인류는 평균수명 연장으로 인해 노인층이 증가하면서 골 질환 문제가 심각해졌다. 특히 전 세계 2억 명의 사람들이 앓고 있는 골다공증은 부분적으로 골절 형태가 나타날 때까지 증상이 두드러지지 않는 조용한 질병이다(Lin과 Lane, 2004). 뼈는 조골세포(osteoblast)와 파골세포(osteoclast) 간의 재성형을 통해 새로운 뼈를 만들고 유지하는데, 조골세포는 뼈를 형성하고 파골세포는 노화된 뼈 흡수를 담당한다(Matsuoka 등, 2014). 뼈세포는 서로 항상성을 유지하기 위해 상호작용을 하는데 조골세포와 파골세포 작용 간의 불균형은 뼈 감소(osteoporosis)나 증가(osteosclerosis)로 인한 골격의 이상으로 뼈 질환, 골다공증을 유발한다(Shin 등, 2008). 골다공증은 가장 흔한 대사성 골 질환의 하나로 골 강도의 손상으로 골절의 위험이 증가하는 전신성 골격계 질환으로 정의할 수 있다(Kanis 등, 2013). 특히 폐경 여성에서 폐경 후 급격한 골 소실로 인하여 발생하며, 이러한 골 소실은 피질골이 많은 장골보다는 척추, 골반, 손목 말단 부위 등 해면골이 많은 뼈에서 더욱 심하게 나타난다(Riggs 등, 2002). 골다공증을 앓는 사람은 노인 인구, 특히 에스트로겐 결핍으로 인한 폐경기 여성에서 더 높은 것으로 보고되었다(Seo 등, 2021). 골다공증 치료제로 비스포스포네이트(bisphosphonate)가 쓰이고 있으며 이는 강력한 골 흡수 억제제이다(Chun, 2019). 현재 골다공증 예방 및 치료에 사용되고 있는 약제는 대부분 골 흡수 억제제이며, 이는 이미 진행된 골 소실을 회복시킬 수는 없으므로 골다공증에 대한 예방 및 치료가 어려운 실정이다(Choi와 Koo, 2002). 이에 골 형성 증가를 통한 골다공증 예방과 치료에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다(Shin 등, 2008).

모든 세포, 원핵생물 및 진핵생물은 세포 외 소포를 방출한다. 세포 외 소포 exosome-like nanovesicles(NVs)는 생리 활성을 지닌 구성성분을 포함하며 다른 세포로 이동하여 정보 전달 및 미세 환경에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Peinado 등, 2012). 엑소좀은 세포 대 세포에서 중요한 역할을 하는 자연적인 나노입자로 다양한 종류의 RNA, 단백질, 지질 등을 포함한 화물들을 운반한다(Zempleni 등, 2019).

무봉(Mubong)은 한라봉에 팔삭이 교잡된 품종으로 무봉의 과피, 과육 메탄올 추출물의 플라보노이드 성분을 분석한 결과 나린진(naringin), 네오헤스페리딘(neohesperidin), 헤스페리딘(hesperidin) 등의 함량이 높으며(An 등, 2015), 이들 플라보노이드 성분은 항산화(antioxidant), 항염증(anti-inflammatory), 항암(anticancer) 효과가 있는 것으로 보고되었다(Ullah 등, 2020). 지난 수년 동안 천연물, 특히 식물과 식물의 폴리페놀 화합물이 인체 건강에 유익한 영향을 미친다는 수많은 과학적 증거가 보고되었다. 그중 헤스페리딘은 수많은 in vitro 및 in vivo 연구에서 강력한 항염증제, 항발암제 및 항산화제임이 입증되었으며(Devi 등, 2015) 파골세포 분화를 억제하여 골 흡수를 감소시키며 골다공증 발생 억제에 효과가 있는 것으로 확인되었다(Tan 등, 2017). 또한 나린진은 감귤류 과일에서 흔히 발견되는 폴리메톡실화된 플라보노이드로 시험관 내에서 뼈세포 활동을 유의하게 증가시키며(Wong과 Rabie, 2006), 뼈 재생에 영향을 미치고 잠재적으로 뼈 치유를 촉진하는 것으로 나타났다(Chen 등, 2016). 이에 본 연구에서는 MC3T3-E1 전조골세포를 이용하여 무봉 유래 NVs(Mb NVs)가 조골세포의 분화 및 무기질화에 미치는 영향을 확인하여 골다공증과 같은 골 질환을 예방 및 치료할 수 있는 잠재적 소재임을 확인하였다.

Mb NVs 분리

본 실험에 사용한 Mb NVs는 Fig. 1A 과정을 통해 분리하였다. 농촌진흥청 국립원예특작과학원 감귤연구소에서 무봉을 받아 당일 500×g로 4°C에서 10분간 원심분리 하여 세포와 상층액을 분리한 다음, 2,000×g에서 4°C로 20분 원심분리 하여 세포 파편 등을 제거하였다. 원심분리 한 상등액을 10,000×g로 4°C에서 30분으로 2회 반복하여 원심분리 하였고 마지막으로 100,000×g로 4°C에서 60분 초원심분리 한 후 상등액을 제거하고 남은 pellet을 단백 정량 후 실험 농도에 맞게 희석하여 사용하였다. 분리된 Mb NVs는 bicinchoninic acid(BCA) protein assay(Pierce) 및 나노입자 추적 분석으로 정량화하였다.

Fig 1. Isolation and characterization of Mubong-derived nanovesicles (NVs). (A) Schematic overview of the isolation of Mubong NVs using differentiation centrifugation. (B) Particle size of isolated Mubong-derived NVs.

실험 재료

본 실험에 사용된 모든 시약은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 세포 실험에 사용된 α-MEM, penicillin & streptomycin, fetal bovine serum(FBS)은 Gibco Laboratories에서 구입하여 실험에 사용하였다. 단백질 발현에 대한 1차 항체와 2차 항체인 horseradish peroxidase가 결합된 anti-rabbit IgG, anti-mouse IgG 등은 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하여 사용하였다.

나노입자 추적 분석

Mb NVs의 직경 및 입자농도는 NanoSight NS300(Malvern Instruments Ltd.)을 사용하여 nanoparticle tracking analysis(NTA)로 분석하였다. NTA 소프트웨어는 Nano Sight NTA 3.4 version(Malvern Instruments Ltd.)을 이용하였다.

Western blot

Mb NVs의 단백질 농도는 BCA protein assay(Pierce)를 사용하여 정량하였다. 동량의 단백질을 10% SDS-PAGE에서 분리하고 PVDF membrane(Bio-Rad Laboratories)으로 이동시킨 후 0.05% Tween 20을 함유하는 Tris 완충액(TBS-T)에서 5% bovine serum albumin으로 실온에서 2시간 동안 blocking 후, 1차 항체와 함께 4°C에서 overnight 하였다. Membrane을 TBS-T로 세척하고 2차 항체와 2시간 반응시킨 후 chemiluminescence kit(Amersham Biosciences)을 이용하여 단백질을 확인하였다.

Quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR) 분석

세포분화와 석회화가 유도된 각 실험군의 MC3T3-E1 세포주에서 mRNA 발현을 정량 PCR 분석으로 확인하였다. RNeasy Mini kit(Qiagen)을 이용하여 total RNA를 추출하였고 cDNA를 합성하기 위하여 High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit(Applied Biosystems)과 Mini Amp Thermal cycler(Life Technologies Holding Pte Ltd.) 기기를 이용하였다. mRNA 발현 정량은 SYBR master mix kit(Applied Biosystems)을 이용하여 cDNA 1 µg, SYBR Green master mix 10 µL, 각 10 µM primer 1 µL를 혼합한 후, 전체 부피가 20 µL가 되도록 diethylpyrocarbonate를 처리한 물을 첨가한 후, QuantStudio^TM 1 real-time PCR(Life Technologies Holding Pte Ltd.) 기기를 이용하여 확인하였고, 정량을 위한 내부 대조군(internal control)으로는 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase를 이용하였다. 사용된 primer는 Table 1과 같다.

Table 1 . Primer sequences for bone-marker genes used for quantitative RT-PCR.

Target gene	Forward primer (5’-3’)	Reverse primer (5’-3’)
Runx2	CCGCACGACAACCGCACCAT	CGCTCCGGCCCACAAATCTC
ALP	GCTGATCATTCCCAGGTTTT	CTGGGCCTGGTAGTTGTTGT
OPN	TGCACCCAGATCTAGCC	CTCCATCGTCATCATCATCG
ProCOLІ	ACGTCCTGGTGAAGTTGGTC	CAGGGAAGCCTCTTTCTCCT
GAPDH	TCCACTCACGGCAAATTCAACG	TAGACTCCACGACATACTCAGC

Runx2, runt-related transcription factor 2; ALP, alkaline phosphatase; OPN, osteopontin; ProCOLI, procollagen I; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase..

Mb NVs DiD labelling

DiD 표지를 위해 Mb NVs[1 mg/mL phosphate-buffered saline(PBS)]를 dimethyl sulfoxide에 5 mM DiD(1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine perchlorate, Invitrogen) 1 µL와 혼합하고 25°C에서 30분 동안 incubation 하였다. MC3T3-E1 세포에 Mb NVs-DiD를 처리하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 6시간, 12시간, 24시간 동안 방치하였다. DiD 염료로 염색된 세포의 이미지를 형광 현미경(iRiSTTM, Logos Biosystems Inc.)으로 확인하였다.

세포배양 및 분화

전조골세포인 MC3T3-E1 세포는 American Type Culture Collection에서 구입하였다. 성장배지는 α-MEM(Gibco BRL) 배지에 10% FBS(Gibco BRL), 100 U/mL penicillin과 100 mg/mL streptomycin(Gibco BRL)을 첨가하였으며, 분화유도 배지는 성장배지에 10 mM β-glycerol phosphate(Sigma-Aldrich)와 50 µg/mL의 비타민 C(Sigma-Aldrich)를 추가로 첨가하였다. Mb NVs를 분화배지에 0, 1, 5, 10 µg/mL 농도가 되도록 제조하여 세포에 처리한 후 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하였고 배지는 3일마다 교환하면서 7일까지 실험을 진행하였다.

세포증식 유도 측정

조골세포 생존 및 증식에 미치는 Mb NVs의 효과를 확인하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 실험방법은 이전에 보고된 논문과 동일한 방법으로 실험하였다(Seo 등, 2021). 먼저 MC3T3-E1 세포를 1×10⁴ cells/well 밀도로 96-well plate에 분주한 후 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양한 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 Mb NVs를 0, 1, 5 및 10 µg/mL 농도로 분화배지에 첨가하여 세포에 처리하였다. 세포는 3일과 7일 배양 후 5 mg/mL 농도의 3-(3,4-dimethylthiazoly-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT, Sigma-Aldrich) 시약을 첨가하여 환원 정도를 측정하였다.

염기성 인산분해효소 활성 측정

염기성 인산분해효소(alkaline phosphatase, ALP)의 활성을 측정하여 Mb NVs가 조골세포 활성에 미치는 영향을 확인하였다. MC3T3-E1 전조골세포는 1×10⁵ cells/well 밀도로 24-well plate에 분주하였고, 37°C, 5% CO₂ incubator에서 48시간 성장배지로 배양하였다. 안정화된 세포는 성장배지를 제거하고 10 mM β-glycerol phosphate와 50 µg/mL의 비타민 C가 첨가된 분화배지에 Mb NVs를 농도별(0, 1, 5, 10 µg/mL)로 제조하여 세포에 처리하였다. 3일과 7일간 배양한 세포의 배양액은 수거하고 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 radioimmunoprecipitation assay buffer(Boston Bio Products)를 이용하여 분리하였다. 세포 현탁액은 1,000×g에서 4°C로 10분간 원심분리 한 후 상등액에서 ALP 효소 활성과 단백질을 정량하였다. 실험방법은 이전에 보고된 논문과 동일한 방법으로 실험하였다(Seo 등, 2021). 즉, 상등액에 1 M Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, lysis buffer 및 5 mM p-nitrophenolphosphate(p-NPP)를 각각 첨가하여 37°C에서 30분간 반응시킨 후 1 N NaOH으로 반응을 중지하였고, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. ALP activity는 p-NPP로부터 생성된 p-nitrophenol(PNP)을 측정하여 PNP에 관한 표준그래프를 작성한 후 활성도를 계산하였다. 단백질은 BCA protein assay kit(Pierce)을 사용하여 정량하였다. 세포에서 측정된 ALP activity는 단백질량(mg/mL)으로 나누어 단위 단백질량당 효소활성도를 산출하여 unit으로 나타내었다.

Von Kossa 염색법

칼슘과 함께 인산 이온의 침착을 확인하기 위해 Von Kossa 염색법을 실시하였다. MC3T3-E1 세포(1×10⁵ cells/well)를 12-well plate에 분주하고 세포가 100% confluency 될 때 Mb NVs가 0, 1, 5, 10 µg/mL 농도로 첨가된 분화배지를 3일 및 7일 동안 처리하여 배양하였다. 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 70% 에탄올로 4°C에서 30분 동안 고정한 다음, 3% 질산은 용액을 처리하여 1시간 동안 UV 광선 아래에서 반응시켰다. 질산은 용액을 제거하고 증류수로 세척 후 광학 현미경으로 관찰하였다. 인산 이온의 침착으로 무기질화된 결절(nodules)은 두꺼운 암갈색 줄무늬로 나타난다.

Alizarin-red 염색법에 의한 골 무기질화 형성도 측정

Alizarin-red 염색법을 이용하여 조골세포 분화 지표인 골 무기질화의 진행 정도를 확인하였다. 무기질화된 세포 외 기질의 Ca은 Alizarin-red 염색 시료와 복합체를 형성하여 붉은색으로 염색된다. 전조골세포인 MC3T3-E1 cell은 1×10⁵ cells/well 밀도로 12-well plate에 분주하였고, 37°C, 5% CO₂ incubator에서 48시간 성장배지로 배양하였다. 안정화된 세포는 성장배지를 제거하고 10 mM β-glycerol phosphate와 50 μg/mL의 비타민 C가 첨가된 분화배지에 Mb NVs를 농도별로(0, 1, 5, 10 µg/mL) 제조하여 세포에 처리하였다. 3일과 7일간 배양한 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 70% 에탄올로 4°C에서 1시간 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 40 mM Alizarin red solution(pH 4.2, Sigma-Aldrich)에 10분간 방치한 후 증류수로 세척하고 현미경으로 nodule 정도를 관찰하였다. 무기질화 형성 정도를 정량하기 위해 10 mM sodium phosphate(pH 7.0) 용액에 10% cetylpyridinium chloride를 첨가한 용액을 제조하여 plate에 넣고 30분간 반응시킨 후, microplate reader(AU/M200, Tecan Systems Inc.)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계처리

실험 결과는 SPSS(Version 26.0, IBM) 통계 프로그램을 이용하여 평균과 표준오차로 나타내었다. 유의성 분석은 one-way analysis of variance(ANOVA) 검정을 실시한 후 Duncan’s multiple range test로 사후검정하였으며 유의수준은 P<0.05이다.

Mb NVs 분리 및 검증

Mb NVs는 Fig. 1A와 같은 방법으로 분리하였다. 차등 초원심분리 기술은 일반적으로 사용되는 방법이며, 사용하기 쉽고 비용 면에서 저렴하다는 장점이 있다(Dad 등, 2021). 무봉에서 분리한 NVs를 나노입자 추적 분석한 결과에서 Mb NVs의 평균 직경은 187±1.3 nm이며 100~250 nm 범위 내의 크기임을 확인하였다(Fig. 1B). Mb NVs-DiD 표지 후 MC3T3-E1 전조골세포에 처리하여 6시간, 12시간 및 24시간 후 조골세포 안으로 internalization이 되는지 확인하기 위해 DiD-NV 라벨링(붉은색 지표) 처리한 결과, 대조군과 달리 Mb NVs 처리 6시간, 12시간 및 24시간 후 모두에서 Mb NVs가 세포 내로 유입되었으며, 시간의 경과와 함께 유입된 Mb NVs도 증가하였음을 형광 현미경을 통해 확인하였다(Fig. 2).

Fig 2. Uptake of Mubong-derived nanovesicles (Mb NVs) by osteoblastic MC3T3-E1 cells. (A) Schematic diagram of the experimental procedure. (B) Confocal microscopy images showing internalization of DiD-labeled Mb NVs into MC3T3-E1 cells for 0, 6, 12, 24 h (n=4/sample). Cell nuclei were counter stained with DAPI.

Mb NVs가 전조골세포 MC3T3-E1 세포의 증식에 미치는 영향

Mb NVs가 조골세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였고, MC3T3-E1 증식률을 대조군과 비교하였을 때 Mb NVs 처리 후 3일과 7일에서 대조군과 같은 증식률을 나타내었다. 특히, 5 µg/mL Mb NVs 처리군의 세포 증식률이 3일과 7일 모두에서 통계적으로 유의하게(P<0.05) 증가하였다(Fig. 3A).

Fig 3. Cell viability and ALP activity by Mubong-derived nanovesicles (Mb NVs) in osteoblastic MC3T3-E1 cells. (A) Cell viability was measured by MTT assay (B) Alkaline phosphatase (ALP) stain of MC3T3-E1 cells for 3, 7 days of Mb NVs treatment by ALP staining. Cells were cultured at 24-well plates for 3, 7 d with the 0∼10 μg/mL Mb NVs treatment. (C) ALP activity in MC3T3-E1 cells (synthesized ALP, C) and the media (secreted ALP, D). Different letters above the bars mean significantly different Mb NVs concentration as analyzed by one-way ANOVA, Duncan’s multiple range test (P<0.05).

Mb NVs가 전조골세포 MC3T3-E1 세포의 분화에 미치는 영향

조골세포의 분화 초기에 나타나는 표지인자인 ALP 활성을 측정하여 Mb NVs가 조골세포의 분화에 미치는 영향을 확인하였다(Kim 등, 2001). Mb NVs를 각각 1, 5, 10 µg/mL 농도로 처리한 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성 결과를 Fig. 3B~D에 나타내었다. 세포 내 ALP 효소의 활성은 Mb NVs 처리 3일 후 대조군(16.16±0.60)보다 1과 5 µg/mL Mb NVs 처리군에서 각각 19.04±0.38, 19.18±0.61로 유의하게 증가하였으며, 7일 후의 세포 내 ALP 효소 활성은 대조군(19.52±2.21)보다 1 µg/mL Mb NVs 처리군(25.97±0.48)과 10 µg/mL Mb NVs 처리군(29.53±2.66)이 유의적으로 증가하였고 5 µg/mL Mb NVs 처리군(22.73±0.53)은 증가하는 경향이었다(Fig. 3C). 배지 내의 ALP 효소 활성도는 세포 외로 분비된 ALP 효소를 확인할 수 있다. Mb NVs 처리 후 3일 차 배지 내 ALP 효소 활성도는 대조군(43.52±0.08)보다 10 µg/mL Mb NVs 처리군(46.85±0.86)이 유의적으로 증가하였고, 7일 후의 배지 내 ALP 효소 활성도는 대조군(20.50±0.44)보다 5 µg/mL Mb NVs 처리군(29.76±1.29)과 10 µg/mL Mb NVs 처리군(29.69±3.08)이 유의적으로 증가하였다(Fig. 3D).

Mb NVs가 전조골세포 MC3T3-E1 세포 외 기질에 무기질의 침착에 미치는 영향

Mb NVs 농도에 따른 무기질 형성도를 확인하기 위해 무기질화 된 세포의 기질을 Von Kossa 및 Alizarin red 염색을 통해 확인하였다(Fig. 4). 칼슘과 함께 인산 이온의 침착을 평가하기 위한 Von Kossa 염색 결과는 대조군보다 Mb NVs 처리군 모두에서 7일 차에 nodules의 증가가 확인되었다(Fig. 4A). Alizarin red 염색에서는 Mb NVs 처리 7일 후 대조군보다 Mb NVs 처리군에서 무기질화 된 결절을 확인할 수 있었다(Fig. 4B). Alizarin red로 염색된 석회화물은 10% cetylpyridinium chloride로 녹여 흡광도 570 nm로 측정하여 대조군에 대한 상대 활성으로 나타내었다(Fig. 4C). Mb NVs 처리 3일에서는 대조군(100.00±2.43)보다 1 µg/mL Mb NVs 처리군(125.65±4.63)이 칼슘 이온의 침착이 유의하게 증가하였으며, 7일에서는 대조군(100.00±19.59)보다 1 µg/mL Mb NVs 처리군(161.40±10.67), 5 µg/mL Mb NVs 처리군(174.84±4.11)과 10 µg/mL Mb NVs 처리군(164.22±6.39) 모두가 칼슘 이온의 침착이 통계적으로 유의하게 증가한 것으로 나타났다.

Fig 4. Mubong-derived nanovesicles (Mb NVs) modulated extracellular matrix Ca deposits in osteoblastic MC3T3-E1 cells. (A, B) Extracellular matrix Ca deposits (bone nodule formation) for matrix mineralization were measured by Von Kossa and Alizarin red S staining. Cells were cultured at 24-well plates for 3 and 7 d with the 0∼10 μg/mL Mb NVs treatment. Representative image of 3 replicates in 24-well plate. Magnification rate, ×100. (C) Quantification analysis of cells stained using Alizarin red S dye which binds with Ca (n=3). Different letters above the bars mean significantly different Mb NVs concentration as analyzed by one-way ANOVA, Duncan’s multiple range test (P<0.05).

Mb NVs가 전조골세포 MC3T3-E1 세포에서 뼈 형성 관련 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향

Mb NVs가 MC3T3-E1 세포에서 뼈 형성에 관여하는 유전자 및 단백질 발현 변화에 미치는 영향을 조사하였다. 뼈 형성 전사인자인 Runx2의 mRNA 수준은 대조군과 비교하여 Mb NVs 처리 3일에서는 3.04배(1 µg/mL Mb NVs), 3.70배(5 µg/mL Mb NVs)와 3.95배(10 µg/mL Mb NVs), 7일에서는 1.95배(1 µg/mL Mb NVs), 2.79배(5 µg/mL Mb NVs)와 2.24배(10 µg/mL Mb NVs)로 Mb NVs 처리군 모두에서 유의하게 상향 조절되었다(Fig. 5A). 초기 분화 인자인 ALP의 mRNA 수준은 1 µg/mL와 5 µg/mL Mb NVs 처리군이 대조군보다 Mb NVs 처리 3일에 각각 1.59배와 3.11배, 7일에는 Mb NVs 처리군 모두에서 대조군보다 유의하게 상향 조절되었다. 무기질화를 촉진하는 후기 분화 마커인 osteopontin(OPN)의 mRNA 수준은 Mb NVs 처리 3일과 7일 후 모두에서 대조군보다 1과 5 µg/mL Mb NVs 처리군이 유의하게 상향 조절되었다. 뼈 형성을 촉진하는 분화 조절 인자인 ProCOLІ의 mRNA 수준은 Mb NVs 처리 3일과 7일 후 대조군과 비교하여 Mb NVs 처리군 모두가 유의하게 상향 조절되었다.

Fig 5. Relative expression of bone-related genes (A) and proteins (B) after Mubong-derived nanovesicles (Mb NVs) treatment in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Data are presented as the mean±SEM (n=3). Different letters above the bars indicate significant differences in the specific Mubong concentration as analyzed via one-way ANOVA, followed by Duncan’s multiple range test (P<0.05). Labeled characters without a common letter represent significant differences from the other group(s).

조골세포의 분화 과정에 관여하는 다양한 단백질들을 western blot 수행으로 확인하였다. Runx2 단백질은 대조군과 비교하여 Mb NVs 처리 3일에서는 Mb NVs 처리군 모두에서 통계적으로 유의하게 발현이 증가하였고, 7일에서는 1과 5 µg/mL Mb NVs 처리군에서 대조군보다 각각 1.48배와 1.66배로 유의한 증가를 나타내었다(Fig. 5B). ALP 단백질 발현은 5 µg/mL Mb NVs 처리군이 대조군보다 Mb NVs 처리 3일에 1.41배 유의하게 증가하였으며, 7일에서는 Mb NVs 처리군 모두에서 유의한 증가를 나타내었다. OPN 단백질은 Mb NVs 처리 3일과 7일 후 모두에서 대조군과 비교하여 Mb NVs 처리군이 높은 경향이었으나 통계적 유의성은 나타나지 않았다. ProCOLІ 단백질 발현은 대조군과 비교하여 Mb NVs 처리 7일에서 1.52배(1 µg/mL Mb NVs), 1.90배(10 µg/mL Mb NVs)와 1.94배(10 µg/mL Mb NVs)로 Mb NVs 처리군 모두에서 유의하게 증가하였다.

본 연구에서는 Mb NVs가 전조골세포인 MC3T3-E1 세포의 증식, 분화 및 무기질 침착에 미치는 영향을 조사하였다. Sun 등(2013)은 엑소좀의 소포 구조가 타 세포로 유입되어 생물학적 역할을 수행한다고 제안했는데, 본 연구에서도 Mb NVs가 MC3T3-E1 전조골세포 내로 유입되었음(Fig. 2B)을 확인했으며, 전조골세포를 이용하여 Mb NVs의 세포 증식 효과를 확인한 결과, 세포증식률이 Mb NVs 처리 3일과 7일 모두 5 µg/mL Mb NVs 처리군이 유의하게 증가하였고 그 외 처리군도 대조군과 동일한 수준

또는 높은 경향으로 나타났으므로 Mb NVs의 안전성을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 무봉에 함유되어 있는 naringin은 항산화, 항염증, 항골다공성 및 항암성 특성이 있으며, 최근 논문에는 알츠하이머 예방에 효과가 있다는 보고가 있다(Wang 등, 2013). 특히 함유량이 높은 헤스페리딘은 암이나 심혈관 질환과 같은 산화 스트레스와 염증과 관련된 질병의 예방에 중요한 역할을 한다고 보고되었다(Barreca 등, 2017). Mb NVs가 조골세포의 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 분화초기의 표지인자인 ALP 효소의 활성을 측정하였다(Kim 등, 2001). Mb NVs를 처리한 후 MC3T3-E1 세포의 ALP 활성 결과에서 Mb NVs 처리가 ALP 활성을 증가시켰으며 Mb NVs 처리 3일보다 7일에서 더 높은 활성을 나타내었다. 조골세포는 무기질 침착에 의해 뼈 형성(bone formation)을 촉진하므로(Seo 등, 2020) Mb NVs 처리가 무기질 침착에 미치는 영향을 확인하기 위해 무기질화된 세포의 기질을 Von Kossa 및 Alizarin red로 염색하여 확인하였다. Von Kossa 염색 결과 Mb NVs 처리 7일에서 무기질화 증가가 확인되었으며, Alizarin red 염색 또한 Mb NVs 처리에 의해 무기질화 증가를 확인할 수 있었다. 염색된 생성물을 정량한 결과 Mb NVs 처리 7일에 Mb NVs 처리군 모두가 칼슘 이온 침착이 증가한 것으로 나타났다. 조골세포 분화 조절 인자인 Runx2와 collagen Ⅰ 등은 뼈 형성을 촉진하며, 성숙 조골세포는 뼈 형성 단백질인 bone morphogenetic protein, OPN 및 osteocalcin 등의 세포 외 기질 단백질을 생성하여 뼈세포의 무기질을 무기질화 한다(Delany와 Canalis, 1998). 5 µg/mL Mb NVs 처리군에서 Runx2와 ALP 단백질 발현량이 증가하였으며, 10 µg/mL Mb NVs 처리 7일에서 proCOLI 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였고 이러한 결과는 Mb NVs가 뼈 형성을 촉진하였음을 시사한다. An 등(2015)은 감귤 신품종인 무봉의 생리활성을 확인하기 위한 연구에서 무봉의 과육과 과피에 나린진, 네오헤스페리딘, 헤스페리딘 등의 플라보노이드 함량과 항산화 활성이 높다고 보고하였는데, 본 연구에 사용한 Mb NVs 내 플라보노이드 함량에 관한 후속 연구뿐만 아니라 기존에 골다공증 예방 효과가 있다고 보고된 소재인 나린진과 헤스페리딘 등과의 비교에 관한 후속 연구가 필요하리라 사료된다. 본 연구의 결과를 종합하면 Mb NVs가 MC3T3-E1 세포의 증식, 분화 및 무기질화를 촉진하여 뼈 형성을 증가시키는 효능이 있는 것으로 판단된다. 또한, 무봉 성분 중 헤스페리딘이 파골세포의 분화를 억제하여 골 흡수를 감소시키는 작용을 하는 것처럼 경로에 관한 추가적인 연구가 진행된다면 항골다공증 소재로서의 가능성이 있을 것이라 생각된다.

본 연구에서는 MC3T3-E1 전조골세포를 이용하여 Mb NVs 조골세포의 분화 및 무기질화에 미치는 영향을 확인하였고, 골다공증과 같은 골 질환을 예방 및 치료할 수 있는 효과적이고 안전한 소재임을 조사하였다. Mb NVs를 분화배지에 0, 1, 5, 10 µg/mL 농도가 되도록 제조하여 MC3T3-E1 세포에 처리하여 3일 및 7일 동안 배양하였고 ALP 활성도, Von Kossa 및 Alizarin red 염색법 등에 의해 조골세포의 활성 변화를 분석하였다. 초원심분리에 의해 분리된 Mb NVs의 평균 크기는 187±1.3 nm였으며, MTT 분석 결과는 Mb NVs가 3일째에 조골세포 증식을 증가시키는 것으로 나타났다. 세포 외 ALP 활성은 7일째에 Mb NVs 농도가 증가함에 따라 유의하게 증가하였다. Von Kossa 및 Alizarin red 염색 결과 Mb NVs 처리 후 3일 및 7일에 용량 의존적 방식으로 광물화된 결절이 유의하게 증가하였다. 본 연구 결과에서 Mb NVs가 조골세포의 성숙과 분화 및 무기질화를 자극하여 골다공증과 같은 골 질환을 예방 및 치료할 수 있는 안전한 소재로서의 가능성을 확인하였다.

이 논문은 안동대학교 학술연구조성비에 의하여 연구되었음.