생체 대사 과정에서 발생하는 활성산소종(reactive oxygen species)은 단백질, DNA, 지방의 과산화 등에 의해 세포의 손상을 유발하며, 과도한 활성산소종의 발생은 산화적 스트레스를 유발하여 노화, 심장질환, 동맥경화, 암 등의 질병을 초래하게 된다(Bae, 2004). 이러한 활성산소종으로는 superoxide radical(･O₂^-), hydrogen peroxide(H₂O₂), singlet oxygen(¹O₂), hydroxyl radical(•OH) 등이 알려져 있으며, 매우 불안정한 분자 구조를 가지고 있어 고분자의 생체 내 세포를 공격하여 산화적 스트레스의 환경을 조성하게 된다(Van den Ende 등, 2011). 따라서 활성산종의 발생을 억제하고 예방하기 위한 항산화제에 관한 관심이 높아지고 있다. 대표적인 항산화제로 사용되는 butylated hydroxyanisole과 butylated hydroxytoluene은 우수한 항산화제로 사용됐지만 안전성의 문제로 인해 사용이 점차 감소하고 있다(Branen, 1975; Ito 등, 1983).

당귀(Angelica gigas)는 미나리과의 다년생 약초로 참당귀(Angelica gigas Nakai)의 뿌리를 건조한 것으로써 예로부터 보혈제의 생약으로 사용하였으며, 고혈압이나 빈혈, 어혈과 진정제 및 진통제로 사용되어 왔다(Jung 등, 1991). 당귀의 주요 성분으로는 coumarin계의 β-sitosterol, decursinol, angelate, decursin 등의 성분이 알려져 있으며, decursin은 신장 독성 경감, 당뇨성 고혈압 치료 등에 효과가 있다고 알려져 있다(Ahn, 1996; Kang 등, 2003). 당귀에 관한 연구로는 decursin 정량 연구(Yook과 Kim, 1990), decursin의 세포독성 연구(Park 등, 2007), coumarin 성분 연구(Ryu 등, 1990), 당귀 추출물의 면역 증가 효과(Rho 등, 2001), 항암 효과(Kim 등, 2020) 등과 함께 당귀 분말을 첨가한 식빵의 특성(Shin과 Kim, 2008), 당귀 추출물을 첨가한 막걸리의 특성(Lee 등, 2013), 고콜레스테롤 혈증을 유발시킨 쥐에 대한 항산화 활성(Won, 2003), 당귀 뿌리 추출물의 초파리에 대한 수명연장 활성(Nguyen 등, 2021) 등 다양하게 이루어져 왔다. 또한, 당귀 ethyl acetate 분획물의 우수한 항산화 활성에 관한 보고도 이루어져 있지만(Moon 등, 2000), 아직 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 모델을 활용한 항산화, 수명연장 활성에 관한 연구는 이루어지지 않았다.

예쁜꼬마선충은 다세포 생물 중 최초로 게놈이 모두 밝혀진 동물로서 생명과학, 공학 분야에서 모델 생물체로 널리 이용되며, 현미경으로 관찰이 가능하고 세대 주기가 짧아 실험 결과를 신속하게 얻을 수 있다는 장점과 인간의 유전자와 약 60% 이상 유사하다는 장점이 있는 동물이다(Brenner, 1974; Kaletta와 Hengartner, 2006). 또한, 동물실험에 대한 윤리적인 문제를 해결할 수 있어 에너지 대사 증후군 및 수명연장 등 다방면에서 모델 생물체로 이용되고 있으며(Kampkötter 등, 2008; Oh 등, 2013), 1 mm의 매우 작은 크기로 실험실에서의 관리가 유용하며, 자웅동체로써 자가수정을 통해 한 마리의 성체가 약 300마리의 알을 낳기 때문에 번식 속도가 빠르다는 장점을 가지고 있다(Kaletta와 Hengartner, 2006; Tissenbaum, 2012). 예쁜꼬마선충은 소화관, 신경계, 생식선, 배설 시스템 등을 갖춤으로써 고도로 조직화 되어있으며(Zhu 등, 2022), 반투명한 몸체를 지니고 있어 체내의 형광단백질의 발현을 쉽게 관찰할 수 있다는 장점이 있고, 선충의 DAF-16 유전자 발현이 항산화 활성, 산화적 스트레스 저항성에 관여하는 것으로 밝혀져 있다(Detienne 등, 2016; Tang 등, 2018). 최근에는 예쁜꼬마선충 모델을 활용한 curcumin의 항산화 및 수명연장 활성(Xu 등, 2023), sesamol의 항산화 활성(Huang 등, 2024), 양파 추출물의 항비만 및 항산화 활성(Moliner 등, 2023) 등 예쁜꼬마선충 모델을 활용한 기능성 규명에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

본 연구에서는 당귀 에탄올 추출물과 분획물의 폴리페놀, 플라보노이드 함량을 분석하고 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS), xanthine 유래 superoxide 라디칼 소거 활성을 측정하여 가장 강력한 소거 활성을 나타낸 ethyl acetate 분획물의 항산화 활성 및 수명연장 효능을 예쁜꼬마선충 대상으로 규명하였다. 즉, 예쁜꼬마선충 내 항산화 효소인 superoxide dismutase(SOD)와 catalase의 활성 증가 확인, 선충 체내에서 발생하는 활성산소종의 축적 억제 확인, 산화적 스트레스 저항성 확인, 형질전환 선충 CF1553의 SOD-3::green fluorescent protein(GFP) 발현량에 관한 분석을 실시하였으며, 수명연장 활성 및 수명 관련 단백질 발현 여부의 증가를 확인하였다. 이에 본 연구진은 이전에는 이루어지지 않았던 예쁜꼬마선충을 대상으로 당귀의 효능을 보고하여 활용 가능성을 제시하고자 한다.

기기 및 시약

Agar, nitro blue tetrazolium(NBT), sodium dodecyl sulfate(SDS), xanthine, xanthine oxidase, 5-hydroxy-1,4-naphthalenedione(juglone) 등의 시약은 Sigma에서 구입하여 사용하였으며, 모든 시약은 특급 시약을 사용하였다. 흡광도 측정은 microplate reader(MMR SPARK Cyto, Tecan)를 사용하였으며, GFP의 발현량 측정은 형광 실체현미경(Olympus)을 사용하였다.

추출 및 분획

본 연구에 사용된 당귀는 두손애약초에서 구입하여 세척 및 건조하여 사용하였다. 당귀 600 g을 분쇄하여 2 L의 에탄올을 용매로 50°C 수욕 상에서 6시간씩 3회 반복하여 열수 추출하였으며, 추출액은 여과 후 감압 농축하여 에탄올 추출물 118.6 g을 확보하였다. 에탄올 추출물 118.6 g에 증류수 1 L를 가하여 현탁한 후 동량의 n-hexane(1.1 g), methylene chloride(17.9 g), ethyl acetate(1.2 g), n-butanol(3.5 g) 순서대로 분획하여 각각의 분획물을 확보하였으며, 항산화 및 수명연장 활성 규명에 사용된 시료는 밀봉 및 차광하여 실험에 필요한 시료로 사용하였다.

폴리페놀, 플라보노이드 함량 측정

당귀 추출물과 분획물의 폴리페놀 함량을 측정하기 위해 추출물 및 분획물 0.5 mg을 에탄올에 용해하여 시료로 사용하였다. 당귀 추출물 및 분획물 시료와 Folin & Ciocalteu’s phenol reagent 용액을 동량 혼합한 뒤 0.1 M의 Na₂CO₃ 용액 800 μL를 가하여 40°C 수욕 상에서 20분 동안 반응시켰다. 이후 10분 동안 냉각한 뒤 700 nm에서 흡광도를 측정하였다(Cicco 등, 2009). 폴리페놀 함량은 tannic acid를 표준물질로 농도에 따른 일차방정식(y=0.0009x+0.0382, R²=0.9997)을 이용하여 총 페놀 함량[mg tannic acid equivalent(TAE)/g]으로 계산하여 나타내었다. 플라보노이드 함량 측정은 추출물 및 분획물 시료 1 mL와 5% NaNO₂ 용액 30 μL를 혼합하여 5분간 반응시킨 후 10% AlCl₃ 30 μL와 1 M의 NaOH 200 μL를 가하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다(Lee 등, 2012). 플라보노이드 함량은 quercetin을 표준물질로 농도에 따른 일차방정식(y=0.0011x+0.0836, R²=0.9951)을 이용하여 총 플라보노이드 함량[mg quercetin equivalent(QE)/g]으로 계산하여 나타내었다.

DPPH 라디칼 및 ABTS 라디칼 소거 활성 측정

당귀 에탄올 추출물 및 분획물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하기 위해 에탄올을 용매로 하여 농도별로 제조한 당귀 시료 50 µL와 0.2 mM의 DPPH 용액 200 µL를 96-well plate에 넣고 실온의 암소에서 30분 동안 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(Yoshida 등, 1989). ABTS 라디칼 소거 활성을 측정하기 위해 7.4 mM의 ABTS 용액과 2.6 mM의 potassium persulfate 용액을 동량 혼합하여 실온의 암소에서 24시간 반응시켜 라디칼의 형성을 유도한 후 혼합 용액의 흡광도 값이 0.7±0.03이 되도록 phosphate buffer saline(pH 7.4)을 이용하여 희석하였다. 이후 희석된 ABTS 용액 190 µL와 당귀 추출물 및 분획물 시료 10 µL를 96-well plate에 넣고 실온의 암소에서 10분 동안 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정하였다(Re 등, 1999). 대조약물로 L-ascorbic acid를 사용하였다.

Xanthine 유래 superoxide 소거 활성 측정

Xanthine/xanthine oxidase에 의해 생성되는 superoxide 라디칼의 소거 활성을 측정하기 위해 농도별로 제조한 당귀 추출물 및 분획물 시료 10 µL, NBT(100 µM)와 xanthine(250 µM)을 포함한 phosphate buffer(pH 7.8, 20 mM)를 혼합하여 5분 동안 반응시켰다. 5분 후 xanthine oxidase(0.05 U/mL) 100 µL를 가하고 37°C에서 20분 동안 반응시킨 후 69 mM의 SDS를 가하여 반응을 멈춘 뒤 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. Superoxide 라디칼 소거 활성에 대한 측정은 시료와 대조군이 NBT를 환원시키는 정도로 비교하였다(Thuong 등, 2007).

예쁜꼬마선충의 배양

예쁜꼬마선충(C. elegans)은 Escherichia coli(OP50)가 도말된 nematode growth medium(NGM) agar plate에서 배양하였다(20°C). 성장단계를 일치시키기 위해 선충의 알은 bleaching solution(NaClO, 5 M KOH) 용액을 가하여 회수하였으며, 당귀 추출물 및 분획물 시료는 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 용매로 하여 멸균된 NGM plate에 stock solution 상태로 첨가되어 최종 DMSO의 농도는 0.1%(v/v)를 유지하였다(Brenner, 1974).

선충 체내 항산화 효소 활성 측정 및 활성산소종 분석

당귀 ethyl acetate 분획을 농도(250, 500 μg/mL)별로 제조하여 NGM agar plate에 넣고 성장단계를 동일시한 선충을 배양하여 성체가 된 지 2일 차의 선충을 분쇄하여 항산화 효소(SOD, catalase) 활성 측정에 사용하였다(homogenization buffer: 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5). SOD의 활성은 10 mM의 phosphate buffer(pH 8.0)를 용매로 반응혼합물(1.6 mM xanthine, 0.48 mM NBT)을 제조하고 농도별 시료 10 μL와 혼합하여 5분 동안 pre-incubation 하였다. 5분 후 0.05 U/mL xanthine oxidase 용액 100 μL를 가하고 37°C에서 20분 동안 incubation 한 후 270 μL의 SDS를 가하여 반응을 멈춘 뒤 570 nm에서 흡광도를 측정하였다(Thuong 등, 2007). Catalase 활성 측정은 hydrogen peroxide의 분해에 따라 감소하는 흡광도 값을 측정하였다. 즉, 농도별 시료 50 μL와 25 mM의 H₂O₂를 혼합하여 3분 동안 반응시키면서 20초 간격으로 240 nm에서 흡광도를 측정하였다(Aebi, 1984). 선충 체내에서 발생되는 활성산소종의 분석은 2′,7′-dichlorodihydro-fluorescein-diacetate(H₂DCF-DA)를 이용하여 분석하였다. 당귀 ethyl acetate 분획이 첨가된 NGM agar plate에서 배양된 4일 차의 선충을 100 μM의 juglone를 포함한 M9 buffer에 넣어 20°C에서 2시간 반응시킨 뒤 50 μL의 M9 buffer가 담긴 96-well plate로 옮겨주었다. 이후 동량의 H₂DCF-DA를 가한 뒤 excitation 485 nm, emission 535 nm에서 형광강도를 측정하였다(Kim 등, 2015).

산화적 스트레스 저항성 평가

산화적 스트레스 조건에서 당귀 ethyl acetate 분획이 선충의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 농도별(250, 500 μg/mL) plate에 성장 단계를 동일시 한 선충을 배양하여 성체가 된 지 7일 차의 선충을 사용하였다. 농도별 plate에서 배양된 선충을 1 mM의 juglone을 포함한 M9 buffer에 넣어 20°C에서 배양하면서 모든 선충이 사망할 때까지 매시간 생존율을 관찰하였다. 선충의 사망 여부는 platinum wire의 끝으로 조심스럽게 자극하였을 때 움직임이 없는 경우를 사망상태로 간주하였다(Mekheimer 등, 2012).

형질전환 선충 내 SOD-3::GFP 형광 측정

SOD-3::GFP를 포함하는 transgenic strain CF1553 선충의 GFP 발현율을 측정하기 위해 당귀 ethyl acetate 분획이 농도별(250, 500 μg/mL)로 첨가된 NGM agar plate에서 배양된 성체가 된 지 3일 차의 선충을 사용하였다. 선충의 표피를 M9 buffer로 세척한 뒤 4% sodium azide로 30분 동안 마취시킨 뒤 형광실체 현미경을 이용하여 GFP의 발현을 관찰하였다. 발현 강도의 정량 및 분석을 위해 현미경을 이용하여 사진을 촬영하였으며, Image J software를 이용하여 GFP의 발현량을 분석하였다(Qi 등, 2021).

수명연장 효능평가 및 단백질 발현 분석

당귀 추출물 및 분획물의 선충에 대한 수명연장 활성을 평가하기 위해 NGM plate로부터 알을 분리하여 당귀 추출물 및 분획물을 첨가(500 μg/mL)한 plate에 성장 단계를 일치시켜 배양하였다. 선충의 수명연장 평가를 위한 생존 여부의 확인은 platinum wire의 끝으로 조심스럽게 자극하였을 때 반응이 없는 경우를 사망상태로 간주하였으며, 정확한 측정과 NGM plate의 오염을 방지하기 위해 1일 간격으로 선충을 옮겨주었으며 7일 차 이후에는 2일 간격으로 옮겨주었다(Lithgow 등, 1995). 당귀 ethyl acetate 분획이 선충의 노화 억제 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 성장 단계를 일치시킨 선충을 배양하였다. 성체가 된 지 48시간이 지난 선충을 M9 buffer로 모아 세척 후 homogenization buffer를 첨가하여 분쇄 후 원심분리 하여 BCA assay를 진행하였다. 단백질은 sample loading buffer와 동량 혼합하여 95°C에서 5분 동안 끓이고 SDS-PAGE 후 PVDF 0.2 μm membrane으로 transfer 하였다. 이후 5% bovine serum albumin을 membrane이 적셔질 만큼 부어 3시간 동안 shaking 하며 blocking 한 후 SIR-2.1(PA1-16933)과 2차 항체(Goat Anti-Rabbit IgG H&L, ab205718)를 사용하여 단백질의 발현 여부를 관찰하였다(Lee 등, 2021).

통계분석

통계 자료의 값은 평균값±표준오차(mean±SEM)로 표기하였으며, 그룹 간의 통계적 유의성 검정은 Student’s t-test를 이용하여 분석하였다. 선충의 생존도 분석은 Log-rank test 분석법을 이용하였으며, P값은 P<0.05, P<0.01, P<0.001일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

폴리페놀, 플라보노이드 함량 측정

페놀성 화합물은 phenolic hydroxyl(OH)기와 탈수소 반응을 일으켜 라디칼이 안정한 형태를 형성하도록 하여 항산화 활성을 나타내는 역할을 하며, 플라보노이드, tannic, lignan, catechins 등의 화합물을 뜻한다. 플라보노이드는 폴리페놀에 속하는 성분으로 채소류나 식물의 줄기, 잎, 뿌리 등에 함유되어 있으며, 활성산소종을 제거하는 능력이 뛰어나 항산화 활성이 우수하다고 알려져 있다(Hertog 등, 1993; Shahidi 등, 1992; Tsao, 2010). 당귀 추출물 및 분획물의 폴리페놀 함량을 측정한 결과, 에탄올 추출물 45.16 μg TAE/mL, n-hexane 31.20 μg TAE/mL, methylene chloride 53.57 μg TAE/mL, ethyl acetate 274.17 μg TAE/mL, n-butanol 55.38 μg TAE/mL로 ethyl acetate 분획 내의 폴리페놀 함량이 가장 우수하게 측정되었다. 당귀 추출물 및 분획물의 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 에탄올 추출물 23.57 μg QE/mL, n-hexane 17.88 μg QE/mL, methylene chloride 11.41 μg QE/mL, ethyl acetate 715.16 μg QE/mL, n-butanol 227.68 μg QE/mL로 ethyl acetate 분획 내의 플라보노이드 함량이 가장 우수하게 측정되었다(Table 1).

Table 1 . Total polyphenol and flavonoid content of Angelica gigas extract and fraction.

Extract and fraction	Total polyphenol (μg TAE/mL)1)	Total flavonoids (μg QE/mL)2)
Ethanol extract	45.16±2.35	23.57±15.81
n-Hexane fraction	31.20±2.86	17.88±12.22
Methylene chloride fraction	53.57±1.85	11.41±4.93
Ethyl acetate fraction	274.17±4.27	715.16±21.54
n-Butanol fraction	55.38±2.00	227.68±26.48

¹⁾Total polyphenol content analyzed as tannic acid equivalent (TAE) μg/mL of extract and fraction..

²⁾Total flavonoid content analyzed as quercetin equivalent (QE) μg/mL of extract and fraction..

Park 등(2011)은 참당귀꽃 에탄올 추출물의 폴리페놀 함량이 48.4 mg/g, 열수 추출물이 39.0 mg/g으로 보고한 바 있으며, 플라보노이드 함량은 에탄올 추출물 67.0 mg/g, 열수 추출물 50.3 mg/g으로 보고하였다. 항산화 활성을 나타내는 페놀성 화합물은 ethyl acetate 등의 유기 용매 또는 수용성 에탄올 등에 쉽게 용출된다고 알려져 있다(Jang과 Park, 2017). 이상의 결과를 토대로 당귀에는 풍부한 폴리페놀과 플라보노이드가 함유되어 있어 매우 우수한 항산화 활성을 나타낼 것으로 판단된다.

DPPH 라디칼 및 ABTS 라디칼 소거 활성 측정

DPPH 라디칼은 안정화된 라디칼로써 517 nm에서 최대 흡광도를 가지며 천연물의 항산화 활성을 평가하는 데 널리 사용된다(Moreno 등, 2000). 당귀 추출물 및 분획물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 Fig. 1A로부터 산출되었으며, 에탄올 추출물 IC₅₀ 1,670 μg/mL, n-hexane IC₅₀ 114,653 μg/mL, methylene chloride IC₅₀ 7,662 μg/mL, ethyl acetate IC₅₀ 42.9 μg/mL, n-butanol IC₅₀ 138.6 μg/mL로 ethyl acetate 분획의 라디칼 소거 활성이 가장 우수하게 측정되었다. ABTS 라디칼은 potassium persulfate로 인해 생성된 라디칼이 시료의 항산화능에 의해 제거 및 탈색되는 원리를 이용한 방법으로써 DPPH 라디칼 소거 활성과 더불어 널리 이용된다(Re 등, 1999). ABTS 라디칼 소거 활성 측정 결과는 Fig. 1B로부터 산출되었으며, 에탄올 추출물 IC₅₀ 87.0 μg/mL, n-hexane IC₅₀ 415.2 μg/mL, methylene chloride IC₅₀ 143.3 μg/mL, ethyl acetate IC₅₀ 11.8 μg/mL, n-butanol IC₅₀ 23.5 μg/mL로 ethyl acetate 분획의 라디칼 소거 활성이 가장 우수하게 측정되었다. 이전에 보고된 연구를 살펴보면 당귀 잎의 DPPH 라디칼 소거 활성이 water 추출물 IC₅₀ 19.1 mg/mL, 50% 에탄올 추출물 IC₅₀ 36.4 mg/mL, 70% 에탄올 추출물 IC₅₀ 45.8 mg/mL의 활성을 나타내었다고 보고하였으며, ABTS 라디칼 소거 활성은 water 추출물 12.7%, 50% 에탄올 추출물 22.8%, 70% 에탄올 추출물 28.7%의 활성을 나타내었다고 보고한 바 있다(Lee, 2021). 당귀의 DPPH, ABTS 라디칼 소거 활성은 폴리페놀과 플라보노이드 화합물이 항산화 활성에 일부 기인한 것으로 추측할 수 있으며 각 분획물 내 특정 성분과 항산화 활성의 상관관계에 관한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.

Fig 1. Radical scavenging effects of the ethanol extract, and its fractions from the Angelica gigas. (A) DPPH free radical scavenging effects. (B) ABTS radical scavenging effects. (C) Superoxide radical scavenging effects. Vit.C, vitamin C; EtOH, ethyl alcohol; n-Hex, n-hexane; MC, methylene chloride; EA, ethyl acetate; n-BuOH, n-butanol.

Xanthine 유래 superoxide 라디칼 소거 활성 측정

Xanthine oxidase는 xanthine을 기질로 uric acid를 생성하는 과정에서 superoxide 라디칼을 생성하거나 hydrogen peroxide와 같은 산화제로 작용하여 통풍을 유발하는 것으로 알려져 있다(Hatano 등, 1989; Ziegler 등, 1971). 당귀 추출물과 분획물의 superoxide 라디칼 소거 활성 측정 결과는 Fig. 1C로부터 산출되었으며, 에탄올 추출물 IC₅₀ 833.9 μg/mL, n-hexane IC₅₀ 1,092 μg/mL, methylene chloride IC₅₀ 1,168 μg/mL, ethyl acetate IC₅₀ 104.1 μg/mL, n-butanol IC₅₀ 356.1 μg/mL로 ethyl acetate 분획의 소거 활성이 가장 우수하게 측정되었다. 이러한 결과는 당귀 열수 추출물의 xanthine oxidase 저해 활성(21.2%)과 70% 에탄올 추출물로 분획한 ethyl acetate 분획물의 superoxide 라디칼 소거 활성(IC₅₀ 68.6 μg/mL)과 더불어 매우 우수한 활성을 나타내었음을 확인할 수 있었다(Do 등, 2019; Lee 등, 2011). Moon 등(2000)에 따르면 당귀 지상부 ethyl acetate 분획의 항산화 활성이 타 분획에 비해 우수하였음을 보고하였으며, ethyl acetate 분획에서 quercetin, kaempferol, luteolin, isoquercetin, avicularin, luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside를 분리하였다고 보고하였다. 본 연구에서는 당귀 추출물과 분획물의 항산화 활성을 평가하였으며, 당귀 ethyl acetate 분획은 가장 우수한 항산화 활성을 나타내었다. 이와 같은 결과는 이전에 보고된 당귀 ethyl acetate 분획의 우수한 항산화 활성에 대한 보고와 매우 유사하며, 폴리페놀, 플라보노이드 화합물에 기인한 결과임을 추측할 수 있다. 따라서 이러한 결과를 토대로 당귀 ethyl acetate 분획을 예쁜꼬마선충에게 처리하였을 때의 항산화 기전에 관한 연구를 진행하였다.

선충 체내 항산화 효소 활성 측정 및 활성산소종 분석

당귀 ethyl acetate 분획을 농도별(250, 500 μg/mL)로 처리하였을 때 SOD의 활성을 250 μg/mL 처리군에서 27.9%, 500 μg/mL 처리군에서 39.9% 증가시켰으며, catalase의 활성을 250 μg/mL 처리군에서 12.6%, 500 μg/mL 처리군에서 22.2% 증가시켜 유의성 있는 항산화 효소 활성 증가 효과를 나타내었다(Fig. 2A, 2B). Lee 등(2003a)에 따르면 당귀에서 분리된 decursinol angelate와 decursin의 처리가 CCl₄(carbon tetrachloride)로 간 손상을 유발한 쥐의 SOD와 catalase의 활성이 증가하였음을 보고한 바 있으며, Kwon 등(2021)에 따르면 시트리닌을 처리한 institute of cancer research(ICR) 쥐에게 당귀에 포함된 HemoHIM을 농도별(125, 250, 500 μg/mL) 투여하였을 때 SOD와 catalase의 활성이 유의하게 증가하였다고 보고한 바 있다. SOD는 superoxide anion radical과 반응하여 H₂O₂를 생성하고, catalase는 H₂O₂를 산소와 물로 변환시켜 세포 내의 라디칼을 소거하는 항산화 효소이다. 당귀 ethyl acetate 분획은 선충 체내의 SOD와 catalase의 활성을 증가시켜 활성산소종의 공격으로부터 방어에 어느 정도 도움을 줄 것으로 판단된다. 당귀 ethyl acetate 분획을 처리한 선충 세포 내 활성산소종의 감소 효능을 확인하기 위해 juglone으로 산화적 스트레스를 유발한 선충 체내의 활성산소종과 H₂DCF-DA를 반응시켜 형광의 강도를 분석하였다. H₂DCF-DA는 세포 내로 이동하여 가수분해되어 H₂DCF로 변형되며, 이 H₂DCF는 활성산소종의 일종인 H₂O₂와 반응하여 형광을 띠는 2′,7′-dichlorofluorescein을 형성하게 되어 활성산소종 생성에 관한 연구에 널리 이용된다(Afri 등, 2004). 당귀 ethyl acetate 분획이 활성산소종의 발생에 미치는 영향을 확인한 결과 당귀 ethyl acetate 분획 처리군의 형광 감소 폭은 대조군과 비교하였을 때 250 μg/mL 처리군에서 4.7%, 500 μg/mL 처리군에서 7.6% 형광의 감소 폭을 나타내었다(Fig. 2C, 2D). 활성산소종은 산화적 스트레스를 유발하여 세포의 구성 성분을 파괴하며 암, 심혈관계 질환, 노화 등 각종 질병의 원인이 된다. 당귀 ethyl acetate 분획은 예쁜꼬마선충 활성산소종의 생성 억제능을 나타내어 활성산소종으로 인한 세포의 손상으로부터 방어에 도움을 줄 것으로 판단된다.

Fig 2. Effects of ethyl acetate fraction from Angelica gigas on the antioxidant enzyme activity and intracellular ROS accumulation of wild-type N2 nematode. (A) SOD activity as a percentage of superoxide scavenged per control. (B) Average catalase activity of each group, calculated from the concentration of residula H₂O₂ (determined spectrophotometrically). (C) Intracellular ROS accumulation spectrometrically quantified at an excitation wavelength of 485 nm and emission wavelength of 535 nm, recorded every 30 min for 120 min. (D) Average percentages of intracellular ROS levels. Differences compared with the control group were considered significant at ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001 by one-way ANOVA.

산화적 스트레스 저항성 평가

Juglone은 호두나무에 의해 생성되는 천연 독소로 주위의 다른 식물에 타감작용을 하여 발육을 억제 시키며(Lindroth 등, 1990), 산화적 스트레스 유도, 세포막 손상, 세포의 사멸 등을 일으킨다고 밝혀져 있다(Aitha 등, 2009). Juglone에 의해 유도된 산화적 스트레스 조건에서 선충의 생존율을 확인하기 위해 1 mM의 juglone을 포함한 M9 buffer에 선충을 배양하면서 사망률을 확인하였다. 산화적 스트레스에 대한 저항성 측정 결과 당귀 ethyl acetate를 처리하지 않은 선충의 평균 생존시간은 14.3±0.7시간, 최대 생존시간은 24시간이었으며, 당귀 ethyl acetate 분획 250 μg/mL 처리군의 평균 생존시간은 17.9±0.8시간, 최대 생존시간은 26시간으로 24.7% 증가한 생존율을 나타내었다. 당귀 ethyl acetate 분획 500 μg/mL 처리군의 평균 생존시간은 20.4±0.8시간, 최대 생존시간은 30시간으로 42.3% 증가한 생존율을 나타내었다(Fig. 3, Table 2).

Table 2 . Effects of ethyl acetate fraction from Angelica gigas on the oxidative stress tolerance of Caenorhabditis elegans.

Stress condition	Treatment	Mean lifespan (h)	Maximum lifespan (h)	Change in mean lifespan (%)	Log-rank test
1 mM juglone	Control	14.3±0.7	24	－
	250 µg/mL	17.9±0.8	26	24.7	**P<0.01
	500 µg/mL	20.4±0.8	30	42.3	***P<0.001

^**P<0.01.

^***P<0.001.

Fig 3. Effects of ethyl acetate fractions from Angelica gigas. on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test. All experiments were done in triplicates. Differences compared to the control were considered significant at ^**P<0.01 and ^***P<0.001 by the one-way ANOVA.

본 결과에서는 당귀 ethyl acetate 분획을 처리한 선충의 생존율이 유의성 있게 증가하였음을 확인하였으며, 이는 당귀의 주성분인 decursin이 선충의 생존율에 어느 정도 영향을 주었음을 시사할 수 있다(Lee 등, 2003b). 따라서 당귀 ethyl acetate 분획은 선충에게 산화적 스트레스에 대한 저항성을 높여 주어 생존율을 증가시키는 것으로 확인되었다.

형질전환 선충 내 SOD-3::GFP 형광 측정

당귀 ethyl acetate 분획이 형질전환 선충 CF1553의 SOD-3::GFP 발현율에 미치는 영향을 확인해 본 결과, 250 μg/mL 처리군은 대조군 선충에 비해 11.6% 증가한 발현율을 나타내었으며, 500 μg/mL 처리군은 대조군 선충에 비해 15.3% 증가한 발현율을 나타내었다(Fig. 4). SOD-3::GFP는 DAF-16의 downstream effectors이며, 선충의 수명과 산화적 스트레스 저항성에 영향을 미치는 중요한 조절인자로써(Braeckman과 Vanfleteren, 2007) 산화적 스트레스에 유도되어 반응하는 SOD-3::GFP를 포함한 형질전환 선충 CF1553은 GFP의 발현율에 따라 분석하고자 하는 시료 중에 산화적 스트레스를 완화하는 물질이 함유되어 있음을 확인할 수 있는 모델로 이용되고 있다(Darr와 Fridovich, 1995; Seo 등, 2015). 당귀 ethyl acetate 분획을 농도별(250, 500 μg/mL)로 처리하였을 때 대조군 선충에 비해 머리와 꼬리, 특히 배 부분에서 강하게 발현됨을 확인할 수 있다. 따라서 당귀 ethyl acetate 분획은 형질전환 선충 CF1553의 SOD-3::GFP 발현율을 증가시켜 산화적 스트레스에 대한 저항성을 높여주는 것으로 확인되었다.

Fig 4. Effects of ethyl acetate fraction of the Angelica gigas on the expression of SOD-3 (CF1553) was determined using transgenic nematodes. (A) Images of SOD-3::GFP expressions of CF1553 nematodes in presence or absence of the ethyl acetate fraction of Angelica gigas. The mean GFP-expressing intensity of CF1553 mutants was expressed as mean SEM of values from 120 worms experiment (B). Data are expressed as the mean±standard deviation of three independent experiments. Differences compared with the control were considered significant at ^**P<0.01 and ^***P<0.001 by one-way ANOVA.

수명연장 효능평가 및 단백질 발현 분석

예쁜꼬마선충의 수명은 약 20%의 유전적 요인과 약 80%의 환경적인 요인으로 결정되며, NGM agar plate의 영양소를 섭취하며 수명을 연장한다(Gill, 2006; Johnson과 Wood, 1982). 당귀 추출물 및 분획물을 농도별(250, 500 μg/mL)로 처리한 plate에서 선충의 수명연장 활성을 확인한 결과, 대조군 선충의 평균 수명일은 11.2±0.2일, 최대 생존일은 17일이었으며, 에탄올 추출물 처리군의 평균 수명일은 12.0 ±0.2일, 최대 생존일은 19일, n-hexane 분획물 처리군의 평균 수명일은 11.8±0.2일, 최대 생존일은 19일, methylene chloride 분획물 처리군의 평균 수명일은 11.7±0.2일, 최대 생존일은 18일, ethyl acetate 분획물 처리군의 평균 생존일은 12.7±0.3일, 최대 생존일은 20일, n-butanol 분획물 처리군의 평균 생존일은 11.4±0.2일, 최대 생존일은 17일로 ethyl acetate 분획물 처리군에서 13.3%(P<0.001) 증가한 수명연장 활성을 나타내었다(Fig. 5A, 5B, Table 3). Lee 등(2003b)의 보고에 따르면 당귀 뿌리에서 분리한 decursinol angelate와 decursin이 ICR 쥐의 수명을 연장함과 동시에 Sarcoma-180 종양의 무게와 부피가 크게 감소하였다고 보고한 바 있다. Wilson 등(2006)에 따르면 블루베리에서 추출된 폴리페놀 화합물이 선충의 수명을 유의성 있게 증가시켰다고 보고한 바 있으며, 이는 블루베리의 폴리페놀 화합물이 calmodulin-dependent protein kinase II(CaMKII)의 신호전달 경로를 통해 선충의 수명을 연장시켰다고 보고하였다. 본 연구에서는 당귀 ethyl acetate 분획을 처리한 선충의 수명이 타분획에 비해 유의성 있게 증가한바, 이는 당귀 ethyl acetate 분획 내 수명연장에 영향을 끼치는 화합물 즉, 폴리페놀 또는 decursin 등이 함유되어 수명연장 활성에 영향을 끼쳤음을 시사할 수 있다. SIR-2.1은 sirtuin의 탈아세틸화 효소로써, SIR-2.1의 발현 증가는 예쁜꼬마선충의 수명을 연장시키는 것으로 알려져 있다(Tissenbaum과 Guarente, 2001; Wang과 Tissenbaum, 2006). 예를 들어 구기자(Lycium barbarum)의 주요 성분인 Lycium barbarum polysaccharide가 SIR-2.1의 발현을 조절하여 수명을 연장시켰다고 보고한 바 있으며(Zhang 등, 2019), 적하수오(Polygonum multiflorum) 추출물이 예쁜꼬마선충의 SIR-2.1을 조절하여 수명을 연장시키고 노화 색소(lipofuscin)와 활성산소종의 축적을 감소시켰다고 보고한 바 있다(Saier 등, 2018). 당귀 ethyl acetate 분획을 농도별로 처리하였을 때 선충 내 SIR-2.1의 발현에 미치는 영향을 확인해 본 결과, 250, 500 μg/mL 처리군에서 SIR-2.1의 발현이 당귀 ethyl acetate 분획을 처리하지 않은 무처리군에 비해 증가하였음을 확인할 수 있었다(Fig. 5C, 5D). 따라서 당귀 ethyl acetate 분획은 SIR-2.1의 발현을 증가시켜 선충의 수명을 유의성 있게 증가시키는 것으로 확인되었다.

Table 3 . Effects of the fractions from the Angelica gigas on the lifespan of wild-type N2.

Fraction	Mean lifespan (day)	Maximum lifespan (day)	Change in mean lifespan	Log-rank test
Control	11.2±0.2	17	－	－
Ethanol	12.0±0.2	19	6.6	**P<0.01
n-Hexane	11.8±0.2	19	5.0	*P<0.5
Methylene chloride	11.7±0.2	18	4.1	*P<0.5
Ethyl acetate	12.7±0.3	20	13.3	***P<0.001
n-Butanol	11.4±0.2	17	1.8	－

Mean lifespan presented as mean±SEM data. Change in mean lifespan compared with control group (%). Statistical significance of the difference between survival curves was determined by log-rank test using the Kaplan-Meier survival analysis. Differences compared to the control were considered significant at ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001..

Fig 5. Effects of the fractions from Angelica gigas on the lifespan of wild-type N2 nematodes. Worms were grown in the NGM agar plate at 20°C in the absence or presence of fractions. The number of worms used per each lifespan assay experiment was 45∼50 and three independent experiments were repeated. Effects of the fractions from Angelica gigas on the immunoblotting of wild-type N2 nematodes. Nematodes were grown under identical conditions in medium supplemented with ethyl acetate fractions at different concentrations, and the grown nematodes were homogenized and used for immunoblotting. (A) The mortality of each group was determined by daily counting of surviving and dead animals. (B) The mean lifespan of the N2 worms was calculated from the survival curves. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test. Error bars represent the standard error of mean. (C) The increase of SIR-2.1 protein expression was confirmed by immunoblotting in the proteins of N2 nematodes grown in medium supplemented with different concentrations of mercuric ethyl acetate fraction. (D) The immunoblotting results of SIR-2.1 protein expression in N2 nematodes were quantified and analyzed by fusion 2.0 and graphed. Differences compared with the control were considered significant at ^*P<0.05, ^**P<0.01, and ^***P<0.001 by one-way ANOVA.

본 연구에서는 예로부터 보혈제의 생약으로 고혈압, 빈혈, 어혈과 진통제로 사용된 당귀의 항산화 활성에 관하여 연구하였다. 당귀 에탄올 추출물을 극성에 따라 n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate, n-butanol 순서로 분획하여 폴리페놀, 플라보노이드의 함량을 측정하고, DPPH, ABTS, superoxide 라디칼 소거 활성을 측정하여 가장 우수한 활성을 나타낸 ethyl acetate 분획을 확보하였다. 생리활성 물질의 함량이 우수하고 라디칼 소거 활성이 뛰어난 ethyl acetate 분획에 대한 항산화 활성을 예쁜꼬마선충 대상으로 규명하였다. 당귀 ethyl acetate 분획을 농도별(250, 500 μg/mL)로 처리하였을 때 선충 체내 SOD의 활성을 최대 39.9% 증가시켰으며, catalase의 활성을 최대 22.2% 증가시켰다. 선충 체내에서 발생하는 활성산소종의 축적은 당귀 ethyl acetate 분획 500 μg/mL 처리군에서 유의성 있게 억제하였으며(7.6%), juglone으로 유도된 산화적 스트레스 저항성 측정 결과 당귀 ethyl acetate 분획 처리군의 생존율이 최대 42.3% 증가하였다. 또한, 형질 전환된 CF1553 선충의 SOD-3::GFP의 발현율을 농도 의존적으로 증가시켰으며(500 μg/mL, 15.3%), SIR-2.1의 발현량을 증가시켜 선충의 수명을 유의성 있게 연장시켰다. 이와 같은 결과를 종합하였을 때 당귀 ethyl acetate 분획은 항산화 활성이 매우 우수하여 항산화 및 이와 관련된 질병의 예방 또는 치료에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료되며, 당귀의 활용 가능성을 높일 수 있을 것으로 판단된다.