 발효하여 생균수를 측정한 결과 모든 시료의 생균수는 6.15~8.68 log CFU/mL 사이의 범위를 나타내었으며 LP 발효군이 8.68±0.11 log CFU/mL로 가장 높은 생균수를 나타내었고, BS 발효군이 6.15±0.04 log CFU/mL로 가장 낮은 생균수를 나타내었으며 다른 균주들에 비해 유산균으로 발효했을 때 비교적 높은 생균수를 나타내었다(P<0.05). 이상으로 페퍼민트 발효액의 pH, 혼탁도, 생균수를 측정한 결과를 미루어 보아 페퍼민트 발효가 잘 진행되었음을 확인하였고, 이 중 유산균을 사용하여 발효를 진행하였을 때 미생물이 자기 증식에 있어서 페퍼민트를 가장 효과적으로 이용하는 것으로 판단된다.

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

페퍼민트 발효 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정 결과는 Table 3에 나타내었다. 총 폴리페놀 함량 측정 결과 발효군 중에서 LP 발효군이 208.14±0.95 mg GAE/g으로 가장 높은 함량을 나타내었으나 LC(205.94±2.86 mg GAE/g) 발효군과 유의적인 차이는 나타나지 않았고(P>0.05), SC(192.74±0.00 mg GAE/g), LB(191.09±0.00 mg GAE/g), BS(186.14±2.86 mg GAE/g) 발효군 순으로 낮은 함량을 나타내었다. 무발효 대조군의 총 폴리페놀 함량은 186.69±2.52 mg GAE/g으로 BS 발효군과 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). BS 발효군을 제외한 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 총 폴리페놀 함량을 나타내었다(P<0.05). Yang 등(2019)의 연구에 따르면 꽃송이버섯을 유산균으로 발효하였을 때 무발효 대조군보다 총 폴리페놀 함량이 증가하였다고 보고하였다. 그리고 발효물의 HPLC 분석 결과 꽃송이버섯 추출물에 함유된 폴리페놀과 꽃송이버섯 발효물에 함유된 폴리페놀이 서로 다르며 Lactobacillus 균의 작용에 영향을 받아 발효 이후 chlorogenic acid와 ascorbic acid가 생성되었다고 보고하였다. 이를 통해 미생물 발효에 의한 효소 가수분해로 생성되는 폴리페놀 화합물에 영향을 받아 페퍼민트 발효군의 총 폴리페놀 함량이 증가한 것으로 사료된다.

Table 3 . Total polyphenol and flavonoid contents of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism.

Microorganism1)Total polyphenol contents (mg GAE2)/g)Total flavonoid contents (mg CE3)/g)
Control186.69±2.52c4)5)87.07±1.13e
BS186.14±2.86c95.93±0.50c
SC192.74±0.00b97.79±0.43c
LB191.09±0.00b93.50±0.74d
LC205.94±2.86a106.80±1.13b
LP208.14±0.95a109.66±1.73a

1)Abbreviations: See the Table 2..

2)GAE: gallic acid equivalents..

3)CE: catechin equivalents..

4)Mean±SD (n=3)..

5)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..



총 플라보노이드 함량 측정 결과 발효군 중에서 LP 발효군이 109.66±1.73 mg CE/g으로 가장 높은 함량을 나타내었고(P<0.05), LC(106.80±1.13 mg CE/g), SC(97.79±0.43 mg CE/g), BS(95.93±0.50 mg CE/g), LB(93.50±0.74 mg CE/g) 발효군 순으로 낮은 함량을 나타내었으며 BS와 SC 발효군 간 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 무발효 대조군의 총 플라보노이드 함량은 87.07±1.13 mg CE/g으로 모든 시료 중 가장 낮은 함량을 나타내었다(P<0.05). 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 총 플라보노이드 함량을 나타내었다(P<0.05). Park 등(2009b)의 연구에 따르면 발효 더덕의 총 플라보노이드 함량이 무발효 대조군보다 약 5배 정도 높았다고 보고하여 발효 이후 총 플라보노이드 함량이 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 이는 식물 조직의 세포벽 성분과 결합 되어 있던 배당체 형태의 플라보노이드가 가수분해되어 비배당체로 전환된 것에 영향을 받아 페퍼민트 발효군의 총 플라보노이드 함량이 증가한 것으로 사료된다(Park 등, 2010).

DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성

페퍼민트 발효 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성 측정 결과는 50%의 라디칼 소거 활성을 나타내는 시료의 농도인 IC50값으로 나타내었으며 그 결괏값은 Table 4에 나타내었다. DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과 발효군 중에서 LP 발효군의 IC50값이 0.054±0.005 mg/mL로 가장 높은 라디칼 소거 활성을 나타내었고(P<0.05), LC(0.066±0.001 mg/mL), SC(0.068±0.001 mg/mL), LB(0.073±0.000 mg/mL), BS(0.074±0.001 mg/mL) 발효군 순으로 낮은 라디칼 소거 활성을 나타내었으며 BS와 LB, LB와 SC, SC와 LC 발효군 간 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 무발효 대조군의 IC50값은 0.077±0.002 mg/mL로 모든 시료 중 라디칼 소거 활성이 가장 낮았으나 BS, LB 발효군과 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). BS, LB 발효군을 제외한 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 라디칼 소거 활성을 보였다(P<0.05). Hwang 등(2016)의 연구에 따르면 갈색콩 두유를 젖산 발효하였을 때 발효가 진행됨에 따라 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였다고 보고하였고, 효소 활성에 의해 glycosides 및 malonyl glycosides 형태가 감소하면서 aglycone의 함량이 증가하였다고 보고하여 발효 이후 항산화 활성이 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 특히 LP 발효군의 경우 ascorbic acid와 비교하였을 때도 유의적인 차이가 나타나지 않아 비교적 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였는데, Hur 등(2014)의 연구에 따르면 LP 균주의 경우 일부 폴리페놀 화합물 중 tannin을 분해하는 대사 능력이 있고 tannin이 존재하는 환경에서 tannase를 생성한다고 알려져 있으며, 이 tannase는 hydrolysable tannin과 gallic acid ester의 가수분해 반응을 촉매하고 강력한 항산화제 중 하나인 propyl gallate의 합성을 위한 기질로 사용되어 항산화 활성을 증가시킬 수 있다고 보고하였다. 그리고 Rodríguez 등(2009)의 연구에 따르면 tannin이 LP 균주에 의해 분해되어 생성되는 최종 대사산물에는 gallic acid, pyrogallol 등의 항산화 물질이 함유되어 있다고 보고하였다. 페퍼민트에는 여러 폴리페놀 화합물이 존재하고 그중 tannin이 함유되었다고 보고되었는데(Benabdallah 등, 2016), tannin이 LP 균주의 영향을 받아 발효 이후 항산화 활성이 증가한 것으로 추정된다. 따라서 페퍼민트 발효 시 LP 균주를 사용하는 것이 항산화 활성 증대에 도움이 될 것으로 사료된다.

Table 4 . DPPH and ABTS radical scavenging activity of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism.

Microorganism1)DPPH radical scavenging activity IC502) (mg/mL)ABTS radical scavenging activity IC50 (mg/mL)
Control0.077±0.002a3)4)0.449±0.016b
BS0.074±0.001a0.523±0.006a
SC0.068±0.001bc0.464±0.011b
LB0.073±0.000ab0.506±0.016a
LC0.066±0.001c0.430±0.003c
LP0.054±0.005d0.403±0.011d
Ascorbic acid0.054±0.005d0.117±0.002e

1)Abbreviations: See the Table 2..

2)Inhibitory activity was expressed as the mean of 50% inhibitory concentration of triplicate determines, obtained by interpolation of concentration inhibition curve..

3)Mean±SD (n=3)..

4)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..



ABTS 라디칼 소거 활성 측정 결과 발효군 중에서 LP 발효군의 IC50값이 0.403±0.011 mg/mL로 가장 높은 라디칼 소거 활성을 나타내었고(P<0.05), LC(0.430±0.003 mg/mL), SC(0.464±0.011 mg/mL), LB(0.506±0.016 mg/mL), BS(0.523±0.006 mg/mL) 발효군 순으로 낮은 라디칼 소거 활성을 나타내었으며, BS와 LB 발효군 간 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 무발효 대조군의 IC50값은 0.449±0.016 mg/mL로 SC 발효군과 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 페퍼민트 LP 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 라디칼 소거 활성을 보였는데 Kim 등(2022)의 연구에 따르면 양파 착즙액을 유산균으로 발효하였을 때 ABTS 라디칼 소거 활성이 증가하였다고 보고하여 발효 이후 항산화 활성이 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 이는 DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과와 마찬가지로 균주의 효소 가수분해 작용에 영향을 받아 항산화 활성이 증가한 것으로 추정되고, 유산균을 이용하여 제조한 페퍼민트 발효 추출물은 생리 활성, 기능성 등을 증진시킬 수 있음을 확인하였으며 페퍼민트 발효 시 LP 균주를 이용하는 것이 항산화 활성 증대에 도움이 될 것으로 사료된다.

FRAP 활성 및 환원력

페퍼민트 발효 추출물의 FRAP 활성 및 환원력 측정 결과는 Table 5에 나타내었다. FRAP 활성 측정 결과 발효군 중에서 LP 발효군이 2.25±0.04 M/g으로 가장 높은 활성을 나타내었고(P<0.05), LC(2.19±0.01 M/g), SC(2.01±0.00 M/g), LB(1.98±0.01 M/g), BS(1.85±0.03 M/g) 발효군 순으로 낮은 FRAP 활성을 나타내었으며, SC와 LB 발효군 간 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 무발효 대조군의 FRAP 활성은 1.73±0.04 M/g으로 모든 시료 중 가장 낮은 활성을 나타내었다(P<0.05). 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 FRAP 활성을 나타내었는데(P<0.05), Jang 등(2021)의 연구에 따르면 황백을 유산균으로 발효하였을 때 미생물 대사를 통해 생성된 대사산물에 영향을 받아 시간이 지남에 따라 FRAP 활성이 증가하였다고 보고하여 발효 이후 항산화 활성이 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 일반적으로 폴리페놀 성분의 항산화 능력은 주로 환원력에 기인하며 그 함량이 높을수록 항산화 활성이 증가한다고 보고되었는데(Holasova 등, 2002), 앞서 측정한 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 결과가 FRAP 활성 결과에 영향을 미치는 것으로 사료된다.

Table 5 . Ferric reducing antioxidant power (FRAP), reducing power and nitrite scavenging activity of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism.

Microorganism1)FRAP value (M/g)Reducing power EC502) (mg/mL)Nitrite scavenging activity IC503) (mg/mL)
Control1.73±0.04a4)5)0.453±0.001a2.505±0.095a
BS1.85±0.03d0.432±0.000b2.245±0.145b
SC2.01±0.00c0.370±0.001c2.029±0.080c
LB1.98±0.01c0.374±0.003c1.887±0.084cd
LC2.19±0.01b0.354±0.002d1.823±0.048de
LP2.25±0.04a0.332±0.001e1.695±0.043e

Ascorbic acid0.066±0.000f0.538±0.002f

1)Abbreviations: See the Table 2..

2)Amount required for 50% effective of reducing power..

3)Inhibitory activity was expressed as the mean of 50% inhibitory concentration of triplicate determines, obtained by interpolation of concentration inhibition curve..

4)Mean±SD (n=3)..

5)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..



환원력 측정 결과는 50%의 환원력을 나타내는 시료의 농도인 EC50값으로 나타내었다. 환원력 측정 결과 발효군 중에서 LP 발효군의 EC50값이 0.332±0.001 mg/mL로 가장 높은 환원력을 나타내었고, LC(0.354±0.002 mg/mL), SC(0.370±0.001 mg/mL), LB(0.374±0.003 mg/mL), BS(0.432±0.000 mg/mL) 발효군 순으로 낮은 환원력을 나타내었으며 모두 유의적인 차이를 나타내었다(P<0.05). 무발효 대조군의 EC50값은 0.453±0.001 mg/mL로 모든 시료 중 가장 낮은 환원력을 나타내었다(P<0.05). 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 환원력을 나타내었는데(P<0.05), Lee와 Hong(2016)의 연구에 따르면 오디를 유산균으로 발효하였을 때 미생물 대사에 의한 생리 활성 물질의 생성으로 인해 환원력이 무발효 대조군보다 증가하였다고 보고하여 발효 이후 항산화 활성이 증가한 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 이는 앞서 측정한 FRAP 활성 결과와 유사한 경향을 나타내었으며 페퍼민트 발효군의 환원력이 무발효 대조군보다 높게 나타난 것은 발효 과정 중 미생물에 의해 고분자 화합물이 분해되어 폴리페놀 화합물 혹은 항산화 물질이 새롭게 생성되거나 증가함에 기인한 것으로 사료된다(Kim 등, 2019).

아질산염 소거 활성

페퍼민트 발효 추출물의 아질산염 소거 활성 측정 결과는 50%의 라디칼 소거 활성을 나타내는 시료의 농도인 IC50값으로 나타내었으며 그 결괏값은 Table 5에 나타내었다. 발효군 중에서 LP 발효군이 1.695±0.043 mg/mL로 가장 높은 소거 활성을 나타내었으나 LC(1.823±0.048 mg/mL) 발효군과 유의적인 차이는 나타나지 않았고(P>0.05), LB(1.887±0.084 mg/mL), SC(2.029±0.080 mg/mL), BS(2.245±0.145 mg/mL) 발효군 순으로 낮은 소거 활성을 나타내었으며, SC와 LB, LB와 LC 발효군 간 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 무발효 대조군의 IC50값은 2.505±0.095 mg/mL로 모든 시료 중 가장 낮은 소거 활성을 나타내었다(P<0.05). 페퍼민트 발효군은 무발효 대조군보다 유의적으로 높은 라디칼 소거 활성을 나타내었는데(P<0.05), Choi 등(2009)의 연구에 따르면 양파를 유산균으로 발효하였을 때 무발효 대조군보다 아질산염 소거 활성이 높았다고 보고하여 발효 이후 아질산염 소거 활성이 증가한 본 연구 결과와 비슷한 경향을 나타내었다. Shin 등(2005)의 연구에 따르면 페놀성 화합물의 높은 함량은 아질산염 소거 활성과 관련이 있다고 보고하였으며, 앞서 측정한 페퍼민트 발효군의 높은 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과도 연관이 있는 것으로 사료된다. 니트로사민의 전구물질인 아질산염과 아민은 식품 내에 널리 존재하고 있고, 이를 함유한 음식물을 동시에 섭취하였을 때 체내에서 니트로사민이 생성될 수 있다. 따라서 페퍼민트 발효 시 아질산염 소거 활성을 통한 니트로사민 생성 억제 관여 및 니트로사민에 의해 동반되는 질병 억제에도 도움이 될 것으로 사료된다.

항균 활성

페퍼민트 발효 추출물의 항균 활성 측정 결과는 Table 6에 나타내었다. 무발효 대조군에서는 항균 활성이 나타나지 않았고, 발효군 중에서 SC, LC, LP 발효군에서 E. cloacae에 대한 생육 저해 활성을 나타내었다. Saeed 등(2006)의 연구에 따르면 페퍼민트 물 추출물의 경우 E. coli, S. Typhimurium, P. aeruginosa 균주에 대한 항균 활성이 나타나지 않았다고 보고하여 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 페퍼민트의 성분 중 항균 활성을 가진 성분은 menthol, menthone 및 그 유도체 등이라고 보고되었으며, 이러한 성분들은 유기용매 중 주로 에틸아세테이트층에서 추출된다고 보고되었다(Kaffenberger와 Doyle, 1990). 페퍼민트 무발효 대조군의 경우 추출 용매로 물을 사용하였기 때문에 본 실험에 사용되는 여러 균주에 대한 항균 활성이 나타나지 않은 것으로 사료된다. 페퍼민트 SC 발효군의 생육 저해환 크기는 10 mg/disc의 농도에서 그람 음성균인 E. cloacae에 대한 활성이 9.95±0.06 mm로 나타났고, LC 발효군은 같은 농도에서 8.94±0.09 mm, LP 발효군은 8.72±0.10 mm로 각각 나타났다. Kim 등(2012a)의 연구에 따르면 포도박을 유산균으로 발효하였을 때 그람 음성균인 E. coli, E. cloacae, S. enterica Typhimurium, P. aeruginosa에 대한 항균 활성을 나타내었다고 보고하여 발효 이후 항균 활성을 나타낸 본 연구 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 이는 유산균이 생산하는 천연 항균 물질인 bacteriocin에 영향을 받은 것으로 판단되며, 유산균 발효 시 생성되는 물질인 diacetyl(2,3-butanedione)은 pH와 상호작용하여 병원성균을 포함하는 그람 음성균에 대한 생육 저해를 나타낸다고 보고되었는데(Ryu 등, 2011), 본 연구의 LC, LP 균주에서도 그람 음성균인 E. cloacae에 대한 생육 저해를 나타내어 유사한 경향을 나타내었다. Ryu 등(2011)의 연구에 따르면 유산균 발효액의 경우 식품 위해 미생물이 생성하는 물질로부터 보호 효과가 뛰어나 방부제 성분이나 유해 첨가물의 대체제 등으로 사용 가능하며 병원성 미생물의 생육을 저해함과 더불어 인체에 안전한 장점이 있어 식품 제조 과정 혹은 화장품, 생활용품 등 다양한 분야의 천연 항균 소재로서의 적용이 가능하다고 보고하였다.

Table 6 . Antibacterial activity of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism.

MicroorganismSize of clear zone (mm)

Sample1)Fraction conc. (mg/disc)

5.010.0
Bacillus cereusControl2)
BS
SC
LB
LC
LP

Bacillus subtilisControl
BS
SC
LB
LC
LP

Staphylococcus aureusControl
BS
SC
LB
LC
LP

Pseudomonas aeruginosaControl
BS
SC
LB
LC
LP

Escherichia coliControl
BS
SC9.95±0.06a3)4)
LB
LC8.94±0.09b
LP8.72±0.10c

Enterobacter cloacaeControl
BS
SC
LB
LC
LP

Salmonella enterica TyphimuriumControl
BS
SC
LB
LC
LP

1)Abbreviations: See the Table 2..

2)Not detected..

3)Mean±SD (n=4)..

4)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..


요 약

본 연구에서는 유용한 미생물을 활용하여 페퍼민트를 발효한 후 균주별 배양 특성을 조사하고 미생물 간 항산화, 항염 및 항균 활성 등의 생리 활성을 비교하여 식품업계에서 페퍼민트 발효 추출물이 새로운 소재로서의 가능성이 있는지 탐구하고자 연구를 진행하였다. 페퍼민트 발효액의 수율을 측정한 결과 발효군의 수율은 26.58~35.68% 사이의 범위로 무발효 대조군(16.55%)보다 높은 수율을 나타내었고, pH를 측정한 결과 발효액의 pH는 5.01~5.56 사이의 범위로 무발효 대조군(5.91±0.00)보다 낮은 pH를 나타내었다. 혼탁도를 측정한 결과 발효군의 혼탁도는 0.783~0.954의 범위로 무발효 대조군(0.701±0.004)보다 높은 혼탁도를 나타내었고, 생균수를 측정한 결과 발효액의 생균수는 6.15~8.68 log CFU/mL 사이의 범위를 나타내었다. 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과 LP 발효군이 208.14±0.95 mg GAE/g으로 발효군 중 가장 높은 총 폴리페놀 함량을 나타내었으나 LC 발효군(205.94±2.86 mg GAE/g)과 유의적인 차이는 나타나지 않았고(P>0.05), 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과 LP 발효군이 109.66±1.73 mg CE/g으로 발효군 중 가장 높은 총 플라보노이드 함량을 나타내었다(P<0.05). DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 발효군 중 LP 발효군의 IC50값이 0.054±0.005 mg/mL로 가장 높은 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내었으나 ascorbic acid(0.054±0.005 mg/mL)와 유의적인 차이는 나타나지 않았고(P>0.05), ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 LP 발효군의 IC50값이 0.403±0.011 mg/mL로 발효군 중 가장 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타내었다(P<0.05). FRAP 활성을 측정한 결과 LP 발효군이 2.25±0.04 M/g으로 발효군 중 가장 높은 FRAP 활성을 나타내었고, 환원력을 측정한 결과 LP 발효군의 EC50값이 0.332±0.001 mg/mL로 발효군 중 가장 높은 환원력을 나타내었다(P<0.05). 아질산염 소거 활성을 측정한 결과 LP 발효군의 IC50값은 1.695±0.043 mg/mL로 발효군 중 가장 높은 소거 활성을 나타내었으나 LC 발효군(1.823±0.048 mg/mL)과 유의적인 차이는 나타나지 않았다(P>0.05). 항균 활성을 측정한 결과 페퍼민트 무발효 대조군에서 항균 활성이 나타나지 않았으나 페퍼민트 SC 발효군의 생육 저해환 크기는 10 mg/disc의 농도에서 그람 음성균인 E. cloacae에 대한 활성이 9.95±0.06 mm로 나타났고, LC 발효군은 같은 농도에서 8.94±0.09 mm, LP 발효군은 8.72±0.10 mm로 각각 나타났다. 이상의 연구 결과를 종합했을 때 발효에 사용한 여러 미생물 중 LP 균주를 이용하여 페퍼민트를 발효하였을 때 무발효 대조군보다 높은 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 나타냄과 동시에 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성, FRAP 활성, 환원력, 아질산염 소거 활성을 나타내었으며 그람 음성균에 대한 항균 활성도 나타내어 페퍼민트 LP 발효군 또한 우수한 생리 활성을 나타내는 것으로 생각된다. 따라서 페퍼민트를 물로 추출하여 이용하는 경우 LP 균주를 이용하여 발효하는 것이 도움 될 수 있으며 향후 천연 항산화제 및 건강기능식품 등의 분야에서 가치를 높이는데 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

Table 1 . List of strains used for antibacterial experiments.

StrainsMedia1)Temp. (°C)
Gram positive bacteriaBacillus cereusNA/NB30
Bacillus subtilisNA/NB30
Staphylococcus aureusNA/NB30
Gram negative bacteriaEscherichia coliNA/NB30
Enterobacter cloacaeNA/NB30
Salmonella enterica TyphimuriumNA/NB37
Pseudomonas aeruginosaNA/NB37

1)NA: nutrient agar, NB: nutrient broth..


Table 2 . The yield, pH value, turbidity, and viable cell count in the broth of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism.

Microorganism1)Yield (%)pHTurbidity2)Viable cell count (log CFU/mL)
Control16.555.91±0.00a3)4)0.701±0.004e
BS35.685.56±0.01b0.954±0.003a6.15±0.04d
SC31.605.51±0.01c0.882±0.005b7.90±0.05b
LB29.085.13±0.01e0.871±0.002c7.63±0.07c
LC27.405.01±0.01f0.783±0.001d7.98±0.01b
LP26.585.18±0.01d0.874±0.005c8.68±0.11a

1)Control: non-fermented M. piperita, BS: Bacillus subtilis, SC: Saccharomyces cerevisiae, LB: Levilactobacillus brevis, LC: Lacticaseibacillus casei, LP: Lactiplantibacillus plantarum..

2)Turbidity measurement based on OD600 in the broth of M. piperita fermented by various microorganism..

3)Mean±SD (n=3)..

4)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..


Table 3 . Total polyphenol and flavonoid contents of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism.

Microorganism1)Total polyphenol contents (mg GAE2)/g)Total flavonoid contents (mg CE3)/g)
Control186.69±2.52c4)5)87.07±1.13e
BS186.14±2.86c95.93±0.50c
SC192.74±0.00b97.79±0.43c
LB191.09±0.00b93.50±0.74d
LC205.94±2.86a106.80±1.13b
LP208.14±0.95a109.66±1.73a

1)Abbreviations: See the Table 2..

2)GAE: gallic acid equivalents..

3)CE: catechin equivalents..

4)Mean±SD (n=3)..

5)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..


Table 4 . DPPH and ABTS radical scavenging activity of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism.

Microorganism1)DPPH radical scavenging activity IC502) (mg/mL)ABTS radical scavenging activity IC50 (mg/mL)
Control0.077±0.002a3)4)0.449±0.016b
BS0.074±0.001a0.523±0.006a
SC0.068±0.001bc0.464±0.011b
LB0.073±0.000ab0.506±0.016a
LC0.066±0.001c0.430±0.003c
LP0.054±0.005d0.403±0.011d
Ascorbic acid0.054±0.005d0.117±0.002e

1)Abbreviations: See the Table 2..

2)Inhibitory activity was expressed as the mean of 50% inhibitory concentration of triplicate determines, obtained by interpolation of concentration inhibition curve..

3)Mean±SD (n=3)..

4)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..


Table 5 . Ferric reducing antioxidant power (FRAP), reducing power and nitrite scavenging activity of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism.

Microorganism1)FRAP value (M/g)Reducing power EC502) (mg/mL)Nitrite scavenging activity IC503) (mg/mL)
Control1.73±0.04a4)5)0.453±0.001a2.505±0.095a
BS1.85±0.03d0.432±0.000b2.245±0.145b
SC2.01±0.00c0.370±0.001c2.029±0.080c
LB1.98±0.01c0.374±0.003c1.887±0.084cd
LC2.19±0.01b0.354±0.002d1.823±0.048de
LP2.25±0.04a0.332±0.001e1.695±0.043e

Ascorbic acid0.066±0.000f0.538±0.002f

1)Abbreviations: See the Table 2..

2)Amount required for 50% effective of reducing power..

3)Inhibitory activity was expressed as the mean of 50% inhibitory concentration of triplicate determines, obtained by interpolation of concentration inhibition curve..

4)Mean±SD (n=3)..

5)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..


Table 6 . Antibacterial activity of fermented Mentha piperita extracts by various microorganism.

MicroorganismSize of clear zone (mm)

Sample1)Fraction conc. (mg/disc)

5.010.0
Bacillus cereusControl2)
BS
SC
LB
LC
LP

Bacillus subtilisControl
BS
SC
LB
LC
LP

Staphylococcus aureusControl
BS
SC
LB
LC
LP

Pseudomonas aeruginosaControl
BS
SC
LB
LC
LP

Escherichia coliControl
BS
SC9.95±0.06a3)4)
LB
LC8.94±0.09b
LP8.72±0.10c

Enterobacter cloacaeControl
BS
SC
LB
LC
LP

Salmonella enterica TyphimuriumControl
BS
SC
LB
LC
LP

1)Abbreviations: See the Table 2..

2)Not detected..

3)Mean±SD (n=4)..

4)Different letters within a column indicate significant differences (P<0.05)..


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