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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(4): 385-391

Published online April 30, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.385

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Method Validation for the Determination of Sulforaphane in Cruciferous Vegetables

Samuel Park1 , Keup-rae Kim1, Keono Kim1 , Heon-Woong Kim2, Chang Joo Lee3 , and Jeehye Sung1

1Department of Food Science and Biotechnology, Andong National University
2National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration
3Department of Food Science and Biotechnology, Wonkwang University

Correspondence to:Jeehye Sung, Department of Food Science and Biotechnology, Andong National University, 1375, Gyeongdong-ro, Andong, Gyeongbuk 36729, Korea, E-mail: jeehye@andong.ac.kr

Received: February 13, 2024; Revised: March 13, 2024; Accepted: March 14, 2024

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Sulforaphane, a phytochemical mainly derived from cruciferous vegetables, possesses anti-oxidative and anti-inflammatory properties. There is a lack of information about the changes in the sulforaphane content of cruciferous vegetables caused by processing conditions such as freezing and drying. Hence, this study investigated the sulforaphane levels of fresh, frozen or dried cruciferous vegetables and cabbage drinks. The results showed that the sulforaphane contents of the fresh samples varied from 0.62±0.00 mg/100 g (cauliflower) to 9.79±0.06 mg/100 g (radish sprout). The sulforaphane levels were significantly higher in frozen broccoli and cauliflower than in fresh samples, whereas the opposite trend was observed in Brussels sprouts and radishes. Although the sulforaphane levels of cabbage and cabbage drinks were 5.36±0.05∼5.62±0.01 mg/100 g and 12.77±0.56∼13.95±0.06 mg/100 g, respectively, sulforaphane was not detected in cabbage powder. The sulforaphane content may be highly vulnerable to drying conditions. Thus, our observations suggest that the sulforaphane contents of cruciferous vegetables could be affected by the processing methods.

Keywords: cruciferous vegetables, sulforaphane, HPLC-UV, method validation

십자화과 채소는 쌍떡잎식물로 북반구 온대나 한대에 주로 분포하며, 350개의 속, 3,000여 종이 보고되어 있다(Amina 등, 2020). 국내에서 식품으로 소비되는 십자화과 채소는 콜라비, 적무, 브로콜리, 배추, 유채, 무순 및 다채 등으로 소비량이 점차 증가하며 이를 활용한 식품들의 인기도 증가하고 있다(Ko 등, 2015; Shin 등, 2014). 십자화과 채소 섭취 증가는 췌장암, 폐암, 대장암 등 다양한 암의 발병 위험을 낮추며 산화스트레스에 대한 보호 효과가 보고되어 있다(Chikara 등 2018; Guerrero-Beltrán 등, 2012).

십자화과 채소에는 생리활성 물질로 알려진 β-carotene, rutin과 같은 phenolic compound뿐만 아니라 sulforaphane과 같은 식이황화합물이 풍부하게 함유되어 있다(Kurilich 등, 1999; Sangthong과 Weerapreeyakul, 2016). 특히 식이황화합물인 glucosinolates는 비활성인 상태로 존재하다가 채소가 가공되는 과정에서 가수분해 효소인 myrosinase의 활성에 의해 당이 가수분해됨으로써 thiohydroximate-O-sulfate와 같은 중간체를 형성하여 생리활성을 나타내는 isothiocyanates, thiocyanates와 같은 성분으로 치환된다(Hanschen, 2020; Kim 등, 2011). 십자화과 채소 중 대표적인 식이황화합물인 sulforaphane은 glucoraphanin이 분해됨으로써 sulforaphane nitrile과 함께 생성되며, 항암, 항염증, 항균 및 심장보호 효능이 뛰어나다고 보고되었다(Cole, 1976; Guo 등, 2016; Jeong과 Cho, 2022; Matusheski, 2004; Yang 등, 2015). 십자화과 채소의 주된 생리활성 효능은 항암효과로 알려져 있으며 이는 sulforaphane이 크게 기여한다(Chen 등, 2020; Liu 등, 2017; Wang 등, 2021b). 십자화과 채소에 함유된 sulforaphane의 함량은 품종, 재배 조건, 수확시기, 가공조건 등과 같은 다양한 요인들에 의해 영향을 받는다(Fenwick과 Heaney, 1983). Sulforaphane은 쉽게 파괴되는 특성이 있어 주로 조리 및 가공방법에 따른 함량 변화에 관한 연구가 주로 진행됐다.

현재까지 국내에서 재배되는 채소류 내 sulforaphane 함량을 분석하기 위한 방법으로는 주로 gas chromatography/mass detector(GC/MS)와 high performance liquid chromatography(HPLC)를 사용하여 연구가 진행되었다. Kim 등(1997)은 브로콜리, 순무, 무, 양배추 등 여러 종류의 십자화과 채소를 dichloromethane으로 추출하여 GC-MS를 통해 sulforaphane 함량을 분석하였고, Choi 등(2008)은 십자화과 채소를 초음파 처리하여 GC-MS를 통해 무, 양배추, 브로콜리의 sulforaphane 함량을 분석하였다. Kim과 Kim(2009)은 조리 방법 차이에 따른 브로콜리의 sulforaphane의 함량을 HPLC-UV를 통해 분석하였으며, Kim과 Kim(2023)은 열처리에 따른 브로콜리 종자와 꽃 부위의 sulforaphane 함량 차이를 HPLC-UV를 통해 비교 분석하였다. 이와 같이 국내에서 소비되는 십자화과 채소의 sulforaphane 함량 분석은 주로 브로콜리와 무를 중점으로 진행되었으며, 유통되는 다양한 십자화과 채소들의 sulforaphane 함량을 비교・분석한 연구는 미비하다. 십자화과 채소의 우수한 기능성으로 인하여 십자화과 채소를 활용한 건강기능식품 원료의 개발이 활발하게 진행되고 있으며, 이들 원료 제품의 품질을 평가하기 위해서는 십자화과 채소의 주된 지표성분인 sulforaphane에 대한 분석법 검증이 요구된다.

따라서 본 연구는 HPLC-UV 분석법을 이용하여 십자화과 채소의 sulforaphane 분석법을 검증하고, 국내에서 주로 소비되는 십자화과 채소들의 sulforaphane 함량을 비교・분석하였다.

실험재료 및 시약

본 실험에 사용된 방울양배추(Brassica oleracea var. gemmifera), 양배추(B. oleracea var. capitata), 브로콜리(B. oleracea var. italica), 브로콜리 새싹, 무(Raphanus sativus var. Longipinnatus), 무순, 콜리플라워(B. oleracea var. botrytis), 양배추즙 그리고 양배추 가루는 2022년 8월 국내 시장에서 구입하여 냉장보관 후 바로 분석에 사용하였으며 냉동 시료는 -20°C 냉동고에서 보관되었다. 분석 표준품으로 사용된 sulforaphane은 Sigma-Aldrich로부터 구입하여 사용하였으며 그 밖의 분석에 사용된 추출 용매 및 시약은 analytical 및 HPLC 등급을 사용하였다.

Sulforaphane 추출

십자화과 채소로부터 sulforaphane을 추출하기 위해 5 g의 십자화과 채소를 50 mL의 dichloromethane을 이용하여 homogenizer(DAIHAN Scientific Co.)로 5분간 균질화시킨 후 30분간 실온에서 반응하였다. 그 후 1.25 g anhydrous sodium sulfate를 첨가하여 반응시킨 뒤 0.22 μm nylon filter(Whatman)를 사용하여 고형물을 제거하였다. 고형물이 제거된 추출용액을 dichloromethane을 첨가하여 50 mL로 volume을 맞춰준 뒤 35°C에서 질소 농축하였고, 잔류물을 acetonitrile 1 mL로 재용해한 후 0.22 μm membrane filter로 여과하여 기기분석에 사용하였다.

Sulforaphane 분석 기기 및 조건

십자화과 채소에 함유된 sulforaphane은 UV detecter(Osaka soda)가 장착된 HPLC를 통해 분석되었으며 분석조건은 Table 1과 같다. 분석컬럼은 Shiseido capcellpak C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)을 사용하였으며 검출기 파장은 254 nm, 컬럼 온도는 30°C를 유지하였다. 분석은 12분간 진행되었으며 이동상은 60% acetonitrile을 사용하였고, 유속은 1.0 mL/min이었으며 시료 주입량은 1회 10 μL였다.

Table 1 . Condition of HPLC analysis for quantitative analysis of sulforaphane

ItemsConditions
InstrumentOsaka soda
DetectorUV 254 nm
ColumnShiseido capcellpak C18 (5 μm, 4.6 mm×250 mm)
Mobile phase60% acetonitrile
Flow rate1.0 mL/min
Injection volume10 μL
Column oven temperature30°C


표준용액의 제조

Sulforaphane의 표준품 5 mg을 정밀하게 취해 HPLC용 100% 메탄올 1 mL에 용해하여 5 mg/mL 농도의 stock standard solution을 조제하였다. 이를 분석조건 확립 및 유효성 검증 시험을 위해 연속적으로 시료를 100% acetonitrile을 사용해 희석하여 2, 1, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05 mg/mL 농도로 제조하였다.

분석법 검증

십자화과 채소 내 sulforaphane 분석법 검증은 개별인정형 건강기능식품 지표성분으로서 의약품 등 분석법의 밸리데이션에 대한 가이드라인을 근거로 하여 지표성분에 대한 특이성(specificity), 직선성(linearity) 및 정밀성(accuracy)을 조사하고 직선성 검증으로 구한 기울기(slope)와 표준편차(standard deviation)를 통해 검출한계(limit of detection, LOD)와 정량한계(limit of quantitation, LOQ)를 통하여 검증을 실시하였다(MFDS, 2015). 본 연구에서는 양배추와 양배추즙을 식이황화합물 분석법 검증 시료로 사용하였다.

특이성은 분석 대상이 다른 배합성분 등과 혼합된 경우 분석 대상을 선택적으로 검출할 수 있는 특성을 의미하며, 분석 대상인 sulforaphane 피크의 동일한 머무름시간(retention time)과 spectrum을 나타내는지를 HPLC 크로마토그램을 통해 확인하였다.

직선성은 분석 대상물질의 농도에 대해 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력을 말하는 것으로 표준물질을 5~2,000 μg/mL로 희석한 후 피크 면적과 각 농도 간의 검량선을 작성하여 기울기, y-절편(y-intercept) 및 상관계수(correlation coefficient, R2)를 통해 확인하였다.

각 성분에 대한 검출한계와 정량한계는 표준용액의 크로마토그램을 사용하였고, 검출한계 3.3×σ/s(σ: 표준편차, s: 표준검량선의 기울기), 정량한계 10×σ/s 식을 이용하여 계산하였다.

정밀성은 균질한 검체를 여러 번 정해진 조건에 따라 측정하였을 때 각각의 측정값들 사이의 근접성(분산 정도)을 의미하는 것으로, 십자화과 채소 내 sulforaphane 함량 분석 재현성을 실험하기 위해 HPLC를 3회 측정하여 피크 머무름시간과 피크 area의 반복 재현성(repeatability)을 확인하였다. 실험실 내 정밀성(intermediate prcecision)은 일내(intra-day) 및 일간(inter-day) 정밀성으로 3일간 반복하여 측정하고, 각 결괏값의 표준편차를 결괏값의 평균으로 나눈 상대표준편차(relative standard deviation, RSD%)로 정밀도를 판단하였다.

통계분석

통계분석은 GraphPad Prsim 8(GraphPad Software) 소프트웨어와 Statistical Analysis System(SAS 9.4 Institute Inc.)을 이용하여 실시하였다. 데이터 간 유의적인 차이는 t-test와 일원 분산분석(one-way ANOVA) 및 Tukey’s test를 통해 P<0.05 수준에서 검정하였다.

특이성 검증

특이성이란 불순물 및 배합물 등의 혼합된 상태에서 분석 대상인 특정 성분을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력으로, 대상 성분이 크로마토그램에 적절하게 표시되어 명확하게 확인할 수 있어야 한다. 표준용액인 sulforaphane의 머무름시간대는 3.036분에서 피크가 검출되었고, 양배추즙 시험용액의 크로마토그램에서는 sulforaphane의 머무름시간대가 2.977분으로 다른 물질의 간섭 없이 피크가 분리되어 검출된 것을 확인하였다(Fig. 1). 표준용액의 피크 유지시간과 양배추즙의 피크 유지시간이 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 시험법이 sulforaphane의 분석을 위한 특이성이 있음을 의미한다.

Fig. 1. Chromatograms of the HPLC elutionprofile of sulforaphane from L-sulforaphane. (A) Standard, (B) Cabbage drink sample.

직선성 확인

직선성이란 분석 대상인 특정 성분의 농도 또는 양에 비례하여 일정 범위 내에 직선적인 측정값을 의미한다. 식품의약품안전처의 밸리데이션 가이드라인에서는 시험방법에서 정하는 모든 범위에 관해 규정한 농도 범위에서 최소 5개 이상의 표준액을 조제하여 실험을 진행하고 그에 대한 직선성이 확인되어야 한다고 제시하고 있다(MFDS, 2015). 십자화과 채소의 sulforaphane 함량을 측정하기 위해 5, 10, 20, 40, 50, 100, 500, 1,000, 2,000 μg/mL sulforaphane 표준용액을 조제하여 3회 반복 분석하였다. 검출된 sulforaphane 피크 면적을 통하여 검량선을 작성하였으며 상관계수(R2)는 각각 0.9994, 0.9998, 1로 높은 직선성이 나타나 분석에 적합함이 확인되었다(Fig. 2).

Fig. 2. Calibration curves of sulforaphane standard solutions.

정밀성 확인

실험실 내 정밀성은 실험실 내에서 분석 일자, 분석자, 분석기구 등을 달리하여 각 시험 결과의 근접성을 확인하는 것으로, 본 연구는 분석, 시료 농도를 변동요인으로 분석법 검증 시료인 양배추와 양배추의 sulforaphane 함량을 측정하였다(Table 2). 양배추는 유효성분들의 소화 흡수를 돕기 위해 착즙액 형태로 주로 출시되고 있으며, 위염 증상을 완화하는 효능을 가지고 십자화과 채소 중 S-methyl-L-methionine, sulforaphane 등과 같은 식이황화합물을 다량으로 함유하는 채소로 알려져 있다(Hong 등, 2013; Li 등, 2012). 정밀성 확인을 위해

Table 2 . Intermediate precision of analytical method for sulforaphane of cabbage and cabbage drink

Sample (mg)Mean±SD (mg/100 g)RSD3) (%)
Intra-dayCabbage drink2,50012.77±0.561)4.36
5,00013.74±0.453.30
Cabbage2,5005.62±0.010.15
5,0005.36±0.030.48
Inter-dayCabbage drink2,50013.03±0.032)0.21
5,00013.95±0.060.46
Cabbage2,5005.61±0.040.67
5,0005.36±0.030.56

1)Values are mean±standard deviation (SD) in triplicate (n=3).

2)Values are mean±SD in triplicate per day for three days (n=9).

3)Relative standard deviation.



동일한 조건으로 일내 및 일간으로 구분하였으며, 3일간 3회 반복하여 50, 100 mg/mL 2가지 농도의 분석법 검증 시료를 HPLC로 sulforaphane 함량을 분석하였다. 분석 일자와 시료 농도를 달리하여 분석한 결과, 일내 정밀성에서 양배추즙의 sulforaphane 함량은 12.77±0.56, 13.74±0.45 mg/100 g을 나타내었고 양배추는 5.62±0.01, 5.36±0.03 mg/100 g을 나타내었다. 일간 정밀성에서 양배추즙은 13.03±0.03, 13.95±0.06 mg/100 g을 나타내었고 양배추는 5.61±0.04, 5.36±0.03 mg/100 g을 나타내었다. 상대표준편차값은 일내 정밀성 0.15~4.36%로 나타났으며, 일간 정밀성은 0.21~0.67%로 5% 이하의 우수한 정밀성을 나타내었다. Campas-Baypoli 등(2010)은 브로콜리 꽃과 줄기의 sulforaphane을 측정한 분석법의 검증 결과로 반복성과 재현성의 상대표준편차값은 일내 정밀성 2.1%, 일간 정밀성은 3.0~4.0%로 나타났다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 분석한 sulforaphane의 상대표준편차값은 기존에 보고된 sulforaphane 값보다 우수한 값으로 본 분석법의 정밀성은 매우 우수한 것으로 판단된다.

검출한계 및 정량한계

검출한계는 균질화된 검체 중 존재하는 분석 대상물질의 최소한의 검출 가능한 양을 뜻하며, 정량한계는 적절한 정밀성과 정확성을 가진 검체 중 정량값으로 표현할 수 있는 분석 대상물질의 최소량을 나타낸다. 직선성 확인 표준용액을 HPLC로 분석하고, 그 결과로 검량선을 작성하여 검량선의 기울기와 y-절편을 산출하고 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법(standard deviation of the response of y-intercepts and the slope)으로 검출한계와 정량한계를 계산하였다(Table 3). 직선상의 검출한계는 0.88 μg/mL였으며 정량한계는 2.68 μg/mL로 나타났다.

Table 3 . Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of sulforaphane

Concentration range (μg/mL)5∼2,000
S1)1,695.2
σ2)453.71
LOD (μg/mL)0.88
LOQ (μg/mL)2.68

1)The slope of the calibration curve.

2)The standard deviation of the response.



십자화과 채소의 sulforaphane 함량

이전 연구 보고에 따르면 sulforaphane과 같은 isothiocyanates는 myrosinase의 작용에 의해 생성되는데, 완전히 마쇄한 브로콜리를 상온에 일정 시간 방치하여 myrosinase가 glucosinolate에 충분히 작용하여 sulforaphane이 최대한 생성되도록 하면서 재분해가 일어나지 않도록 하는 것이 중요하다(Kawakishi와 Namiki, 1969; Kim 등, 1997). 본 연구에서는 균질화 후 30분간 실온에 방치하여 충분한 myrosinase의 작용을 유도한 후 추출 및 분석을 진행하였다. 본 연구에서 확립된 분석법을 이용하여 국내산 십자화과 채소의 sulforaphane 함량을 분석한 결과는 Table 4와 같다. 분석 결과는 각 성분의 피크를 적분하여 area를 측정하였고 area는 calibration curve의 식을 이용하여 mg/100 g의 단위로 나타내었다. 신선한 십자화과 채소의 함량은 1.37±0.01~9.79±0.06 mg/100 g 범위로 존재하였고 가장 많은 함량을 보인 것은 무순이었다. 냉동 보관된 십자화과 채소의 함량은 1.37±0.01~7.23±0.36 mg/100 g으로 나타났으며 브로콜리가 sulforaphane을 가장 많이 함유하고 있었다. 이전

Table 4 . Content of sulforaphan in various cruciferous vegetables

FormVegetablesSulforaphane (mg/100 g)
FreshBroccoli2.07±0.02e
Broccoli sprouts2.21±0.11e
Cauliflower1.37±0.01f
Brussels sprouts3.64±0.03d
Cabbage4.33±0.05c
Radish5.17±0.02b
Radish sprout9.79±0.06a

FrozenBroccoli7.23±0.36a
Cauliflower2.84±0.17b
Brussels sprouts1.77±0.06c
Radish1.37±0.01c

Different letters (a-f) in the same row indicate statistically significant differences (Tukey’s HSD, n=3, P<0.05).



연구에 따르면 Kim 등(2009)은 신선한 브로콜리 sulforaphane 함량을 HPLC-UV로 꽃과 줄기로 나누어 비교했을 때 꽃은 1.48±0.01 mg/100 g, 줄기는 0.62±0.03 mg/100 g으로 보고하였고, Choi 등(2008)은 브로콜리에서 14.90±0.04 mg/100 g, 양배추는 6.79±0.00 mg/100 g, 무에서 3.54±0.05 mg/100 g으로 보고하였다. 본 연구에서 분석된 브로콜리 suforaphane 함량과의 차이를 확인하였다. 이러한 다양한 브로콜리의 sulforaphane 함량 차이는 브로콜리의 품종, 부위, 재배 시기, 재배지역, 균질화 후 방치시간 및 추출방법 등의 차이에 기인한 것이라고 판단된다.

Choi 등(2009)은 무의 sulforaphane 함량을 GC-MS로 분석하여 2.02 mg/100 g으로 보고하였고, Kim 등(1997)도 GC-MS를 활용하여 십자화과 채소의 sulforaphane 함량을 분석한 결과, 무는 0.55~0.88 mg/100 g, 양배추는 0.76 mg/100 g, 콜리플라워는 0.52 mg/100 g 검출되었고 무순에서는 검출되지 않았다고 보고하였다. 본 연구에서 무는 5.17±0.02 mg/100 g, 양배추는 4.33±0.05 mg/100 g, 냉동 콜리플라워는 2.84±0.17 mg/100 g, 신선한 콜리플라워는 1.37±0.01 mg/100 g, 무순은 9.79±0.06 mg/100 g을 나타내었다. 본 연구에서는 브로콜리를 제외한 대부분의 십자화과 채소 내 sulforaphane 함량이 이전 연구보다 높게 측정되었다. 그 이유는 시료의 전처리 과정 중 myrosinase가 glucosinolate에 충분히 작용하도록 균질화 후 상온에서 30분간 방치하여 sulforaphane이 최대한 생성될 수 있도록 유도한 것이 원인으로 추정된다. Kim 등(1997)은 마쇄한 채소즙의 sulforaphane 함량이 실온에 30분 방치했을 때 증가율이 가장 높았으며 30분 이후부터는 증가율이 낮아졌다고 보고하였다. González 등(2021)은 분쇄한 브로콜리를 60분 동안 배양하여 myrosinase에 의한 glucosinolate 분해를 유도하였다. 이외에도 십자화과 채소에 함유된 sulforaphane은 품종에 따라 다를 수 있으며, 재배되는 토양, 기후, 보관온도 및 조리・가공 정도의 영향에 의해 차이가 나는 것으로 추측된다(Fenwick과 Heaney, 1983).

신선한 상태와 냉동상태의 십자화과 채소 내 sulforaphane 함량을 비교한 결과는 Fig. 3과 같다. 브로콜리와 콜리플라워의 sulforaphane 함량은 신선한 상태보다 냉동상태에서 유의적으로 더 높은 값을 나타냈다. 본 연구에서 냉동 브로콜리는 7.23±0.36 mg/100 g, 신선한 브로콜리는 2.07±0.02 mg/100 g으로 측정되었다. 브로콜리는 높은 호흡률과 증산율이 높아 부패하기 쉽기 때문에 유통기한을 연장하고 품질을 유지하기 위해 냉동상태로 보관하는 것이 효과적인 방법 중 하나이다(Brennan과 Shewfelt, 1989; Tosun과 Yücecan, 2008). Makino 등(2019)

Fig. 3. Sulforaphane contents between fresh and frozen cruciferous vegetables (n=3, *P<0.05).

냉동보관 후 브로콜리의 sulforaphane 함량이 감소하지 않았지만 냉장보관 시 sulforaphane의 함량이 감소했다고 보고하였다. Rodrigues와 Rosa(1999)는 냉동보관이 브로콜리의 glucosinolate 및 주요 건강증진 화합물을 보존하는 방법이라고 제시했으며, Wang 등(2021a)은 브로콜리의 보관온도 0~10°C에서의 glucosinolate의 함량을 측정했을 때 온도가 낮아질수록 높은 glucosinolate와 sulforaphane 함량을 보고하였다. 본 연구에서 신선한 상태보다 냉동상태의 브로콜리가 sulforaphane이 더 많이 측정된 이유로 냉동상태에서 myrosinase의 활성이 억제되어 glucosinolate 분해를 지연시켰기 때문으로 생각되며, 신선한 상태의 브로콜리는 유통과정 중 sulforaphane이 분해되어 보다 낮은 값을 나타낸 것으로 판단된다.

반면 방울양배추의 sulforaphane 함량은 냉동된 상태보다 신선한 상태에서 유의적으로 더 높았다. Cieślik 등(2007)은 신선한 상태의 십자화과 채소를 데친 후 냉동했을 때 방울양배추는 50.7%의 glucosinolate의 손실률을 나타내었으나 그린 콜리플라워와 브로콜리에서 각각 20.9% 및 28.5%의 증가율을 보고하였다. 데치기는 냉동채소 가공의 기본 절차로 물이나 증기 열을 활용하여 분해 효소를 비활성화함으로써 제품의 유통기한을 연장하는 단계이다(Wang 등, 2020). Korus 등(2014)은 냉동채소 가공 과정 중 데친 후 동결 과정에서 높은 glucosinolate 손실을 초래할 수 있다고 보고하였으며, Jha 등(2019)은 채소가 냉동되는 과정에서 물의 부피가 팽창하여 얼음 결정을 형성하는데, 식물 세포 또는 조직의 손상으로 인해 glucosinolate의 손실로 이어질 수 있다고 보고하였다.

본 연구 결과는 HPLC-UV를 사용한 분석법 검증과 국내에서 소비되는 십자화과 채소의 sulforaphane 함량에 대한 차이를 알아봄으로써 추후 원료 제품의 품질을 평가하기 위한 기초 데이터로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

본 연구에서는 국내에서 소비되고 있는 십자화과 채소의 sulforaphane 함량 차이를 HPLC-UV를 이용하여 분석을 진행하였다. 분석법 검증은 LOD, LOQ, 직선성, 특이성, 정밀성을 평가하여 검증하였다. 분석법 검증 결과 표준용액의 머무름시간과 십자화과 채소 추출물의 머무름시간이 일치하여 특이성을 나타냈으며, sulforaphane 표준품 검량선의 결정계수 값이 0.999 이상으로 나타나 높은 직선성을 보였다. 일간 정밀도와 일내 정밀도에서는 0.15~4.36%의 정밀성을 나타내었다. 검출한계는 0.88 μg/mL, 정량한계는 2.68 μg/mL로 나타났다. 십자화과 채소를 dichloromethane으로 추출하여 sulforaphane 함량을 분석한 결과, 무순에 9.79±0.06 mg/100 g으로 가장 많이 함유되어 있었다. 신선한 상태와 냉동상태의 십자화과 채소 내 sulforaphane 함량을 비교하였을 때 브로콜리와 콜리플라워는 냉동된 상태에서 신선한 상태보다 sulforaphane의 함량이 유의적으로 더 높게 나타났으며, 방울양배추는 신선한 상태에서 냉동상태보다 유의적으로 더 높은 sulforaphane 함량을 나타내었다. 본 연구에서 분석된 자료는 원료와 제품의 품질을 평가하기 위한 데이터로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

본 논문은 농촌진흥청 연구사업(과제번호:RS-2022-RD010244)의 지원에 의해 이루어진 것임.

  1. Amina HM, Ahmad GR, Bhatti GR, et al. Microscopic investigation of pollen morphology of Brassicaceae from Central Punjab-Pakistan. Microsc Res Tech. 2020. 83:446-454.
    Pubmed CrossRef
  2. Brennan PS, Shewfelt RL. Effect of cooling delay at harvest on broccoli quality during postharvest storage. J Food Qual. 1989. 12:13-22.
    CrossRef
  3. Campas-Baypoli ON, Sánchez-Machado DI, Bueno-Solano C, et al. HPLC method validation for measurement of sulforaphane level in broccoli by-products. Biomed Chromatogr. 2010. 24:387-392.
    Pubmed CrossRef
  4. Chen Y, Wang MH, Zhu JY, et al. TAp63α targeting of Lgr5 mediates colorectal cancer stem cell properties and sulforaphane inhibition. Oncogenesis. 2020. 9:89. https://doi.org/10.1038/s41389-020-00273-z.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  5. Chikara S, Nagaprashantha LD, Singhal J, et al. Oxidative stress and dietary phytochemicals: Role in cancer chemoprevention and treatment. Cancer Lett. 2018. 413:122-134.
    Pubmed CrossRef
  6. Choi AR, Lee GS, Chae HJ. Effects of ultrasonication on the analysis of sulforaphane content in vegetables. Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society. 2008. 9:794-799.
    CrossRef
  7. Choi SJ, Choi AR, Cho E, et al. The glucosinolate and sulforaphane contents of land race radish and wild race radish extracts and their inhibititory effects on cancer cell lines. J East Asian Soc Diet Life. 2009. 19:558-563.
  8. Cieślik E, Leszczyńska T, Filipiak-Florkiewicz A, et al. Effects of some technological processes on glucosinolate contents in cruciferous vegetables. Food Chem. 2007. 105:976-981.
    CrossRef
  9. Cole RA. Isothiocyanates, nitriles and thiocyanates as products of autolysis of glucosinolates in Cruciferae. Phytochemistry. 1976. 15:759-762.
    CrossRef
  10. Fenwick GR, Heaney RK. Glucosinolates and their breakdown products in cruciferous crops, foods and feedingstuffs. Food Chem. 1983. 11:249-271.
    CrossRef
  11. González F, Quintero J, Del Río R, et al. Optimization of an extraction process to obtain a food-grade sulforaphane-rich extract from broccoli (Brassica oleracea var. italica). Molecules. 2021. 26:4042. https://doi.org/10.3390/molecules26134042.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  12. Guerrero-Beltrán CE, Mukhopadhyay P, Horváth B, et al. Sulforaphane, a natural constituent of broccoli, prevents cell death and inflammation in nephropathy. J Nutr Biochem. 2012. 23:494-500.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  13. Guo L, Yang R, Zhou Y, et al. Heat and hypoxia stresses enhance the accumulation of aliphatic glucosinolates and sulforaphane in broccoli sprouts. Eur Food Res Technol. 2016. 242:107-116.
    CrossRef
  14. Hanschen FS. Domestic boiling and salad preparation habits affect glucosinolate degradation in red cabbage (Brassica oleracea var. capitata f. rubra). Food Chem. 2020. 321:126694. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.126694.
    Pubmed CrossRef
  15. Hong YJ, Kim SY, Han J, et al. Inhibitory effects of cabbage juice and cabbage-mixed juice on the growth of AGS human gastric cancer cells and on HCl-ethanol induced gastritis in rats. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2013. 42:682-689.
    CrossRef
  16. Jeong MS, Cho SJ. Assessment of the nutritional and antioxidant properties of five Brassicaceae (Cruciferae) vegetable by-products. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2022. 51:1166-1170.
    CrossRef
  17. Jha PK, Xanthakis E, Chevallier S, et al. Assessment of freeze damage in fruits and vegetables. Food Res Int. 2019. 121:479-496.
    Pubmed CrossRef
  18. Kawakishi S, Namiki M. Decomposition of allyl isothiocyanate in aqueous solution. Agr Biol Chem. 1969. 33:452-459.
    CrossRef
  19. Kim CR, Lim YS, Lee SW, et al. Identification and quantification of glucosinolates in rocket salad (Eruca sativa). Korean Journal of Agricultural Science. 2011. 38:285-294.
  20. Kim JY, Park SH, Lee KT. Sulforaphane content and antioxidative effect of cooked broccoli. J East Asian Soc Diet Life. 2009. 19:564-569.
  21. Kim MR, Lee KJ, Kim JH, et al. Determination of sulforaphane in cruciferous vegetables by SIM. Korean J Food Sci Technol. 1997. 29:882-887.
  22. Kim Y, Kim SJ. Effect of dry heat treatment on sulforaphane contents and antioxidant capacities in broccoli seeds and florets. Korean J Food Sci Technol. 2023. 55:494-501.
    CrossRef
  23. Ko MO, Ko YJ, Kim MB, et al. Antibacterial activity of isothiocyanates from cruciferous vegetables against pathogenic bacteria in olive flounder. Korean J Food Preserv. 2015. 22:886-892.
    CrossRef
  24. Korus A, Słupski J, Gębczyński P, et al. Effect of preliminary processing and method of preservation on the content of glucosinolates in kale (Brassica oleracea L. var. acephala) leaves. LWT-. Food Sci Technol. 2014. 59:1003-1008.
    CrossRef
  25. Kurilich AC, Tsau GJ, Brown A, et al. Carotene, tocopherol, and ascorbate contents in subspecies of Brassica oleracea. J Agric Food Chem. 1999. 47:1576-1581.
    Pubmed CrossRef
  26. Li Z, Liu Y, Fang Z, et al. Development and verification of sulforaphane extraction method in cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata) and broccoli (Brassica oleracea L. var. italica Planch.). J Med Plants Res. 2012. 6:4796-4803.
    CrossRef
  27. Liu P, Atkinson SJ, Akbareian SE, et al. Sulforaphane exerts anti-angiogenesis effects against hepatocellular carcinoma through inhibition of STAT3/HIF-1α/VEGF signalling. Sci Rep. 2017. 7:12651. https://doi.org/10.1038/s41598-017-12855-w.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  28. Makino Y, Hashizume M, Boerzhijin S, et al. Influence of cold or frozen storage on temporal changes in sulforaphane and objective taste values of broccoli (Brassica oleracea var. italica) florets. Environ Control Biol. 2019. 57(3):45-51.
    CrossRef
  29. Matusheski NV, Juvik JA, Jeffery EH. Heating decreases epithiospecifier protein activity and increases sulforaphane formation in broccoli. Phytochemistry. 2004. 65:1273-1281.
    Pubmed CrossRef
  30. Rodrigues AS, Rosa EAS. Effect of post-harvest treatments on the level of glucosinolates in broccoli. J Sci Food Agric. 1999. 79:1028-1032.
    CrossRef
  31. Sangthong S, Weerapreeyakul N. Simultaneous quantification of sulforaphene and sulforaphane by reverse phase HPLC and their content in Raphanus sativus L. var. caudatus Alef extracts. Food Chem. 2016. 201:139-144.
    Pubmed CrossRef
  32. Shin GH, Lee YJ, Kim JH, et al. Antioxidant activities of commonly used Brassica spp. sprout vegetables in Korea. J Korean Food Preserv. 2014. 21:587-592.
    CrossRef
  33. Tosun BN, Yücecan S. Influence of commercial freezing and storage on vitamin C content of some vegetables. Int J Food Sci Technol. 2008. 43:316-321.
    CrossRef
  34. Wang H, Zhang Q, Mujumdar AS, et al. High-humidity hot air impingement blanching (HHAIB) efficiently inactivates enzymes, enhances extraction of phytochemicals and mitigates brown actions of chili pepper. Food Control. 2020. 111:107050. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2019.107050.
    CrossRef
  35. Wang J, Mao S, Yuan Y, et al. Effect of storage conditions and cooking methods on chlorophyll, glucosinolate, and sulforaphane content in broccoli florets. Horticulturae. 2021a. 7:519. https://doi.org/10.3390/horticulturae7120519.
    CrossRef
  36. Wang Y, Wu H, Dong N, et al. Sulforaphane induces S-phase arrest and apoptosis via p53-dependent manner in gastric cancer cells. Sci Rep. 2021b. 11:2504. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81815-2.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  37. Yang R, Guo L, Zhou Y, et al. Calcium mitigates the stress caused by ZnSO4 as a sulphur fertilizer and enhances the sulforaphane formation of broccoli sprouts. RSC Adv. 2015. 5:12563-12570.
    CrossRef

Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(4): 385-391

Published online April 30, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.385

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

십자화과 채소의 Sulforaphane 분석 및 분석법 검증

박사무엘1․김급래1․김건오1․김헌웅2․이창주3․성지혜1

1안동대학교 식품생명공학과
2국립농업과학원 농식품자원부
3원광대학교 식품생명공학과

Received: February 13, 2024; Revised: March 13, 2024; Accepted: March 14, 2024

Method Validation for the Determination of Sulforaphane in Cruciferous Vegetables

Samuel Park1 , Keup-rae Kim1, Keono Kim1 , Heon-Woong Kim2, Chang Joo Lee3 , and Jeehye Sung1

1Department of Food Science and Biotechnology, Andong National University
2National Institute of Agricultural Sciences, Rural Development Administration
3Department of Food Science and Biotechnology, Wonkwang University

Correspondence to:Jeehye Sung, Department of Food Science and Biotechnology, Andong National University, 1375, Gyeongdong-ro, Andong, Gyeongbuk 36729, Korea, E-mail: jeehye@andong.ac.kr

Received: February 13, 2024; Revised: March 13, 2024; Accepted: March 14, 2024

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Sulforaphane, a phytochemical mainly derived from cruciferous vegetables, possesses anti-oxidative and anti-inflammatory properties. There is a lack of information about the changes in the sulforaphane content of cruciferous vegetables caused by processing conditions such as freezing and drying. Hence, this study investigated the sulforaphane levels of fresh, frozen or dried cruciferous vegetables and cabbage drinks. The results showed that the sulforaphane contents of the fresh samples varied from 0.62±0.00 mg/100 g (cauliflower) to 9.79±0.06 mg/100 g (radish sprout). The sulforaphane levels were significantly higher in frozen broccoli and cauliflower than in fresh samples, whereas the opposite trend was observed in Brussels sprouts and radishes. Although the sulforaphane levels of cabbage and cabbage drinks were 5.36±0.05∼5.62±0.01 mg/100 g and 12.77±0.56∼13.95±0.06 mg/100 g, respectively, sulforaphane was not detected in cabbage powder. The sulforaphane content may be highly vulnerable to drying conditions. Thus, our observations suggest that the sulforaphane contents of cruciferous vegetables could be affected by the processing methods.

Keywords: cruciferous vegetables, sulforaphane, HPLC-UV, method validation

서 론

십자화과 채소는 쌍떡잎식물로 북반구 온대나 한대에 주로 분포하며, 350개의 속, 3,000여 종이 보고되어 있다(Amina 등, 2020). 국내에서 식품으로 소비되는 십자화과 채소는 콜라비, 적무, 브로콜리, 배추, 유채, 무순 및 다채 등으로 소비량이 점차 증가하며 이를 활용한 식품들의 인기도 증가하고 있다(Ko 등, 2015; Shin 등, 2014). 십자화과 채소 섭취 증가는 췌장암, 폐암, 대장암 등 다양한 암의 발병 위험을 낮추며 산화스트레스에 대한 보호 효과가 보고되어 있다(Chikara 등 2018; Guerrero-Beltrán 등, 2012).

십자화과 채소에는 생리활성 물질로 알려진 β-carotene, rutin과 같은 phenolic compound뿐만 아니라 sulforaphane과 같은 식이황화합물이 풍부하게 함유되어 있다(Kurilich 등, 1999; Sangthong과 Weerapreeyakul, 2016). 특히 식이황화합물인 glucosinolates는 비활성인 상태로 존재하다가 채소가 가공되는 과정에서 가수분해 효소인 myrosinase의 활성에 의해 당이 가수분해됨으로써 thiohydroximate-O-sulfate와 같은 중간체를 형성하여 생리활성을 나타내는 isothiocyanates, thiocyanates와 같은 성분으로 치환된다(Hanschen, 2020; Kim 등, 2011). 십자화과 채소 중 대표적인 식이황화합물인 sulforaphane은 glucoraphanin이 분해됨으로써 sulforaphane nitrile과 함께 생성되며, 항암, 항염증, 항균 및 심장보호 효능이 뛰어나다고 보고되었다(Cole, 1976; Guo 등, 2016; Jeong과 Cho, 2022; Matusheski, 2004; Yang 등, 2015). 십자화과 채소의 주된 생리활성 효능은 항암효과로 알려져 있으며 이는 sulforaphane이 크게 기여한다(Chen 등, 2020; Liu 등, 2017; Wang 등, 2021b). 십자화과 채소에 함유된 sulforaphane의 함량은 품종, 재배 조건, 수확시기, 가공조건 등과 같은 다양한 요인들에 의해 영향을 받는다(Fenwick과 Heaney, 1983). Sulforaphane은 쉽게 파괴되는 특성이 있어 주로 조리 및 가공방법에 따른 함량 변화에 관한 연구가 주로 진행됐다.

현재까지 국내에서 재배되는 채소류 내 sulforaphane 함량을 분석하기 위한 방법으로는 주로 gas chromatography/mass detector(GC/MS)와 high performance liquid chromatography(HPLC)를 사용하여 연구가 진행되었다. Kim 등(1997)은 브로콜리, 순무, 무, 양배추 등 여러 종류의 십자화과 채소를 dichloromethane으로 추출하여 GC-MS를 통해 sulforaphane 함량을 분석하였고, Choi 등(2008)은 십자화과 채소를 초음파 처리하여 GC-MS를 통해 무, 양배추, 브로콜리의 sulforaphane 함량을 분석하였다. Kim과 Kim(2009)은 조리 방법 차이에 따른 브로콜리의 sulforaphane의 함량을 HPLC-UV를 통해 분석하였으며, Kim과 Kim(2023)은 열처리에 따른 브로콜리 종자와 꽃 부위의 sulforaphane 함량 차이를 HPLC-UV를 통해 비교 분석하였다. 이와 같이 국내에서 소비되는 십자화과 채소의 sulforaphane 함량 분석은 주로 브로콜리와 무를 중점으로 진행되었으며, 유통되는 다양한 십자화과 채소들의 sulforaphane 함량을 비교・분석한 연구는 미비하다. 십자화과 채소의 우수한 기능성으로 인하여 십자화과 채소를 활용한 건강기능식품 원료의 개발이 활발하게 진행되고 있으며, 이들 원료 제품의 품질을 평가하기 위해서는 십자화과 채소의 주된 지표성분인 sulforaphane에 대한 분석법 검증이 요구된다.

따라서 본 연구는 HPLC-UV 분석법을 이용하여 십자화과 채소의 sulforaphane 분석법을 검증하고, 국내에서 주로 소비되는 십자화과 채소들의 sulforaphane 함량을 비교・분석하였다.

재료 및 방법

실험재료 및 시약

본 실험에 사용된 방울양배추(Brassica oleracea var. gemmifera), 양배추(B. oleracea var. capitata), 브로콜리(B. oleracea var. italica), 브로콜리 새싹, 무(Raphanus sativus var. Longipinnatus), 무순, 콜리플라워(B. oleracea var. botrytis), 양배추즙 그리고 양배추 가루는 2022년 8월 국내 시장에서 구입하여 냉장보관 후 바로 분석에 사용하였으며 냉동 시료는 -20°C 냉동고에서 보관되었다. 분석 표준품으로 사용된 sulforaphane은 Sigma-Aldrich로부터 구입하여 사용하였으며 그 밖의 분석에 사용된 추출 용매 및 시약은 analytical 및 HPLC 등급을 사용하였다.

Sulforaphane 추출

십자화과 채소로부터 sulforaphane을 추출하기 위해 5 g의 십자화과 채소를 50 mL의 dichloromethane을 이용하여 homogenizer(DAIHAN Scientific Co.)로 5분간 균질화시킨 후 30분간 실온에서 반응하였다. 그 후 1.25 g anhydrous sodium sulfate를 첨가하여 반응시킨 뒤 0.22 μm nylon filter(Whatman)를 사용하여 고형물을 제거하였다. 고형물이 제거된 추출용액을 dichloromethane을 첨가하여 50 mL로 volume을 맞춰준 뒤 35°C에서 질소 농축하였고, 잔류물을 acetonitrile 1 mL로 재용해한 후 0.22 μm membrane filter로 여과하여 기기분석에 사용하였다.

Sulforaphane 분석 기기 및 조건

십자화과 채소에 함유된 sulforaphane은 UV detecter(Osaka soda)가 장착된 HPLC를 통해 분석되었으며 분석조건은 Table 1과 같다. 분석컬럼은 Shiseido capcellpak C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm)을 사용하였으며 검출기 파장은 254 nm, 컬럼 온도는 30°C를 유지하였다. 분석은 12분간 진행되었으며 이동상은 60% acetonitrile을 사용하였고, 유속은 1.0 mL/min이었으며 시료 주입량은 1회 10 μL였다.

Table 1 . Condition of HPLC analysis for quantitative analysis of sulforaphane.

ItemsConditions
InstrumentOsaka soda
DetectorUV 254 nm
ColumnShiseido capcellpak C18 (5 μm, 4.6 mm×250 mm)
Mobile phase60% acetonitrile
Flow rate1.0 mL/min
Injection volume10 μL
Column oven temperature30°C


표준용액의 제조

Sulforaphane의 표준품 5 mg을 정밀하게 취해 HPLC용 100% 메탄올 1 mL에 용해하여 5 mg/mL 농도의 stock standard solution을 조제하였다. 이를 분석조건 확립 및 유효성 검증 시험을 위해 연속적으로 시료를 100% acetonitrile을 사용해 희석하여 2, 1, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05 mg/mL 농도로 제조하였다.

분석법 검증

십자화과 채소 내 sulforaphane 분석법 검증은 개별인정형 건강기능식품 지표성분으로서 의약품 등 분석법의 밸리데이션에 대한 가이드라인을 근거로 하여 지표성분에 대한 특이성(specificity), 직선성(linearity) 및 정밀성(accuracy)을 조사하고 직선성 검증으로 구한 기울기(slope)와 표준편차(standard deviation)를 통해 검출한계(limit of detection, LOD)와 정량한계(limit of quantitation, LOQ)를 통하여 검증을 실시하였다(MFDS, 2015). 본 연구에서는 양배추와 양배추즙을 식이황화합물 분석법 검증 시료로 사용하였다.

특이성은 분석 대상이 다른 배합성분 등과 혼합된 경우 분석 대상을 선택적으로 검출할 수 있는 특성을 의미하며, 분석 대상인 sulforaphane 피크의 동일한 머무름시간(retention time)과 spectrum을 나타내는지를 HPLC 크로마토그램을 통해 확인하였다.

직선성은 분석 대상물질의 농도에 대해 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력을 말하는 것으로 표준물질을 5~2,000 μg/mL로 희석한 후 피크 면적과 각 농도 간의 검량선을 작성하여 기울기, y-절편(y-intercept) 및 상관계수(correlation coefficient, R2)를 통해 확인하였다.

각 성분에 대한 검출한계와 정량한계는 표준용액의 크로마토그램을 사용하였고, 검출한계 3.3×σ/s(σ: 표준편차, s: 표준검량선의 기울기), 정량한계 10×σ/s 식을 이용하여 계산하였다.

정밀성은 균질한 검체를 여러 번 정해진 조건에 따라 측정하였을 때 각각의 측정값들 사이의 근접성(분산 정도)을 의미하는 것으로, 십자화과 채소 내 sulforaphane 함량 분석 재현성을 실험하기 위해 HPLC를 3회 측정하여 피크 머무름시간과 피크 area의 반복 재현성(repeatability)을 확인하였다. 실험실 내 정밀성(intermediate prcecision)은 일내(intra-day) 및 일간(inter-day) 정밀성으로 3일간 반복하여 측정하고, 각 결괏값의 표준편차를 결괏값의 평균으로 나눈 상대표준편차(relative standard deviation, RSD%)로 정밀도를 판단하였다.

통계분석

통계분석은 GraphPad Prsim 8(GraphPad Software) 소프트웨어와 Statistical Analysis System(SAS 9.4 Institute Inc.)을 이용하여 실시하였다. 데이터 간 유의적인 차이는 t-test와 일원 분산분석(one-way ANOVA) 및 Tukey’s test를 통해 P<0.05 수준에서 검정하였다.

결과 및 고찰

특이성 검증

특이성이란 불순물 및 배합물 등의 혼합된 상태에서 분석 대상인 특정 성분을 선택적으로 정확하게 측정할 수 있는 능력으로, 대상 성분이 크로마토그램에 적절하게 표시되어 명확하게 확인할 수 있어야 한다. 표준용액인 sulforaphane의 머무름시간대는 3.036분에서 피크가 검출되었고, 양배추즙 시험용액의 크로마토그램에서는 sulforaphane의 머무름시간대가 2.977분으로 다른 물질의 간섭 없이 피크가 분리되어 검출된 것을 확인하였다(Fig. 1). 표준용액의 피크 유지시간과 양배추즙의 피크 유지시간이 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 시험법이 sulforaphane의 분석을 위한 특이성이 있음을 의미한다.

Fig 1. Chromatograms of the HPLC elutionprofile of sulforaphane from L-sulforaphane. (A) Standard, (B) Cabbage drink sample.

직선성 확인

직선성이란 분석 대상인 특정 성분의 농도 또는 양에 비례하여 일정 범위 내에 직선적인 측정값을 의미한다. 식품의약품안전처의 밸리데이션 가이드라인에서는 시험방법에서 정하는 모든 범위에 관해 규정한 농도 범위에서 최소 5개 이상의 표준액을 조제하여 실험을 진행하고 그에 대한 직선성이 확인되어야 한다고 제시하고 있다(MFDS, 2015). 십자화과 채소의 sulforaphane 함량을 측정하기 위해 5, 10, 20, 40, 50, 100, 500, 1,000, 2,000 μg/mL sulforaphane 표준용액을 조제하여 3회 반복 분석하였다. 검출된 sulforaphane 피크 면적을 통하여 검량선을 작성하였으며 상관계수(R2)는 각각 0.9994, 0.9998, 1로 높은 직선성이 나타나 분석에 적합함이 확인되었다(Fig. 2).

Fig 2. Calibration curves of sulforaphane standard solutions.

정밀성 확인

실험실 내 정밀성은 실험실 내에서 분석 일자, 분석자, 분석기구 등을 달리하여 각 시험 결과의 근접성을 확인하는 것으로, 본 연구는 분석, 시료 농도를 변동요인으로 분석법 검증 시료인 양배추와 양배추의 sulforaphane 함량을 측정하였다(Table 2). 양배추는 유효성분들의 소화 흡수를 돕기 위해 착즙액 형태로 주로 출시되고 있으며, 위염 증상을 완화하는 효능을 가지고 십자화과 채소 중 S-methyl-L-methionine, sulforaphane 등과 같은 식이황화합물을 다량으로 함유하는 채소로 알려져 있다(Hong 등, 2013; Li 등, 2012). 정밀성 확인을 위해

Table 2 . Intermediate precision of analytical method for sulforaphane of cabbage and cabbage drink.

Sample (mg)Mean±SD (mg/100 g)RSD3) (%)
Intra-dayCabbage drink2,50012.77±0.561)4.36
5,00013.74±0.453.30
Cabbage2,5005.62±0.010.15
5,0005.36±0.030.48
Inter-dayCabbage drink2,50013.03±0.032)0.21
5,00013.95±0.060.46
Cabbage2,5005.61±0.040.67
5,0005.36±0.030.56

1)Values are mean±standard deviation (SD) in triplicate (n=3)..

2)Values are mean±SD in triplicate per day for three days (n=9)..

3)Relative standard deviation..



동일한 조건으로 일내 및 일간으로 구분하였으며, 3일간 3회 반복하여 50, 100 mg/mL 2가지 농도의 분석법 검증 시료를 HPLC로 sulforaphane 함량을 분석하였다. 분석 일자와 시료 농도를 달리하여 분석한 결과, 일내 정밀성에서 양배추즙의 sulforaphane 함량은 12.77±0.56, 13.74±0.45 mg/100 g을 나타내었고 양배추는 5.62±0.01, 5.36±0.03 mg/100 g을 나타내었다. 일간 정밀성에서 양배추즙은 13.03±0.03, 13.95±0.06 mg/100 g을 나타내었고 양배추는 5.61±0.04, 5.36±0.03 mg/100 g을 나타내었다. 상대표준편차값은 일내 정밀성 0.15~4.36%로 나타났으며, 일간 정밀성은 0.21~0.67%로 5% 이하의 우수한 정밀성을 나타내었다. Campas-Baypoli 등(2010)은 브로콜리 꽃과 줄기의 sulforaphane을 측정한 분석법의 검증 결과로 반복성과 재현성의 상대표준편차값은 일내 정밀성 2.1%, 일간 정밀성은 3.0~4.0%로 나타났다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서 분석한 sulforaphane의 상대표준편차값은 기존에 보고된 sulforaphane 값보다 우수한 값으로 본 분석법의 정밀성은 매우 우수한 것으로 판단된다.

검출한계 및 정량한계

검출한계는 균질화된 검체 중 존재하는 분석 대상물질의 최소한의 검출 가능한 양을 뜻하며, 정량한계는 적절한 정밀성과 정확성을 가진 검체 중 정량값으로 표현할 수 있는 분석 대상물질의 최소량을 나타낸다. 직선성 확인 표준용액을 HPLC로 분석하고, 그 결과로 검량선을 작성하여 검량선의 기울기와 y-절편을 산출하고 반응의 표준편차와 검량선의 기울기에 근거하는 방법(standard deviation of the response of y-intercepts and the slope)으로 검출한계와 정량한계를 계산하였다(Table 3). 직선상의 검출한계는 0.88 μg/mL였으며 정량한계는 2.68 μg/mL로 나타났다.

Table 3 . Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of sulforaphane.

Concentration range (μg/mL)5∼2,000
S1)1,695.2
σ2)453.71
LOD (μg/mL)0.88
LOQ (μg/mL)2.68

1)The slope of the calibration curve..

2)The standard deviation of the response..



십자화과 채소의 sulforaphane 함량

이전 연구 보고에 따르면 sulforaphane과 같은 isothiocyanates는 myrosinase의 작용에 의해 생성되는데, 완전히 마쇄한 브로콜리를 상온에 일정 시간 방치하여 myrosinase가 glucosinolate에 충분히 작용하여 sulforaphane이 최대한 생성되도록 하면서 재분해가 일어나지 않도록 하는 것이 중요하다(Kawakishi와 Namiki, 1969; Kim 등, 1997). 본 연구에서는 균질화 후 30분간 실온에 방치하여 충분한 myrosinase의 작용을 유도한 후 추출 및 분석을 진행하였다. 본 연구에서 확립된 분석법을 이용하여 국내산 십자화과 채소의 sulforaphane 함량을 분석한 결과는 Table 4와 같다. 분석 결과는 각 성분의 피크를 적분하여 area를 측정하였고 area는 calibration curve의 식을 이용하여 mg/100 g의 단위로 나타내었다. 신선한 십자화과 채소의 함량은 1.37±0.01~9.79±0.06 mg/100 g 범위로 존재하였고 가장 많은 함량을 보인 것은 무순이었다. 냉동 보관된 십자화과 채소의 함량은 1.37±0.01~7.23±0.36 mg/100 g으로 나타났으며 브로콜리가 sulforaphane을 가장 많이 함유하고 있었다. 이전

Table 4 . Content of sulforaphan in various cruciferous vegetables.

FormVegetablesSulforaphane (mg/100 g)
FreshBroccoli2.07±0.02e
Broccoli sprouts2.21±0.11e
Cauliflower1.37±0.01f
Brussels sprouts3.64±0.03d
Cabbage4.33±0.05c
Radish5.17±0.02b
Radish sprout9.79±0.06a

FrozenBroccoli7.23±0.36a
Cauliflower2.84±0.17b
Brussels sprouts1.77±0.06c
Radish1.37±0.01c

Different letters (a-f) in the same row indicate statistically significant differences (Tukey’s HSD, n=3, P<0.05)..



연구에 따르면 Kim 등(2009)은 신선한 브로콜리 sulforaphane 함량을 HPLC-UV로 꽃과 줄기로 나누어 비교했을 때 꽃은 1.48±0.01 mg/100 g, 줄기는 0.62±0.03 mg/100 g으로 보고하였고, Choi 등(2008)은 브로콜리에서 14.90±0.04 mg/100 g, 양배추는 6.79±0.00 mg/100 g, 무에서 3.54±0.05 mg/100 g으로 보고하였다. 본 연구에서 분석된 브로콜리 suforaphane 함량과의 차이를 확인하였다. 이러한 다양한 브로콜리의 sulforaphane 함량 차이는 브로콜리의 품종, 부위, 재배 시기, 재배지역, 균질화 후 방치시간 및 추출방법 등의 차이에 기인한 것이라고 판단된다.

Choi 등(2009)은 무의 sulforaphane 함량을 GC-MS로 분석하여 2.02 mg/100 g으로 보고하였고, Kim 등(1997)도 GC-MS를 활용하여 십자화과 채소의 sulforaphane 함량을 분석한 결과, 무는 0.55~0.88 mg/100 g, 양배추는 0.76 mg/100 g, 콜리플라워는 0.52 mg/100 g 검출되었고 무순에서는 검출되지 않았다고 보고하였다. 본 연구에서 무는 5.17±0.02 mg/100 g, 양배추는 4.33±0.05 mg/100 g, 냉동 콜리플라워는 2.84±0.17 mg/100 g, 신선한 콜리플라워는 1.37±0.01 mg/100 g, 무순은 9.79±0.06 mg/100 g을 나타내었다. 본 연구에서는 브로콜리를 제외한 대부분의 십자화과 채소 내 sulforaphane 함량이 이전 연구보다 높게 측정되었다. 그 이유는 시료의 전처리 과정 중 myrosinase가 glucosinolate에 충분히 작용하도록 균질화 후 상온에서 30분간 방치하여 sulforaphane이 최대한 생성될 수 있도록 유도한 것이 원인으로 추정된다. Kim 등(1997)은 마쇄한 채소즙의 sulforaphane 함량이 실온에 30분 방치했을 때 증가율이 가장 높았으며 30분 이후부터는 증가율이 낮아졌다고 보고하였다. González 등(2021)은 분쇄한 브로콜리를 60분 동안 배양하여 myrosinase에 의한 glucosinolate 분해를 유도하였다. 이외에도 십자화과 채소에 함유된 sulforaphane은 품종에 따라 다를 수 있으며, 재배되는 토양, 기후, 보관온도 및 조리・가공 정도의 영향에 의해 차이가 나는 것으로 추측된다(Fenwick과 Heaney, 1983).

신선한 상태와 냉동상태의 십자화과 채소 내 sulforaphane 함량을 비교한 결과는 Fig. 3과 같다. 브로콜리와 콜리플라워의 sulforaphane 함량은 신선한 상태보다 냉동상태에서 유의적으로 더 높은 값을 나타냈다. 본 연구에서 냉동 브로콜리는 7.23±0.36 mg/100 g, 신선한 브로콜리는 2.07±0.02 mg/100 g으로 측정되었다. 브로콜리는 높은 호흡률과 증산율이 높아 부패하기 쉽기 때문에 유통기한을 연장하고 품질을 유지하기 위해 냉동상태로 보관하는 것이 효과적인 방법 중 하나이다(Brennan과 Shewfelt, 1989; Tosun과 Yücecan, 2008). Makino 등(2019)

Fig 3. Sulforaphane contents between fresh and frozen cruciferous vegetables (n=3, *P<0.05).

냉동보관 후 브로콜리의 sulforaphane 함량이 감소하지 않았지만 냉장보관 시 sulforaphane의 함량이 감소했다고 보고하였다. Rodrigues와 Rosa(1999)는 냉동보관이 브로콜리의 glucosinolate 및 주요 건강증진 화합물을 보존하는 방법이라고 제시했으며, Wang 등(2021a)은 브로콜리의 보관온도 0~10°C에서의 glucosinolate의 함량을 측정했을 때 온도가 낮아질수록 높은 glucosinolate와 sulforaphane 함량을 보고하였다. 본 연구에서 신선한 상태보다 냉동상태의 브로콜리가 sulforaphane이 더 많이 측정된 이유로 냉동상태에서 myrosinase의 활성이 억제되어 glucosinolate 분해를 지연시켰기 때문으로 생각되며, 신선한 상태의 브로콜리는 유통과정 중 sulforaphane이 분해되어 보다 낮은 값을 나타낸 것으로 판단된다.

반면 방울양배추의 sulforaphane 함량은 냉동된 상태보다 신선한 상태에서 유의적으로 더 높았다. Cieślik 등(2007)은 신선한 상태의 십자화과 채소를 데친 후 냉동했을 때 방울양배추는 50.7%의 glucosinolate의 손실률을 나타내었으나 그린 콜리플라워와 브로콜리에서 각각 20.9% 및 28.5%의 증가율을 보고하였다. 데치기는 냉동채소 가공의 기본 절차로 물이나 증기 열을 활용하여 분해 효소를 비활성화함으로써 제품의 유통기한을 연장하는 단계이다(Wang 등, 2020). Korus 등(2014)은 냉동채소 가공 과정 중 데친 후 동결 과정에서 높은 glucosinolate 손실을 초래할 수 있다고 보고하였으며, Jha 등(2019)은 채소가 냉동되는 과정에서 물의 부피가 팽창하여 얼음 결정을 형성하는데, 식물 세포 또는 조직의 손상으로 인해 glucosinolate의 손실로 이어질 수 있다고 보고하였다.

본 연구 결과는 HPLC-UV를 사용한 분석법 검증과 국내에서 소비되는 십자화과 채소의 sulforaphane 함량에 대한 차이를 알아봄으로써 추후 원료 제품의 품질을 평가하기 위한 기초 데이터로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

요 약

본 연구에서는 국내에서 소비되고 있는 십자화과 채소의 sulforaphane 함량 차이를 HPLC-UV를 이용하여 분석을 진행하였다. 분석법 검증은 LOD, LOQ, 직선성, 특이성, 정밀성을 평가하여 검증하였다. 분석법 검증 결과 표준용액의 머무름시간과 십자화과 채소 추출물의 머무름시간이 일치하여 특이성을 나타냈으며, sulforaphane 표준품 검량선의 결정계수 값이 0.999 이상으로 나타나 높은 직선성을 보였다. 일간 정밀도와 일내 정밀도에서는 0.15~4.36%의 정밀성을 나타내었다. 검출한계는 0.88 μg/mL, 정량한계는 2.68 μg/mL로 나타났다. 십자화과 채소를 dichloromethane으로 추출하여 sulforaphane 함량을 분석한 결과, 무순에 9.79±0.06 mg/100 g으로 가장 많이 함유되어 있었다. 신선한 상태와 냉동상태의 십자화과 채소 내 sulforaphane 함량을 비교하였을 때 브로콜리와 콜리플라워는 냉동된 상태에서 신선한 상태보다 sulforaphane의 함량이 유의적으로 더 높게 나타났으며, 방울양배추는 신선한 상태에서 냉동상태보다 유의적으로 더 높은 sulforaphane 함량을 나타내었다. 본 연구에서 분석된 자료는 원료와 제품의 품질을 평가하기 위한 데이터로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

감사의 글

본 논문은 농촌진흥청 연구사업(과제번호:RS-2022-RD010244)의 지원에 의해 이루어진 것임.

Fig 1.

Fig 1.Chromatograms of the HPLC elutionprofile of sulforaphane from L-sulforaphane. (A) Standard, (B) Cabbage drink sample.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 385-391https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.385

Fig 2.

Fig 2.Calibration curves of sulforaphane standard solutions.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 385-391https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.385

Fig 3.

Fig 3.Sulforaphane contents between fresh and frozen cruciferous vegetables (n=3, *P<0.05).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 385-391https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.385

Table 1 . Condition of HPLC analysis for quantitative analysis of sulforaphane.

ItemsConditions
InstrumentOsaka soda
DetectorUV 254 nm
ColumnShiseido capcellpak C18 (5 μm, 4.6 mm×250 mm)
Mobile phase60% acetonitrile
Flow rate1.0 mL/min
Injection volume10 μL
Column oven temperature30°C

Table 2 . Intermediate precision of analytical method for sulforaphane of cabbage and cabbage drink.

Sample (mg)Mean±SD (mg/100 g)RSD3) (%)
Intra-dayCabbage drink2,50012.77±0.561)4.36
5,00013.74±0.453.30
Cabbage2,5005.62±0.010.15
5,0005.36±0.030.48
Inter-dayCabbage drink2,50013.03±0.032)0.21
5,00013.95±0.060.46
Cabbage2,5005.61±0.040.67
5,0005.36±0.030.56

1)Values are mean±standard deviation (SD) in triplicate (n=3)..

2)Values are mean±SD in triplicate per day for three days (n=9)..

3)Relative standard deviation..


Table 3 . Limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) of sulforaphane.

Concentration range (μg/mL)5∼2,000
S1)1,695.2
σ2)453.71
LOD (μg/mL)0.88
LOQ (μg/mL)2.68

1)The slope of the calibration curve..

2)The standard deviation of the response..


Table 4 . Content of sulforaphan in various cruciferous vegetables.

FormVegetablesSulforaphane (mg/100 g)
FreshBroccoli2.07±0.02e
Broccoli sprouts2.21±0.11e
Cauliflower1.37±0.01f
Brussels sprouts3.64±0.03d
Cabbage4.33±0.05c
Radish5.17±0.02b
Radish sprout9.79±0.06a

FrozenBroccoli7.23±0.36a
Cauliflower2.84±0.17b
Brussels sprouts1.77±0.06c
Radish1.37±0.01c

Different letters (a-f) in the same row indicate statistically significant differences (Tukey’s HSD, n=3, P<0.05)..


References

  1. Amina HM, Ahmad GR, Bhatti GR, et al. Microscopic investigation of pollen morphology of Brassicaceae from Central Punjab-Pakistan. Microsc Res Tech. 2020. 83:446-454.
    Pubmed CrossRef
  2. Brennan PS, Shewfelt RL. Effect of cooling delay at harvest on broccoli quality during postharvest storage. J Food Qual. 1989. 12:13-22.
    CrossRef
  3. Campas-Baypoli ON, Sánchez-Machado DI, Bueno-Solano C, et al. HPLC method validation for measurement of sulforaphane level in broccoli by-products. Biomed Chromatogr. 2010. 24:387-392.
    Pubmed CrossRef
  4. Chen Y, Wang MH, Zhu JY, et al. TAp63α targeting of Lgr5 mediates colorectal cancer stem cell properties and sulforaphane inhibition. Oncogenesis. 2020. 9:89. https://doi.org/10.1038/s41389-020-00273-z.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  5. Chikara S, Nagaprashantha LD, Singhal J, et al. Oxidative stress and dietary phytochemicals: Role in cancer chemoprevention and treatment. Cancer Lett. 2018. 413:122-134.
    Pubmed CrossRef
  6. Choi AR, Lee GS, Chae HJ. Effects of ultrasonication on the analysis of sulforaphane content in vegetables. Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society. 2008. 9:794-799.
    CrossRef
  7. Choi SJ, Choi AR, Cho E, et al. The glucosinolate and sulforaphane contents of land race radish and wild race radish extracts and their inhibititory effects on cancer cell lines. J East Asian Soc Diet Life. 2009. 19:558-563.
  8. Cieślik E, Leszczyńska T, Filipiak-Florkiewicz A, et al. Effects of some technological processes on glucosinolate contents in cruciferous vegetables. Food Chem. 2007. 105:976-981.
    CrossRef
  9. Cole RA. Isothiocyanates, nitriles and thiocyanates as products of autolysis of glucosinolates in Cruciferae. Phytochemistry. 1976. 15:759-762.
    CrossRef
  10. Fenwick GR, Heaney RK. Glucosinolates and their breakdown products in cruciferous crops, foods and feedingstuffs. Food Chem. 1983. 11:249-271.
    CrossRef
  11. González F, Quintero J, Del Río R, et al. Optimization of an extraction process to obtain a food-grade sulforaphane-rich extract from broccoli (Brassica oleracea var. italica). Molecules. 2021. 26:4042. https://doi.org/10.3390/molecules26134042.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  12. Guerrero-Beltrán CE, Mukhopadhyay P, Horváth B, et al. Sulforaphane, a natural constituent of broccoli, prevents cell death and inflammation in nephropathy. J Nutr Biochem. 2012. 23:494-500.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  13. Guo L, Yang R, Zhou Y, et al. Heat and hypoxia stresses enhance the accumulation of aliphatic glucosinolates and sulforaphane in broccoli sprouts. Eur Food Res Technol. 2016. 242:107-116.
    CrossRef
  14. Hanschen FS. Domestic boiling and salad preparation habits affect glucosinolate degradation in red cabbage (Brassica oleracea var. capitata f. rubra). Food Chem. 2020. 321:126694. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.126694.
    Pubmed CrossRef
  15. Hong YJ, Kim SY, Han J, et al. Inhibitory effects of cabbage juice and cabbage-mixed juice on the growth of AGS human gastric cancer cells and on HCl-ethanol induced gastritis in rats. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2013. 42:682-689.
    CrossRef
  16. Jeong MS, Cho SJ. Assessment of the nutritional and antioxidant properties of five Brassicaceae (Cruciferae) vegetable by-products. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2022. 51:1166-1170.
    CrossRef
  17. Jha PK, Xanthakis E, Chevallier S, et al. Assessment of freeze damage in fruits and vegetables. Food Res Int. 2019. 121:479-496.
    Pubmed CrossRef
  18. Kawakishi S, Namiki M. Decomposition of allyl isothiocyanate in aqueous solution. Agr Biol Chem. 1969. 33:452-459.
    CrossRef
  19. Kim CR, Lim YS, Lee SW, et al. Identification and quantification of glucosinolates in rocket salad (Eruca sativa). Korean Journal of Agricultural Science. 2011. 38:285-294.
  20. Kim JY, Park SH, Lee KT. Sulforaphane content and antioxidative effect of cooked broccoli. J East Asian Soc Diet Life. 2009. 19:564-569.
  21. Kim MR, Lee KJ, Kim JH, et al. Determination of sulforaphane in cruciferous vegetables by SIM. Korean J Food Sci Technol. 1997. 29:882-887.
  22. Kim Y, Kim SJ. Effect of dry heat treatment on sulforaphane contents and antioxidant capacities in broccoli seeds and florets. Korean J Food Sci Technol. 2023. 55:494-501.
    CrossRef
  23. Ko MO, Ko YJ, Kim MB, et al. Antibacterial activity of isothiocyanates from cruciferous vegetables against pathogenic bacteria in olive flounder. Korean J Food Preserv. 2015. 22:886-892.
    CrossRef
  24. Korus A, Słupski J, Gębczyński P, et al. Effect of preliminary processing and method of preservation on the content of glucosinolates in kale (Brassica oleracea L. var. acephala) leaves. LWT-. Food Sci Technol. 2014. 59:1003-1008.
    CrossRef
  25. Kurilich AC, Tsau GJ, Brown A, et al. Carotene, tocopherol, and ascorbate contents in subspecies of Brassica oleracea. J Agric Food Chem. 1999. 47:1576-1581.
    Pubmed CrossRef
  26. Li Z, Liu Y, Fang Z, et al. Development and verification of sulforaphane extraction method in cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata) and broccoli (Brassica oleracea L. var. italica Planch.). J Med Plants Res. 2012. 6:4796-4803.
    CrossRef
  27. Liu P, Atkinson SJ, Akbareian SE, et al. Sulforaphane exerts anti-angiogenesis effects against hepatocellular carcinoma through inhibition of STAT3/HIF-1α/VEGF signalling. Sci Rep. 2017. 7:12651. https://doi.org/10.1038/s41598-017-12855-w.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  28. Makino Y, Hashizume M, Boerzhijin S, et al. Influence of cold or frozen storage on temporal changes in sulforaphane and objective taste values of broccoli (Brassica oleracea var. italica) florets. Environ Control Biol. 2019. 57(3):45-51.
    CrossRef
  29. Matusheski NV, Juvik JA, Jeffery EH. Heating decreases epithiospecifier protein activity and increases sulforaphane formation in broccoli. Phytochemistry. 2004. 65:1273-1281.
    Pubmed CrossRef
  30. Rodrigues AS, Rosa EAS. Effect of post-harvest treatments on the level of glucosinolates in broccoli. J Sci Food Agric. 1999. 79:1028-1032.
    CrossRef
  31. Sangthong S, Weerapreeyakul N. Simultaneous quantification of sulforaphene and sulforaphane by reverse phase HPLC and their content in Raphanus sativus L. var. caudatus Alef extracts. Food Chem. 2016. 201:139-144.
    Pubmed CrossRef
  32. Shin GH, Lee YJ, Kim JH, et al. Antioxidant activities of commonly used Brassica spp. sprout vegetables in Korea. J Korean Food Preserv. 2014. 21:587-592.
    CrossRef
  33. Tosun BN, Yücecan S. Influence of commercial freezing and storage on vitamin C content of some vegetables. Int J Food Sci Technol. 2008. 43:316-321.
    CrossRef
  34. Wang H, Zhang Q, Mujumdar AS, et al. High-humidity hot air impingement blanching (HHAIB) efficiently inactivates enzymes, enhances extraction of phytochemicals and mitigates brown actions of chili pepper. Food Control. 2020. 111:107050. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2019.107050.
    CrossRef
  35. Wang J, Mao S, Yuan Y, et al. Effect of storage conditions and cooking methods on chlorophyll, glucosinolate, and sulforaphane content in broccoli florets. Horticulturae. 2021a. 7:519. https://doi.org/10.3390/horticulturae7120519.
    CrossRef
  36. Wang Y, Wu H, Dong N, et al. Sulforaphane induces S-phase arrest and apoptosis via p53-dependent manner in gastric cancer cells. Sci Rep. 2021b. 11:2504. https://doi.org/10.1038/s41598-021-81815-2.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  37. Yang R, Guo L, Zhou Y, et al. Calcium mitigates the stress caused by ZnSO4 as a sulphur fertilizer and enhances the sulforaphane formation of broccoli sprouts. RSC Adv. 2015. 5:12563-12570.
    CrossRef