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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(4): 340-349

Published online April 30, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.340

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Effects of Gloiopeltis furcata Extract on Osteoclastogenesis and Osteoporosis in Ovariectomized Rats

Jeong Hyeon Kang , Mi Hwa Park , Kyung Im Jung , and Mihyang Kim

Department of Food and Nutrition, College of Health and Welfare, Silla University

Correspondence to:Mihyang Kim, Department of Food and Nutrition, College of Health and Welfare, Silla University, 140, Baegyang-daero 700beon-gil, Sasang-gu, Busan 46958, Korea, E-mail: mihkim@silla.ac.kr

Received: February 13, 2024; Accepted: February 27, 2024

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Osteoporosis is an age-dependent metabolic bone disease characterized by reduced bone mass. Postmenopausal women with estrogen deficiency are at high risk of developing osteoporosis. This study examined the effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract (GFE) on osteoclastogenesis in vitro and ovariectomy (OVX)-induced osteoporosis in vivo. GFE (10∼250 μg/mL) inhibited the receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced osteoclast proliferation and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity. The RANKL-induced protein expression of nuclear factor of activated T cells c1 and TRAP, which are the key transcription factors for osteoclastogenesis, was also decreased by a treatment with GFE. On the other hand, female rats were assigned to five experimental groups: SHAM (sham-operated), OVX-CON (OVX), OVX-GFE20 (OVX+GFE 20 mg/kg/d), OVX-GFE200 (OVX+GFE 200 mg/kg/ d), and OVX-E2 (OVX+estradiol 10 μg/kg/d). After six weeks, an analysis of various bone-related serum parameters showed that the levels of alkaline phosphatase, osteocalcin, TRAP, and RANKL decreased after the administration of GFE. 3D micro-CT analysis showed that the low bone density that developed in the OVX-CON group was reversed in the OVX-GFE20 and OVX-GFE200 groups. H&E and Safranin-O staining revealed less bone destruction in the OVX-GFE groups than in the other groups. Therefore, GFE may serve as a novel therapeutic agent for the treatment of osteoporosis.

Keywords: Gloiopeltis furcata, osteoclastogenesis, bone mineral density, osteoporosis, ovariectomy

최근 인구 노령화와 생활 습관의 서구화 등으로 만성 퇴행성 질환 유병률 증가에 대한 사회적 관심이 크게 증가하고 있으며, 그중 골다공증은 삶을 위협하는 매우 심각한 문제로 대두되고 있다. 골다공증은 골의 강도가 약화되어 골절 발생률이 매우 높아지는 전신적 질환으로, 특히 골 소실이 급격하게 진행되기 시작하는 폐경기 여성의 경우 골절로 파생되는 여러 합병증을 예방하기 위한 관리가 더욱 요구된다(Im 등, 2010; Lee와 Bak, 2009; Lee 등, 2022). 폐경은 난소에서 분비되는 에스트로겐(estrogen)의 대부분을 차지하는 estradiol(E2) 혈중 농도가 급격히 감소하는 현상으로, 에스트로겐은 세포막과 핵막에 존재하는 수용체(estrogen receptor)와 결합하여 파골세포의 분화에 관여한다(Kim, 2012; Park 등, 2010).

골조직은 파골세포에 의한 골 흡수와 조골세포에 의한 골 형성 과정을 반복적으로 작용시키는 대사기관으로, 파골세포를 활성화하는 cytokine인 receptor activator of nuclear factor κB ligand(RANKL)는 수용체인 RANK와의 결합과 길항제인 osteoprotegerin(OPG)과의 균형에 의해 파골세포의 활성을 조절한다. 이때 에스트로겐 결핍 및 부갑상선 호르몬 항진증 등의 원인으로 파골세포가 활성화되면 골 흡수가 더욱 촉진된다(Jeon과 Kim, 2011; Lim 등, 2009; Park 등, 2020). 이를 통해 유발된 골다공증과 같은 골 관련 질환의 치료나 예방에는 내인성 조절인자들, 특히 bisphosphonate와 같은 골 흡수 억제제가 주로 이용되고 있으나, 이들은 부작용과 복용상의 어려움 등의 한계가 있는 것으로 알려져 있다. 또한 이미 소실된 뼈 질량을 회복시키는 것은 불가능하므로, 최근에는 독성과 부작용이 적으며 골다공증의 예방 및 치료에 효과적인 천연물질에 관한 연구의 필요성이 강조되고 있다(Kwon 등, 2022; Nam 등, 2015).

해조류는 알긴산, 카라기난, 한천 등의 다당류를 주로 하는 탄수화물과 무기질, 단백질, 지질 등이 풍부해 기능성 식품, 의약품 등으로 다양하게 이용되며, 특히 높은 항산화 활성을 가지는 폴리페놀계 물질을 함유한 것으로 알려져 있다(Do 등, 1997; Lee와 Hong, 2017a; Wang 등, 2023). 그중 해수 온도 상승으로 인해 국내 해양 생태계에서의 비중이 높아지고 있는 홍조류는 홍조식물문(Rhodophyta)에 속하는 조류로 약 400속 4,000여 종이 알려져 있으며, 53~70%의 총 탄수화물 함량과 아가로스, 카라기난 및 포피란 등의 다당류를 함유하고 있어 항산화, 항염증, 항암, 면역증진 활성 등 다양한 기능성이 있는 것으로 보고되고 있다(Hong 등, 2014; Kim과 Lee, 2023; Lee와 Hong, 2017a). 본 연구에 사용된 불등풀가사리(Gloiopeltis furcata)는 홍조식물문 진정홍조강(Florideophyceae) 풀가사리과(Endocladiaceae)로, 우리나라 남해안의 조간대 상부를 대상으로 군락을 이루어 분포하며, 나뭇가지 모양의 형태로 바위나 돌 등에 붙어 서식한다(Kim 등, 2021; Kwon, 2016). 불등풀가사리에 관한 연구로는 피부 주름 개선 효과(Lee와 Hong, 2017b), 백혈병세포 증식 억제 효과(Choi 등, 2006), 암세포 증식 억제 효과(Park 등, 2005) 및 항산화 효과(Fang 등, 2010; Lee와 Hong, 2017b), 조골세포 분화 효과(Kang 등, 2023) 등이 보고되어 있으나, 파골세포 형성 및 동물 실험을 이용한 골다공증 예방 효과에 관련된 연구는 전무한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 불등풀가사리 추출물이 골 형성에 미치는 영향을 세포 실험과 동물 실험을 통해 검토하였다. 먼저 골을 재흡수시키는 RANKL로 유도된 RAW 264.7 파골세포를 이용하여 성장 억제능, tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) 활성 및 파골세포 분화인자의 단백질 발현정도를 확인하였다. 이상의 실험 결과를 바탕으로 난소적출로 갱년기 장애가 유도된 골다공증 동물모델에 불등풀가사리 추출물을 급여 후, 골밀도 측정, 골 용해지표분석 등을 통하여 불등풀가사리 추출물이 골 형성 및 골 대사에 미치는 영향을 규명하고자 하였다.

실험 재료 및 시료 제조

본 연구에 사용한 불등풀가사리는 제주도에서 채취하여 세척 후 자연 건조한 분말 형태의 제품으로 (주)파라제주에서 구입하여 시료로 사용하였다. 불등풀가사리 분말에 10배량의 80% 에탄올(Avantor Inc.)을 가하여 80°C에서 8시간 동안 2회 추출하였다. 추출물은 Whatman No. 2 filter paper(Whatman International Ltd.)로 2회 여과하여 rotary vacuum evaporator(EYELA N-1000, Rikakikai Co.)로 농축한 다음, 동결건조 장치(Ilshin BioBase)를 사용하여 동결건조한 후 -70°C에 보관하면서 실험에 사용하였다. 불등풀가사리 에탄올 추출물의 수율은 4.33%였다.

RAW 264.7 파골세포의 배양 및 분화

Mouse monocyte/macrophage인 RAW 264.7 cell은 한국세포주은행에서 분양받아 실험에 사용하였다. 세포는 Dulbecco’s modified Eagle medium에 10% fetal bovine serum(Thermo Fisher Scientific)과 1% penicillin(Thermo Fisher Scientific)을 첨가하여 37°C, 5%의 CO2 incubator (Panasonic Healthcare Holdings Co.)에서 3일마다 배지 교환을 하면서 실험에 사용하였다. 파골세포로의 분화유도를 위해 50 ng/mL RANKL(Sigma Aldrich Co.)을 첨가하여 분화유도 배지를 제조하여 처리했으며, 5일 동안 2일마다 배지를 교환하였다.

Cell proliferation 측정

세포의 증식은 Green 등(1984)의 방법에 의한 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT) assay로 측정하였다. 배양한 RAW 264.7 cell을 5×103 cells/mL로 조정하여 96-well plate에 분주하여 24시간 배양한 후, 파골세포 분화유도 배지로 교환하여 5일간 배양하였다. 그 후 대조군과 함께 농도별로 준비된 불등풀가사리 추출물을 첨가한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 MTT(0.5 mg/mL) 시약을 각각의 well에 첨가하고 CO2 incubator에서 4시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide를 첨가하여 생성된 불용성 formazan 결정을 용해시킨 뒤 ELISA reader(Thermo Fisher Scientific)로 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 증식률은 불등풀가사리 추출물의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

TRAP 활성 측정

파골세포의 분화 정도를 Hotokezaka 등(2002)의 방법에 따라 TRAP 활성을 통해 측정하였다. 배양한 RAW 264.7 cell을 1×104 cells/mL로 조정하여 6-well plate에 24시간 배양한 후 파골세포 분화유도 배지로 교환하여 5일간 배양하고, 불등풀가사리 추출물을 농도별로 첨가하여 24시간 배양하였다. 배지를 제거해 세척하고 원심분리기를 이용하여 세포를 harvest 한 후 0.1% triton X-100을 넣고 CO2 incubator에서 1시간 lysis 시켰다.

Lysate의 단백질량은 표준시료로 bovine serum albumin(BSA)을 사용하여 표준 곡선을 작성한 후 정량하였다. 얻어진 양에 TRAP 용액[0.1 M sodium acetate(pH 5.8), 1 mM ascorbic acid, 0.15 M KCl, 10 mM disodium tartrate, 10 mM p-nitrophenyl phosphate]을 첨가한 뒤 CO2 incubator에서 30분간 반응시킨 후 0.3 N NaOH를 첨가하여 반응을 정지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Western blot 분석

Western blotting 분석법을 통해 대표적인 파골세포 분화 인자인 nuclear factor of activated T cells c1(NFATc1)과 TRAP의 단백질 발현 양상을 살펴보았다. RAW 264.7 세포를 T-75 플라스크에 5×105 cells/mL로 분주하여 5일 동안 파골세포 분화 유도 배지로 배양한 뒤, 불등풀가사리 추출물을 처리하여 CO2 incubator에서 24시간 동안 분화 배양하였다. RIPA buffer를 첨가하여 원심분리한 상층액을 취해 BCA kit(Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용하여 단백질 농도를 정량하였다. 정량한 값을 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamaide gel에서 전기영동을 이용하여 단백질을 분리하였다(Schägger와 von Jagow, 1987). 분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride membrane에 100 V로 1시간 transfer 한 후 5% skim milk에 넣어 상온에서 1시간 blocking 시킨 후 TBS-T로 15분간 3회 세척하였다. NFATc1(Santacruz, 1:1,000), TRAP(Santacruz, 1:1,000)로 희석한 1차 항체를 처리하여 12시간 반응시킨 후 TBS-T로 15분간 3회 세척한 다음 2차 항체로 horseradish peroxidase와 결합한 anti-rabbit IgG와 anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology)를 1:3,000으로 희석하여 1시간 반응시켰다. 그 후 membrane을 TBS-T로 15분간 5회 세척한 다음 ECL kit(Bio-Rad Laboratories Inc.)을 사용하여 Luminescent Image Analyzer Davinch-ChemiTM(Davinch-K Co., Ltd.)를 통해 단백질 발현량을 측정하였다.

실험동물 사육 및 관리

실험동물로 평균 체중 220~260 g, 9주령에 난소적출 수술을 진행한 암컷 흰쥐(Sprague-Dawley) 30마리를 오리엔트제니아에서 분양받아 약 5일간 고형 사료를 급여하며 적응시킨 후, 난괴법(randomized complete block design)으로 각 군을 나누어 실험을 진행하였다. 실험동물은 총 5개의 군으로 분류하였으며, 개복수술만 진행한 비난소적출 대조군(SHAM), 난소적출 대조군(OVX-CON), 난소적출 후 골다공증 치료 약물인 E2 10 μg/kg/d를 경구투여한 약물대조군(OVX-E2), 난소 절제 후 불등풀가사리 추출물 20 mg/kg/d 투여군(OVX-GFE20), 난소 절제 후 불등풀가사리 추출물 200 mg/kg/d 투여군(OVX-GFE200)으로 각 6마리씩 5군으로 나누어, 1 mL의 시료를 매일 투여하며 6주간 사육하였다(Table 1).

Table 1 . Experimental design of animals

Group (No.)1)Treatment
SHAM (6)Sham-operated rats
OVX-CON (6)Ovariectomized rats
OVX-E2 (6)Ovariectomized rats supplemented with estradiol 10 μg/kg bw/d
OVX-GFE20 (6)Ovariectomized rats supplemented with Gloiopeltis furcata ethanol extract 20 mg/kg bw/d
OVX-GFE200 (6)Ovariectomized rats supplemented with Gloiopeltis furcata ethanol extract 200 mg/kg bw/d

1)Number of rats.



실험 시료는 증류수로 용해하였으며, 대조군은 동일 용량의 증류수를 투여하였다. 실험 기간의 식이 섭취량과 체중은 매주 일정한 시간에 측정하였다. 동물실험실의 사육조건은 온도 24±2°C, 습도 50~55%를 유지했고, 물과 식이는 제한 없이 제공하였다. 본 동물 실험의 모든 과정은 신라대학교 동물실험 윤리위원회의 승인(승인번호: SUACAC-2018-009) 후 지침에 따라 수행하였다.

해부 후 혈액 채취 및 장기 적출

실험 종료 후, 혈액 채취 및 장기 적출을 위해 해부하였다. 해부 전 24시간 절식시켰으며, 동물용 전신마취제인 ketamine(Yuhan Corporation)을 복강 투여하여 마취한 후 개복하여 복대정맥에서 혈액을 채취하였다. 혈액의 생화학적 분석을 위해 상온에서 30분간 방치한 후, 190×g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하여 사용하였다. 자궁 조직은 적출하여 주위의 지방과 물기를 제거하였고, 관절 부위의 조직은 채취하여 10% formaldehyde로 고정해 보관하며 실험을 진행하였다.

골 관련 혈청 parameter 측정

골 관련 인자들의 혈청 parameter 측정을 위해 혈청 alkaline phosphatase(ALP)와 혈청 calcium은 측정용 kit인 FUJI DRI-CHEM slide를 사용해 자동생화학분석기 DRI CHEM 3600i로 분석하였다.

Collagen type 1의 효소인 cross linked C-telopeptide of type Ⅰ collagen(CTxⅠ)과 cross linked N-telopeptide of type Ⅰ collagen(NTxⅠ) level은 ELISA kit(Elabscience)을 사용하여 정량하였다. 또한 potassium ELISA kit(MyBioSource), osteocalcin(OC/BGP) ELISA kit(Elabscience), TRAP ELISA kit(MyBioSource), RANKL mouse ELISA kit(Abcam)을 사용하여 ELISA reader로 흡광도를 측정해 값을 분석하였다.

Mocro CT 측정 및 연골의 조직학적 검사

흰쥐의 대퇴골 골밀도 측정은 micro CT(Viva CT80, Scanco Inc.)를 사용하여 촬영하였다. 촬영된 이미지는 CTAn 프로그램을 통해 분석하였으며, 이는 (주)노터스에 의뢰하여 시험 분석하였다.

실험 종료 후 채취한 연골 조직을 조직 포매한 후, 표본을 4 μm 두께로 절삭하여 슬라이드에 부착하였다. 절삭된 조직은 hematoxylin-eosin(H&E, Sigma Aldrich Co.), safranin O-fast green(Sigma Aldrich Co.)으로 염색하였으며, 염색 후 광학현미경으로 40× 배율로 조직학적 관찰을 시행하였다. 이는 (주)노터스에 의뢰하여 시험 분석하였다.

통계처리

실험 결과는 통계 SAS package(Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc.)를 사용하여 각 시료의 평균과 표준편차를 계산하였고, 분산분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test를 실시하여 P<0.05에서 시료 간의 유의차를 검정하였다.

RAW 264.7 파골세포의 성장 억제 효과

파골세포는 다핵성 세포로 조혈모세포로부터 유래하여 단핵 대식세포로부터 분화되며, 일반적으로 전구체에서 macrophage stimulating factor(M-CSF)와 수용체가 결합하면 파골세포의 생존과 분화에 대한 신호를 전달하게 된다(Kim 등, 2011; Yoo 등, 2007).

본 연구에서는 RANKL로 유도된 RAW 264.7 파골세포를 이용한 불등풀가사리 추출물의 농도에 따른 성장억제능을 측정하였으며, 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 파골세포의 성장억제능을 측정한 결과, 대조군과 비교해 10~100 μg/mL의 농도로 처리한 불등풀가사리 추출물군에서 농도 의존적으로 유의적인 세포 성장 억제를 확인하였다. 특히, 불등풀가사리 추출물 처리 100 μg/mL 농도에서 대조군 대비 세포 생존율이 73.54%로 감소하였다. 따라서 불등풀가사리 추출물은 파골세포 증식 억제 효과가 있는 것으로 사료되며, 농도 100 μg/mL를 최대 농도로 설정하여 다음 실험을 진행하였다.

Fig. 1. Effect of Gloiopeltis furcata ethanol extract on proliferation in RAW 264.7 osteoclastic cells. RAW 264.7 cells were cultured for 5 days with RANKL (50 ng/mL) in the presence of various concentrations of Gloiopeltis furcata ethanol extract as indicated. Cell proliferation was measured by MTT assay. Values with different letters (a-c) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

TRAP 활성

파골세포는 골을 흡수하는 세포로서 TRAP 양성 다핵세포로 골수의 colony forming unit-macrophage(CFU-M) 세포로부터 유래되며, 이들 세포의 증식, TRAP 발현 및 융합 과정을 거쳐 분화한다(Choi 등, 2007).

본 연구에서는 불등풀가사리 추출물의 파골세포 분화 억제 효과를 확인하기 위해 TRAP 활성을 측정하였다(Fig. 2). RANKL을 처리하여 파골세포로 분화를 유도하여 실험하였으며, 그 결과, 10~100 μg/mL의 농도로 처리한 불등풀가사리 추출물군은 대조군과 비교해 유의적으로 TRAP 활성을 감소시킴을 확인하였다. 특히 100 μg/mL 농도의 불등풀가사리 추출물을 처리하였을 때 TRAP 활성이 78%로 감소하였다. Kim(2013)의 연구 결과에 의하면 같은 해조류에 속하는 패 에탄올 추출물의 TRAP 활성은 농도 100 μg/mL에서 대조군과 비교하여 약 76% 정도로 나타난다고 보고하였으며, 본 연구에서 사용한 불등풀가사리 추출물 역시 유사한 TRAP 저해 활성을 보여주었다. 따라서 불등풀가사리 추출물은 TRAP 활성 저해를 통해 파골세포 분화 억제에 효과가 있는 것으로 사료된다.

Fig. 2. Effect of Gloiopeltis furcata ethanol extract on TRAP activity of RAW 264.7 osteoclastic cells. RAW 264.7 cells were cultured for 5 days with RANKL (50 ng/mL) in the presence of various concentrations of Gloiopeltis furcata ethanol extract as indicated. Values with different letters (a-c) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Western blot 분석을 통한 파골세포 분화인자 단백질 발현

파골세포의 분화에는 조골세포로부터 분비되는 cytokine인 M-CSF와 RANKL이 필수적이며, RANKL이 전구세포의 RANK에 결합하면 NF-κB, c-Fos, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성이 증가하여 파골세포의 분화가 촉진된다(Lee 등, 2010; Park, 2015). 특히 NFATc1은 표적유전자 promoter의 결합 부위에 결속함으로써 파골세포 분화 지표인 TRAP, OSCAR, CTR 등의 발현을 촉진한다(Lee 등, 2010; Park, 2015). 따라서 파골세포 분화의 중요한 전사인자인 NFATc1과 TRAP의 발현에 불등풀가사리 추출물이 미치는 영향을 측정하였다.

실험 결과, RANKL의 처리로 파골세포 분화유도를 확인하였으며, 불등풀가사리 추출물 처리는 파골세포 분화 시 발현되는 NFATc1 및 TRAP의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다(Fig. 3). 특히 불등풀가사리 추출물 100 μg/mL 농도에서 NFATc1과 TRAP의 단백질 발현이 유의적으로 억제되는 것으로 나타났다.

Fig. 3. Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on RANKL-incued osteoclastogenesis-specific protein expressions. (A) The protein expressions of the NFATc1 and TRAP were detected by western blotting. (B) Relative expression was quantified by densitometry using image J program and calculated according to the reference band densities of β-actin. Values with different letters (a-c) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Beak 등(2013)은 산토끼꽃과 식물인 천속단(Phlomis umbrosa Turcz.)이 NFATc1 및 c-Fos 등의 단백질 발현을 억제한다고 보고하였으며, Chung 등(2017)의 연구 결과에서는 한약재 천수근(Harpagophytum procumbens)의 활성 성분인 harpagoside가 TRAP, NFATc1 및 c-Fos 등의 발현을 억제함으로써 파골세포 분화를 조절하는 관절염의 치료제로 사용될 수 있다고 보고하였다. 본 연구에서 불등풀가사리 추출물 또한 파골세포 분화 지표 단백질 수준을 조절하여 발현을 감소시킴으로써 파골세포 분화 억제능을 나타낸 것으로 보아, 골다공증을 비롯한 골 관련 질환의 치료 및 예방의 후보 물질로 사용 가능할 것으로 판단된다.

불등풀가사리 추출물이 난소적출 흰쥐의 체중 및 식이효율에 미치는 영향

앞선 세포 실험에서 불등풀가사리 추출물의 파골세포 분화억제 활성을 확인하였으며, 이를 바탕으로 난소적출을 통해 갱년기를 유도한 골다공증 동물모델에서 불등풀가사리 추출물의 골 대사 변화에 미치는 영향을 검토하였다. 9주령 암컷 쥐의 난소를 적출하여 인위적으로 갱년기 장애를 유도하였으며, 총 6주의 실험 기간에 주 1회 측정한 체중의 결과와 식이, 식수 섭취량 결과 및 식이효율 값을 Table 2에 나타내었다.

Table 2 . Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on body weight gain, food intake, and food efficiency ratio of ovariectomized rats for 6 weeks

Group1)SHAMOVX-CONOVX-E2OVX-GFE20OVX-GFE200
Final body weight (g)319.85±11.04c2)3)379.03±21.95a348.83±10.45b358.48±17.88ab358.13±7.81ab
Body weight gain (g/d)0.93±1.05NS4)1.75±1.060.96±1.081.18±0.981.16±0.85
Food intake (g/d)19.88±1.66NS22.06±3.6520.57±2.3821.2±2.5221.21±3.28
Water intake (mL/d)26.93±2.93NS30.29±13.5128.80±4.1725.61±3.4426.87±5.54
FER (%)5)4.70±0.40b7.92±1.35a4.68±0.55b5.57±0.67b5.45±0.87b

1)Refer the legend to Table 1.

2)All values are mean±SD (n=6).

3)Values with different superscripts (a-c) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

4)NS: Not significantly different among group.

5)FER (food efficiency ratio): Body weight gain/ Dietary intake×100.



일반적으로 여성은 폐경 후 체내 콜레스테롤이 에스트로겐으로 전환되는 비율이 감소하면서 혈중 콜레스테롤이 상승하고 지방조직의 증가로 인해 내장지방이 증가하게 되며, 난소를 적출한 실험동물 역시 에스트로겐이 결핍되어 전반적으로 체중이 증가하게 된다(Lim 등, 2023). 실험 결과, 난소를 절제하지 않고 복부수술만 진행한 SHAM군과 난소를 절제한 OVX-CON군의 최종 체중 증가량을 비교하였을 때, 유의적으로 OVX-CON군의 체중이 증가하였다. 반면 약물대조군인 E2를 처리한 OVX-E2군의 경우 OVX-CON군과 비교하여 체중이 유의적으로 감소하였다. 한편, OVX-GFE20, OVX-GFE200군의 경우, OVX-CON군보다 최종 체중이 감소하는 결과가 나타났으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 본 실험 결과는 E2 섭취가 갱년기 여성의 에스트로겐 결핍으로 인한 내장지방 및 콜레스테롤 증가를 효과적으로 억제할 수 있음을 보여주며, 불등풀가사리 추출물 또한 일부 억제 효과가 있는 것으로 나타나 장기간 섭취 시 더욱 큰 체중감소 효과가 있을 것으로 사료된다.

한편 식이 및 식수 섭취량은 군별로 유의적인 차이가 없었으며, SHAM군과 OVX-CON군의 식이효율을 비교하였을 때, 유의적으로 OVX-CON군의 식이효율이 증가하였다. OVX-GFE20, OVX-GFE200군과 약물대조군 OVX-E2군은 SHAM군과 비교하여 유의적인 차이가 없었다.

불등풀가사리 추출물이 난소적출 흰쥐의 자궁 무게에 미치는 영향

군별 자궁 무게를 측정하여 Table 3에 나타내었다. 난소를 절제한 OVX-CON군의 난소 무게는 난소를 절제하지 않은 SHAM군보다 유의적으로 낮은 것으로 나타났으며, OVX-GFE20, OVX-GFE200군의 자궁 무게는 OVX-CON군과 비교하여 증가하는 경향을 나타내었다. 특히, 약물대조군 OVX-E2군과 비교하여 불등풀가사리 추출물을 200 mg/kg 투여한 OVX-GFE200군의 자궁 무게가 거의 유사한 값으로 나타났다.

Table 3 . Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on uterus weight in ovariectomized rats

Group1)SHAMOVX-CONOVX-E2OVX-GFE20OVX-GFE200
Uterus (g)1.08±0.38a2)3)0.11±0.01b0.24±0.05b0.13±0.05b0.20±0.17b

1)Refer the legend to Table 1.

2)All values are mean±SD (n=6).

3)Values with different superscripts (a,b) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.



폐경이 진행되면 자궁조직이 위축되어 자궁 중량이 감소하며, 에스트로겐 유사 활성 성분이 난소적출로 인해 비대해지는 지방세포 크기를 감소시킴으로써 자궁 주위 지방 무게가 감소한다는 연구가 보고된 바 있다(Lim 등, 2023). 본 연구 결과에 따르면 난소적출로 인한 자궁의 퇴화가 일어나 OVX-CON군이 SHAM군에 비해 자궁의 무게가 감소하였으며, 불등풀가사리 추출물과 E2의 투여는 갱년기 자궁 조직 위축 감소에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

불등풀가사리 추출물이 난소적출 흰쥐의 골 관련 혈청 parameter 변화에 미치는 영향

염기성 인산분해효소인 ALP는 세포 외에서 세포 내로 기질 운반에 관여하는데, 조골세포에서는 ALP를 생성하여 세포막의 소포에 저장하며 이 중 일부가 혈액 내로 유리된다. 따라서 혈청 ALP는 골 질환으로 인한 파괴가 주된 질환에서 증가하는 양상을 나타낸다(Moon 등, 2015). Osteocalcin (OCN)은 골아세포와 상아세포에서만 생산되는 골격 산성단백질로, 폐경기 이후 골 교체율이 급증하면서 혈청 OCN 수치는 약 2배 이상 증가하는 것으로 알려져 있다. 이는 폐경 후 골절위험도 증가와 밀접한 관련이 있어 골다공증 평가에 유용한 생화학적 지표로 보고되고 있다(Bhatnagar와 Kekatpure, 2022). 본 연구에서 분석한 혈청 ALP 결과를 보면, OVX-CON군에서 SHAM군에 비해 유의적으로 수치가 증가했으며, OVX-GFE20, OVX-GFE200군에서는 OVX-CON군에 비해 유의적으로 수치가 감소하였다(Table 4). 또한 OCN 역시 OVX-CON군에서 SHAM군에 비해 유의적으로 수치가 증가하였으며, OVX-GFE20, OVX-GFE200군에서는 OVX-CON군에 비해 유의적으로 감소하는 결과를 보였다. 따라서 본 연구 결과로 미루어보아 불등풀가사리 추출물 투여는 폐경기 여성의 골 교체율을 지연시키며, 골절위험도 감소에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

Table 4 . Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on the serum bone parameters in ovariectomized rats

Group1)SHAMOVX-CONOVX-E2OVX-GFE20OVX-GFE200
ALP (U/L)180.17±25.96c2)3)631.33±17.26a445.00±19.50b480.00±96.50b244.83±71.67c
Calcium (mg/dL)12.07±0.59NS4)12.30±0.2912.38±0.7112.10±0.1412.08±1.24
Potassium (mg/dL)5.27±0.44NS5.44±0.975.21±0.345.22±0.635.27±1.19
OCN (ng/mL)6.17±0.20ab10.22±0.02a5.74±1.30ab6.87±3.89ab5.31±3.67b
CTx (ng/mL)1.01±0.23b3.81±0.58a1.94±0.02ab2.83±2.45ab1.78±1.61ab
NTx (ng/mL)38.78±10.32b82.77±9.68a33.41±0.02b38.52±13.53b20.71±18.66b
TRAP (U/L)4.34±4.23b16.59±10.74a4.44±5.71b2.71±1.54b1.60±1.29b
RANKL (pg/mL)275.69±1.21d404.92±26.11a341.46±4.90c378.00±16.46b340.31±19.16c

1)Refer the legend to Table 1.

2)All values are mean±SD (n=6).

3)Values with different superscripts (a-d) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

4)NS: Not significantly different among group.



다음으로 혈청 칼슘과 칼륨의 농도를 측정한 결과, 모든 군에서 정상 범위 내의 수치를 나타내었으나 군별 유의적인 차이를 나타내지는 않았다(칼슘, 7.2~13.0 mg/dL; 칼륨, 3.5~5.5 mg/dL).

한편, 뼈의 기질 중 90%를 차지하는 제1형 콜라겐은 2개의 α1 사슬과 1개의 α2 사슬로 구성되어 있고, 콜라겐에서 연결되는 부위는 N-말단단백(NTx), C-말단단백(CTx)으로 파골세포에 의해 연결사슬 형태로 유리되며, 이는 골 흡수를 반영하는 지표가 된다(Herrmann과 Seibel, 2008). 조골세포로부터 생성되는

RANKL은 파골세포의 형성과 활성을 촉진하며, 활성화된 파골세포에서 실제적 골 흡수 작용에 관여하는 TRAP 또한 골 흡수 지표로 골 밀도를 감소시키고 골다공증을 악화시킨다(Choi와 Hwang, 2017; Gravallese 등, 2001). 본 연구에서 분석한 골 흡수 parameter 결과를 살펴보면, CTx, NTx의 혈청 수준은 SHAM군과 비교해 OVX-CON군에서 증가하였으며, 약물대조군인 OVX-E2군과 불등풀가사리 추출물 투여군인 OVX-GFE20, OVX-GFE200군에서는 감소하여 OVX-CON군과 유의적인 차이를 보였다. RANKL과 TRAP 수치를 살펴보면, OVX-CON군에서는 혈청 수치가 증가하여 파골 세포 생성과 골 흡수를 위한 분화가 증가하였음을 확인하였고, OVX-E2, OVX-GFE20, OVX-GFE200군에서 수치가 유의적으로 감소하여 불등풀가사리 추출물이 그 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 그러므로 불등풀가사리의 성분은 난소 절제로 인한 골 손실을 효과적으로 조절하여 폐경 후 골밀도 증가에 긍정적인 효과가 있는 것으로 사료된다.

불등풀가사리 추출물이 난소적출 흰쥐의 골 밀도에 미치는 영향

불등풀가사리 추출물 급여가 골 밀도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 난소적출을 통해 흰쥐의 골 손실을 유도한 후, 추출물을 투여하고 대퇴골 샘플을 사용하여 골 밀도 측정 실험을 진행하였으며, 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 3D Micro CT로 대퇴골의 골 밀도를 분석한 결과, SHAM군과 비교하여 OVX-CON군의 대퇴골에서 섬유 골 파괴가 증가하였으며, 불등풀가사리 추출물 투여 OVX-GFE20과 OVX-GFE200군은 OVX-CON군에 비해 유의적으로 섬유 골 파괴가 줄어든 것으로 나타나 높은 골 손실 회복력을 보여주었다.

Fig. 4. Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on the distal femurs in rats, as visualized by bone 3D micro-CT imaging.

골의 부피 대비 골 표면적(bone surface area/ bone volume)과 가지 모양의 작은 기둥으로 이루어진 중앙부의 해면 골소주(잔기둥)의 간격(trabecular separation)은 SHAM군과 비교하여 OVX-CON군에서 증가하였으며, OVX-E2군과 불등풀가사리 추출물 투여 OVX-GFE20과 OVX-GFE200군은 유의적으로 감소하였다(Fig. 5). 또한 골 밀도(bone mineral density), 골의 용적비(bone volume/ total volume, BV/TV), 해면 골소주 수(trabecular number), 해면 골소주 두께(trabecular thickness)는 SHAM군과 비교해 OVX-CON군에서 감소하는 경향을 나타내었으며, E2와 불등풀가사리 추출물 투여군에서 증가하였다.

Fig. 5. Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on the bone morphometric parameters BMD (mg/cc), BV/TV (%), trabecular number (mm), trabecular thickness (1/mm), and trabecular separation (mm), as analyzed by micro-CT CTAn software. Values with different letters (a-d) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

보통 사람의 경우 대퇴골 골절은 폐경까지 서서히 증가하는 경향을 보이다가 폐경 이후 기하급수적으로 증가한다는 보고에 근거하여 볼 때(Ye 등, 2017), 본 연구 역시 골 밀도에 있어 일치하는 결과를 나타내었으며, 결론적으로 불등풀가사리 추출물 투여는 에스트로겐 결핍 상태의 대퇴부 골 밀도 감소 지연 효과가 있는 것으로 판단된다.

불등풀가사리 추출물이 난소적출 흰쥐의 연골 조직 변화에 미치는 영향(근위 대퇴골 섬유주 조직)

콜라겐과 proteoglycan으로 구성된 관절의 연골 조직 중 proteoglycan은 쇼크 작용으로부터 조직의 섬유와 세포 성분을 보호하고 압박을 견디는 탄성을 갖고 있으며, proteoglycan의 합성을 촉진하고 분해를 억제하는 치료 방법은 골관절염의 증상을 완화하는 주요 방법의 하나로 알려져 있다(An 등, 2012).

불등풀가사리 추출물 투여에 의한 조직학적 변화를 확인하기 위하여 H&E 염색 결과(Fig. 6A), SHAM군과 비교해 OVX-CON군에서 심한 연골 파괴와 골 침식, 침윤 등이 보였으며, OVX-E2군과 OVX-GFE20, OVX-GFE200군에서는 연골의 침식 정도가 크게 개선된 것으로 나타났다. 또한 safranin O-fast green 염색을 실시한 결과(Fig. 6B), SHAM군과 비교하여 OVX-CON군은 연골 주변과 활막 내에 붉은색으로 염색된 proteoglycan이 고르게 형성되어 있지 않아 관절 연골의 결손이나 미란이 심해졌으며, 약물대조군인 OVX-E2군의 경우 SHAM군과 유사한 정도로 회복된 것으로 나타났다. 불등풀가사리 추출물 OVX-GFE200군 역시 SHAM군과 유사하게 연골의 손상이 회복된 것을 확인할 수 있었다. 우리는 이전 연구에서도 난소 절제 흰쥐에 갈조류인 다시마 추출물을 급여한 결과, 피부와 연골 조직 중 콜라겐 함량 증가와 콜라겐의 성숙 가교물질인 pyridinoline 함량 증가를 확인한 바 있으며, 본 연구에서도 이와 일치하는 결과를 나타내었다(Lee와 Kim, 2008).

Fig. 6. Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on the trabecular bone tissue of the proximal femur in rats, as visualized by (A) hematoxylin-eosin (H&E) stain and (B) safranin O-fast green stain (magnification: 40× and scale bar: 4 μm, respectively).

따라서 본 연구 결과, 불등풀가사리 추출물 투여는 폐경 후 연골의 침식과 결손을 완화하는 효과가 있는 것으로 판단된다.

본 연구에서는 불등풀가사리 추출물이 파골세포 형성에 미치는 영향을 검토하고, 난소적출 흰쥐의 골다공증 동물모델을 이용하여 골 형성에 미치는 영향을 분석하였다. 우선 RANKL로 유도한 파골세포에 불등풀가사리 추출물을 10~100 μg/mL의 농도로 처리 후 세포 생존율을 확인한 결과, 대조군과 비교해 농도 의존적으로 유의적인 세포 성장 억제를 확인하였다. 파골세포의 분화 인자인 TRAP 활성 측정 결과, 100 μg/mL 농도의 불등풀가사리 추출물을 처리하였을 때 활성이 78%까지 감소하였다. 또한 추출물의 농도 10 μg/mL와 100 μg/mL 처리 시 파골세포 분화인자인 NFATc1, TRAP의 단백질 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 앞선 실험 내용을 바탕으로 난소적출로 골다공증을 유발한 흰쥐에서 불등풀가사리 추출물의 급여가 골 형성에 미치는 영향을 검토하였다. 식이효율은 난소를 절제한 OVX-CON군과 비교하여 다른 모든 군에서 감소하였으며, 자궁조직의 무게는 OVX-CON보다

다른 모든 군에서 높은 것으로 보아 불등풀가사리 추출물 투여로 인한 자궁조직 위축 감소를 확인하였다. 골 관련 혈청 parameter 분석 결과, 골 교체율이 높은 폐경기 또는 골 질환이 있을 때 값이 증가하는 ALP 및 OCN 수치는 SHAM군에 비해 OVX-CON군에서 증가하였으나, estradiol과 불등풀가사리 추출물 20, 200 mg/kg을 투여한 OVX-E2, OVX-GFE20, OVX-GFE200 군에서는 감소하는 것으로 나타났다. 또한 골 흡수 지표인 TRAP, RANKL의 수치는 OVX-CON군에서 증가하였으나, 불등풀가사리 추출물 투여군에서는 유의적으로 활성이 감소하였다. 그리고 난소적출을 통해 골 손실을 유도한 뒤, 대퇴골의 골밀도 및 조직학적 검사를 실시한 결과, SHAM군과 비교하여 OVX-CON군의 대퇴골에서 섬유 골 파괴가 증가하였으며, 불등풀가사리 추출물 투여군은 OVX-CON군과 비교해 유의적으로 골밀도 증가와 골 파괴 회복을 확인하였다. 이상과 같이 불등풀가사리 추출물은 파골세포 분화억제와 골 형성에 긍정적인 영향을 미치며, 향후 이를 활용한 식품 소재 및 기능성 식품 개발에 접목시켜 질병 예방 및 증상 완화에 있어 우수한 기능성 식품 소재로서 개발이 가능할 것으로 사료된다.

본 논문은 부산광역시 및 (재)부산테크노파크의 BB21plus 사업의 지원을 받아 수행된 연구결과이며 이에 감사드립니다.

  1. An HJ, Lee CK, Park JH, et al. Effects of bee venom on papain-induced osteoarthritis in an animal model. Kor J Pharmacogn. 2012. 43:167-172.
  2. Beak JM, Park JH, Song JH, et al. The effects of Phlomis umbrosa Turcz on osteoclast differentiation. Korean J Phys Anthropol. 2013. 26:115-123.
    CrossRef
  3. Bhatnagar A, Kekatpure AL. Postmenopausal osteoporosis: A literature review. Cureus. 2022. 14:e29367. https://doi.org/10.7759/cureus.29367.
    CrossRef
  4. Choi HK, Lee YS, Kim MY, et al. Induction of osteoclastogenesis-inducing cytokines and invasion by alive Aggregatibacter actinomycetemcomitans in osteoblasts. J Korean Acad Periodontol. 2007. 37:553-562.
    CrossRef
  5. Choi WY, Park C, Kim GY, et al. Induction of apoptosis by methanol extract of Gloiopeltis furcata in human leukemia cell line U937. J Mar Biosci Biotechnol. 2006. 1:76-83.
  6. Choi YK, Hwang GS. Effects of Gardeniae jasminoides on RANKL-induced osteoclastogenesis and bone resorption. J Int Korean Med. 2017. 38:1035-1048.
    CrossRef
  7. Chung HJ, Kim WK, Oh J, et al. Anti-osteoporotic activity of harpagoside by upregulation of the BMP2 and Wnt signaling pathways in osteoblasts and suppression of differentiation in osteoclasts. J Nat Prod. 2017. 80:434-442.
    Pubmed CrossRef
  8. Do JR, Nam YJ, Park JH, et al. Studies on chemical composition of red algae. J Korean Fish Soc. 1997. 30:428-431.
  9. Fang Z, Jeong SY, Jung HA, et al. Anticholinesterase and antioxidant constituents from Gloiopeltis furcata. Chem Pharm Bull. 2010. 58:1236-1239.
    Pubmed CrossRef
  10. Gravallese EM, Galson DL, Goldring SR, et al. The role of TNF-receptor family members and other TRAF-dependent receptors in bone resorption. Arthritis Res Ther. 2001. 3:6. https://doi.org/10.1186/ar134.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  11. Green LM, Reade JL, Ware CF. Rapid colormetric assay for cell viability: Application to the quantitation of cytotoxic and growth inhibitory lymphokines. J Immunol Methods. 1984. 70:257-268.
    Pubmed CrossRef
  12. Herrmann M, Seibel MJ. The amino- and carboxyterminal cross-linked telopeptides of collagen type I, NTX-I and CTX-I: A comparative review. Clin Chim Acta. 2008. 393:57-75.
    Pubmed CrossRef
  13. Hong CH, Kim SW, Kim YW, et al. Industrial applications of saccharification technology for red seaweed polysaccharide. KSBB Journal. 2014. 29:307-315.
    CrossRef
  14. Hotokezaka H, Sakai E, Kanaoka K, et al. U0126 and PD98059, specific inhibitors of MEK, accelerate differentiation of RAW 264.7 cells into osteoclast-like cells. J Biol Chem. 2002. 277:47366-47372.
    Pubmed CrossRef
  15. Im NK, Kim HJ, Kim MJ, et al. Effects of medicinal herb extracts on osteoblast differentiation and osteoclast formation. Korean J food Sci Technol. 2010. 42:637-642.
  16. Jeon MH, Kim M. Effect of Hijikia fusiforme fractions on proliferation and differentiation in osteoblastic MC3T3-E1 cells. J Life Sci. 2011. 21:300-308.
    CrossRef
  17. Kang JH, Jung KI, Park MH, et al. Effects of Gloiopeltis furcata extract on antioxidant activity and osteoblast differentiation. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2023. 52:450-459.
    CrossRef
  18. Kim BK. Effect of Ishige okamurae extracts on bone formation in vivo and in vitro test. Master's thesis. Silla University. 2013.
  19. Kim KJ. Effects of soy protein supplementation and treadmill running exercise on the changes of body composition, blood metabolic markers, estradiol, estrogen receptor gene expression in ovariectomized rats. Exercise Science. 2012. 21:243-254.
    CrossRef
  20. Kim MJ, Im NK, Yu MH, et al. Effects of extracts from sarcocarp, peels, and seeds of avocado on osteoblast differentiation and osteoclast formation. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2011. 40:919-927.
    CrossRef
  21. Kim SH, Kim JY, Jeon EB, et al. Quality and antioxidant activity of soybean curd supplemented with Gloiopeltis furcata juice. The Journal of Fisheries and Marine Sciences Education. 2021. 33:1326-1334.
    CrossRef
  22. Kim SH, Lee JB. A study on the antioxidative and anti-inflammatory properties of Gloiopeltis furcata extract obtained using different concentrations of ethanol. Asian J Beauty Cosmetol. 2023. 21:41-50.
    CrossRef
  23. Kwon DH. Anti-inflammatory function and biological activity of ethanol extract of Gloiopeltis furcata. Master's thesis. Dongeui University. 2016.
  24. Kwon JH, Seo HJ, Kwun IS, et al. Effects of cow milk-derived extracellular vesicles on the differentiation and mineralization of osteoblastic MC3T3-E1 cells. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2022. 51:1158-1165.
    CrossRef
  25. Lee DH, Hong JH. Biological activities and physicochemical properties of polysaccharides from Gloiopeltis furcata prepared by using various enzymes. Korean J Food Preserv. 2017a. 24:455-463.
    CrossRef
  26. Lee DH, Hong JH. Physicochemical properties and anti-wrinkle effect of polysaccharides with different molecular weights from Gloiopeltis furcata. Korean J Food Preserv. 2017b. 24:688-696.
    CrossRef
  27. Lee HY, Bak WS. The risk factors of osteoporosis in Korean postmenopausal women. Journal of Korean Academy of Adult Nursing. 2009. 21:303-313.
  28. Lee JM, Kim NH, Lee EJ. The effects of oral administration of deer antler extracts on an osteoporosis-induced animal model: A systematic review and meta-analysis. J Korean Med Rehabi. 2022. 32:65-81.
    CrossRef
  29. Lee SM, Kim MG, Lee SY, et al. Effects of Artemisia princeps extract on bone metabolism. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2010. 39:363-368.
    CrossRef
  30. Lee YA, Kim M. Effects of sea tangle extract on formation of collagen and collagen cross-link in ovariectomized rats. J Life Sci. 2008. 18:1578-1583.
    CrossRef
  31. Lim HR, Ji ES, Byun HK, et al. Effect of Gastrodia elata Blume extract (TVB-1000) on the menopausal disorder model in ovariectomized rats. J Life Sci. 2023. 33:252-259.
  32. Lim YW, Sun DH, Kim YS. Osteoporosis: Pathogenesis and fracture prevention. J Korean Hip Soc. 2009. 21:6-16.
    CrossRef
  33. Moon JY, Cho EJ, Joo SJ, et al. Effect of calcium extracted from salt-fermented anchovy Engraulis japonicus on osteoporosis in ovariectomized SD-rats. Korean J Fish Aquat Sci. 2015. 48:426-431.
    CrossRef
  34. Nam SY, Kim NS, Lee YM, et al. Effects of Oryza sativa L. aleurone layer extract on bone mineral density and bone-related markers in the ovariectomized rat. Kor J Pharmacogn. 2015. 46:167-172.
  35. Park K, Ju WC, Yeo JH, et al. Conditioned medium of soybean extract treated osteoblasts inhibits RANKL induced differentiation of osteoclasts. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2010. 39:64-70.
    CrossRef
  36. Park KL. Relationship between the regulator of calcineurin 1-4 isoform and in vitro osteoclast differentiation. J Life Sci. 2015. 25:223-230.
    CrossRef
  37. Park SH, Kang SH, Yoon JH. Effects of exercise detraining on BMD, bone metabolism marker and OPG, RANKL mRNA expression of bone marrow cell in ovariectomized rats. J Korean Soc Living Environ Sys. 2020. 27:184-192.
    CrossRef
  38. Park SY, Jung BM, Choi YH, et al. Growth inhibition effects of cancer cell lines by Gloiopeltis furcata fractions in vitro. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2005. 34:771-775.
    CrossRef
  39. Schägger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem. 1987. 166:368-379.
    Pubmed CrossRef
  40. Wang Q, Yan J, Im Y, et al. In vitro screening of seaweed ethanol extracts for anti-inflammatory and anti-obesity properties. Korean J Food Sci Technol. 2023. 55:50-56.
    CrossRef
  41. Ye T, Cao P, Qi J, et al. Protective effect of low-dose risedronate against osteocyte apoptosis and bone loss in ovariectomized rats. PLoS One 2017.. 12:e0186012. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0186012.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  42. Yoo M, Youn Y, Lee N, et al. Cellular proteins related to osteoclastogenesis in RAW 264.7 cells. Cancer Prevention Research. 2007. 12:310-318.

Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(4): 340-349

Published online April 30, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.340

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

불등풀가사리 추출물이 파골세포 형성 및 난소적출 흰쥐의 골다공증에 미치는 영향

강정현․박미화․정경임․김미향

신라대학교 보건복지대학 식품영양학과

Received: February 13, 2024; Accepted: February 27, 2024

Effects of Gloiopeltis furcata Extract on Osteoclastogenesis and Osteoporosis in Ovariectomized Rats

Jeong Hyeon Kang , Mi Hwa Park , Kyung Im Jung , and Mihyang Kim

Department of Food and Nutrition, College of Health and Welfare, Silla University

Correspondence to:Mihyang Kim, Department of Food and Nutrition, College of Health and Welfare, Silla University, 140, Baegyang-daero 700beon-gil, Sasang-gu, Busan 46958, Korea, E-mail: mihkim@silla.ac.kr

Received: February 13, 2024; Accepted: February 27, 2024

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Osteoporosis is an age-dependent metabolic bone disease characterized by reduced bone mass. Postmenopausal women with estrogen deficiency are at high risk of developing osteoporosis. This study examined the effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract (GFE) on osteoclastogenesis in vitro and ovariectomy (OVX)-induced osteoporosis in vivo. GFE (10∼250 μg/mL) inhibited the receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced osteoclast proliferation and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity. The RANKL-induced protein expression of nuclear factor of activated T cells c1 and TRAP, which are the key transcription factors for osteoclastogenesis, was also decreased by a treatment with GFE. On the other hand, female rats were assigned to five experimental groups: SHAM (sham-operated), OVX-CON (OVX), OVX-GFE20 (OVX+GFE 20 mg/kg/d), OVX-GFE200 (OVX+GFE 200 mg/kg/ d), and OVX-E2 (OVX+estradiol 10 μg/kg/d). After six weeks, an analysis of various bone-related serum parameters showed that the levels of alkaline phosphatase, osteocalcin, TRAP, and RANKL decreased after the administration of GFE. 3D micro-CT analysis showed that the low bone density that developed in the OVX-CON group was reversed in the OVX-GFE20 and OVX-GFE200 groups. H&E and Safranin-O staining revealed less bone destruction in the OVX-GFE groups than in the other groups. Therefore, GFE may serve as a novel therapeutic agent for the treatment of osteoporosis.

Keywords: Gloiopeltis furcata, osteoclastogenesis, bone mineral density, osteoporosis, ovariectomy

서 론

최근 인구 노령화와 생활 습관의 서구화 등으로 만성 퇴행성 질환 유병률 증가에 대한 사회적 관심이 크게 증가하고 있으며, 그중 골다공증은 삶을 위협하는 매우 심각한 문제로 대두되고 있다. 골다공증은 골의 강도가 약화되어 골절 발생률이 매우 높아지는 전신적 질환으로, 특히 골 소실이 급격하게 진행되기 시작하는 폐경기 여성의 경우 골절로 파생되는 여러 합병증을 예방하기 위한 관리가 더욱 요구된다(Im 등, 2010; Lee와 Bak, 2009; Lee 등, 2022). 폐경은 난소에서 분비되는 에스트로겐(estrogen)의 대부분을 차지하는 estradiol(E2) 혈중 농도가 급격히 감소하는 현상으로, 에스트로겐은 세포막과 핵막에 존재하는 수용체(estrogen receptor)와 결합하여 파골세포의 분화에 관여한다(Kim, 2012; Park 등, 2010).

골조직은 파골세포에 의한 골 흡수와 조골세포에 의한 골 형성 과정을 반복적으로 작용시키는 대사기관으로, 파골세포를 활성화하는 cytokine인 receptor activator of nuclear factor κB ligand(RANKL)는 수용체인 RANK와의 결합과 길항제인 osteoprotegerin(OPG)과의 균형에 의해 파골세포의 활성을 조절한다. 이때 에스트로겐 결핍 및 부갑상선 호르몬 항진증 등의 원인으로 파골세포가 활성화되면 골 흡수가 더욱 촉진된다(Jeon과 Kim, 2011; Lim 등, 2009; Park 등, 2020). 이를 통해 유발된 골다공증과 같은 골 관련 질환의 치료나 예방에는 내인성 조절인자들, 특히 bisphosphonate와 같은 골 흡수 억제제가 주로 이용되고 있으나, 이들은 부작용과 복용상의 어려움 등의 한계가 있는 것으로 알려져 있다. 또한 이미 소실된 뼈 질량을 회복시키는 것은 불가능하므로, 최근에는 독성과 부작용이 적으며 골다공증의 예방 및 치료에 효과적인 천연물질에 관한 연구의 필요성이 강조되고 있다(Kwon 등, 2022; Nam 등, 2015).

해조류는 알긴산, 카라기난, 한천 등의 다당류를 주로 하는 탄수화물과 무기질, 단백질, 지질 등이 풍부해 기능성 식품, 의약품 등으로 다양하게 이용되며, 특히 높은 항산화 활성을 가지는 폴리페놀계 물질을 함유한 것으로 알려져 있다(Do 등, 1997; Lee와 Hong, 2017a; Wang 등, 2023). 그중 해수 온도 상승으로 인해 국내 해양 생태계에서의 비중이 높아지고 있는 홍조류는 홍조식물문(Rhodophyta)에 속하는 조류로 약 400속 4,000여 종이 알려져 있으며, 53~70%의 총 탄수화물 함량과 아가로스, 카라기난 및 포피란 등의 다당류를 함유하고 있어 항산화, 항염증, 항암, 면역증진 활성 등 다양한 기능성이 있는 것으로 보고되고 있다(Hong 등, 2014; Kim과 Lee, 2023; Lee와 Hong, 2017a). 본 연구에 사용된 불등풀가사리(Gloiopeltis furcata)는 홍조식물문 진정홍조강(Florideophyceae) 풀가사리과(Endocladiaceae)로, 우리나라 남해안의 조간대 상부를 대상으로 군락을 이루어 분포하며, 나뭇가지 모양의 형태로 바위나 돌 등에 붙어 서식한다(Kim 등, 2021; Kwon, 2016). 불등풀가사리에 관한 연구로는 피부 주름 개선 효과(Lee와 Hong, 2017b), 백혈병세포 증식 억제 효과(Choi 등, 2006), 암세포 증식 억제 효과(Park 등, 2005) 및 항산화 효과(Fang 등, 2010; Lee와 Hong, 2017b), 조골세포 분화 효과(Kang 등, 2023) 등이 보고되어 있으나, 파골세포 형성 및 동물 실험을 이용한 골다공증 예방 효과에 관련된 연구는 전무한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 불등풀가사리 추출물이 골 형성에 미치는 영향을 세포 실험과 동물 실험을 통해 검토하였다. 먼저 골을 재흡수시키는 RANKL로 유도된 RAW 264.7 파골세포를 이용하여 성장 억제능, tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) 활성 및 파골세포 분화인자의 단백질 발현정도를 확인하였다. 이상의 실험 결과를 바탕으로 난소적출로 갱년기 장애가 유도된 골다공증 동물모델에 불등풀가사리 추출물을 급여 후, 골밀도 측정, 골 용해지표분석 등을 통하여 불등풀가사리 추출물이 골 형성 및 골 대사에 미치는 영향을 규명하고자 하였다.

재료 및 방법

실험 재료 및 시료 제조

본 연구에 사용한 불등풀가사리는 제주도에서 채취하여 세척 후 자연 건조한 분말 형태의 제품으로 (주)파라제주에서 구입하여 시료로 사용하였다. 불등풀가사리 분말에 10배량의 80% 에탄올(Avantor Inc.)을 가하여 80°C에서 8시간 동안 2회 추출하였다. 추출물은 Whatman No. 2 filter paper(Whatman International Ltd.)로 2회 여과하여 rotary vacuum evaporator(EYELA N-1000, Rikakikai Co.)로 농축한 다음, 동결건조 장치(Ilshin BioBase)를 사용하여 동결건조한 후 -70°C에 보관하면서 실험에 사용하였다. 불등풀가사리 에탄올 추출물의 수율은 4.33%였다.

RAW 264.7 파골세포의 배양 및 분화

Mouse monocyte/macrophage인 RAW 264.7 cell은 한국세포주은행에서 분양받아 실험에 사용하였다. 세포는 Dulbecco’s modified Eagle medium에 10% fetal bovine serum(Thermo Fisher Scientific)과 1% penicillin(Thermo Fisher Scientific)을 첨가하여 37°C, 5%의 CO2 incubator (Panasonic Healthcare Holdings Co.)에서 3일마다 배지 교환을 하면서 실험에 사용하였다. 파골세포로의 분화유도를 위해 50 ng/mL RANKL(Sigma Aldrich Co.)을 첨가하여 분화유도 배지를 제조하여 처리했으며, 5일 동안 2일마다 배지를 교환하였다.

Cell proliferation 측정

세포의 증식은 Green 등(1984)의 방법에 의한 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT) assay로 측정하였다. 배양한 RAW 264.7 cell을 5×103 cells/mL로 조정하여 96-well plate에 분주하여 24시간 배양한 후, 파골세포 분화유도 배지로 교환하여 5일간 배양하였다. 그 후 대조군과 함께 농도별로 준비된 불등풀가사리 추출물을 첨가한 후 24시간 배양하였다. 배양 후 MTT(0.5 mg/mL) 시약을 각각의 well에 첨가하고 CO2 incubator에서 4시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide를 첨가하여 생성된 불용성 formazan 결정을 용해시킨 뒤 ELISA reader(Thermo Fisher Scientific)로 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 증식률은 불등풀가사리 추출물의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.

TRAP 활성 측정

파골세포의 분화 정도를 Hotokezaka 등(2002)의 방법에 따라 TRAP 활성을 통해 측정하였다. 배양한 RAW 264.7 cell을 1×104 cells/mL로 조정하여 6-well plate에 24시간 배양한 후 파골세포 분화유도 배지로 교환하여 5일간 배양하고, 불등풀가사리 추출물을 농도별로 첨가하여 24시간 배양하였다. 배지를 제거해 세척하고 원심분리기를 이용하여 세포를 harvest 한 후 0.1% triton X-100을 넣고 CO2 incubator에서 1시간 lysis 시켰다.

Lysate의 단백질량은 표준시료로 bovine serum albumin(BSA)을 사용하여 표준 곡선을 작성한 후 정량하였다. 얻어진 양에 TRAP 용액[0.1 M sodium acetate(pH 5.8), 1 mM ascorbic acid, 0.15 M KCl, 10 mM disodium tartrate, 10 mM p-nitrophenyl phosphate]을 첨가한 뒤 CO2 incubator에서 30분간 반응시킨 후 0.3 N NaOH를 첨가하여 반응을 정지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Western blot 분석

Western blotting 분석법을 통해 대표적인 파골세포 분화 인자인 nuclear factor of activated T cells c1(NFATc1)과 TRAP의 단백질 발현 양상을 살펴보았다. RAW 264.7 세포를 T-75 플라스크에 5×105 cells/mL로 분주하여 5일 동안 파골세포 분화 유도 배지로 배양한 뒤, 불등풀가사리 추출물을 처리하여 CO2 incubator에서 24시간 동안 분화 배양하였다. RIPA buffer를 첨가하여 원심분리한 상층액을 취해 BCA kit(Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용하여 단백질 농도를 정량하였다. 정량한 값을 10% sodium dodecyl sulfate polyacrylamaide gel에서 전기영동을 이용하여 단백질을 분리하였다(Schägger와 von Jagow, 1987). 분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride membrane에 100 V로 1시간 transfer 한 후 5% skim milk에 넣어 상온에서 1시간 blocking 시킨 후 TBS-T로 15분간 3회 세척하였다. NFATc1(Santacruz, 1:1,000), TRAP(Santacruz, 1:1,000)로 희석한 1차 항체를 처리하여 12시간 반응시킨 후 TBS-T로 15분간 3회 세척한 다음 2차 항체로 horseradish peroxidase와 결합한 anti-rabbit IgG와 anti-mouse IgG(Cell Signaling Technology)를 1:3,000으로 희석하여 1시간 반응시켰다. 그 후 membrane을 TBS-T로 15분간 5회 세척한 다음 ECL kit(Bio-Rad Laboratories Inc.)을 사용하여 Luminescent Image Analyzer Davinch-ChemiTM(Davinch-K Co., Ltd.)를 통해 단백질 발현량을 측정하였다.

실험동물 사육 및 관리

실험동물로 평균 체중 220~260 g, 9주령에 난소적출 수술을 진행한 암컷 흰쥐(Sprague-Dawley) 30마리를 오리엔트제니아에서 분양받아 약 5일간 고형 사료를 급여하며 적응시킨 후, 난괴법(randomized complete block design)으로 각 군을 나누어 실험을 진행하였다. 실험동물은 총 5개의 군으로 분류하였으며, 개복수술만 진행한 비난소적출 대조군(SHAM), 난소적출 대조군(OVX-CON), 난소적출 후 골다공증 치료 약물인 E2 10 μg/kg/d를 경구투여한 약물대조군(OVX-E2), 난소 절제 후 불등풀가사리 추출물 20 mg/kg/d 투여군(OVX-GFE20), 난소 절제 후 불등풀가사리 추출물 200 mg/kg/d 투여군(OVX-GFE200)으로 각 6마리씩 5군으로 나누어, 1 mL의 시료를 매일 투여하며 6주간 사육하였다(Table 1).

Table 1 . Experimental design of animals.

Group (No.)1)Treatment
SHAM (6)Sham-operated rats
OVX-CON (6)Ovariectomized rats
OVX-E2 (6)Ovariectomized rats supplemented with estradiol 10 μg/kg bw/d
OVX-GFE20 (6)Ovariectomized rats supplemented with Gloiopeltis furcata ethanol extract 20 mg/kg bw/d
OVX-GFE200 (6)Ovariectomized rats supplemented with Gloiopeltis furcata ethanol extract 200 mg/kg bw/d

1)Number of rats..



실험 시료는 증류수로 용해하였으며, 대조군은 동일 용량의 증류수를 투여하였다. 실험 기간의 식이 섭취량과 체중은 매주 일정한 시간에 측정하였다. 동물실험실의 사육조건은 온도 24±2°C, 습도 50~55%를 유지했고, 물과 식이는 제한 없이 제공하였다. 본 동물 실험의 모든 과정은 신라대학교 동물실험 윤리위원회의 승인(승인번호: SUACAC-2018-009) 후 지침에 따라 수행하였다.

해부 후 혈액 채취 및 장기 적출

실험 종료 후, 혈액 채취 및 장기 적출을 위해 해부하였다. 해부 전 24시간 절식시켰으며, 동물용 전신마취제인 ketamine(Yuhan Corporation)을 복강 투여하여 마취한 후 개복하여 복대정맥에서 혈액을 채취하였다. 혈액의 생화학적 분석을 위해 상온에서 30분간 방치한 후, 190×g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하여 사용하였다. 자궁 조직은 적출하여 주위의 지방과 물기를 제거하였고, 관절 부위의 조직은 채취하여 10% formaldehyde로 고정해 보관하며 실험을 진행하였다.

골 관련 혈청 parameter 측정

골 관련 인자들의 혈청 parameter 측정을 위해 혈청 alkaline phosphatase(ALP)와 혈청 calcium은 측정용 kit인 FUJI DRI-CHEM slide를 사용해 자동생화학분석기 DRI CHEM 3600i로 분석하였다.

Collagen type 1의 효소인 cross linked C-telopeptide of type Ⅰ collagen(CTxⅠ)과 cross linked N-telopeptide of type Ⅰ collagen(NTxⅠ) level은 ELISA kit(Elabscience)을 사용하여 정량하였다. 또한 potassium ELISA kit(MyBioSource), osteocalcin(OC/BGP) ELISA kit(Elabscience), TRAP ELISA kit(MyBioSource), RANKL mouse ELISA kit(Abcam)을 사용하여 ELISA reader로 흡광도를 측정해 값을 분석하였다.

Mocro CT 측정 및 연골의 조직학적 검사

흰쥐의 대퇴골 골밀도 측정은 micro CT(Viva CT80, Scanco Inc.)를 사용하여 촬영하였다. 촬영된 이미지는 CTAn 프로그램을 통해 분석하였으며, 이는 (주)노터스에 의뢰하여 시험 분석하였다.

실험 종료 후 채취한 연골 조직을 조직 포매한 후, 표본을 4 μm 두께로 절삭하여 슬라이드에 부착하였다. 절삭된 조직은 hematoxylin-eosin(H&E, Sigma Aldrich Co.), safranin O-fast green(Sigma Aldrich Co.)으로 염색하였으며, 염색 후 광학현미경으로 40× 배율로 조직학적 관찰을 시행하였다. 이는 (주)노터스에 의뢰하여 시험 분석하였다.

통계처리

실험 결과는 통계 SAS package(Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc.)를 사용하여 각 시료의 평균과 표준편차를 계산하였고, 분산분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test를 실시하여 P<0.05에서 시료 간의 유의차를 검정하였다.

결과 및 고찰

RAW 264.7 파골세포의 성장 억제 효과

파골세포는 다핵성 세포로 조혈모세포로부터 유래하여 단핵 대식세포로부터 분화되며, 일반적으로 전구체에서 macrophage stimulating factor(M-CSF)와 수용체가 결합하면 파골세포의 생존과 분화에 대한 신호를 전달하게 된다(Kim 등, 2011; Yoo 등, 2007).

본 연구에서는 RANKL로 유도된 RAW 264.7 파골세포를 이용한 불등풀가사리 추출물의 농도에 따른 성장억제능을 측정하였으며, 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 파골세포의 성장억제능을 측정한 결과, 대조군과 비교해 10~100 μg/mL의 농도로 처리한 불등풀가사리 추출물군에서 농도 의존적으로 유의적인 세포 성장 억제를 확인하였다. 특히, 불등풀가사리 추출물 처리 100 μg/mL 농도에서 대조군 대비 세포 생존율이 73.54%로 감소하였다. 따라서 불등풀가사리 추출물은 파골세포 증식 억제 효과가 있는 것으로 사료되며, 농도 100 μg/mL를 최대 농도로 설정하여 다음 실험을 진행하였다.

Fig 1. Effect of Gloiopeltis furcata ethanol extract on proliferation in RAW 264.7 osteoclastic cells. RAW 264.7 cells were cultured for 5 days with RANKL (50 ng/mL) in the presence of various concentrations of Gloiopeltis furcata ethanol extract as indicated. Cell proliferation was measured by MTT assay. Values with different letters (a-c) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

TRAP 활성

파골세포는 골을 흡수하는 세포로서 TRAP 양성 다핵세포로 골수의 colony forming unit-macrophage(CFU-M) 세포로부터 유래되며, 이들 세포의 증식, TRAP 발현 및 융합 과정을 거쳐 분화한다(Choi 등, 2007).

본 연구에서는 불등풀가사리 추출물의 파골세포 분화 억제 효과를 확인하기 위해 TRAP 활성을 측정하였다(Fig. 2). RANKL을 처리하여 파골세포로 분화를 유도하여 실험하였으며, 그 결과, 10~100 μg/mL의 농도로 처리한 불등풀가사리 추출물군은 대조군과 비교해 유의적으로 TRAP 활성을 감소시킴을 확인하였다. 특히 100 μg/mL 농도의 불등풀가사리 추출물을 처리하였을 때 TRAP 활성이 78%로 감소하였다. Kim(2013)의 연구 결과에 의하면 같은 해조류에 속하는 패 에탄올 추출물의 TRAP 활성은 농도 100 μg/mL에서 대조군과 비교하여 약 76% 정도로 나타난다고 보고하였으며, 본 연구에서 사용한 불등풀가사리 추출물 역시 유사한 TRAP 저해 활성을 보여주었다. 따라서 불등풀가사리 추출물은 TRAP 활성 저해를 통해 파골세포 분화 억제에 효과가 있는 것으로 사료된다.

Fig 2. Effect of Gloiopeltis furcata ethanol extract on TRAP activity of RAW 264.7 osteoclastic cells. RAW 264.7 cells were cultured for 5 days with RANKL (50 ng/mL) in the presence of various concentrations of Gloiopeltis furcata ethanol extract as indicated. Values with different letters (a-c) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Western blot 분석을 통한 파골세포 분화인자 단백질 발현

파골세포의 분화에는 조골세포로부터 분비되는 cytokine인 M-CSF와 RANKL이 필수적이며, RANKL이 전구세포의 RANK에 결합하면 NF-κB, c-Fos, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성이 증가하여 파골세포의 분화가 촉진된다(Lee 등, 2010; Park, 2015). 특히 NFATc1은 표적유전자 promoter의 결합 부위에 결속함으로써 파골세포 분화 지표인 TRAP, OSCAR, CTR 등의 발현을 촉진한다(Lee 등, 2010; Park, 2015). 따라서 파골세포 분화의 중요한 전사인자인 NFATc1과 TRAP의 발현에 불등풀가사리 추출물이 미치는 영향을 측정하였다.

실험 결과, RANKL의 처리로 파골세포 분화유도를 확인하였으며, 불등풀가사리 추출물 처리는 파골세포 분화 시 발현되는 NFATc1 및 TRAP의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다(Fig. 3). 특히 불등풀가사리 추출물 100 μg/mL 농도에서 NFATc1과 TRAP의 단백질 발현이 유의적으로 억제되는 것으로 나타났다.

Fig 3. Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on RANKL-incued osteoclastogenesis-specific protein expressions. (A) The protein expressions of the NFATc1 and TRAP were detected by western blotting. (B) Relative expression was quantified by densitometry using image J program and calculated according to the reference band densities of β-actin. Values with different letters (a-c) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Beak 등(2013)은 산토끼꽃과 식물인 천속단(Phlomis umbrosa Turcz.)이 NFATc1 및 c-Fos 등의 단백질 발현을 억제한다고 보고하였으며, Chung 등(2017)의 연구 결과에서는 한약재 천수근(Harpagophytum procumbens)의 활성 성분인 harpagoside가 TRAP, NFATc1 및 c-Fos 등의 발현을 억제함으로써 파골세포 분화를 조절하는 관절염의 치료제로 사용될 수 있다고 보고하였다. 본 연구에서 불등풀가사리 추출물 또한 파골세포 분화 지표 단백질 수준을 조절하여 발현을 감소시킴으로써 파골세포 분화 억제능을 나타낸 것으로 보아, 골다공증을 비롯한 골 관련 질환의 치료 및 예방의 후보 물질로 사용 가능할 것으로 판단된다.

불등풀가사리 추출물이 난소적출 흰쥐의 체중 및 식이효율에 미치는 영향

앞선 세포 실험에서 불등풀가사리 추출물의 파골세포 분화억제 활성을 확인하였으며, 이를 바탕으로 난소적출을 통해 갱년기를 유도한 골다공증 동물모델에서 불등풀가사리 추출물의 골 대사 변화에 미치는 영향을 검토하였다. 9주령 암컷 쥐의 난소를 적출하여 인위적으로 갱년기 장애를 유도하였으며, 총 6주의 실험 기간에 주 1회 측정한 체중의 결과와 식이, 식수 섭취량 결과 및 식이효율 값을 Table 2에 나타내었다.

Table 2 . Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on body weight gain, food intake, and food efficiency ratio of ovariectomized rats for 6 weeks.

Group1)SHAMOVX-CONOVX-E2OVX-GFE20OVX-GFE200
Final body weight (g)319.85±11.04c2)3)379.03±21.95a348.83±10.45b358.48±17.88ab358.13±7.81ab
Body weight gain (g/d)0.93±1.05NS4)1.75±1.060.96±1.081.18±0.981.16±0.85
Food intake (g/d)19.88±1.66NS22.06±3.6520.57±2.3821.2±2.5221.21±3.28
Water intake (mL/d)26.93±2.93NS30.29±13.5128.80±4.1725.61±3.4426.87±5.54
FER (%)5)4.70±0.40b7.92±1.35a4.68±0.55b5.57±0.67b5.45±0.87b

1)Refer the legend to Table 1..

2)All values are mean±SD (n=6)..

3)Values with different superscripts (a-c) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

4)NS: Not significantly different among group..

5)FER (food efficiency ratio): Body weight gain/ Dietary intake×100..



일반적으로 여성은 폐경 후 체내 콜레스테롤이 에스트로겐으로 전환되는 비율이 감소하면서 혈중 콜레스테롤이 상승하고 지방조직의 증가로 인해 내장지방이 증가하게 되며, 난소를 적출한 실험동물 역시 에스트로겐이 결핍되어 전반적으로 체중이 증가하게 된다(Lim 등, 2023). 실험 결과, 난소를 절제하지 않고 복부수술만 진행한 SHAM군과 난소를 절제한 OVX-CON군의 최종 체중 증가량을 비교하였을 때, 유의적으로 OVX-CON군의 체중이 증가하였다. 반면 약물대조군인 E2를 처리한 OVX-E2군의 경우 OVX-CON군과 비교하여 체중이 유의적으로 감소하였다. 한편, OVX-GFE20, OVX-GFE200군의 경우, OVX-CON군보다 최종 체중이 감소하는 결과가 나타났으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 본 실험 결과는 E2 섭취가 갱년기 여성의 에스트로겐 결핍으로 인한 내장지방 및 콜레스테롤 증가를 효과적으로 억제할 수 있음을 보여주며, 불등풀가사리 추출물 또한 일부 억제 효과가 있는 것으로 나타나 장기간 섭취 시 더욱 큰 체중감소 효과가 있을 것으로 사료된다.

한편 식이 및 식수 섭취량은 군별로 유의적인 차이가 없었으며, SHAM군과 OVX-CON군의 식이효율을 비교하였을 때, 유의적으로 OVX-CON군의 식이효율이 증가하였다. OVX-GFE20, OVX-GFE200군과 약물대조군 OVX-E2군은 SHAM군과 비교하여 유의적인 차이가 없었다.

불등풀가사리 추출물이 난소적출 흰쥐의 자궁 무게에 미치는 영향

군별 자궁 무게를 측정하여 Table 3에 나타내었다. 난소를 절제한 OVX-CON군의 난소 무게는 난소를 절제하지 않은 SHAM군보다 유의적으로 낮은 것으로 나타났으며, OVX-GFE20, OVX-GFE200군의 자궁 무게는 OVX-CON군과 비교하여 증가하는 경향을 나타내었다. 특히, 약물대조군 OVX-E2군과 비교하여 불등풀가사리 추출물을 200 mg/kg 투여한 OVX-GFE200군의 자궁 무게가 거의 유사한 값으로 나타났다.

Table 3 . Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on uterus weight in ovariectomized rats.

Group1)SHAMOVX-CONOVX-E2OVX-GFE20OVX-GFE200
Uterus (g)1.08±0.38a2)3)0.11±0.01b0.24±0.05b0.13±0.05b0.20±0.17b

1)Refer the legend to Table 1..

2)All values are mean±SD (n=6)..

3)Values with different superscripts (a,b) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..



폐경이 진행되면 자궁조직이 위축되어 자궁 중량이 감소하며, 에스트로겐 유사 활성 성분이 난소적출로 인해 비대해지는 지방세포 크기를 감소시킴으로써 자궁 주위 지방 무게가 감소한다는 연구가 보고된 바 있다(Lim 등, 2023). 본 연구 결과에 따르면 난소적출로 인한 자궁의 퇴화가 일어나 OVX-CON군이 SHAM군에 비해 자궁의 무게가 감소하였으며, 불등풀가사리 추출물과 E2의 투여는 갱년기 자궁 조직 위축 감소에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

불등풀가사리 추출물이 난소적출 흰쥐의 골 관련 혈청 parameter 변화에 미치는 영향

염기성 인산분해효소인 ALP는 세포 외에서 세포 내로 기질 운반에 관여하는데, 조골세포에서는 ALP를 생성하여 세포막의 소포에 저장하며 이 중 일부가 혈액 내로 유리된다. 따라서 혈청 ALP는 골 질환으로 인한 파괴가 주된 질환에서 증가하는 양상을 나타낸다(Moon 등, 2015). Osteocalcin (OCN)은 골아세포와 상아세포에서만 생산되는 골격 산성단백질로, 폐경기 이후 골 교체율이 급증하면서 혈청 OCN 수치는 약 2배 이상 증가하는 것으로 알려져 있다. 이는 폐경 후 골절위험도 증가와 밀접한 관련이 있어 골다공증 평가에 유용한 생화학적 지표로 보고되고 있다(Bhatnagar와 Kekatpure, 2022). 본 연구에서 분석한 혈청 ALP 결과를 보면, OVX-CON군에서 SHAM군에 비해 유의적으로 수치가 증가했으며, OVX-GFE20, OVX-GFE200군에서는 OVX-CON군에 비해 유의적으로 수치가 감소하였다(Table 4). 또한 OCN 역시 OVX-CON군에서 SHAM군에 비해 유의적으로 수치가 증가하였으며, OVX-GFE20, OVX-GFE200군에서는 OVX-CON군에 비해 유의적으로 감소하는 결과를 보였다. 따라서 본 연구 결과로 미루어보아 불등풀가사리 추출물 투여는 폐경기 여성의 골 교체율을 지연시키며, 골절위험도 감소에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

Table 4 . Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on the serum bone parameters in ovariectomized rats.

Group1)SHAMOVX-CONOVX-E2OVX-GFE20OVX-GFE200
ALP (U/L)180.17±25.96c2)3)631.33±17.26a445.00±19.50b480.00±96.50b244.83±71.67c
Calcium (mg/dL)12.07±0.59NS4)12.30±0.2912.38±0.7112.10±0.1412.08±1.24
Potassium (mg/dL)5.27±0.44NS5.44±0.975.21±0.345.22±0.635.27±1.19
OCN (ng/mL)6.17±0.20ab10.22±0.02a5.74±1.30ab6.87±3.89ab5.31±3.67b
CTx (ng/mL)1.01±0.23b3.81±0.58a1.94±0.02ab2.83±2.45ab1.78±1.61ab
NTx (ng/mL)38.78±10.32b82.77±9.68a33.41±0.02b38.52±13.53b20.71±18.66b
TRAP (U/L)4.34±4.23b16.59±10.74a4.44±5.71b2.71±1.54b1.60±1.29b
RANKL (pg/mL)275.69±1.21d404.92±26.11a341.46±4.90c378.00±16.46b340.31±19.16c

1)Refer the legend to Table 1..

2)All values are mean±SD (n=6)..

3)Values with different superscripts (a-d) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

4)NS: Not significantly different among group..



다음으로 혈청 칼슘과 칼륨의 농도를 측정한 결과, 모든 군에서 정상 범위 내의 수치를 나타내었으나 군별 유의적인 차이를 나타내지는 않았다(칼슘, 7.2~13.0 mg/dL; 칼륨, 3.5~5.5 mg/dL).

한편, 뼈의 기질 중 90%를 차지하는 제1형 콜라겐은 2개의 α1 사슬과 1개의 α2 사슬로 구성되어 있고, 콜라겐에서 연결되는 부위는 N-말단단백(NTx), C-말단단백(CTx)으로 파골세포에 의해 연결사슬 형태로 유리되며, 이는 골 흡수를 반영하는 지표가 된다(Herrmann과 Seibel, 2008). 조골세포로부터 생성되는

RANKL은 파골세포의 형성과 활성을 촉진하며, 활성화된 파골세포에서 실제적 골 흡수 작용에 관여하는 TRAP 또한 골 흡수 지표로 골 밀도를 감소시키고 골다공증을 악화시킨다(Choi와 Hwang, 2017; Gravallese 등, 2001). 본 연구에서 분석한 골 흡수 parameter 결과를 살펴보면, CTx, NTx의 혈청 수준은 SHAM군과 비교해 OVX-CON군에서 증가하였으며, 약물대조군인 OVX-E2군과 불등풀가사리 추출물 투여군인 OVX-GFE20, OVX-GFE200군에서는 감소하여 OVX-CON군과 유의적인 차이를 보였다. RANKL과 TRAP 수치를 살펴보면, OVX-CON군에서는 혈청 수치가 증가하여 파골 세포 생성과 골 흡수를 위한 분화가 증가하였음을 확인하였고, OVX-E2, OVX-GFE20, OVX-GFE200군에서 수치가 유의적으로 감소하여 불등풀가사리 추출물이 그 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 그러므로 불등풀가사리의 성분은 난소 절제로 인한 골 손실을 효과적으로 조절하여 폐경 후 골밀도 증가에 긍정적인 효과가 있는 것으로 사료된다.

불등풀가사리 추출물이 난소적출 흰쥐의 골 밀도에 미치는 영향

불등풀가사리 추출물 급여가 골 밀도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 난소적출을 통해 흰쥐의 골 손실을 유도한 후, 추출물을 투여하고 대퇴골 샘플을 사용하여 골 밀도 측정 실험을 진행하였으며, 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 3D Micro CT로 대퇴골의 골 밀도를 분석한 결과, SHAM군과 비교하여 OVX-CON군의 대퇴골에서 섬유 골 파괴가 증가하였으며, 불등풀가사리 추출물 투여 OVX-GFE20과 OVX-GFE200군은 OVX-CON군에 비해 유의적으로 섬유 골 파괴가 줄어든 것으로 나타나 높은 골 손실 회복력을 보여주었다.

Fig 4. Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on the distal femurs in rats, as visualized by bone 3D micro-CT imaging.

골의 부피 대비 골 표면적(bone surface area/ bone volume)과 가지 모양의 작은 기둥으로 이루어진 중앙부의 해면 골소주(잔기둥)의 간격(trabecular separation)은 SHAM군과 비교하여 OVX-CON군에서 증가하였으며, OVX-E2군과 불등풀가사리 추출물 투여 OVX-GFE20과 OVX-GFE200군은 유의적으로 감소하였다(Fig. 5). 또한 골 밀도(bone mineral density), 골의 용적비(bone volume/ total volume, BV/TV), 해면 골소주 수(trabecular number), 해면 골소주 두께(trabecular thickness)는 SHAM군과 비교해 OVX-CON군에서 감소하는 경향을 나타내었으며, E2와 불등풀가사리 추출물 투여군에서 증가하였다.

Fig 5. Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on the bone morphometric parameters BMD (mg/cc), BV/TV (%), trabecular number (mm), trabecular thickness (1/mm), and trabecular separation (mm), as analyzed by micro-CT CTAn software. Values with different letters (a-d) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.

보통 사람의 경우 대퇴골 골절은 폐경까지 서서히 증가하는 경향을 보이다가 폐경 이후 기하급수적으로 증가한다는 보고에 근거하여 볼 때(Ye 등, 2017), 본 연구 역시 골 밀도에 있어 일치하는 결과를 나타내었으며, 결론적으로 불등풀가사리 추출물 투여는 에스트로겐 결핍 상태의 대퇴부 골 밀도 감소 지연 효과가 있는 것으로 판단된다.

불등풀가사리 추출물이 난소적출 흰쥐의 연골 조직 변화에 미치는 영향(근위 대퇴골 섬유주 조직)

콜라겐과 proteoglycan으로 구성된 관절의 연골 조직 중 proteoglycan은 쇼크 작용으로부터 조직의 섬유와 세포 성분을 보호하고 압박을 견디는 탄성을 갖고 있으며, proteoglycan의 합성을 촉진하고 분해를 억제하는 치료 방법은 골관절염의 증상을 완화하는 주요 방법의 하나로 알려져 있다(An 등, 2012).

불등풀가사리 추출물 투여에 의한 조직학적 변화를 확인하기 위하여 H&E 염색 결과(Fig. 6A), SHAM군과 비교해 OVX-CON군에서 심한 연골 파괴와 골 침식, 침윤 등이 보였으며, OVX-E2군과 OVX-GFE20, OVX-GFE200군에서는 연골의 침식 정도가 크게 개선된 것으로 나타났다. 또한 safranin O-fast green 염색을 실시한 결과(Fig. 6B), SHAM군과 비교하여 OVX-CON군은 연골 주변과 활막 내에 붉은색으로 염색된 proteoglycan이 고르게 형성되어 있지 않아 관절 연골의 결손이나 미란이 심해졌으며, 약물대조군인 OVX-E2군의 경우 SHAM군과 유사한 정도로 회복된 것으로 나타났다. 불등풀가사리 추출물 OVX-GFE200군 역시 SHAM군과 유사하게 연골의 손상이 회복된 것을 확인할 수 있었다. 우리는 이전 연구에서도 난소 절제 흰쥐에 갈조류인 다시마 추출물을 급여한 결과, 피부와 연골 조직 중 콜라겐 함량 증가와 콜라겐의 성숙 가교물질인 pyridinoline 함량 증가를 확인한 바 있으며, 본 연구에서도 이와 일치하는 결과를 나타내었다(Lee와 Kim, 2008).

Fig 6. Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on the trabecular bone tissue of the proximal femur in rats, as visualized by (A) hematoxylin-eosin (H&E) stain and (B) safranin O-fast green stain (magnification: 40× and scale bar: 4 μm, respectively).

따라서 본 연구 결과, 불등풀가사리 추출물 투여는 폐경 후 연골의 침식과 결손을 완화하는 효과가 있는 것으로 판단된다.

요 약

본 연구에서는 불등풀가사리 추출물이 파골세포 형성에 미치는 영향을 검토하고, 난소적출 흰쥐의 골다공증 동물모델을 이용하여 골 형성에 미치는 영향을 분석하였다. 우선 RANKL로 유도한 파골세포에 불등풀가사리 추출물을 10~100 μg/mL의 농도로 처리 후 세포 생존율을 확인한 결과, 대조군과 비교해 농도 의존적으로 유의적인 세포 성장 억제를 확인하였다. 파골세포의 분화 인자인 TRAP 활성 측정 결과, 100 μg/mL 농도의 불등풀가사리 추출물을 처리하였을 때 활성이 78%까지 감소하였다. 또한 추출물의 농도 10 μg/mL와 100 μg/mL 처리 시 파골세포 분화인자인 NFATc1, TRAP의 단백질 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 앞선 실험 내용을 바탕으로 난소적출로 골다공증을 유발한 흰쥐에서 불등풀가사리 추출물의 급여가 골 형성에 미치는 영향을 검토하였다. 식이효율은 난소를 절제한 OVX-CON군과 비교하여 다른 모든 군에서 감소하였으며, 자궁조직의 무게는 OVX-CON보다

다른 모든 군에서 높은 것으로 보아 불등풀가사리 추출물 투여로 인한 자궁조직 위축 감소를 확인하였다. 골 관련 혈청 parameter 분석 결과, 골 교체율이 높은 폐경기 또는 골 질환이 있을 때 값이 증가하는 ALP 및 OCN 수치는 SHAM군에 비해 OVX-CON군에서 증가하였으나, estradiol과 불등풀가사리 추출물 20, 200 mg/kg을 투여한 OVX-E2, OVX-GFE20, OVX-GFE200 군에서는 감소하는 것으로 나타났다. 또한 골 흡수 지표인 TRAP, RANKL의 수치는 OVX-CON군에서 증가하였으나, 불등풀가사리 추출물 투여군에서는 유의적으로 활성이 감소하였다. 그리고 난소적출을 통해 골 손실을 유도한 뒤, 대퇴골의 골밀도 및 조직학적 검사를 실시한 결과, SHAM군과 비교하여 OVX-CON군의 대퇴골에서 섬유 골 파괴가 증가하였으며, 불등풀가사리 추출물 투여군은 OVX-CON군과 비교해 유의적으로 골밀도 증가와 골 파괴 회복을 확인하였다. 이상과 같이 불등풀가사리 추출물은 파골세포 분화억제와 골 형성에 긍정적인 영향을 미치며, 향후 이를 활용한 식품 소재 및 기능성 식품 개발에 접목시켜 질병 예방 및 증상 완화에 있어 우수한 기능성 식품 소재로서 개발이 가능할 것으로 사료된다.

감사의 글

본 논문은 부산광역시 및 (재)부산테크노파크의 BB21plus 사업의 지원을 받아 수행된 연구결과이며 이에 감사드립니다.

Fig 1.

Fig 1.Effect of Gloiopeltis furcata ethanol extract on proliferation in RAW 264.7 osteoclastic cells. RAW 264.7 cells were cultured for 5 days with RANKL (50 ng/mL) in the presence of various concentrations of Gloiopeltis furcata ethanol extract as indicated. Cell proliferation was measured by MTT assay. Values with different letters (a-c) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 340-349https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.340

Fig 2.

Fig 2.Effect of Gloiopeltis furcata ethanol extract on TRAP activity of RAW 264.7 osteoclastic cells. RAW 264.7 cells were cultured for 5 days with RANKL (50 ng/mL) in the presence of various concentrations of Gloiopeltis furcata ethanol extract as indicated. Values with different letters (a-c) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 340-349https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.340

Fig 3.

Fig 3.Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on RANKL-incued osteoclastogenesis-specific protein expressions. (A) The protein expressions of the NFATc1 and TRAP were detected by western blotting. (B) Relative expression was quantified by densitometry using image J program and calculated according to the reference band densities of β-actin. Values with different letters (a-c) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 340-349https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.340

Fig 4.

Fig 4.Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on the distal femurs in rats, as visualized by bone 3D micro-CT imaging.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 340-349https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.340

Fig 5.

Fig 5.Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on the bone morphometric parameters BMD (mg/cc), BV/TV (%), trabecular number (mm), trabecular thickness (1/mm), and trabecular separation (mm), as analyzed by micro-CT CTAn software. Values with different letters (a-d) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 340-349https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.340

Fig 6.

Fig 6.Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on the trabecular bone tissue of the proximal femur in rats, as visualized by (A) hematoxylin-eosin (H&E) stain and (B) safranin O-fast green stain (magnification: 40× and scale bar: 4 μm, respectively).
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 340-349https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.340

Table 1 . Experimental design of animals.

Group (No.)1)Treatment
SHAM (6)Sham-operated rats
OVX-CON (6)Ovariectomized rats
OVX-E2 (6)Ovariectomized rats supplemented with estradiol 10 μg/kg bw/d
OVX-GFE20 (6)Ovariectomized rats supplemented with Gloiopeltis furcata ethanol extract 20 mg/kg bw/d
OVX-GFE200 (6)Ovariectomized rats supplemented with Gloiopeltis furcata ethanol extract 200 mg/kg bw/d

1)Number of rats..


Table 2 . Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on body weight gain, food intake, and food efficiency ratio of ovariectomized rats for 6 weeks.

Group1)SHAMOVX-CONOVX-E2OVX-GFE20OVX-GFE200
Final body weight (g)319.85±11.04c2)3)379.03±21.95a348.83±10.45b358.48±17.88ab358.13±7.81ab
Body weight gain (g/d)0.93±1.05NS4)1.75±1.060.96±1.081.18±0.981.16±0.85
Food intake (g/d)19.88±1.66NS22.06±3.6520.57±2.3821.2±2.5221.21±3.28
Water intake (mL/d)26.93±2.93NS30.29±13.5128.80±4.1725.61±3.4426.87±5.54
FER (%)5)4.70±0.40b7.92±1.35a4.68±0.55b5.57±0.67b5.45±0.87b

1)Refer the legend to Table 1..

2)All values are mean±SD (n=6)..

3)Values with different superscripts (a-c) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

4)NS: Not significantly different among group..

5)FER (food efficiency ratio): Body weight gain/ Dietary intake×100..


Table 3 . Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on uterus weight in ovariectomized rats.

Group1)SHAMOVX-CONOVX-E2OVX-GFE20OVX-GFE200
Uterus (g)1.08±0.38a2)3)0.11±0.01b0.24±0.05b0.13±0.05b0.20±0.17b

1)Refer the legend to Table 1..

2)All values are mean±SD (n=6)..

3)Values with different superscripts (a,b) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..


Table 4 . Effects of Gloiopeltis furcata ethanol extract on the serum bone parameters in ovariectomized rats.

Group1)SHAMOVX-CONOVX-E2OVX-GFE20OVX-GFE200
ALP (U/L)180.17±25.96c2)3)631.33±17.26a445.00±19.50b480.00±96.50b244.83±71.67c
Calcium (mg/dL)12.07±0.59NS4)12.30±0.2912.38±0.7112.10±0.1412.08±1.24
Potassium (mg/dL)5.27±0.44NS5.44±0.975.21±0.345.22±0.635.27±1.19
OCN (ng/mL)6.17±0.20ab10.22±0.02a5.74±1.30ab6.87±3.89ab5.31±3.67b
CTx (ng/mL)1.01±0.23b3.81±0.58a1.94±0.02ab2.83±2.45ab1.78±1.61ab
NTx (ng/mL)38.78±10.32b82.77±9.68a33.41±0.02b38.52±13.53b20.71±18.66b
TRAP (U/L)4.34±4.23b16.59±10.74a4.44±5.71b2.71±1.54b1.60±1.29b
RANKL (pg/mL)275.69±1.21d404.92±26.11a341.46±4.90c378.00±16.46b340.31±19.16c

1)Refer the legend to Table 1..

2)All values are mean±SD (n=6)..

3)Values with different superscripts (a-d) are significantly at P<0.05 by Duncan’s multiple range test..

4)NS: Not significantly different among group..


References

  1. An HJ, Lee CK, Park JH, et al. Effects of bee venom on papain-induced osteoarthritis in an animal model. Kor J Pharmacogn. 2012. 43:167-172.
  2. Beak JM, Park JH, Song JH, et al. The effects of Phlomis umbrosa Turcz on osteoclast differentiation. Korean J Phys Anthropol. 2013. 26:115-123.
    CrossRef
  3. Bhatnagar A, Kekatpure AL. Postmenopausal osteoporosis: A literature review. Cureus. 2022. 14:e29367. https://doi.org/10.7759/cureus.29367.
    CrossRef
  4. Choi HK, Lee YS, Kim MY, et al. Induction of osteoclastogenesis-inducing cytokines and invasion by alive Aggregatibacter actinomycetemcomitans in osteoblasts. J Korean Acad Periodontol. 2007. 37:553-562.
    CrossRef
  5. Choi WY, Park C, Kim GY, et al. Induction of apoptosis by methanol extract of Gloiopeltis furcata in human leukemia cell line U937. J Mar Biosci Biotechnol. 2006. 1:76-83.
  6. Choi YK, Hwang GS. Effects of Gardeniae jasminoides on RANKL-induced osteoclastogenesis and bone resorption. J Int Korean Med. 2017. 38:1035-1048.
    CrossRef
  7. Chung HJ, Kim WK, Oh J, et al. Anti-osteoporotic activity of harpagoside by upregulation of the BMP2 and Wnt signaling pathways in osteoblasts and suppression of differentiation in osteoclasts. J Nat Prod. 2017. 80:434-442.
    Pubmed CrossRef
  8. Do JR, Nam YJ, Park JH, et al. Studies on chemical composition of red algae. J Korean Fish Soc. 1997. 30:428-431.
  9. Fang Z, Jeong SY, Jung HA, et al. Anticholinesterase and antioxidant constituents from Gloiopeltis furcata. Chem Pharm Bull. 2010. 58:1236-1239.
    Pubmed CrossRef
  10. Gravallese EM, Galson DL, Goldring SR, et al. The role of TNF-receptor family members and other TRAF-dependent receptors in bone resorption. Arthritis Res Ther. 2001. 3:6. https://doi.org/10.1186/ar134.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  11. Green LM, Reade JL, Ware CF. Rapid colormetric assay for cell viability: Application to the quantitation of cytotoxic and growth inhibitory lymphokines. J Immunol Methods. 1984. 70:257-268.
    Pubmed CrossRef
  12. Herrmann M, Seibel MJ. The amino- and carboxyterminal cross-linked telopeptides of collagen type I, NTX-I and CTX-I: A comparative review. Clin Chim Acta. 2008. 393:57-75.
    Pubmed CrossRef
  13. Hong CH, Kim SW, Kim YW, et al. Industrial applications of saccharification technology for red seaweed polysaccharide. KSBB Journal. 2014. 29:307-315.
    CrossRef
  14. Hotokezaka H, Sakai E, Kanaoka K, et al. U0126 and PD98059, specific inhibitors of MEK, accelerate differentiation of RAW 264.7 cells into osteoclast-like cells. J Biol Chem. 2002. 277:47366-47372.
    Pubmed CrossRef
  15. Im NK, Kim HJ, Kim MJ, et al. Effects of medicinal herb extracts on osteoblast differentiation and osteoclast formation. Korean J food Sci Technol. 2010. 42:637-642.
  16. Jeon MH, Kim M. Effect of Hijikia fusiforme fractions on proliferation and differentiation in osteoblastic MC3T3-E1 cells. J Life Sci. 2011. 21:300-308.
    CrossRef
  17. Kang JH, Jung KI, Park MH, et al. Effects of Gloiopeltis furcata extract on antioxidant activity and osteoblast differentiation. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2023. 52:450-459.
    CrossRef
  18. Kim BK. Effect of Ishige okamurae extracts on bone formation in vivo and in vitro test. Master's thesis. Silla University. 2013.
  19. Kim KJ. Effects of soy protein supplementation and treadmill running exercise on the changes of body composition, blood metabolic markers, estradiol, estrogen receptor gene expression in ovariectomized rats. Exercise Science. 2012. 21:243-254.
    CrossRef
  20. Kim MJ, Im NK, Yu MH, et al. Effects of extracts from sarcocarp, peels, and seeds of avocado on osteoblast differentiation and osteoclast formation. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2011. 40:919-927.
    CrossRef
  21. Kim SH, Kim JY, Jeon EB, et al. Quality and antioxidant activity of soybean curd supplemented with Gloiopeltis furcata juice. The Journal of Fisheries and Marine Sciences Education. 2021. 33:1326-1334.
    CrossRef
  22. Kim SH, Lee JB. A study on the antioxidative and anti-inflammatory properties of Gloiopeltis furcata extract obtained using different concentrations of ethanol. Asian J Beauty Cosmetol. 2023. 21:41-50.
    CrossRef
  23. Kwon DH. Anti-inflammatory function and biological activity of ethanol extract of Gloiopeltis furcata. Master's thesis. Dongeui University. 2016.
  24. Kwon JH, Seo HJ, Kwun IS, et al. Effects of cow milk-derived extracellular vesicles on the differentiation and mineralization of osteoblastic MC3T3-E1 cells. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2022. 51:1158-1165.
    CrossRef
  25. Lee DH, Hong JH. Biological activities and physicochemical properties of polysaccharides from Gloiopeltis furcata prepared by using various enzymes. Korean J Food Preserv. 2017a. 24:455-463.
    CrossRef
  26. Lee DH, Hong JH. Physicochemical properties and anti-wrinkle effect of polysaccharides with different molecular weights from Gloiopeltis furcata. Korean J Food Preserv. 2017b. 24:688-696.
    CrossRef
  27. Lee HY, Bak WS. The risk factors of osteoporosis in Korean postmenopausal women. Journal of Korean Academy of Adult Nursing. 2009. 21:303-313.
  28. Lee JM, Kim NH, Lee EJ. The effects of oral administration of deer antler extracts on an osteoporosis-induced animal model: A systematic review and meta-analysis. J Korean Med Rehabi. 2022. 32:65-81.
    CrossRef
  29. Lee SM, Kim MG, Lee SY, et al. Effects of Artemisia princeps extract on bone metabolism. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2010. 39:363-368.
    CrossRef
  30. Lee YA, Kim M. Effects of sea tangle extract on formation of collagen and collagen cross-link in ovariectomized rats. J Life Sci. 2008. 18:1578-1583.
    CrossRef
  31. Lim HR, Ji ES, Byun HK, et al. Effect of Gastrodia elata Blume extract (TVB-1000) on the menopausal disorder model in ovariectomized rats. J Life Sci. 2023. 33:252-259.
  32. Lim YW, Sun DH, Kim YS. Osteoporosis: Pathogenesis and fracture prevention. J Korean Hip Soc. 2009. 21:6-16.
    CrossRef
  33. Moon JY, Cho EJ, Joo SJ, et al. Effect of calcium extracted from salt-fermented anchovy Engraulis japonicus on osteoporosis in ovariectomized SD-rats. Korean J Fish Aquat Sci. 2015. 48:426-431.
    CrossRef
  34. Nam SY, Kim NS, Lee YM, et al. Effects of Oryza sativa L. aleurone layer extract on bone mineral density and bone-related markers in the ovariectomized rat. Kor J Pharmacogn. 2015. 46:167-172.
  35. Park K, Ju WC, Yeo JH, et al. Conditioned medium of soybean extract treated osteoblasts inhibits RANKL induced differentiation of osteoclasts. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2010. 39:64-70.
    CrossRef
  36. Park KL. Relationship between the regulator of calcineurin 1-4 isoform and in vitro osteoclast differentiation. J Life Sci. 2015. 25:223-230.
    CrossRef
  37. Park SH, Kang SH, Yoon JH. Effects of exercise detraining on BMD, bone metabolism marker and OPG, RANKL mRNA expression of bone marrow cell in ovariectomized rats. J Korean Soc Living Environ Sys. 2020. 27:184-192.
    CrossRef
  38. Park SY, Jung BM, Choi YH, et al. Growth inhibition effects of cancer cell lines by Gloiopeltis furcata fractions in vitro. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2005. 34:771-775.
    CrossRef
  39. Schägger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem. 1987. 166:368-379.
    Pubmed CrossRef
  40. Wang Q, Yan J, Im Y, et al. In vitro screening of seaweed ethanol extracts for anti-inflammatory and anti-obesity properties. Korean J Food Sci Technol. 2023. 55:50-56.
    CrossRef
  41. Ye T, Cao P, Qi J, et al. Protective effect of low-dose risedronate against osteocyte apoptosis and bone loss in ovariectomized rats. PLoS One 2017.. 12:e0186012. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0186012.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  42. Yoo M, Youn Y, Lee N, et al. Cellular proteins related to osteoclastogenesis in RAW 264.7 cells. Cancer Prevention Research. 2007. 12:310-318.