최근 식습관 변화 등의 원인으로 2020년 기준 국내 당뇨병 인구는 약 570만 명이고 당뇨병으로 이환될 수 있는 30세 이상의 당뇨병 전단계 인구 역시 약 1,497만 명으로 추정되고 65세 이상 인구 30.1%가 당뇨병으로 나타났다고 2022년 당뇨병학회 발표 자료에서 보고되었다. 이러한 당뇨병은 비만뿐 아니라 다른 만성질환 등의 합병증을 유발하여 사망 위험률을 2배 이상 증가시키는 등 많은 위험성이 문제시되고 있다(Mandavia 등, 2013). 이에 최근 혈당 기능 개선에 도움을 줄 수 있는 다양한 기능성 소재 개발 연구를 통해 2023년 10월 현재 ｢건강기능식품의 기준 및 규격｣에 등재된 기능성 원료는 69종이며, 식품의약품안전처에서는 2022년 건강기능식품 기능성 원료 인정 현황 분석 결과, 인정 원료가 총 45건으로 전년 대비 약 2배 증가했다고 밝혔다.

소나무는 신생대 제4기 홀로세 이래 우리나라 전역에 광범위하게 분포하는 소나무과(Pinaceae)에 속하는 대표적인 침엽수로 ‘대한민국 국가지도집’에 따르면 국내 산림의 21.9% 이상을 차지하고 있으며, 사계절 채취가 용이하고 솔잎, 꽃가루, 송진, 껍질 등 모든 부위가 식품 및 의약품 산업에서 다양한 소재로 활용되고 있다(Lee 등, 2004). 이 중 소나무의 잎인 솔잎은 초봄에서 초가을에 채취하여 생것을 그대로 사용하거나 건조하여 솔잎차, 솔잎 술 또는 솔잎가루로 활용되었으며, 민간요법과 한방의 약용식물로 주로 사용되고 있다(Kim 등, 2006). 특히, 솔잎은 방부, 살균 및 향기를 돋우는 효과 이외에 동맥경화증, 고혈압, 당뇨병, 신경통 등의 노화 관련 질환 예방과 성인병 치료에 사용되는 등 약리적 효능을 가진 기능성 소재로 활용되고 있다(Choi, 2009; Choi 등, 2007). 솔잎의 성분으로는 식이섬유소, 클로로필, 카로틴, 테르페노이드, 쿼세틴과 켐페롤 등의 플라보노이드류, 탄닌, 알칼로이드 화합물, α-oniene, β-pinene 및 camphene 등의 정유 성분과 다량의 페놀 화합물이 보고되고 있다(Lim 등, 2002). 또한 솔잎 중 올레오레진에 있는 테르페노이드의 연구 동향을 살펴보면 솔잎을 용매 추출하거나 건조하여 그 활성을 분석하는 연구들이 주를 이루고 있으며, 솔잎 착즙액을 제조한 후 이의 총 폴리페놀 함량, 항산화 활성, DNA 손상 억제능, 알파 글루코시데이즈 억제능, ACE 저해 활성 확인으로 솔잎 착즙액의 생리활성을 규명하였다(Kim 등, 2013; Lee 등, 2013; Park 등, 2013). 이처럼 현재 솔잎차, 솔잎즙, 솔잎 술 등으로 그 이용 가치가 확대되어 다양해지고, 국내에서도 다양한 기능성 소재로 많은 관심을 받고 있다(Son 등, 2015).

솔잎의 주요 성분 중 모노테르펜(C₁₀H₁₆)은 테르펜 계열 내에서 다양한 화합 물질로 구성되어 있고 주로 에센셜 오일의 화학적 전구체가 약 90% 구성하고 있으며 화학 구조 및 생물학적 활성이 매우 다양한 물질이라 할 수 있다. 모노테르펜 계열 중 본 연구에서 분석하고자 하는 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌 또한 식물 호르몬의 역할뿐 아니라 항균, 저혈압, 항염증 등 다양한 약리학적 기능이 있다고 알려져 있고, 식품 가공 중 부산물로 상업적으로 쉽게 얻을 수 있는 물질로 향미와 향료로 다양하게 사용되는 식품 소재라 할 수 있다(Kabir 등, 2020).

리모넨은 감귤류 껍질에 자연적으로 존재하는 성분이며 오렌지 주스 생산 시 부산물로 산업적으로 대량으로 얻어질 수 있는 모노테르펜(C₁₀H₁₆)으로 이중 결합과 고리 내 및 고리 외 부분을 특징으로 열, 빛, 산소에 노출되면 불안정한 성분으로 알려져 있다(Almatarneh 등, 2018; Son 등, 2015).

소나무 등에서 테르페노이드 성분을 추출하는 분석 방법은 주로 헥산 또는 기타 비극성 용매를 사용하여 추출하고 GC를 사용하여 정량화한다(Achotegui-Castells 등, 2013; Lewinsohn 등, 1993; Park 등, 2019). Allenspach 등(2020)은 솔잎에서 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌을 헵탄으로 추출한 후 가스크로마토그래피/불꽃이온화검출기를 이용하여 정량 분석하였고, Schimitberger 등(2018)은 후추를 헥산 추출하여 3-카렌, 리모넨과 테르피놀렌을 가스크로마토그래피/불꽃이온화검출기로 동시 분석하였으며, West 등(2016)은 솔잎에서 3-카렌과 테르피놀렌을 헥산으로 추출한 후 가스크로마토그래피/불꽃이온화검출기를 이용하여 분석하였다.

본 연구의 소재인 솔잎증류농축액은 기능성 원료로 2건(제2007-8호, 제2012-30호) 인정되었으며 기능성 내용은 ‘건강한 혈당의 유지에 도움을 줄 수 있음’이고 지표･기능성분은 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌으로 모노테르펜(monoterpene)류의 휘발성 유기화합물로 각각 특이적인 향을 갖고 있다.

또한 ｢건강기능식품 기능성 원료 및 기준･규격 인정에 관한 규정｣에 따라 인정된 기능성 원료는 인정받은 일로부터 6년이 경과하고, 품목제조 신고 50건 이상인 경우 고시형 원료로 등재가 가능하다고 ｢건강기능식품 기준 및 규격｣에서 규정하고 있어, 본 연구에서는 기능성 원료의 최근 5년 품목제조 보고 실적과 유통 판매되는 제품 현황 분석을 통해 고시형 원료 등재 가능성이 높은 솔잎증류농축액이 함유된 건강기능식품의 기능･지표성분의 규격 관리를 위한 표준화된 분석법을 마련하고자 하였다.

이에 본 연구에서는 개별인정형 원료로 인정받은 솔잎증류농축액(3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌) 분석 연구 자료 검토와 AOAC 밸리데이션 가이드라인에 따른 시험법 밸리데이션 및 건강기능식품 적용성 검토 등으로 규격 관리 시 3가지 성분을 동시 분석할 수 있는 시험법을 마련하여 분석의 편의성을 높이고 유통 중 제품 품질 관리의 효율성 향상과 최적의 분석법 확립을 목적으로 수행되었다.

재료 및 시약

3-카렌 표준품(Supelco 94415), 리모넨 표준품(Supelco 62118), 테르피놀렌 표준품(Supelco 43905)과 추출 시 사용한 헥산(GC급) 시약은 Sigma사로부터 구입하여 사용하였다.

본 연구에서 유통 중인 건강기능식품의 적용성 검토를 위해 사용된 검체는 인정된 기능성 원료(제2007-8호, 제2012-30호)가 주원료로 사용되면서 기능성과 함량에 적합한 제품을 대상으로 선정하고 2021년 기준 품목제조 보고된 총 29건 중 유통 판매량이 높은 제품 3종을 선정하여 시험에 사용하였다.

표준용액 조제

3-카렌 표준품, 리모넨 표준품, 테르피놀렌 표준품을 각각 100 mg 정밀하게 취해 헥산으로 완전히 녹인 후 10 mL 갈색부피플라스크에 정용한 용액을 표준원액으로 한다. 이 용액에 헥산을 가해 적정농도(3-카렌, 리모넨: 10, 50, 100, 200, 300 μg/mL, 테르피놀렌: 10, 100, 200, 300, 400 μg/mL)로 희석하여 표준용액으로 사용하였다.

시험용액 조제

리모넨으로 약 3.3 mg 이상 함유되도록 시료를 정밀하게 취해 헥산을 첨가하여 시료를 녹인다. 50 mL 갈색부피플라스크에 정용한 액을 시험원액으로 한다. 필요시 1,610×g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 사용하며, 이 용액을 헥산으로 적절히 희석한 액(표준용액 농도 10~400 μg/mL에 포함되도록)을 시험용액으로 사용하였다.

기기 분석 조건

3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌의 동시 분석을 위해 flame ionization detector(FID)가 장착된 GC-7890B(Agilent Co.)를 사용하였으며, 컬럼은 100% polyethylene glycol로 충진된 DB-WAX(길이 30 m×안지름 0.25 mm×필름두께 0.25 μm; Agilent Co.)를 사용하였다. 캐리어 가스는 헬륨(또는 질소)을 사용하여 1.0 mL/min으로 흘려주었으며, 주입부와 검출기 온도는 각각 220°C와 230°C로 설정하였고, 오븐 온도는 Table 1과 같이 설정하여 분석하였다.

Table 1 . Analysis parameters of GC for 3-carene, limonene, and terpinolene in sample.

Parameter	Conditions
Column	DB-WAX (30 m×0.25 mm×0.25 μm)
Inlet temp.	220°C
Detecter temp.	230°C
Oven temp.	50°C (2 min)－(8°C/min)－230°C (2 min)
Carrier gas	Helium (or nitrogen)
Flow rate	1.0 mL/min
Injection volume	1 μL
Split ratio	10:1

시험법 밸리데이션

특이성을 확인하기 위해 표준품과 시료에서의 분리도 및 머무름시간을 확인하였다. 직선성은 시료에서 성분이 검출되는 농도 범위를 중간값으로 설정하여 총 5개 농도(3-카렌, 리모넨: 10, 50, 100, 200, 300 μg/mL, 테르피놀렌: 10, 100, 200, 300, 400 μg/mL)를 검토하였으며, 표준용액만을 이용하여 산출하였고 시험 시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위해 각 농도에 대해서 3회 반복 시험을 시행하였다. 정확도는 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌을 함유하지 않은 공시료에 대하여 각각 다른 농도를 spiking/recovery 방법으로 회수되는 백분율을 통해 매트릭스 영향을 검토하였다. 표준물질 첨가법에 따라 공시료에 대하여 일정량의 시료를 채취하고, 표준용액을 각각 첨가 시 농도 범위에서 포함되도록(시험용액을 제조하여 측정되는 농도를 기준으로 3-카렌과 리모넨은 1, 2, 3배, 테르피놀렌은 0.5, 1, 1.5배로 표준용액을 첨가) 하였을 때 3-카렌 최종 농도 100, 200, 300 μg/mL, 리모넨 최종 농도 50, 100, 150 μg/mL, 테르피놀렌 최종 농도 100, 200, 300 μg/mL가 되도록 설정하여 진행하였다. 시료에 존재하는 참값과 가까운 농도를 시료에 추가하여 회수율을 측정하였다. 검출한계와 정량한계의 경우 표준용액을 3회 분석한 검량선의 기울기와 y-절편값을 이용하였다. 검량선 y-절편값의 표준편차에 3.3배를 곱한 값을 기울기 평균값으로 나눈 것을 검출한계, 10배를 곱한 값에 기울기 평균값으로 나눈 것을 정량한계로 설정하였다. 정밀도는 시료량의 변화에 대한 반복 정밀도(반복성, repeatability)를 확인하기 위해 1개의 표본 시료를 선정한 후 시료 50, 100, 200 mg을 각각 취하여 5회 반복 측정하였다. 마지막으로 실험실 간 재현성(reproducibility)을 확인하기 위해 3개 실험실에서 표본 시료를 5회 반복 측정하였다.

통계 처리

통계적 분석은 IBM SPSS Statistic(Version 26.0, IBM Corp.)을 이용하여 수행하였다. 각 시료에 대한 유의성 검정은 Duncan’s multiple range test를 이용하였다. P<0.05 수준에서 유의성을 검증하였으며 데이터는 평균±표준편차로 표기하였다.

시료 추출 및 전처리 조건 설정

본 연구에서는 식품의약품안전처에서 인정받은 기능성 원료 솔잎증류농축액(제2007-8호, 제2012-30호)이 함유된 건강기능식품의 규격 및 품질 관리를 위하여 설정된 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌 3종의 동시 분석법 마련을 위해 인정 원료의 시험법을 검토하였다. 제안된 시험법은 디클로로메탄 추출 후 100% polyethylene glycol 컬럼으로 캐리어 가스 질소를 이용해 가스크로마토그래피/불꽃이온화검출기로 분석하는 방법으로, 검토 결과 matrix effect가 발생하였고 회수율 또한 낮아 추출 조건 및 건강기능식품 적용성 등 표준화된 시험법을 확립하고자 시료의 추출 용매, 분석 컬럼 조건, 시료 채취량 등의 검토 및 적용성 검증을 실시하였다.

분석하고자 하는 물질 3종은 모노테르계에 속하는 성분으로 탄화수소 구조인 pinene이 분자 안에 2개 고리 구조와 1개의 이중결합 구조로 되어 있어 탄화수소 구조에 이중결합이 존재하는 구조로 휘발성이 높은 물리화학적 특성을 고려하였다(Almatarneh 등, 2018). 또한 3가지 성분 중 리모넨은 헥산의 유전 상수와 매우 가까운 유전 상수(dielectric constant)를 갖고 있어(Cháfer 등, 2004) 3가지 성분 추출을 위해 물질의 성질과 용매의 극성 지수 등 검토를 통해 비극성 용매 중에서 선택하기로 하였다.

시험용액 추출 용매를 선정하기 위해 표준용액과 시험용액을 디클로로메탄, 헵탄, 헥산 등 극성지수가 각각 3.1, 0.1, 0.1인 세 가지 비극성 용매(Lim 등, 2017)로 추출하여 동일한 기기조건으로 비교･분석 결과 극성지수의 차이가 있음에도 불구하고 3개 성분의 피크 분리도 및 함량의 차이가 없었다(자료미제시).

또한, 탄소수가 높은 용매의 경우 분석 후 컬럼에서 완전히 휘발되지 않고 잔존할 수 있다. 컬럼의 수명과 검출기에서 noise를 증가시켜 상대적으로 감도를 저하할 수 있으며, 온도 상승 시 유사 피크가 검출되는 경우 등을 고려하여 탄소수가 낮은 용매인 헥산을 시험용액 추출 용매로 선정하였다(Kang 등, 2017).

기기 분석 조건 설정

분석하고자 하는 3가지 휘발성 성분의 분석 기기는 GC가 정확할 것으로 판단하였으며, 검출기 또한 효율성과 선택성이 좋고 가장 많이 사용되는 불꽃이온화 검출기(FID)를 결합하여 분석 기기로 결정하였다. 또한 분석하고자 하는 성분들의 분리도와 선택성 등을 고려하여 고정상, 즉 컬럼의 조건을 설정하고자 주요 문헌 등에서 사용하는 100% polyethylene glycol 컬럼과 5% phenyl-95% methylpolysiloxane 컬럼에 따라 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌이 영향을 받는지 확인하고자 하였다.

표준용액과 시험용액을 헥산 추출 후 100% polyethylene glycol 컬럼과 5% phenyl-95% methylpolysiloxane 컬럼을 캐리어 가스 질소와 헬륨을 이용한 각각의 기기조건과 비교･분석 결과(Table 2), 컬럼에 따른 크로마토그램 분리도 차이는 없었으나 리모넨의 함량이 5% phenyl-95% methylpolysiloxane 컬럼으로 분석 시 2배로 높게 측정되는 문제가 발생되었다. 분리도 또한 100% polyethylene glycol 컬럼에서 리모넨 피크 분리가 정확한 것으로 확인되었다. 이러한 결과와 함께 polyethylene glycol을 고정상으로 이용 시 중간 극성 고정상으로 분리 효율적인 측면에서 주로 사용하는 것으로 보고되고 있는 점(Caglieto 등, 2022) 등을 고려하여 분석 컬럼의 충진 물질은 100% polyethylene glycol로 결정하였으며, 여러 종류의 컬럼 중 비활성화 표면처리로 분석 시 피크의 테일링과 베이스라인의 블리드 현상이 없고 분석 시 한계온도(290°C)가 높아 열적 안전성이 있는 DB-WAX 컬럼으로 설정하였다.

Table 2 . Chromatogram comparison of analysis results by instrument analysis conditions (analysis column).

Chromatogram
Column A (100% polyethylene glycol)	Standard sol.
				Contents (mg/g)
			3-carene	134.6
			limonene	65.3
	Sample sol.		terpinolene	218.8
Column B (5% phenyl -95% methylpoly -siloxane)	Standard sol.
				Contents (mg/g)
			3-carene	129.9
			limonene	134.5
	Sample sol.		terpinolene	238.1

또한, GC-FID 분석 시 캐리어 가스는 수소 또는 질소, 헬륨 등을 사용하고 있는 점과 안전성을 고려하여, 본 연구에서는 질소와 헬륨을 캐리어 가스로 비교하고자 표준용액과 시험용액을 헥산으로 추출 후 동일한 기기조건으로 비교･분석하였다. 그 결과 3개 성분의 피크 분리도와 분석 시간(Fig. 1) 및 3가지 성분의 분석 함량(Table 3)에 큰 차이가 없었다. 하지만 헬륨 가스의 경우 감도가 높고 noise peak 발생이 적어 분석 시 더 효율적이었다.

Table 3 . Content comparison according to mobile phase gas (nitrogen, helium).

	3-Carene		Limonene		Terpinolene
	N2	He	N2	He	N2	He
1	132.7	133.2	95.0	97.5	192.3	204.2
2	135.7	136.8	97.3	100.0	201.5	209.8
3	132.7	136.4	95.0	99.9	196.6	208.9
Measured mean (μg/mL)	133.7	135.5	95.7	99.1	196.8	207.6
SD	1.8	2.0	1.3	1.4	4.6	3.0
%RSD	1.3	1.5	1.4	1.4	2.3	1.5

Fig 1. Comparison of chromatograms peak separation according to mobile phase gas. (A) N₂ gas, (B) He gas.

그러나 최근 다양한 연구 자료 등에서 카타르 봉쇄 등으로 헬륨 공급이 중단되어 전 세계적으로 가격이 인상되고 있다고 보고되었고(Reisch, 2017), 새로운 헬륨 매장량이 확인되었지만 재생이 불가능하고 제한된 자원으로 발표되고 있다(Saltzman, 2019). 본 연구에서는 두 캐리어 가스 분석 결과를 기초로 하여 질소와 헬륨 가스의 분리도와 함량의 차이가 없음을 고려하여 헬륨과 질소를 모두 선택하여 분석할 수 있도록 제시하고 있다.

지표성분의 함량으로 채취되는 시료량을 설정하고자 3개 성분 함량 표시(3-카렌: 153.3 mg/g, 리모넨: 66.7 mg/g, 테르피놀렌: 193.3 mg/g)가 같은 시료 3개를 선택하여 시료 채취량을 50~500 mg 칭량하여 동시 분석하였다. 그 결과, 시료량을 50 mg부터 칭량하여도 3개 성분 모두 규격에 적합하여, 시료량 50 mg을 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌으로 환산하였다. 시료 채취량 50 mg 이상 칭량 시, 3-카렌 7.7 mg, 리모넨 3.3 mg, 테르피놀렌 9.7 mg이 되므로 함량이 가장 적게 포함된 리모넨을 기준으로 하여 시료 채취 시 약 3.3 mg 이상 칭량하도록 하였다(Table 4).

Table 4 . Comparison of analysis results by pre-treatment conditions (sample amount).

Sample amount (mg)	Sample1) (mg/g)
	3-Carene converted content	3-Carene analysis content	Limonene converted content	Limonene analysis content	Terpinolene converted content	Terpinolene analysis content
50	7.7	126.1±2.9	3.3	62.4±1.2	9.7	188.0±4.4
100	15.3	130.0±1.2	6.7	64.1±0.4	19.3	193.5±1.7
200	30.7	132.3±0.7	13.3	65.3±0.4	38.7	196.6±1.1
300	46.0	133.7±2.6	20.0	65.9±1.4	58.0	198.6±4.0
400	61.3	132.1±0.7	26.7	65.3±0.5	77.3	196.2±1.2
500	76.7	130.9±1.4	33.3	64.8±0.7	96.7	194.6±2.1

¹⁾Sample labeled amount: 3-carene, 153.3 mg/g; limonene, 66.7 mg/g; terpinolene, 193.3 mg/g..

Sample specification: 3-carene, 125.0∼165.0 mg/g; limonene, 50.0∼100.0 mg/g; terpinolene, 180.0∼260.0 mg/g..

시험법 검증

특이성을 확인하기 위하여 표준용액과 시험용액에서 분리도 및 머무름시간을 확인하였다. Fig. 2는 표준품과 시료를 분석한 크로마토그램이며 동일한 위치에서 단일 피크가 형성되는지 확인하였다. 그 결과, 표준용액과 시료에서 지표성분인 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌의 머무름시간은 각각 6.5분, 7.3분, 8.8분으로 일치함을 확인할 수 있었다.

Fig 2. GC chromatograms of 3-carene, limonene, and terpinolene in (A) standard solution, and (B) sample solution.

시료에서 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌이 검출되는 농도 범위를 중간값으로 설정하여 총 5개의 농도(3-카렌, 리모넨: 10, 50, 100, 200, 300 μg/mL, 테르피놀렌: 10, 100, 200, 300, 400 μg/mL)에 대한 직선성을 검토하였다. 시험 시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위해 각 농도에 대해 3회 반복을 수행한 결과, 검량선 상관계수(R²) 0.999 이상의 높은 직선성을 보였다(Fig. 3). 또한, 표준용액을 3회 분석한 검량선을 이용하여 검출한계 및 정량한계를 분석한 결과, 검출한계는 2.7, 2.6, 2.4 μg/mL이며 정량한계는 8.0, 7.9, 7.3 μg/mL로 나타났다.

Fig 3. Calibration curves of 3-carene, limonene, and terpinolene in (A) 3-carene, (B) limonene, and (C) terpinolene.

다음 정확도 측정을 위해 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌을 함유하지 않은 공시료에 대하여 각각 다른 농도를 spiking/recovery 방법으로 회수되는 백분율을 통해 매트릭스 영향을 검토하였다. 표준물질 첨가법에 따라 공시료에 대하여 일정량의 시료를 채취하고 표준용액을 첨가하였을 때 3-카렌 최종 농도는 100, 200, 300 μg/mL, 리모넨 최종 농도는 50, 100, 150 μg/mL, 테르피놀렌 최종 농도는 100, 200, 300 μg/mL가 되도록 하였다. 그 결과, 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌의 회수율은 95.4~99.8%로 나타났으며, 상대표준편차는 0.3~1.1%임을 확인하였다(Table 5).

Table 5 . Validation (accuracy, repeatability, reproducibility) of analysis method for 3-carene, limonene, and terpinolene (n=5).

	Treatment	Spiked concentration (μg/mL)
		3-Carene			Limonene			Terpinolene
		100	200	300	50	100	150	100	200	300
Accuracy	1	95.9	194.0	292.6	48.6	99.1	149.8	96.3	193.9	292.9
	2	94.3	193.5	288.6	47.9	98.7	147.7	94.9	193.4	288.9
	3	96.1	194.8	290.4	48.8	99.4	148.7	96.7	195.0	291.1
	4	95.4	194.7	294.5	48.5	99.3	150.9	96.2	195.0	295.4
	5	95.4	193.2	295.9	48.4	98.6	151.5	95.9	193.5	296.7
	Measured mean (μg/mL)	95.4	194.0	292.4	48.4	99.0	149.7	96.0	194.2	293.0
	%RSD	0.7	0.4	1.0	0.7	0.3	1.0	0.7	0.4	1.1
	Recovery mean (%)	95.4	97.0	97.5	96.9	99.0	99.8	96.0	97.1	97.7
	Treatment	Analysis sample volume (mg)
		3-Carene			Limonene			Terpinolene
		50	100	200	50	100	200	50	100	200
Repeatability	1	125.0	131.4	133.0	62.2	64.6	65.7	186.3	195.4	197.9
	2	127.3	129.1	131.7	63.1	64.0	65.1	190.1	192.3	195.8
	3	128.2	129.6	132.1	63.1	63.7	64.9	191.0	192.7	196.0
	4	126.9	130.2	131.4	62.9	64.5	64.8	189.7	194.0	195.1
	5	128.9	129.8	130.5	63.8	64.4	64.5	192.2	193.5	193.9
	Measured mean (mg/g)	127.3	130.0	131.7	63.0	64.2	65.0	189.9	193.6	195.7
	SD	1.5	0.8	0.9	0.6	0.4	0.5	2.2	1.2	1.5
	%RSD	1.2	0.7	0.7	0.9	0.6	0.7	1.2	0.6	0.7
	Treatment	Laboratory
		3-Carene			Limonene			Terpinolene
		A	B	C	A	B	C	A	B	C
Reproducibility	1	131.4	137.4	154.3	64.6	59.7	76.6	195.4	191.1	225.5
	2	129.1	135.4	153.1	64.0	58.2	76.0	192.3	189.3	223.3
	3	129.6	133.9	150.2	63.7	57.4	74.6	192.7	187.8	219.4
	4	130.2	136.6	153.4	64.5	59.5	76.3	194.0	191.2	224.0
	5	129.8	138.9	153.6	64.4	61.5	76.4	193.5	194.1	224.5
	Measured mean (mg/g)		139.8			66.5			202.5
	SD		10.1			7.3			15.4
	%RSD		7.2			11.0			7.6

시료량의 변화에 대한 반복 정밀도를 확인하기 위하여 1개의 표본 시료를 선정하였으며, 각각 시료량으로 50, 100, 200 mg을 취하여 5회 반복 측정하였다. 그 결과, 3-카렌의 함량은 127.3, 130.0, 131.7 mg/g으로 나타났으며, 상대표준편차는 1.2%, 0.7%, 0.7%임을 확인하였다. 리모넨의 함량은 63.0, 64.2, 65.0 mg/g으로 나타났으며, 상대표준편차는 0.9%, 0.6%, 0.7%임을 확인하였다. 또한 테르피놀렌 함량은 189.9, 193.6, 195.7 mg/g으로 나타났으며, 상태표준편차는 1.2%, 0.6%, 0.7%임을 확인하였다(Table 5).

실험실 간 정밀도를 확인하기 위해 1개의 표본 시료를 선정하여 세 실험실에서 각각 5회 반복 측정했다. 재현성의 상대표준편차를 확인한 결과, 3-카렌 7.2%, 리모넨 11.0%, 테르피놀렌 7.6%로 나타났다(Table 5). 확립된 시험법의 검토 결과는 AOAC(2012, 2016) 밸리데이션 가이드라인을 통해 적합함을 확인하였으며, 기능성 원료 솔잎증류농축액에 함유된 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌 동시분석법을 최종적으로 확립하였다.

유통제품 및 시제품 적용성 검토

솔잎증류농축액이 함유된 건강기능식품으로 품목제조 보고된 제품 중 온라인에서 판매량이 높은 제품 3종을 구매하여 본 연구에서 수립된 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌 동시분석법을 적용하였다. 그 결과 제품에 표시된 일일 섭취량 450 mg 중 함유된 각 성분의 기준･규격인 3-카렌 125.0~165.0 mg/g, 리모넨 50.0~100.0 mg/g, 테르피놀렌 180.0~260.0 mg/g의 검증을 위해 5회 반복 분석한 결과, 총 3건의 유통제품에서 표시 함량 대비 3개의 성분 모두 적합함을 확인하였다(Table 6). 유통제품의 적용성 검증을 통해 마련된 시험법이 기능성 원료 및 기타 부원료와 혼합하여 생산･판매되는 최종 제품에서 적용 가능성을 확인할 수 있었다.

Table 6 . Results of content analysis of 3-carene, limonene, and terpinolene in distributed products (3 samples).

	3-Carene			Limonene			Terpinolene
	A	B	C	A	B	C	A	B	C
1	128.6	135.8	134.7	90.2	99.9	90.7	224.8	204.6	244.0
2	127.6	130.5	136.7	92.0	95.9	92.1	229.1	196.8	247.6
3	127.0	133.1	136.6	91.5	98.2	92.3	227.8	200.7	247.2
4	125.6	135.8	136.3	90.4	100.2	91.5	225.4	204.7	246.6
5	122.5	132.9	135.8	88.0	98.2	91.6	219.4	200.3	245.8
Measured mean (μg/mL)	126.3	133.6	136.0	90.4	98.5	91.6	225.3	201.4	246.3
SD	2.4	2.2	0.8	1.6	1.7	0.6	3.7	3.3	1.5
%RSD	1.9	1.7	0.6	1.7	1.8	0.7	1.7	1.6	0.6

본 연구는 기능성 원료인 솔잎증류농축액이 ｢건강기능식품의 기준 및 규격｣에 등재 시 규격 관리를 위해 건강기능식품 중 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌의 동시분석법을 마련하고자 하였다. 이 3개의 성분은 솔잎의 기능성 성분인 모노테르펜의 주성분으로 잘 알려져 있다. 표준화된 시험법은 헥산 추출 후 100% polyethylene glycol로 충진된 컬럼을 이용해 가스크로마토그래프/불꽃이온화검출기(GC-FID) 동시분석법을 설정하였다. 시험법 밸리데이션 결과, 직선성 정량범위 내에서 상관계수(R²) 0.999 이상의 유의수준을 보였고, 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌의 검출한계는 2.7, 2.6, 2.4 μg/mL, 정량한계는 8.0, 7.9, 7.3 μg/mL로 나타났다. 정밀도와 정확성 결과는 AOAC 밸리데이션 가이드라인을 통해 적합함을 확인하여 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌 동시분석법을 마련하였다. 또한, 유통제품으로 제형별 적용성을 검토하여 3-카렌, 리모넨, 테르피놀렌을

동시에 정량 가능한 시험법임을 재확인하였다. 본 연구에서 설정된 표준화된 시험법은 솔잎증류농축액을 함유한 건강기능식품 유통 시 제품의 규격 관리에 대한 소비자 신뢰도를 높일 수 있을 것으로 기대한다.

본 연구는 2021년도 식품의약품안전처 연구개발사업의 연구비지원(21161미래식044)에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.