Ex) Article Title, Author, Keywords
Online ISSN 2288-5978
Ex) Article Title, Author, Keywords
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(4): 350-357
Published online April 30, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.350
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
Yoo Kyung Seon1,2 , Heami Sung1
, Jeongjin Park2,3
, and Woojin Jun2
,3
1Food Research Center, Jeonnam Bio Foundation 2Division of Food and Nutrition and 3Research Institute for Human Ecology, Chonnam National University
Correspondence to:Woojin Jun, Division of Food and Nutrition, Chonnam National University, 77, Yongbong-ro, Buk-gu, Gwangju 61186, Korea, E-mail: wjjun@chonnam.ac.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
This study examined the physiological activities (antioxidant, anti-hypertensive, anti-cholesterol, anti-diabetic, and anti-obesity) of Aronia fermented with oligosaccharides and pear juices. The Aronia, oligosaccharides and pear juices were fermented with lactic acid bacteria for 24 h, and its activity before and after fermentation was measured. The DPPH radical scavenging activity in the Aronia fermentation extracts was increased by fermentation. Anti-hypertensive and anti-diabetic activities were significantly higher after 24 h of fermentation than in the control. No anti-cholesterol activity was observed after fermentation. Furthermore, the Aronia fermentation extract had significant inhibitory activity on adipocytes differentiation in the 3T3-L1 preadipocytes as assessed by measuring fat accumulation using Oil Red O staining. The intracellular triglyceride levels were also reduced by 8.7% at the same concentration. The level of free glycerol released into the culture medium decreased by 27.1% after treatment with the Aronia 24 h-fermented product. These results suggest that Aronia fermentation with lactic acid bacteria improves diverse physiological activities and can be developed as a functional material or food.
Keywords: Aronia melanocarpa, lactic acid bacteria, pear juice, fermentation, physiological activity
최근 서구화된 식생활과 고령화로 대사증후군 및 만성질환의 유병률이 급격하게 증가하여 현대인들의 건강을 위협하고 있다. 대사증후군이란 고혈압, 고혈당, 비만, 혈중지질 이상 등 여러 가지 질환이 한꺼번에 나타나는 것을 말하며 이를 예방하기 위한 식물성 식품, 자연 유래 기능성식품에 관한 관심이 증가하고 있다(Lee 등, 2002). 과일은 비타민 C, 토코페롤, 카로티노이드, 플라보노이드, 폴리페놀 등이 풍부한 천연자원의 하나로 맛과 색깔 등 관능적 특성이 소비자들의 기호에 맞아 소비가 증가하고 유통이 점차 확대되는 추세이다(Chung, 2016). 특히 베리류 과일은 안토시아닌이 풍부하여 항당뇨, 항산화, 항염증, 비만 억제와 연관성이 높은 것으로 보고되고 있다(Zafra-Stone 등, 2007).
아로니아(Aronia,
유산균은 프로바이오틱스 중 가장 대표적인 미생물로 탄수화물을 발효시켜 젖산을 생성하는 균류로, 요구르트, 발효 분말, 과립 및 정제 등의 형태로 건강기능식품 및 기능성식품 제조에 이용되는 기능성과 활용성이 우수한 미생물이다(Hwang 등, 2018). 유산균 발효는 젖산과 여러 가지 우수한 대사산물을 생산하고 발효물의 면역기능 강화, 장 기능 개선(Jeong 등, 2023), 항비만 및 항당뇨(Lee 등, 2019), 항산화 활성 증진 및 혈압상승 억제(Park과 Kang, 2020) 등 여러 유익한 효능이 알려져 있으며 건강증진 및 질병 예방의 특징을 가지는 프로바이오틱스 균주로 활발한 연구가 진행되고 있다.
이와 같은 생리활성을 지니고 기능성을 부여하는 유산균을 활용한 아로니아의 발효는 아로니아 자체의 항산화 활성 및 높은 산도 때문에 발효가 어려워(Lee 등, 2015), 본 연구에서는 당류를 추가하여 발효의 유익균을 증가시키고자 올리고당과 배즙을 첨가하여 아로니아를 발효하였다. 또한 아로니아 발효액에 대한 발효 전후의 생리활성을 평가하여 아로니아 유산균 발효의 유익함을 확인하고 기능성식품 소재 개발을 위한 기초자료로 활용하고자 하였다.
본 실험에 사용한 아로니아(고창산)는 2021년 8월에 전라남도 담양군 창평면 하나로마트에서 구입하여 세척한 후 분쇄하여 사용하였고 배즙(햇살가득)과 프락토올리고당(삼양사)은 시중에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 유산균은 고시형인 플란타김치유산균-100((주)메디오젠)을 사용하였고, 이 제품은
아로니아 발효액은 분쇄한 아로니아와 배즙, 올리고당을 100:15:20 배합 비율로 혼합하고 유산균을 Lactobacilli MRS broth(BD DifcoTM)에 배양하여 아로니아 원물의 1% (v/w)로 접종하여 36±1°C에서 24시간 동안 정치배양 하였다. 배양이 완료된 발효액을 원심분리(8,400×
아로니아 발효액 10 μL에 0.1 mM DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Wako Pure Chemical Industries) 190 μL를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 spectrophotometer(PowerWave XS, BioTek)를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 다음 식을 사용하여 계산하였다.
Angiotensin converting enzyme(ACE) 저해 활성은 ACE kit(Dojindo)을 사용하여 측정하였다. 아로니아 발효액 각 20 μL와 substrate buffer 20 μL, enzyme working solution 200 μL를 혼합하여 37°C에서 1시간 반응시켰다. 이후 indicator working 용액을 첨가하여 상온에서 10분간 반응시킨 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군은 시료 대신 증류수를 처리하였고 ACE 저해 활성은 다음 식을 사용하여 계산하였다.
아로니아 발효액의 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA(HMG-CoA) 환원효소 활성 억제를 확인하기 위하여 HMG-CoA reductase activity assay kit(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하였다. Kim 등(2022)의 방법에 따라 시료 1 μL에 assay buffer와 NADPH 기질 용액, HMG-CoA reductase를 넣고 37°C로 설정된 spectrophotometer를 이용하여 340 nm에서 20초 단위로 20분간 흡광도를 측정하였다.
아로니아 발효액의 α-glucosidase 저해 활성은 α-glucosidase inhibitor screening kit(Biovision)으로 측정하였다. 아로니아 발효액 10 μL에 α-glucosidase 10 μL와 α-glucosidase assay buffer 60 μL를 가하여 실온에서 20분간 반응시킨 후 20 μL의 α-glucosidase 기질 혼합물을 각 well에 첨가하고, 410 nm에서 30분 동안 흡광도를 측정하였다. 시료 무처리구는 음성대조군으로 사용하였고, acarbose를 양성대조군으로 사용하여 아래의 식으로 저해율을 계산하였다.
실험에 사용된 3T3-L1 지방 전구세포는 American Type Culture Collection으로부터 구매하였다. 3T3-L1 세포는 10% newborn calf serum(NCS), 1% penicillin/streptomycin antibiotics를 넣은 Dulbecco’s modified Eagle’s medium high glucose(DMEM) 배지에서 37°C, 5% 이산화탄소(CO2) 환경에서 배양하였다.
3T3-L1 세포의 분화는 6-well plate에 well당 1×106 세포를 분주하여 세포가 100% 밀집되게 배양하였다. 2일 후 10% FBS와 MDI 용액(0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 0.5 µM dexamethasone, 10 µg/mL insulin)을 포함한 DMEM 배지를 2일 동안 처리하였고 다시 10% FBS와 10 µg/mL 인슐린을 포함한 DMEM을 3일 동안 3회 총 9일 동안 배양하며 세포 내 지방구의 형성을 근거하여 지방세포로 분화시켰다. 아로니아 발효액 처리는 분화 유도 배지 첨가 시점부터 같이 처리하였다.
아로니아의 유산균 발효에 따른 지방구 형성에 대한 영향은 Chu 등(2008)의 방법을 일부 수정하여 Oil Red O 염색을 실시하였다. 9일 동안 분화된 3T3-L1 세포의 배양액을 제거하고 phosphate buffered saline(PBS)을 각 well당 500 μL씩 넣고 3번 세척한 후 10% 폼알데하이드(formaldehyde)로 30분간 상온에서 방치한 후 제거하였다. 그 후 60% 이소프로판올(isopropanol)로 세척하고 건조한 다음 Oil Red O 용액을 넣어 1시간 동안 상온에서 염색하였다. 염색된 지방구는 100% 이소프로판올을 가하여 Oil Red O를 모두 용출시킨 후 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포 내 중성지방의 함량은 AdipoRedTM 분석 시약(Lonza)에 지시된 정량법에 따라 수행하였다. 세포 내 중성지방 함량 측정은 6-well plate에 well당 1×106 세포를 분주하여 세포가 100% 밀집되게 배양하였다. 2일 동안 더 배양한 후에 분화 유도 배지와 아로니아 발효액을 함께 처리하였다. 9일 동안 분화가 완료된 3T3-L1은 배지를 제거한 뒤, PBS로 2회 세척한 후 AdipoRedTM 시약을 well당 1 mL 처리하여 37°C에서 10분간 배양한 후 형광 정도를 excitation 485 nm, emission 572 nm에서 측정하였다.
Sigma-Aldrich사의 글리세롤 시약(glycerol reagent)과 글리세롤 표준용액(glycerol standard solution)을 사용하여 아로니아 발효액이 지방 분해에 미치는 영향을 확인하였다. 3T3-L1 세포에 분화 유도 배지와 아로니아 발효액을 처리한 후 분화 시점부터 9일째 수득한 배양액 50 μL를 글리세롤 시약 50 μL에 첨가하여 96-well plate에 10분간 37°C에서 반응시킨 후 540 nm 흡광도에서 측정하였다.
각 실험은 3회 반복 실험하여 얻은 결과를 SPSS 프로그램(version 17, SPSS Inc.)을 이용하여 각 실험군 간 평균과 표준편차를 계산하였다. 각 시료 간의 유의성은
DPPH 라디칼 소거능 평가는 특정 화합물이나 추출물이 활성산소 제거 효과를 평가하는 방법으로(Ammar 등, 2009), 비교적 안정한 자유라디칼인 DPPH와 항산화 물질이 만나면 DPPH의 라디칼을 소거시켜 탈색되는 점을 이용하여 측정한다(Jung 등, 2004). 아로니아 발효액에 대한 DPPH 라디칼 소거능은 Fig. 1에 나타내었으며 0시간 발효군보다 24시간 발효군의 DPPH 라디칼 소거 활성이 유의적으로 증가하였다. 0시간 발효군은 24.93%, 24시간 발효군은 38.96%의 소거능을 나타내었다. 양성대조군인 ascorbic acid는 35.33%의 소거능을 나타내어 24시간 발효군과 유사한 활성을 나타내었다. Chung(2016)은 아로니아 추출액의 DPPH 라디칼 소거능을 평가한 결과 5 mg/mL에서 약 80% 수준의 소거능을 나타내어 본 연구보다 더 높은 소거 활성을 보였으나, 이는 아로니아 발효액에서의 아로니아 첨가 비율이 낮아지면서 항산화 활성 감소에 영향을 준 것으로 판단된다. Park 등(2016)은 아로니아를 첨가한 막걸리가 발효가 진행될수록 항산화 활성이 증가하였는데 이는 안토시아닌과 폴리페놀류의 증가에 기인한 것으로 추정한다고 보고하였다. 베리류로 알려진 아사이베리, 아로니아, 블루베리, 블랙커런트, 크랜베리 시료 중 아로니아가 총 페놀 화합물, 플라보노이드, DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능에서 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다(Li와 Jeong, 2015). 또한 Ahn 등(2021)은 아티초크, 꽃차를 유산균으로 발효하여 발효 전후 DPPH 라디칼 소거능을 분석한 결과 유산균으로 발효한 시료들이 발효대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였고, Yang 등(2014)은 다른 유산균에 비해
ACE는 불활성인 angiotensin Ⅰ을 혈압상승 peptide인 angiotensin Ⅱ로의 전환을 촉매하고 혈압 강하 작용을 하는 bradykinin을 불활성화하여 생채 내에서 고혈압을 일으키는 중요한 효소로 알려져 있다(Ju 등, 2009). 발효 전후 아로니아 발효액의 ACE 저해 활성을 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. 0시간 발효군의 ACE 저해 활성은 58.50%를 나타내었고, 동일 농도의 24시간 발효군은 67.50%를 나타내어 유의적으로 높은 활성을 나타내었으며, 양성대조군인 코엔자임Q10과 유사한 항고혈압 효과를 나타내었다. 코엔자임Q10은 고시형 기능성 원료로 혈압을 상승시키는 호르몬(angiotensin Ⅱ)의 작용을 억제하여 혈압을 낮추는 데 도움을 줄 수 있다고 알려져 있다. Hellström 등(2010)은 아로니아가 다양한 안토시아닌 계통의 물질들과 폴리페놀 성분이 함유되어 있어 동맥경화, 심혈관질환, 암, 당뇨병, 위염, 알레르기성 피부질환 등에 효능이 있는 것으로 보고했다. Hwang 등(2018)은 오미자를 유산균으로 발효했을 때 비 발효 오미자 분말의 ACE 저해 활성은 34%, 오미자 유산균 발효물은 44%로 유산균을 넣어 발효시켰을 때 ACE 저해 활성이 증가했다고 보고했으며, Lee 등(2014)은 부추 당침액을
우리 몸은 식이 콜레스테롤을 흡수한 LDL 수용체, 간세포 내 콜레스테롤 합성속도 조절효소인 HMG-CoA reductase, 담즙산 합성속도 조절효소인 cholesterol 7-α-hydroxylase(CYP7A1), 그리고 에스테르 연결 효소 등으로 연결되어 세포 내 콜레스테롤 농도를 조절한다(Han 등, 2021). 콜레스테롤이 체내에 축적되면 고콜레스테롤 혈증이 나타나고 장기간에 걸쳐 콜레스테롤이 조절되지 않을 경우 동맥경화증으로 이어진다. 콜레스테롤의 기전에서 HMG-CoA reductase 활성의 억제는 콜레스테롤 합성을 감소시키는 효과가 있다(Jeon과 Bai, 2009). 아로니아 발효 전후의 HMG-CoA reuductase 억제 활성을 비교한 결과(Fig. 3) 0시간 발효군은 19.54%, 24시간 발효군은 19.44%를 나타내어 시료 간 유의적인 차이가 없었고 양성대조군인 pravastatin과 유사한 활성을 나타내었다. Pravastatin은 HMG-CoA reductase 억제제 중 하나로 고지혈증 환자에게 뛰어난 지질 강하 효과가 있음이 이미 알려져 있고, 고지혈증 환자에게 1일 10 mg씩 2회 경구 투여 시 총콜레스테롤의 경우 15~20%의 강하율을 보였다고 보고하였다(Park 등, 1993). 이에 아로니아 발효액은 0.25 mg/mL의 pravastatin과 동일한 항콜레스테롤 활성이 있는 것으로 판단된다.
α-Glucosidase는 탄수화물을 단당류로 분해하는 효소로, α-glucosidase 저해제는 탄수화물 분해를 억제하고 glucose의 흡수를 지연시켜 혈당 상승을 억제한다(Park 등, 2013). 또한 소장 내의 mucosal maltase와 sucrose 활성을 감소시키거나 glucose 섭취로 인한 인슐린 분비의 증가에 대한 자극과 산화적 스트레스를 감소시키는 메커니즘 작용으로 항당뇨 활성을 나타낸다.
아로니아 발효액의 α-glucosidase 저해 활성을 비교한 결과(Fig. 4) 0시간 발효군은 21.17%, 24시간 발효군은 34.80%를 나타내어 24시간 발효군의 저해 활성이 더 높은 결과를 보였다. 양성대조군인 acarbose는 대표적인 당뇨 치료제로 25.18%의 α-glucosidase 저해 활성을 나타내어 24시간 발효군보다 낮은 항당뇨 활성을 나타내었다. Jeong 등(2016)의 연구에서 두 품종의 아로니아 착즙액을 증류수에 400배 희석하여 α-glucosidase 저해 활성을 검토한 결과 77.93%와 88.64%의 활성을 나타내어 본 연구와는 차이가 있었다. 이는 아로니아의 품종, 착즙액과 발효액의 아로니아 함량 등에 따른 차이로 보인다. 아로니아의 항당뇨능에 관한 연구로 아로니아 주스를 6주 동안 streptozotocin 유발 당뇨쥐에게 섭취시켰을 때 glycaemia가 감소했다는 연구(Valcheva-Kuzmanova 등, 2007)와 유산균으로 발효한 홍고추가 발효하지 않은 홍고추보다 인슐린 저항성 억제 효과가 더 크다는 연구(Lee 등, 2019)를 종합했을 때 아로니아를 유산균으로 발효한 24시간 발효군은 항당뇨와 같은 질환에 우수한 식품 소재로 개발 가능성이 매우 높다고 판단된다.
항비만 활성은 3T3-L1 세포를 사용하여 효능을 확인하였다. 3T3-L1 세포는 mouse fibroblast인 3T3 세포에서 유래된 세포주로서 적절한 조건에서 배양하면 지방세포로 분화한다. 전지방세포에서 지방세포로 분화하는 과정을 adipogenesis라고 하며 다양한 전사인자 및 단백질 발현을 통해 조절된다고 알려져 있다(Kim 등, 2020). 분화 촉진 인자에 의해 분화된 3T3-L1 세포는 세포 내 지방적(lipid droplet)을 축적하는데 아로니아의 발효액을 처리하여 지방적 형성을 얼마나 저해할 수 있는지 확인하기 위하여 Oil Red O 염색법을 이용하여 측정하였다(Wee 등, 2015). 지방세포 분화로 인해 축적된 대부분의 지질은 중성지방으로 염색된 세포의 붉은색 정도를 통해 분화 정도를 확인할 수 있다(Kim 등, 2013). 시료를 처리하지 않고 지방세포로 분화가 완료된 CON군과 아로니아 발효액을 처리하여 지방세포로 분화한 결과는 Fig. 5에 나타내었다. 0시간 발효군과 24시간 발효군의 분화도를 비교했을 때 0시간 발효군보다 24시간 발효군에서 지방세포 분화억제 효과가 유의적으로 나타났다. CON군 대비 0시간 발효군은 지방세포의 분화를11.78%, 24시간 발효군은 22.46% 억제하였다. 양성대조군은 체지방감소 개별인정형 소재인 시서스 추출물을 사용하였으며, 24시간 발효군은 시서스 추출물과 유사한 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 아로니아 추출물과
아로니아 발효액의 지방구 감소 효과를 확인하기 위하여 지방세포 내에 축적된 중성지방의 함량을 확인하였다. 3T3-L1 전지방세포에서 지방세포로 분화될 때 중성지방이 생성되는데 첫째 세포 내로 유입되는 포도당의 대사 과정에 의해 생성되며, 둘째 지단백 분해효소(lipoprotein lipase)에 의해 분해되어 유리된 지방산과 모노글리세롤로 인해 생성된다. 그리고 세포 내 de novo 지방산 합성과정 등으로 인해 세포 내 중성지방이 생성되어 최종 분화 단계까지 지방구를 계속 형성하게 되고 그 지방구끼리 결합하여 크기가 점점 증가하게 된다(Wee 등, 2015). 아로니아 발효액의 지방구 감소 효과를 확인하기 위해 형광염색법으로 측정하였다. 아로니아 발효액을 처리한 군의 중성지방 함량이 CON군에 비해 유의적으로 낮아졌으며, 0시간 발효군보다 24시간 발효군에서 더 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6). 또한 24시간 발효군은 양성대조군인 시서스 추출물과 유사한 활성을 나타내었다. 아로니아 섭취는 인체 혈액 내 중성지방의 함량을 낮춰주며(Son과 Seo, 2017), Park 등(2014)은 김치에서 분리한 유산균이 3T3-L1 세포 내의 중성지방 함량을 저하시켰다고 보고하였다. 이들 결과는 지방구 생성을 확인한 Oil Red O 염색 결과와 일치하며, 아로니아 발효액이 지질 축적 억제를 나타내는 것으로 사료된다.
세포배양액으로 방출되는 유리 글리세롤양을 측정하여 아로니아 발효액이 지방세포 분화억제에 미치는 영향을 확인하였다. 지방세포로 유입된 포도당은 해당과정을 통해 glyceraldehyde-3-phosphate와 dihydroxyacetone-phosphate를 거쳐 글리세롤로 전환된 후, 지방산과 결합하여 중성지방을 생성하는데 유리된 글리세롤의 함량은 지방구 내 중성지방의 분해 정도를 간접적으로 나타내는 척도가 된다(Cha 등, 2010; Kim과 Jun, 2015). 아로니아 발효액은 CON군과 비교 시 낮은 유리 글리세롤 함량이 확인되었고, 0시간 발효군보다 24시간 발효군에서 유의적으로 낮은 유리 글리세롤 함량을 확인하였다(Fig. 7). 24시간 발효군은 양성대조군인 시서스 추출물과 유사한 활성을 나타내었다. Kim과 Jun(2015)의 연구에서 유리 글리세롤 함량의 감소는 시료가 전지방세포의 분화를 억제하여 지방구 생성이 감소함에 따라 지방구 내 중성지방 함량이 감소하여 배양액으로 유출되는 유리 글리세롤의 함량이 감소한다고 하였다. 또한 Oh 등(2020)은 유산균이 생성하는 lactic acid와 같은 유용성분들이 지방세포의 수를 조절하거나 지방 축적량을 감소시키는 등 지방 분화과정을 지연시킨다고 보고하였다. 따라서 9일 동안 처리한 아로니아 발효액으로 인해 세포분화가 억제되었다고 판단된다.
본 연구에서는 아로니아에 올리고당과 배즙을 첨가하여 유산균으로 24시간 발효한 아로니아 발효액의 발효 전후 생리활성을 측정하였다. 대사증후군 관련 생리활성인 항산화, 항고혈압, 항콜레스테롤 및 항당뇨를 측정하기 위해 DPPH 라디칼 소거능, ACE 저해 활성, HMG-CoA 환원효소 억제 활성 및 α-glucosidase 저해 활성을 측정하였다. 항산화 활성은 24시간 발효군이 0시간 발효군보다 14.03% 유의적으로 증가했으며, 항고혈압 활성은 0시간 발효군보다 24시간 발효군에서 약 9.00% 더 높은 활성을 나타내었다. 항당뇨 활성은 24시간 발효군에서 0시간 발효군보다 13.63% 유의적으로 증가하였다. 항비만 활성을 평가하기 위해 3T3-L1 세포에서 Oil Red O 염색법을 이용한 지방축적 저해 정도 및 세포 내 중성지방 함량을 측정한 결과, 24시간 발효군에서 지방축적 저해 및 중성지방의 함량이 감소하는 것을 확인하였다. 이상의 결과로부터 24시간 발효군은 0시간 발효군보다 생리활성에 효과적인 결과를 보여주었고, 대사증후군에 도움을 주는 아로니아를 활용한 기능성 음료와 같은 가공식품으로 활용할 수 있는 잠재적 가능성을 보여주었다.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(4): 350-357
Published online April 30, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.350
Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.
선유경1,2․성혜미1․박정진2,3․전우진2,3
1(재)전남바이오진흥원 식품산업연구센터
2전남대학교 식품영양학과
3전남대학교 생활과학연구소
Yoo Kyung Seon1,2 , Heami Sung1
, Jeongjin Park2,3
, and Woojin Jun2,3
1Food Research Center, Jeonnam Bio Foundation 2Division of Food and Nutrition and 3Research Institute for Human Ecology, Chonnam National University
Correspondence to:Woojin Jun, Division of Food and Nutrition, Chonnam National University, 77, Yongbong-ro, Buk-gu, Gwangju 61186, Korea, E-mail: wjjun@chonnam.ac.kr
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
This study examined the physiological activities (antioxidant, anti-hypertensive, anti-cholesterol, anti-diabetic, and anti-obesity) of Aronia fermented with oligosaccharides and pear juices. The Aronia, oligosaccharides and pear juices were fermented with lactic acid bacteria for 24 h, and its activity before and after fermentation was measured. The DPPH radical scavenging activity in the Aronia fermentation extracts was increased by fermentation. Anti-hypertensive and anti-diabetic activities were significantly higher after 24 h of fermentation than in the control. No anti-cholesterol activity was observed after fermentation. Furthermore, the Aronia fermentation extract had significant inhibitory activity on adipocytes differentiation in the 3T3-L1 preadipocytes as assessed by measuring fat accumulation using Oil Red O staining. The intracellular triglyceride levels were also reduced by 8.7% at the same concentration. The level of free glycerol released into the culture medium decreased by 27.1% after treatment with the Aronia 24 h-fermented product. These results suggest that Aronia fermentation with lactic acid bacteria improves diverse physiological activities and can be developed as a functional material or food.
Keywords: Aronia melanocarpa, lactic acid bacteria, pear juice, fermentation, physiological activity
최근 서구화된 식생활과 고령화로 대사증후군 및 만성질환의 유병률이 급격하게 증가하여 현대인들의 건강을 위협하고 있다. 대사증후군이란 고혈압, 고혈당, 비만, 혈중지질 이상 등 여러 가지 질환이 한꺼번에 나타나는 것을 말하며 이를 예방하기 위한 식물성 식품, 자연 유래 기능성식품에 관한 관심이 증가하고 있다(Lee 등, 2002). 과일은 비타민 C, 토코페롤, 카로티노이드, 플라보노이드, 폴리페놀 등이 풍부한 천연자원의 하나로 맛과 색깔 등 관능적 특성이 소비자들의 기호에 맞아 소비가 증가하고 유통이 점차 확대되는 추세이다(Chung, 2016). 특히 베리류 과일은 안토시아닌이 풍부하여 항당뇨, 항산화, 항염증, 비만 억제와 연관성이 높은 것으로 보고되고 있다(Zafra-Stone 등, 2007).
아로니아(Aronia,
유산균은 프로바이오틱스 중 가장 대표적인 미생물로 탄수화물을 발효시켜 젖산을 생성하는 균류로, 요구르트, 발효 분말, 과립 및 정제 등의 형태로 건강기능식품 및 기능성식품 제조에 이용되는 기능성과 활용성이 우수한 미생물이다(Hwang 등, 2018). 유산균 발효는 젖산과 여러 가지 우수한 대사산물을 생산하고 발효물의 면역기능 강화, 장 기능 개선(Jeong 등, 2023), 항비만 및 항당뇨(Lee 등, 2019), 항산화 활성 증진 및 혈압상승 억제(Park과 Kang, 2020) 등 여러 유익한 효능이 알려져 있으며 건강증진 및 질병 예방의 특징을 가지는 프로바이오틱스 균주로 활발한 연구가 진행되고 있다.
이와 같은 생리활성을 지니고 기능성을 부여하는 유산균을 활용한 아로니아의 발효는 아로니아 자체의 항산화 활성 및 높은 산도 때문에 발효가 어려워(Lee 등, 2015), 본 연구에서는 당류를 추가하여 발효의 유익균을 증가시키고자 올리고당과 배즙을 첨가하여 아로니아를 발효하였다. 또한 아로니아 발효액에 대한 발효 전후의 생리활성을 평가하여 아로니아 유산균 발효의 유익함을 확인하고 기능성식품 소재 개발을 위한 기초자료로 활용하고자 하였다.
본 실험에 사용한 아로니아(고창산)는 2021년 8월에 전라남도 담양군 창평면 하나로마트에서 구입하여 세척한 후 분쇄하여 사용하였고 배즙(햇살가득)과 프락토올리고당(삼양사)은 시중에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 유산균은 고시형인 플란타김치유산균-100((주)메디오젠)을 사용하였고, 이 제품은
아로니아 발효액은 분쇄한 아로니아와 배즙, 올리고당을 100:15:20 배합 비율로 혼합하고 유산균을 Lactobacilli MRS broth(BD DifcoTM)에 배양하여 아로니아 원물의 1% (v/w)로 접종하여 36±1°C에서 24시간 동안 정치배양 하였다. 배양이 완료된 발효액을 원심분리(8,400×
아로니아 발효액 10 μL에 0.1 mM DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Wako Pure Chemical Industries) 190 μL를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 spectrophotometer(PowerWave XS, BioTek)를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 다음 식을 사용하여 계산하였다.
Angiotensin converting enzyme(ACE) 저해 활성은 ACE kit(Dojindo)을 사용하여 측정하였다. 아로니아 발효액 각 20 μL와 substrate buffer 20 μL, enzyme working solution 200 μL를 혼합하여 37°C에서 1시간 반응시켰다. 이후 indicator working 용액을 첨가하여 상온에서 10분간 반응시킨 다음 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군은 시료 대신 증류수를 처리하였고 ACE 저해 활성은 다음 식을 사용하여 계산하였다.
아로니아 발효액의 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA(HMG-CoA) 환원효소 활성 억제를 확인하기 위하여 HMG-CoA reductase activity assay kit(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하였다. Kim 등(2022)의 방법에 따라 시료 1 μL에 assay buffer와 NADPH 기질 용액, HMG-CoA reductase를 넣고 37°C로 설정된 spectrophotometer를 이용하여 340 nm에서 20초 단위로 20분간 흡광도를 측정하였다.
아로니아 발효액의 α-glucosidase 저해 활성은 α-glucosidase inhibitor screening kit(Biovision)으로 측정하였다. 아로니아 발효액 10 μL에 α-glucosidase 10 μL와 α-glucosidase assay buffer 60 μL를 가하여 실온에서 20분간 반응시킨 후 20 μL의 α-glucosidase 기질 혼합물을 각 well에 첨가하고, 410 nm에서 30분 동안 흡광도를 측정하였다. 시료 무처리구는 음성대조군으로 사용하였고, acarbose를 양성대조군으로 사용하여 아래의 식으로 저해율을 계산하였다.
실험에 사용된 3T3-L1 지방 전구세포는 American Type Culture Collection으로부터 구매하였다. 3T3-L1 세포는 10% newborn calf serum(NCS), 1% penicillin/streptomycin antibiotics를 넣은 Dulbecco’s modified Eagle’s medium high glucose(DMEM) 배지에서 37°C, 5% 이산화탄소(CO2) 환경에서 배양하였다.
3T3-L1 세포의 분화는 6-well plate에 well당 1×106 세포를 분주하여 세포가 100% 밀집되게 배양하였다. 2일 후 10% FBS와 MDI 용액(0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 0.5 µM dexamethasone, 10 µg/mL insulin)을 포함한 DMEM 배지를 2일 동안 처리하였고 다시 10% FBS와 10 µg/mL 인슐린을 포함한 DMEM을 3일 동안 3회 총 9일 동안 배양하며 세포 내 지방구의 형성을 근거하여 지방세포로 분화시켰다. 아로니아 발효액 처리는 분화 유도 배지 첨가 시점부터 같이 처리하였다.
아로니아의 유산균 발효에 따른 지방구 형성에 대한 영향은 Chu 등(2008)의 방법을 일부 수정하여 Oil Red O 염색을 실시하였다. 9일 동안 분화된 3T3-L1 세포의 배양액을 제거하고 phosphate buffered saline(PBS)을 각 well당 500 μL씩 넣고 3번 세척한 후 10% 폼알데하이드(formaldehyde)로 30분간 상온에서 방치한 후 제거하였다. 그 후 60% 이소프로판올(isopropanol)로 세척하고 건조한 다음 Oil Red O 용액을 넣어 1시간 동안 상온에서 염색하였다. 염색된 지방구는 100% 이소프로판올을 가하여 Oil Red O를 모두 용출시킨 후 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포 내 중성지방의 함량은 AdipoRedTM 분석 시약(Lonza)에 지시된 정량법에 따라 수행하였다. 세포 내 중성지방 함량 측정은 6-well plate에 well당 1×106 세포를 분주하여 세포가 100% 밀집되게 배양하였다. 2일 동안 더 배양한 후에 분화 유도 배지와 아로니아 발효액을 함께 처리하였다. 9일 동안 분화가 완료된 3T3-L1은 배지를 제거한 뒤, PBS로 2회 세척한 후 AdipoRedTM 시약을 well당 1 mL 처리하여 37°C에서 10분간 배양한 후 형광 정도를 excitation 485 nm, emission 572 nm에서 측정하였다.
Sigma-Aldrich사의 글리세롤 시약(glycerol reagent)과 글리세롤 표준용액(glycerol standard solution)을 사용하여 아로니아 발효액이 지방 분해에 미치는 영향을 확인하였다. 3T3-L1 세포에 분화 유도 배지와 아로니아 발효액을 처리한 후 분화 시점부터 9일째 수득한 배양액 50 μL를 글리세롤 시약 50 μL에 첨가하여 96-well plate에 10분간 37°C에서 반응시킨 후 540 nm 흡광도에서 측정하였다.
각 실험은 3회 반복 실험하여 얻은 결과를 SPSS 프로그램(version 17, SPSS Inc.)을 이용하여 각 실험군 간 평균과 표준편차를 계산하였다. 각 시료 간의 유의성은
DPPH 라디칼 소거능 평가는 특정 화합물이나 추출물이 활성산소 제거 효과를 평가하는 방법으로(Ammar 등, 2009), 비교적 안정한 자유라디칼인 DPPH와 항산화 물질이 만나면 DPPH의 라디칼을 소거시켜 탈색되는 점을 이용하여 측정한다(Jung 등, 2004). 아로니아 발효액에 대한 DPPH 라디칼 소거능은 Fig. 1에 나타내었으며 0시간 발효군보다 24시간 발효군의 DPPH 라디칼 소거 활성이 유의적으로 증가하였다. 0시간 발효군은 24.93%, 24시간 발효군은 38.96%의 소거능을 나타내었다. 양성대조군인 ascorbic acid는 35.33%의 소거능을 나타내어 24시간 발효군과 유사한 활성을 나타내었다. Chung(2016)은 아로니아 추출액의 DPPH 라디칼 소거능을 평가한 결과 5 mg/mL에서 약 80% 수준의 소거능을 나타내어 본 연구보다 더 높은 소거 활성을 보였으나, 이는 아로니아 발효액에서의 아로니아 첨가 비율이 낮아지면서 항산화 활성 감소에 영향을 준 것으로 판단된다. Park 등(2016)은 아로니아를 첨가한 막걸리가 발효가 진행될수록 항산화 활성이 증가하였는데 이는 안토시아닌과 폴리페놀류의 증가에 기인한 것으로 추정한다고 보고하였다. 베리류로 알려진 아사이베리, 아로니아, 블루베리, 블랙커런트, 크랜베리 시료 중 아로니아가 총 페놀 화합물, 플라보노이드, DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능에서 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다(Li와 Jeong, 2015). 또한 Ahn 등(2021)은 아티초크, 꽃차를 유산균으로 발효하여 발효 전후 DPPH 라디칼 소거능을 분석한 결과 유산균으로 발효한 시료들이 발효대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였고, Yang 등(2014)은 다른 유산균에 비해
ACE는 불활성인 angiotensin Ⅰ을 혈압상승 peptide인 angiotensin Ⅱ로의 전환을 촉매하고 혈압 강하 작용을 하는 bradykinin을 불활성화하여 생채 내에서 고혈압을 일으키는 중요한 효소로 알려져 있다(Ju 등, 2009). 발효 전후 아로니아 발효액의 ACE 저해 활성을 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. 0시간 발효군의 ACE 저해 활성은 58.50%를 나타내었고, 동일 농도의 24시간 발효군은 67.50%를 나타내어 유의적으로 높은 활성을 나타내었으며, 양성대조군인 코엔자임Q10과 유사한 항고혈압 효과를 나타내었다. 코엔자임Q10은 고시형 기능성 원료로 혈압을 상승시키는 호르몬(angiotensin Ⅱ)의 작용을 억제하여 혈압을 낮추는 데 도움을 줄 수 있다고 알려져 있다. Hellström 등(2010)은 아로니아가 다양한 안토시아닌 계통의 물질들과 폴리페놀 성분이 함유되어 있어 동맥경화, 심혈관질환, 암, 당뇨병, 위염, 알레르기성 피부질환 등에 효능이 있는 것으로 보고했다. Hwang 등(2018)은 오미자를 유산균으로 발효했을 때 비 발효 오미자 분말의 ACE 저해 활성은 34%, 오미자 유산균 발효물은 44%로 유산균을 넣어 발효시켰을 때 ACE 저해 활성이 증가했다고 보고했으며, Lee 등(2014)은 부추 당침액을
우리 몸은 식이 콜레스테롤을 흡수한 LDL 수용체, 간세포 내 콜레스테롤 합성속도 조절효소인 HMG-CoA reductase, 담즙산 합성속도 조절효소인 cholesterol 7-α-hydroxylase(CYP7A1), 그리고 에스테르 연결 효소 등으로 연결되어 세포 내 콜레스테롤 농도를 조절한다(Han 등, 2021). 콜레스테롤이 체내에 축적되면 고콜레스테롤 혈증이 나타나고 장기간에 걸쳐 콜레스테롤이 조절되지 않을 경우 동맥경화증으로 이어진다. 콜레스테롤의 기전에서 HMG-CoA reductase 활성의 억제는 콜레스테롤 합성을 감소시키는 효과가 있다(Jeon과 Bai, 2009). 아로니아 발효 전후의 HMG-CoA reuductase 억제 활성을 비교한 결과(Fig. 3) 0시간 발효군은 19.54%, 24시간 발효군은 19.44%를 나타내어 시료 간 유의적인 차이가 없었고 양성대조군인 pravastatin과 유사한 활성을 나타내었다. Pravastatin은 HMG-CoA reductase 억제제 중 하나로 고지혈증 환자에게 뛰어난 지질 강하 효과가 있음이 이미 알려져 있고, 고지혈증 환자에게 1일 10 mg씩 2회 경구 투여 시 총콜레스테롤의 경우 15~20%의 강하율을 보였다고 보고하였다(Park 등, 1993). 이에 아로니아 발효액은 0.25 mg/mL의 pravastatin과 동일한 항콜레스테롤 활성이 있는 것으로 판단된다.
α-Glucosidase는 탄수화물을 단당류로 분해하는 효소로, α-glucosidase 저해제는 탄수화물 분해를 억제하고 glucose의 흡수를 지연시켜 혈당 상승을 억제한다(Park 등, 2013). 또한 소장 내의 mucosal maltase와 sucrose 활성을 감소시키거나 glucose 섭취로 인한 인슐린 분비의 증가에 대한 자극과 산화적 스트레스를 감소시키는 메커니즘 작용으로 항당뇨 활성을 나타낸다.
아로니아 발효액의 α-glucosidase 저해 활성을 비교한 결과(Fig. 4) 0시간 발효군은 21.17%, 24시간 발효군은 34.80%를 나타내어 24시간 발효군의 저해 활성이 더 높은 결과를 보였다. 양성대조군인 acarbose는 대표적인 당뇨 치료제로 25.18%의 α-glucosidase 저해 활성을 나타내어 24시간 발효군보다 낮은 항당뇨 활성을 나타내었다. Jeong 등(2016)의 연구에서 두 품종의 아로니아 착즙액을 증류수에 400배 희석하여 α-glucosidase 저해 활성을 검토한 결과 77.93%와 88.64%의 활성을 나타내어 본 연구와는 차이가 있었다. 이는 아로니아의 품종, 착즙액과 발효액의 아로니아 함량 등에 따른 차이로 보인다. 아로니아의 항당뇨능에 관한 연구로 아로니아 주스를 6주 동안 streptozotocin 유발 당뇨쥐에게 섭취시켰을 때 glycaemia가 감소했다는 연구(Valcheva-Kuzmanova 등, 2007)와 유산균으로 발효한 홍고추가 발효하지 않은 홍고추보다 인슐린 저항성 억제 효과가 더 크다는 연구(Lee 등, 2019)를 종합했을 때 아로니아를 유산균으로 발효한 24시간 발효군은 항당뇨와 같은 질환에 우수한 식품 소재로 개발 가능성이 매우 높다고 판단된다.
항비만 활성은 3T3-L1 세포를 사용하여 효능을 확인하였다. 3T3-L1 세포는 mouse fibroblast인 3T3 세포에서 유래된 세포주로서 적절한 조건에서 배양하면 지방세포로 분화한다. 전지방세포에서 지방세포로 분화하는 과정을 adipogenesis라고 하며 다양한 전사인자 및 단백질 발현을 통해 조절된다고 알려져 있다(Kim 등, 2020). 분화 촉진 인자에 의해 분화된 3T3-L1 세포는 세포 내 지방적(lipid droplet)을 축적하는데 아로니아의 발효액을 처리하여 지방적 형성을 얼마나 저해할 수 있는지 확인하기 위하여 Oil Red O 염색법을 이용하여 측정하였다(Wee 등, 2015). 지방세포 분화로 인해 축적된 대부분의 지질은 중성지방으로 염색된 세포의 붉은색 정도를 통해 분화 정도를 확인할 수 있다(Kim 등, 2013). 시료를 처리하지 않고 지방세포로 분화가 완료된 CON군과 아로니아 발효액을 처리하여 지방세포로 분화한 결과는 Fig. 5에 나타내었다. 0시간 발효군과 24시간 발효군의 분화도를 비교했을 때 0시간 발효군보다 24시간 발효군에서 지방세포 분화억제 효과가 유의적으로 나타났다. CON군 대비 0시간 발효군은 지방세포의 분화를11.78%, 24시간 발효군은 22.46% 억제하였다. 양성대조군은 체지방감소 개별인정형 소재인 시서스 추출물을 사용하였으며, 24시간 발효군은 시서스 추출물과 유사한 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 아로니아 추출물과
아로니아 발효액의 지방구 감소 효과를 확인하기 위하여 지방세포 내에 축적된 중성지방의 함량을 확인하였다. 3T3-L1 전지방세포에서 지방세포로 분화될 때 중성지방이 생성되는데 첫째 세포 내로 유입되는 포도당의 대사 과정에 의해 생성되며, 둘째 지단백 분해효소(lipoprotein lipase)에 의해 분해되어 유리된 지방산과 모노글리세롤로 인해 생성된다. 그리고 세포 내 de novo 지방산 합성과정 등으로 인해 세포 내 중성지방이 생성되어 최종 분화 단계까지 지방구를 계속 형성하게 되고 그 지방구끼리 결합하여 크기가 점점 증가하게 된다(Wee 등, 2015). 아로니아 발효액의 지방구 감소 효과를 확인하기 위해 형광염색법으로 측정하였다. 아로니아 발효액을 처리한 군의 중성지방 함량이 CON군에 비해 유의적으로 낮아졌으며, 0시간 발효군보다 24시간 발효군에서 더 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6). 또한 24시간 발효군은 양성대조군인 시서스 추출물과 유사한 활성을 나타내었다. 아로니아 섭취는 인체 혈액 내 중성지방의 함량을 낮춰주며(Son과 Seo, 2017), Park 등(2014)은 김치에서 분리한 유산균이 3T3-L1 세포 내의 중성지방 함량을 저하시켰다고 보고하였다. 이들 결과는 지방구 생성을 확인한 Oil Red O 염색 결과와 일치하며, 아로니아 발효액이 지질 축적 억제를 나타내는 것으로 사료된다.
세포배양액으로 방출되는 유리 글리세롤양을 측정하여 아로니아 발효액이 지방세포 분화억제에 미치는 영향을 확인하였다. 지방세포로 유입된 포도당은 해당과정을 통해 glyceraldehyde-3-phosphate와 dihydroxyacetone-phosphate를 거쳐 글리세롤로 전환된 후, 지방산과 결합하여 중성지방을 생성하는데 유리된 글리세롤의 함량은 지방구 내 중성지방의 분해 정도를 간접적으로 나타내는 척도가 된다(Cha 등, 2010; Kim과 Jun, 2015). 아로니아 발효액은 CON군과 비교 시 낮은 유리 글리세롤 함량이 확인되었고, 0시간 발효군보다 24시간 발효군에서 유의적으로 낮은 유리 글리세롤 함량을 확인하였다(Fig. 7). 24시간 발효군은 양성대조군인 시서스 추출물과 유사한 활성을 나타내었다. Kim과 Jun(2015)의 연구에서 유리 글리세롤 함량의 감소는 시료가 전지방세포의 분화를 억제하여 지방구 생성이 감소함에 따라 지방구 내 중성지방 함량이 감소하여 배양액으로 유출되는 유리 글리세롤의 함량이 감소한다고 하였다. 또한 Oh 등(2020)은 유산균이 생성하는 lactic acid와 같은 유용성분들이 지방세포의 수를 조절하거나 지방 축적량을 감소시키는 등 지방 분화과정을 지연시킨다고 보고하였다. 따라서 9일 동안 처리한 아로니아 발효액으로 인해 세포분화가 억제되었다고 판단된다.
본 연구에서는 아로니아에 올리고당과 배즙을 첨가하여 유산균으로 24시간 발효한 아로니아 발효액의 발효 전후 생리활성을 측정하였다. 대사증후군 관련 생리활성인 항산화, 항고혈압, 항콜레스테롤 및 항당뇨를 측정하기 위해 DPPH 라디칼 소거능, ACE 저해 활성, HMG-CoA 환원효소 억제 활성 및 α-glucosidase 저해 활성을 측정하였다. 항산화 활성은 24시간 발효군이 0시간 발효군보다 14.03% 유의적으로 증가했으며, 항고혈압 활성은 0시간 발효군보다 24시간 발효군에서 약 9.00% 더 높은 활성을 나타내었다. 항당뇨 활성은 24시간 발효군에서 0시간 발효군보다 13.63% 유의적으로 증가하였다. 항비만 활성을 평가하기 위해 3T3-L1 세포에서 Oil Red O 염색법을 이용한 지방축적 저해 정도 및 세포 내 중성지방 함량을 측정한 결과, 24시간 발효군에서 지방축적 저해 및 중성지방의 함량이 감소하는 것을 확인하였다. 이상의 결과로부터 24시간 발효군은 0시간 발효군보다 생리활성에 효과적인 결과를 보여주었고, 대사증후군에 도움을 주는 아로니아를 활용한 기능성 음료와 같은 가공식품으로 활용할 수 있는 잠재적 가능성을 보여주었다.
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