프로바이오틱스 및 프리바이오틱스 국제학회(ISAPP)에서는 프로바이오틱스는 충분한 양을 섭취하면 건강에 긍정적인 영향을 주는 살아있는 미생물이라고 정의한다. 자가 관리, 웰니스 등과 같이 건강에 대한 소비자의 인식이 높아짐에 따라 프로바이오틱스 산업은 급속하게 확대되고 있으며 건강기능식품 시장에서 경제적으로 상당히 중요한 비중을 차지하고 있다(Lejaniya 등, 2023). 코로나19 팬데믹 기간 사람들의 면역 건강에 대한 우려가 커지면서 프로바이오틱스 보충제의 시장 성장률이 높아진 것으로 보고되고 있다. 또한 전 세계 프로바이오틱스 시장이 2024년까지 768억 5천만 달러에 이를 것으로 전망했으며, 2020~2025년 예측 기간 8.15%의 연평균 성장률을 기록했다(Yoha 등, 2022).

프로바이오틱스는 장내 미생물 무리의 분포를 조절하고 면역 체계를 강화하며 유당 불내증으로 인한 불편을 완화하는 등 다양한 건강상의 이점을 가지고 있다(Hill 등, 2014). 또한 유아기 설사, 괴사성 장염, 항생제 관련 설사, Helicobacter pylori 감염, 염증성 장 질환 등 다양한 임상 조건에서 효과적인 것으로 나타났다(Reid 등, 2003). 이는 장내 미생물의 균형을 조절하고 병원균의 군집화 및 점막 침투를 방지하며, 국소 및 전신적인 면역 반응을 조절하며 위장 장벽 기능을 안정화 또는 유지하는 메커니즘을 통해 작용한다(Boirivant와 Strober, 2007).

김치는 한국의 대표적인 발효식품으로 주재료, 지역 및 제조 방법에 따라 다양한 유형으로 존재하며, Leuconostoc, Weisella, Lactobacillus 속을 포함한 다양한 젖산균에 의해 발효된다(Jung 등, 2014). 김치에서 분리된 젖산균은 항산화 및 항암 효과, 장 건강 개선 기능, 면역 기능 강화 등의 다양한 건강 기능성 연구 결과들이 보고되고 있다(Kim 등, 2018). 이와 같이 젖산균은 프로바이오틱스로 적용되는 가장 일반적인 미생물로 평가된다. 적합한 프로바이오틱스로 균주를 선택하기 위한 주요 기준은 위산 및 담즙산에 대한 내성, 장 상피 세포에 부착되고 군집화하는 능력, 숙주에 건강상 이점을 발휘할 수 있는 잠재력 등이 있다(Ruiz-Moyano 등, 2019).

이러한 배경에서 본 연구에서는 한국 전통 발효식품인 깍두기에서 분리한 신규 젖산균을 대상으로 프로바이오틱스로서의 특성을 평가하였다. 더불어 이 균주들의 항산화 및 항당뇨 활성, 주름 개선, 미백, 모공 수축 효과 등의 생리활성을 평가하여 건강기능식품 또는 기능성 화장품 소재로 개발하기 위한 가능성을 평가하고자 하였다.

사용 균주 및 배양 방법

본 실험에 사용한 L. plantarum K1-5, L. plantarum K1-9, P. pentosaceus K1-1, P. pentosaceus K1-2, L. brevis K1-8, L. brevis K2-9, P. acidilactici K3-6, P. acidilactici K3-8, L. sakei K4-4, L. sakei K4-8, Leu. mesenteroides K3-3은 깍두기에서 분리한 젖산균으로 경북대학교 식품공학부에서 보관 중인 균주를 사용하였다. 균주의 보관은 40% glycerol(Duksan)과 균 배양액을 1:1로 섞어 -80°C deep freezer에 보관하며 실험에 사용하였다. 젖산균의 배양은 MRS broth에 2%(v/v) 접종한 후 37°C 인큐베이터에서 18~24시간 배양하였으며 실험 시 2회 계대 배양하여 사용하였다.

젖산균 배양 상등액의 제조

MRS broth에 배양한 젖산균 배양액을 4,000×g, 15분의 조건으로 원심분리 후 상등액을 0.45 μm 멸균 syringe filter(Hyundai Mic.)로 여과멸균 하여 제조하였다. 젖산균 배양 상등액을 동일한 농도로 맞추기 위해 bicinchoninic acid(BCA) 법(Smith 등, 1985)을 통해 단백질 함량을 측정하였다. 단백질 함량은 BCA kit(Thermo Fisher Scientific)으로 정량하였다. 실험에 사용하는 working solution은 BCA reagent A와 BCA reagent B를 50:1의 비율로 혼합하여 제조하였다. 96-Well plate에 젖산균 배양 상등액 2 μL에 BCA reagent 100 μL를 혼합하여 37°C incubator에서 30분간 반응시켰다. 그 후 microplate reader(SPECTROstar Nano, BMG Labtech)를 이용하여 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. Standard로 bovine serum albumin으로 작성한 표준곡선을 사용하여 단백질 함량을 산출하여 5 mg/mL로 맞추어 실험에 사용하였으며, 배지 내 존재하는 질소원이 단백질 함량 측정 시에 bias로 작용할 가능성이 있어 MRS broth를 단독으로 측정한 값을 blank로 잡아 결괏값을 보정하였다. 또한 배양 후 pH 변화를 측정하기 위해 pH meter(STARTER 3100, OHAUS)를 이용하여 3회 반복 측정하였다.

인공위액 및 인공담즙 저항성

깍두기에서 분리한 젖산균의 산에 대한 저항성은 체내 소화관 조건과 유사한 인공위액과 인공담즙에서의 내성을 평가하였다. 인공위액 및 인공담즙에 대한 내성은 Kobayashi 등(1974)과 Shin 등(1999)의 방법을 참고하여 진행하였다. 인공위액은 1 N HCl을 사용하여 pH 3.0으로 조정한 MRS broth에 pepsin(Daejung Chem.) 1,000 unit/mL를 첨가하여 제조하였다. 인공담즙의 제조는 MRS broth에 0.45 μm 멸균 syringe filter로 여과, 제균된 oxgall(BD)을 0.5%(v/v) 첨가하였다. MRS broth에 젖산균 균주를 2% 접종하여 37°C, 24시간 동안 배양한 후 배양액을 원심분리(9,950×g, 5 min) 하여 상등액을 제거하였다. 균체에 인공위액을 초기 배양액과 동량으로 첨가하여 현탁한 후 37°C에서 2시간 배양 후 생균수를 측정하였다. 인공위액 저항성 시험을 거친 배양액을 원심분리(9,950×g, 5 min) 하여 상등액을 제거하고 동량의 인공담즙을 첨가하여 현탁시킨 후 37°C에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 생균수를 측정하여 인공담즙에 대한 저항성을 비교하였다.

세포 표면 소수성 및 응집력 평가

젖산균의 장내 세포에 대한 부착능을 간접적으로 확인하기 위해 세포 표면 소수성과 응집력 평가를 진행하였다. 세포 표면 소수성은 Vinderola 등(2004)의 방법을 참고하여 microbial adhesion to solvents 법에 의해 측정하였으며 유기용매로 n-hexane을 사용하였다. Autoaggregation은 Krausova 등(2019)의 방법을 참고하여 측정하였다. MRS broth에 2% 접종하여 24시간 배양한 젖산균 배양액을 4,000×g, 4°C, 10 min의 조건으로 원심분리 하여 상등액을 제거하고 pellet을 pH 7.5인 phosphate bufferd saline에 2회 세척하여 O.D₆₀₀＝0.55~0.60이 되도록 조정(A₀, H₀)하였다. Autoaggregation 측정을 위해 균주 현탁액을 37°C incubator에 방치하면서 3, 6, 24시간마다 상등액의 흡광도(A_t)를 측정하였다. 세포 표면의 소수성을 측정하기 위해 n-hexane 1 mL를 균주 현탁액 3 mL에 첨가하여 1분간 voltexing 하였다. 상 안정화 및 분리를 위해 37°C에서 30분간 방치 후 상층의 유기 용매를 제거하고 균주 현탁액의 탁도 감소를 600 nm에서 측정하였다(H₁). Autoaggregation 및 세포 표면 소수성의 값은 아래 계산식에 따라 계산하였다.

Autoaggregation (%)＝(1－A_t/A₀)×100

Hydrophobicity (%)＝(H₀－H₁)/H₀×100

DPPH 라디칼 소거 활성

DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성 능력 평가는 Blois(1958)의 방법을 참고하여 진행하였다. 1 mM DPPH 시약을 50% 에탄올을 사용하여 517 nm에서 O.D값이 0.6~0.7이 되도록 맞추어 60 µM DPPH solution을 제조하였다. 96-Well plate에 젖산균 배양 상등액 50 μL와 60 μM DPPH solution 150 μL를 넣고 혼합하여 암실에서 15분 동안 반응시킨 후 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 ascorbic acid를 사용하였으며, DPPH 라디칼 소거 활성 능력(%)은 {1-(sample O.D/control O.D)}×100으로 계산하여 나타내었다.

ABTS 라디칼 소거 활성

ABTS[2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 라디칼 소거 활성 능력 평가는 Fellegrini 등(1999)의 방법을 참고하여 진행하였다. 라디칼을 생성시키기 위해 7 mM ABTS와 140 mM K₂S₂O₈을 50:0.88 비율로 혼합한 후 암실에서 14~16시간 동안 반응시킨 후 냉장 보관을 하였다. 반응시킨 stock solution을 50% 에탄올과 혼합하여 O.D값이 0.7±0.02가 되도록 맞춘 뒤 사용하였다. 96-Well plate에 젖산균 배양 상등액 9 μL와 ABTS solution 180 μL를 넣어 암실에서 1분 30초 동안 반응시킨 후 734 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 ascorbic acid를 사용하였으며, ABTS 라디칼 소거 활성 능력(%)은 {1-(sample O.D/control O.D)}×100으로 계산하여 나타내었다.

Collagenase 저해 활성

Collagenase 저해 활성은 Wünsch와 Heidrich(1963)의 방법을 참고하여 진행하였다. 젖산균 배양 상등액 0.1 mL에 4 mM CaCl₂ in 0.1 M tris-HCl(pH 7.5) buffer에 녹인 기질 0.4 mM 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg 0.25 mL를 넣고, 4 mM CaCl₂ in 0.1 M tris-HCl(pH 7.5) buffer 0.15 mL를 넣었다. 그다음 4 mM CaCl₂ in 0.1 M tris-HCl(pH 7.5) buffer로 제조한 9.77 unit/mL collagenase from Clostridium histolyticum(Sigma Aldrich Co.) 0.15 mL를 첨가한 후 25°C water bath에서 20분 반응시켰다. 반응 후 종료 시약인 6% citric acid 0.5 mL와 ethyl acetate 2 mL를 넣고 1분간 voltexing 하여 상등액을 320 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 (-)epigallocatechin-3-O-gallate(EGCG)를 사용하였으며, collagenase 저해율(%)은 {1－(sample O.D/control O.D)}×100으로 계산하여 나타내었다.

Elastase 저해 활성

Elastase 저해 활성은 Kraunsoe 등(1996)의 방법을 참고하여 진행하였다. 96-Well plate에 젖산균 배양 상등액 30 μL와 0.2 M Tris-HCl(pH 8.0) buffer 200 μL 그리고 0.2 M Tris-HCl(pH 8.0) buffer에 녹인 기질 0.8 mM N-suc-(Ala)₃-ρ-nitroanilide 30 μL를 첨가한 후 25°C에서 10분간 전처리한 다음 0.2 M Tris-HCl(pH 8.0) buffer로 제조한 1.18 unit/mL elastase from porcine pancreas(Sigma Aldrich Co.) 30 μL를 첨가하여 25°C에서 20분간 반응시켰다. 그 후 microplate reader(SPECTROstar Nano)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 EGCG를 사용하였으며, elastase 저해율(%)은 {1－(sample O.D/control O.D)}×100으로 계산하여 나타내었다.

Tyrosinase 저해 활성

Tyrosinase 저해 활성은 Flurkey(1991)의 방법을 참고하여 진행하였다. 96-Well plate에 젖산균 배양 상등액 50 μL와 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.8)에 녹인 기질 10 mM L-DOPA 50 μL 그리고 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.8)로 제조한 100 unit/mL tyrosinase form mushroom(Sigma Aldrich Co.) 25 μL 그리고 0.1 M sodium phosphate buffer 125 μL를 혼합한 다음 37°C에서 30분간 반응시켰다. 그 후 microplate reader(SPECTROstar Nano)를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 kojic acid를 사용하였으며, tyrosinase 저해율(%)은 {1－(sample O.D/control O.D)}×100으로 계산하여 나타내었다.

수렴 효과

수렴 효과는 Lee 등(2002)의 방법을 참고하여 진행하였다. 1.5 mL Eppendorf tube에 젖산균 배양 상등액 700 μL와 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 7.5) 350 μL 그리고 기질로는 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질인 0.4% hemoglobin 350 μL를 넣은 후 voltexing 하여 17,177×g에서 5분간 원심분리 하여 응고된 혈액 단백질을 가라앉히고 576 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 tannic acid를 사용하였으며, astringent effect(%)는 {1－(sample O.D/control O.D)}×100으로 계산하여 나타내었다.

α-Glucosidase 저해 활성

α-Glucosidase 저해 활성은 Watanabe 등(1997)의 방법을 참고하여 진행하였다. 96-Well plate에 젖산균 배양 상등액 40 μL와 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.8)에 녹인 기질 5 mM ρ-nitrophenyl α-D-glucopyranoside 40 μL, 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 6.8)로 제조한 1.95 unit/mL α-glucosidase from Saccaromyces cerevisiae(Sigma Aldrich Co.) 40 μL 그리고 buffer 40 μL를 혼합하여 37°C에서 30분간 반응시켰다. 반응을 정지하기 위해 1 N NaOH 용액을 100 μL 첨가하여 혼합한 후 microplate reader(SPECTROstar Nano)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 acarbose를 사용하였으며, tyrosinase 저해율(%)은 {1－(sample O.D/control O.D)}×100으로 계산하여 나타내었다.

통계처리

모든 실험의 결과는 3회 반복하여 얻어진 결과로, 평균±표준편차로 나타내었다. 통계분석은 SPSS(SPSS Inc.) 프로그램을 이용하였고, 각 sample 간의 차이는 Duncan’s multiple range test, one-way ANOVA로 95% 수준에서 통계적 유의성을 검증하였으며, 대조군과의 유의차는 Student’s t-test로 95% 수준에서 검증하였다.

젖산균 배양 상등액의 pH 측정

젖산균은 당을 통해 젖산을 생산하며, 이에 따라 배양 후 pH가 감소한다(Ahn 등, 2006). 이에 대한 결과는 Table 1과 같다. 젖산균을 배양하기 전 MRS broth의 pH는 5.97로 나타났지만, 젖산균 배양 후 3.79~4.34로 pH가 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 pH의 변화는 젖산균이 생산한 유기산뿐만 아니라 효소 가수분해에 의한 펩타이드, 아미노산, 유리지방산 등의 증가로 수소이온농도 차이에 의한 것으로 보고된 바 있다(Kim 등, 2023).

Table 1 . pH result of LAB culture supernatant.

	MRS broth	LAB culture supernatant
L. plantarum K1-5	5.97±0.00c1)	3.81±0.11a
L. plantarum K1-9		3.80±0.11a
P. pentosaceus K1-1		3.79±0.10a
P. pentosaceus K1-2		3.80±0.12a
L. brevis K1-8		3.80±0.13a
L. brevis K2-9		4.16±0.19b
P. acidilactici K3-6		3.80±0.11a
P. acidilactici K3-8		3.79±0.13a
L. sakei K4-4		4.28±0.08b
L. sakei K4-8		4.34±0.19b
Leu. mesenteroides K3-3		3.80±0.10a

¹⁾Values are presented as mean±SD (n=3). Means with the different letters (a-c) are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test..

젖산균의 장내 생존 가능성

프로바이오틱스로서 정장작용 등의 효능을 나타내기 위해서는 균주가 소화기관을 통과하는 과정에서 생존해야 한다. 섭취된 균주는 최종 목적 부위인 장에 도달하기까지 위액 및 담즙염에 노출되기 때문에 산에 대한 내성을 갖추어야 한다(Madureira 등, 2005). Fig. 1에 나타난 바와 같이 분리된 균주의 최초 균수는 10⁸~10⁹ CFU/mL로 나타났다. 인공위액(pH 3.0) 환경에서 2시간 배양했을 때 L. sakei K4-8 균주를 제외하고 모든 균주에서 90% 이상 생존율이 유지되었다. 특히 L. plantarum K1-9, P. pentosaceus K1-1, L. brevis K1-8, L. brevis K2-9, P. acidilactici K3-6, P. acidilactici K3-8, Leu. mesenteroides K3-3 균주는 100% 이상의 생존율을 보였다. 이는 pH 3.0인 인공위액 환경에서도 균의 생장이 억제되지 않고 증식이 가능하였음을 의미한다. Martini 등(1987)에 의하면 식품 또는 유제품을 섭취하면 위의 pH는 3.0 이상으로 상승하는 것을 고려하면 생존율은 더 높을 것으로 생각된다.

Fig 1. Artificial gastric juice and bile tolerance of probiotics strains separated from kkakdugi. Values are presented as mean±SD (n=3). Means with the different letters (A-E, a-f) above the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test.

섭취된 균주는 위를 통과하여 담즙이 분비되는 십이지장으로 이동하는 것을 고려하여 인공위액에서 2시간 처리한 후 0.5% oxgall에 24시간 처리하여 인공담즙 내성을 확인하였다. 그 결과 모든 젖산균 균주에서 92~97%의 생존율을 유지하였다. 따라서 pH 3.0 조건인 인공위액에서 높은 내산성의 기능을 가지면서 동시에 담즙에 대한 내성을 가지는 것으로 보아, 본 연구에서 분리된 젖산균은 프로바이오틱스로써 활용 가능한 조건을 갖추었다고 볼 수 있다.

젖산균의 장내 부착능 평가

상피 세포에 대한 부착과 그에 따른 위장관의 colonization은 장내에서 젖산균이 효과적으로 경쟁하고 증식하는 데 도움을 주는 특성이다. 따라서 장내 부착능은 프로바이오틱스로써 작용 가능 여부를 판단하는 중요한 특성이며, autoaggregation 및 MATH(microbial adhesion to solvents) 법에 의한 세포 표면 소수성 평가는 젖산균 균주의 세포 접착 특성을 연구하기 위한 보충 실험이라고 할 수 있다. 또한 autoaggregation을 통해 젖산균 균주가 세포 응집체를 형성하면 장내 지속성에 기여할 수 있으며, 프로바이오틱스로써 작용하기 위해 응집을 통해 큰 바이오매스를 형성할 필요가 있다(Krausova 등, 2019).

깍두기에서 분리한 젖산균의 autoaggregation을 확인한 결과 Table 2에서와 같이 모든 균주는 시간이 경과함에 따라 응집력이 높아지는 것을 관찰할 수 있었고, 24시간 후 평균 72.64%의 응집력을 나타내었다. L. sakei K4-8 균주는 92.53%로 가장 높은 응집력을 보였으며, L. brevis K2-9(80.64%), L. sakei K4-4(81.47%)도 높은 응집력을 나타냈다. Del Re 등(2000)의 연구에 따르면 autoaggregation 능력이 10% 미만인 균주는 Caco-2 cell에 부착되지 않는 것으로 보아, autoaggregation은 adhesion과 강한 상관관계가 있다는 것을 증명하였다. 따라서 본 연구에서 분리된 젖산균 균주는 강한 접착력이 있을 것이라 기대된다.

Table 2 . Autoaggregation percentages for probiotics strains from kkakdugi after incubation (%).

Strain	Time (h)
	3	6	24
L. plantarum K1-5	14.69±0.83abc1)	22.42±2.72ab	75.93±4.92cd
L. plantarum K1-9	19.02±2.00cd	26.79±0.34bc	71.77±1.12c
P. pentosaceus K1-1	12.81±1.28ab	19.16±1.22a	72.72±2.73cd
P. pentosaceus K1-2	11.06±1.58a	20.58±0.701ab	60.37±12.01b
L. brevis K1-8	12.08±1.25ab	18.92±0.77a	37.90±1.36a
L. brevis K2-9	23.89±1.42e	29.81±0.68c	80.64±4.29cd
P. acidilactici K3-6	18.11±0.94cd	21.54±1.03ab	75.85±2.99cd
P. acidilactici K3-8	16.04±1.13bc	19.32±1.51ab	77.82±2.63cd
L. sakei K4-4	22.18±2.13de	30.88±0.67d	81.47±3.19d
L. sakei K4-8	31.94±6.80f	37.74±2.57d	92.53±2.78e
Leu. mesenteroides K3-3	12.97±0.67ab	18.61±2.88a	72.01±4.33c

¹⁾Values are presented as mean±SD (n=3). Means with the different letters (a-f) with the value in the same incubation times are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test..

박테리아 접착은 두 표면 사이의 비특이적인 물리화학적 상호 작용을 기반으로, 세포 표면의 특성과 관련이 있다. MATH 법은 세포 표면의 소수성을 측정하는 가장 일반적인 방법으로 용매에 대한 미생물의 친화도로써 소수성을 평가하는 방법이다. 따라서 세포 표면의 소수성이 높을수록 상피 세포에 더 높은 결합 능력을 갖는다고 간주할 수 있다. 그 결과 Fig. 2에서와 같이 L. brevis K2-9 균주는 97.79%로 가장 높은 소수성을 나타내었으며, L. plantarum K1-9, L. sakei K4-4 균주도 각각 32.05%, 23.89%의 소수성을 나타내는 것으로 보인다. Mishra와 Prasad(2005)의 연구에 따르면 20.29%의 소수성을 보이는 균주에서 Caco-2 cell에 대한 부착능이 49.5%, 15.29%의 소수성을 보이는 균주에서는 66%의 부착능을 보이는 것으로 미루어 보아, 본 연구에서 분리된 젖산균도 높은 세포 부착능을 가지는 것으로 판단되었다.

Fig 2. Cellular hydrophobicity of probiotic strains from kkakdugi. Values are presented as mean±SD (n=3). Means with the different letters (a-f) above the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test.

젖산균 배양 상등액의 항산화 효과

항산화 평가는 활성산소를 제거하는 산화환원 분자의 능력을 평가하는 것으로 산화 스트레스 매개 질환에 대한 산화환원제의 잠재적 건강상 이점을 연구하는데 유용하다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성은 합성 착색 라디칼이 샘플에 의해 감소하는 능력을 측정하는 방법으로 항산화능을 정량화한다(Floegel 등, 2011).

DPPH 라디칼 소거 활성 측정 결과, Fig. 3A에서와 같이 젖산균 배양 상등액의 단백질 농도 5 mg/mL에서 평균 82.54%의 소거능을 보였으며, 그중 P. acidilactici K3-6은 89.22%로 가장 높은 소거능을 가지는 것으로 나타났다. P. acidilactici K3-8(88.50%), L. sakei K4-8(88.23%), L. plantarum K1-9(87.74%)의 균주도 높은 소거능을 가지는 것으로 나타났다. 이는 positive control인 ascorbic acid 25 μg/mL(88.71%)와 비교하였을 때 이와 비슷하거나 높은 소거능을 가지는 것으로 보아 젖산균 배양 상등액이 DPPH 라디칼에 대한 항산화 활성이 우수한 것이라고 판단되었다.

Fig 3. Radical scavenging activity of lactic acid bacteria culture supernatant separated from kkakdugi. (A) DPPH radical scavenging activity, (B) ABTS radical scavenging activity. Values are presented as mean±SD (n=3). Means with the different letters (a-f) above the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test.

ABTS 라디칼 소거 활성 측정 결과, Fig. 3B에서와 같이 젖산균 배양 상등액의 단백질 농도 5 mg/mL에서 평균 60.28%의 소거능을 보였으며, 그중 L. sakei K4-8은 81.08%로 가장 높은 소거능을 가지는 것으로 나타났다. P. acid-ilactici K3-6(80.56%), P. acidilactici K3-8(64.66%), L. brevis K2-9(63.57%)의 균주도 높은 소거능을 가지는 것으로 나타났다. 이는 positive control인 ascorbic acid 50 μg/mL(65.16%)와 비교하였을 때 이와 비슷하거나 높은 소거능을 가지는 것으로 나타났다.

피부 주름 개선 효과

Collagen은 피부, 뼈 및 힘줄의 주요 구조 단백질로써 다른 세포가 증식할 수 있는 지지체, 매트릭스 역할을 하며, 다수의 단백질 합성을 하는 것으로 알려져 있다. 자외선에 노출되면 피부 collagen을 분해하는 collagenase의 합성을 촉진하여 거칠고 주름진 피부의 원인이 된다(Madhan 등, 2007). 젖산균 배양 상등액의 주름 생성 방지 효과를 확인하기 위해 collagenase 억제 능력을 측정하였다. 그 결과 Fig. 4A에서와 같이 평균 23.80%의 억제 효과를 보였으며, 그중 L. sakei K4-4는 51.52%로 가장 높은 collagenase 억제 효능을 가지는 것으로 나타났다. L. plantarum K1-9(36.51%), P. acidlactici K3-8(29.51%), L. sakei K4-8(25.74%), L. brevis K1-8(21.56%)의 균주도 posititve control인 EGCG 100 μg/mL(12.02%)와 비교하였을 때 이보다 높은 collagenase 억제 효능을 나타내는 것으로 보아, 본 젖산균은 collagenase에 대한 저해 효과가 있는 것으로 확인되어 피부 주름 발생을 억제하는 억제제 역할을 수행할 수 있을 것이라 기대된다.

Fig 4. Collagenase (A) and elastase (B) inhibition activity of lactic acid bacteria culture supernatant separated from kkakdugi. Values are presented as mean±SD (n=3). Means with the different letters (a-g) above the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test. EGCG, (−)epigallocatechin-3-O-gallate.

Elastin은 collagen과 마찬가지로 중요한 피부 단백질로써 피부에 탄력을 제공하는데, 자외선 노출에 의해 유도된 elastase는 elastin 섬유의 손상을 일으켜 피부 탄력성 저하를 초래한다(Ko 등, 2011). 따라서 젖산균 배양 상등액의 elastase 활성 억제능을 측정하여 피부 탄력성 유지 효과를 확인한 결과는 Fig. 4B와 같다. 평균 27.96%의 억제 효과를 보였고, 그중 P. acidilactici K3-6은 37.77%로 가장 높은 elastase 억제 효능을 보이는 것으로 나타났다. 또한 L. plantarum K1-5(33.63%), L. plantarum K1-9(33.25%), P. acidilactici K3-8(31.91%) 균주도 30%대의 elastase 억제 효과를 가지는 것으로 나타났다. 이는 positive control인 EGCG 10 μg/mL(21.39%)보다 높은 elastase 억제 효과를 가지는 것을 보아 젖산균 배양 상등액은 피부 탄력성 유지 효과를 가지는 것으로 판단된다.

피부 미백 효과

피부의 표피층에서는 melanin 색소를 합성하여 자외선으로부터 내피를 보호한다. 그러나 melanin의 과잉생산 및 축적은 기미, 주근깨 등 표피 색소 침착 장애를 유발할 수 있다. Melanin 생합성에서는 구리를 함유한 산화효소인 tyrosinase가 중요한 역할을 하므로 tyrosinase 활성 억제 정도를 측정함으로써 피부 색소 생성 조절 효능을 측정할 수 있다(Ko 등, 2011). 따라서 젖산균 배양 상등액의 미백 효과를 확인하기 위해 tyrosinase 억제 효과를 확인한 결과 평균 16.99%의 억제 효과를 나타냈으며, 특히 P. pentosaceus K1-2 균주는 27.12%로 가장 높은 tyrosinase 억제 효능을 보이는 것으로 나타났고, Leu. mesenteroides K3-3 균주도 22.72%의 활성을 보였다(Fig. 5). 이는 positive control인 kojic acid 100 μg/mL(20.70%)보다 높은 효과를 가지는 것이라 볼 수 있다.

Fig 5. Tyrosinase inhibition activity of lactic acid bacteria culture supernatant separated from kkakdugi. Values are presented as mean±SD (n=3). Means with the different letters (a-e) above the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test.

수렴 효과

수렴이란 주름이 지고 또는 움츠린다는 의미이며 단백질과 결합하는 성질을 나타내는데, 피부 단백질인 고분자 플라보노이드와 가교적 결합 형태로 생성되어 피부가 수축하는 현상을 말한다. 따라서 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질 hemoglobin을 사용하여 수렴 효과를 측정하여 모공 수축 효과를 확인할 수 있다. 또한 피부 표면에 복합체를 형성하여 피지 분비량을 감소시킬 수 있다(Ditthawutthikul 등, 2021; Youn 등, 2012). Hemoglobin의 단백질이 젖산균 배양 상등액과 결합하는 정도에 따라 수렴 효과를 판단하였다. 그 결과 평균 6.37%의 수렴 효과를 나타냈으며, 특히 L. brevis K1-8 균주와 P. acidlactici K3-8 균주는 각각 12.28%, 11.19%의 수렴 효과를 나타냈다(Fig. 6). 이는 positive control인 tannic acid 380 μg/mL(5.15%)와 비교하였을 때 더 높은 효과를 가지는 것으로 확인되었다. 반면 L. sakei K4-8 균주는 수렴 효과를 나타내지 않는 것으로 보이며, 나머지 균주도 수렴 활성이 미약하였으나 젖산균 배양 상등액의 농도를 더 높인다면 농도 의존적으로 수렴 효과를 보일 것으로 기대된다.

Fig 6. Astringent effect of lactic acid bacteria culture supernatant separated from kkakdugi. Values are presented as mean±SD (n=3). Means with the different letters (a-e) above the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test.

항당뇨 효과

소장 상피세포의 brush-border-membrane에는 α-glucosidase라는 효소가 존재하는데, 이는 이당류나 다당류를 단당류로 분해하는 효소이다. 이 효소의 활성을 억제하는 것이 당질 가수분해와 흡수를 지연시킴에 따라 식후 당 농도를 제한하게 된다. 따라서 α-glucosidase 저해 효과는 항당뇨 활성 측정법으로 이용되고 있다(Lee 등, 2008). 젖산균 배양 상등액의 α-glucosidase 억제 효과 측정 결과 평균 23.81%의 억제 효과를 보이는 것으로 나타났다(Fig. 7). 특히 L. plantarum K1-5 균주는 33.72%로 가장 높은 억제 효능을 보였으며, L. brevis K1-8, P. acidlactici K3-6, L. plantarum K1-9 균주도 각각 29.39%, 29.25%, 28.28 %의 저해율을 나타내었다. 이는 positive control인 acarbose 250 μg/mL(23.11%)보다 높은 α-glucosidase 억제 효과를 가지는 것으로 나타났다. 따라서 젖산균 배양 상등액은 탄수화물 소화 과정에서 α-glucosidase에 의한 단당류 생성을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.

Fig 7. α-Glucosidase inhibition activity of lactic acid bacteria culture supernatant separated from kkakdugi. Values are presented as mean±SD (n=3). Means with the different letters (a-g) above the bars are significantly different at P<0.05, as determined by Duncan’s multiple range test.

본 연구에서는 한국 전통 발효식품인 깍두기에서 분리 동정한 젖산균의 프로바이오틱스로써 활용하기 위한 특성 그리고 항산화 활성 및 피부 기능성 소재로써 활용 가능성을 평가하였다. 젖산균 배양 상등액의 pH를 측정한 결과 젖산을 비롯한 다양한 대사산물에 의해 pH의 감소를 보이는 것으로 나타났다. 젖산균의 프로바이오틱스로써 활용 가능성을 검증하기 위해 인공위액과 인공담즙의 환경에서의 생존율을 평가하였다. 인공위액에서는 평균 5.3×10⁹ CFU/mL의 생균수를 유지하여 99% 정도의 생존율을 보였으며, 인공담즙에서는 평균 1.2×10⁹ CFU/mL의 생균수를 유지하여 95% 정도의 생존율을 보여 목적 부위까지 도달하여 그 효과를 발휘할 수 있을 것으로 보인다. 또한 위장관 표면 부착능을 간접적으로 확인하기 위해 autoaggregation과 세포 표면 소수성 실험을 진행하였다. 시간이 경과함에 따라 모든 젖산균 균주의 응집률이 증가하였고, L. plantarum K1-9 균주와 L. brevis K2-9 균주는 높은 소수성을 보였다. 젖산균 배양 상등액을 사용하여 항산화 활성 및 항당뇨 활성과 더불어 피부 주름 및 미백, 수렴 효과도 평가하였다. 그 결과 깍두기에서 분리한 젖산균은 높은 항산화 활성을 보였다. 또한 젖산균 배양 상등액의 농도를 높이면 피부 주름 및 미백 효과에도 긍정적인 활성을 보일 것으로 기대된다. 젖산균 배양 상등액의 pH를 측정한 결과 젖산을 비롯한 다양한 대사산물에 의해 pH의 감소를 보이는 것으로 나타났다. 젖산균이 생산한 배양 산물에 의해 본 연구에서 진행한 여러 가지 기능성 실험에서 긍정적인 결과를 얻을 수 있는 것으로 판단된다. 따라서 깍두기에서 분리한 젖산균의 이러한 특성은 정장용 프로바이오틱스 및 기능성 화장품 소재로써 활용 가능성이 충분한 것으로 판단되나 구체적으로 어떤 산물이 얼마나 생산되었는지 대한 추가적인 분석 연구가 필요하다고 사료된다.