면역은 인간의 생존에 있어 필수적인 방어 수단으로, 외부로부터 유입되는 병원성 항원으로부터 인체를 보호하는 중추적인 역할을 수행하며, 선천 면역(innate immunity)과 적응 면역(adaptative immune)으로 구분된다(Tomasi 등, 1965).

선천 면역은 항원에 대한 자기(self) 및 비자기(non-self)를 인식하여 외부 항원을 제어하는 면역반응의 단계이며, 적응면역은 특이적 항원에 대한 특정 림프구가 작용하여 기억하고 있다가 동일 항원에 대해 직접 반응한다. 선천 및 적응 면역반응은 다양한 면역세포들에 의해서 일어나며, 이들은 각각 또는 서로 협력하여 활성화되고, 활성화된 면역세포는 강력한 면역조절 인자인 cytokine을 분비하여 면역반응을 조절한다(Tomasi 등, 1965).

선천성면역에 관여하는 대표적인 면역세포로서 대식세포(macrophage)는 외부로부터 유입된 병원성 항원을 포식하거나, 바이러스 등에 감염된 세포 및 노화된 세포를 제거하고 항상성을 유지하는 역할을 수행한다(Klimp 등, 2002). 대식세포는 inducible nitric oxide synthase에 의해 유도된 면역조절 인자인 산화질소(nitric oxide)와 종양괴사인자(tumor necrosis factor; TNF-α), 인터루킨(interleukin-6; IL-6), IL-1β 및 pro-inflammatory 사이토카인 등을 분비하여 면역체계를 유지하며, 이러한 면역반응은 mitogen activated protein kinases(MAPKs)와 nuclear factor κB(NF-κB) 등과 같은 신호 전달계의 활성을 통하여 조절된다(Murray와 Wynn, 2011). 또한 자연살해세포(natural killer cell, NK cell)는 세포독성 과립을 방출하여 암세포 등을 직접적으로 죽일 수 있는 강력한 세포 살해 기능과 cytokine interferon gamma(IFN-γ)를 분비하여 대식세포와 T세포를 활성화하는 두 가지 기능을 수행하며 면역반응을 조절한다(Kim 등, 2017).

적응 면역반응은 B세포가 관여하는 체액성 면역반응과 T세포가 관여하는 세포 매개성 면역반응으로 구분된다(McDade 등, 2016). 체액성 면역반응은 특정 항원의 자극으로 B 림프구가 활성화되면 항원을 무력화시키는 항체를 다량 생성하여 혈액과 림프로 분비한다(Carroll과 Isenman, 2012). 세포 매개성 면역반응은 T세포가 관여하는 면역반응으로, T세포는 CD3 표지자를 가지며 크게 보조 T세포와 세포독성 T세포로 구분된다. 보조 T세포는 CD4 표지자를 통해 표적세포가 MHC class Ⅱ를 통해 제시한 항원을 인식한 후 활성화되어 B세포에 자극을 가한다. 자극을 받은 B세포는 항체를 분비하기 위한 형질세포 클론을 형성하거나 기억B세포 클론을 형성한다. 세포독성 T세포는 CD8 표지자를 가지며 표적세포가 MHC class Ⅰ을 통해 제시한 항원을 인식한 후 표적세포에 구멍을 내어 세포 사멸을 유도한다(Virchow 등, 1994).

Cyclophosphamide(CPA)는 DNA alkylating agent로 면역을 억제하여 자가 면역질환의 치료 및 수혈, 골수 이식 중 면역관용 유도(tolerance induction)를 위해 주로 사용되고 있다(Emadi 등, 2009). CPA는 면역억제 기능뿐만 아니라 식물유래 천연물의 면역조절 기능 연구를 위하여 면역 저하를 나타내는 동물모델을 유도하는 데 많이 사용하고 있다(Winkelstein, 1973).

괭생이모자반(Sargassum horneri)은 모자반과에 속하는 1년생 갈조류로 아시아-태평양 지역에서 널리 분포한다. 모자반은 해중림을 형성하여 수산 동물의 서식지 구성으로 매우 중요한 역할을 하고 있으나, 수정/생식 시 엽체가 기질에서 떨어져 나와 다량의 부유성 모자반 띠를 형성하고 조류를 따라 이동하며 해양 쓰레기로 취급되고 있는 실정이다(Hwang 등, 2016). 국내에도 전남 신안 일대, 제주도 연안 등에 부유성 괭생이모자반 띠가 떠내려와 양식장 피해뿐 아니라 해변에 악취를 발생시키고 경관 피해를 유발하여, 한때 국내에서는 유해 조류로 지정되는 심각한 상황이 발생하였다(Hwang 등, 2016). 그러나 최근 국제적으로 괭생이모자반의 다양한 영양학적인 가치와 생리활성 등이 보고되면서 우리나라에서도 점차 괭생이모자반의 건강 기능성에 대한 연구가 활발해지고 있다(Brown 등, 2014; Liu 등, 2012; Matsumura, 2001). 현재까지의 연구에 의하면 괭생이모자반 추출물은 골다공증 방지, 심장병 억제, 항산화, 항암효과, 헤르페스 바이러스 억제효과 등의 생리활성을 가지는 것으로 보고되고 있으나(Cardoso 등, 2015; Preeprame 등, 2001; Shao 등, 2014, 2015; Yamaguchi, 2006), 괭생이모자반 추출물의 면역 활성에 관한 연구는 활발하게 이루어지고 있지 않다.

따라서 본 연구에서는 괭생이모자반 추출물의 면역 활성에 관한 평가를 위해 CPA 유도 면역저하 동물모델을 구축하였고, 구축된 동물모델에서 괭생이모자반 추출물의 투여가 면역기관인 비장 및 흉선의 무게 변화, 혈액 내 혈구 학적인 변화, 비장세포 및 NK 세포 활성, 비장 조직 내 T세포의 분포, 마지막으로 Jurkat 세포주를 이용한 세포 내 면역 활성 기전 분석에 관하여 평가하였다.

실험동물 및 시료 투여

수컷 BALB/c 마우스(6주령)를 대한바이오링크로부터 구입하여 온도 23±2°C, 상대습도 50±5%, 명암주기 12시간으로 일정하게 유지된 사육실에 7일간 순화시킨 후 연구에 사용하였다. 본 연구에 사용된 동물실험은 경기도 경제과학진흥원 내 캠온에서 동물실험윤리위원회의 승인(2023-IA0655-00) 후 수행하였다. 일주일간 순화를 마친 BALB/c 마우스를 군당 8마리씩 5군으로 나누어 실험을 진행하였다. 본 연구에 사용된 괭생이모자반 추출물은 건조한 괭생이모자반을 정제수로 열수 추출한 후 농축하고 건조한 분말로 한국프라임제약(주)에서 제작하여 실험에 사용하였으며, 모든 실험은 해당 샘플로 진행하였다. 실험군은 정상군(Blank), CPA 처리군, 괭생이모자반 추출물 50 mg/kg, 100 mg/kg 그리고 150 mg/kg 군으로 총 5군을 설정하여 실험을 진행하였다. 괭생이모자반 추출물은 각 실험군의 평균 체중을 측정하여 distilled water(DW)에 50, 100, 150 mg/kg의 농도로 녹여 21일 동안 경구투여하였으며, 정상군과 CPA 처리군에는 동량의 DW를 경구투여하였다. 면역억제 유도를 위하여 희생 7일 및 5일 전 각각 150 및 100 mg/kg의 CPA를 복강 내 주사하여 면역억제를 유도하였으며(Park과 Lee, 2018), 정상군에는 동량의 saline을 복강투여하였다.

실험동물의 장기 무게 및 혈액 분석

경추 탈골법으로 희생시킨 마우스의 복대 정맥을 통해 혈액을 채취하였으며, 비장과 흉선을 적출하여 생리식염수로 3회 이상 세척 후 수분을 제거하여 각각의 무게를 측정하였다. 혈액은 ethylenediaminetetraacetic acid가 처리된 튜브(BD)에 담아 (주)케이피앤티에 전달하여 white blood cell, lymphocyte, neutrophil 및 monocytes 항목에 대한 분석을 의뢰하였다. 혈청 내 immunoglobulin(Ig)A, IgG 및 IgM은 ELISA kit(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 측정하였다.

비장세포 분리

경추 탈골법으로 희생시킨 마우스의 비장을 bio masher-2(Nippi Inc.)를 사용하여 균질화하였으며, RBC lysis buffer(Thermo Fisher Scientific)를 반응시켜 적혈구를 제거한 후 70 μm nylon mesh(SPL)로 불순물을 제거하였다. 이후 혈구계수기를 이용하여 비장세포를 계수하였다.

NK 세포 분리 및 활성

NK 세포는 분리된 비장세포에 NK cell isolation kit(Miltenyi Biotec)을 처리하여 분리하였다. NK 세포 활성을 측정하기 위해 한국세포주은행에서 분양받은 림프 암세포인 YAC-1 세포를 96-well plate에 5×10⁴ cells로 50 μL씩 넣고, 마우스의 비장세포에서 분리한 NK 세포를 1:1, 10:1 및 20:1 비율로 계수하여 50 μL씩 넣은 후 세포배양기에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 plate에 10 μL의 lysis solution을 넣고 5분간 배양 후 600×g로 5분간 원심분리하고 상등액 10 μL를 새로운 96-well microplate에 옮겨 담았다. LDH reaction mix를 각 well에 100 μL씩 첨가하고 빛이 차단된 실온에서 30분간 반응한 후 microplate spectrophotometer(Bio-Rad)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Haematoxylin and eosin(H&E) staining

CO₂ 가스로 희생시킨 마우스의 비장 및 흉선 조직을 48시간 동안 10% 포르말린에 고정하였다. 이후 파라핀 블록에 embedding 한 뒤, 4 μm로 절단하여 슬라이드에 옮겨 건조하였다. 샘플이 포함된 슬라이드를 자일렌으로 파라핀을 제거한 후, 알코올로 함수한 뒤 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고, 염색한 이미지는 광학 현미경(Olympus)을 사용하여 얻었다.

Immunohistochemistry(IHC)

경추 탈골법으로 희생시킨 마우스의 비장 조직을 48시간 동안 10% 포르말린에 고정하였다. 이후 파라핀 블록에 embedding 한 뒤, 4 μm로 절단하여 슬라이드에 옮겨 건조하였다. 샘플이 포함된 슬라이드를 자일렌으로 파라핀을 제거한 후 알코올로 함수하였다. 항원복구를 위해 완충액(0.01 M citrate, pH 6.0)을 처리한 후, 내인성 과산화 효소의 활성을 억제하기 위해 3% 과산화수소에 10분간 처리한 후 증류수로 수세하였다. 인산염 완충용액에 담근 후 일차 항체인 anti-CD3 및 CD4 epsilon antibody(Abcam)를 사용하여 4°C에서 하루 동안 반응시켰다. 수세 후 EnVison mouse(Dako)를 사용하여 30분간 반응시켰다. 이후 인산염 완충용액으로 수세한 뒤 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride로 발색하였다. 염색한 이미지는 광학 현미경(Olympus)을 사용하여 얻었다.

세포 배양 및 증식률 측정

Jurkat 세포주를 배양하기 위해 10% fetal bovine serum, 1% antibiotic-antimycotic이 포함된 RPMI 1640 성장배지를 사용하여 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포 증식률 확인을 위해 Jurkat 세포를 1×10⁶ cells만큼 96-well microplate의 well마다 분주한 뒤 괭생이모자반 추출물을 1~1,000 μg/mL까지 농도별로 처리하고, 24시간 동안 배양시킨 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay로 세포 활성을 측정하였다.

IL-2 및 IFN-γ발현량 측정

비장 조직에서 분리한 비장세포를 48-well microplate의 well마다 1×10⁶ cells만큼 넣고 배양하여 안정화시켰다. 이후 Concanavalin A(Con A, Invitrogen)를 1 μg/mL 농도로 처리하고 24시간 동안 배양시킨 후 상등액을 채취하였다. 상등액의 IL-2와 IFN-γ 분비량은 ELISA kit(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 측정하였다.

Jurkat 세포에서는 96-well microplate의 well마다 1×10⁶ cells만큼 넣어준 뒤 배양하였으며, 안정화 후 괭생이모자반 추출물을 0, 100, 500 및 1,000 μg/mL 농도로 처리하였다. 괭생이모자반 추출물 처리 24시간 후 상등액을 채취하였으며, 상등액의 IL-2와 IFN-γ 분비량은 ELISA kit(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 측정하였다. 이때 사이토카인의 농도는 kit에 포함된 표준용액으로부터 산출된 표준곡선으로부터 계산되었다.

Real-time PCR에 의한 mRNA 발현 분석

Jurkat 세포를 6-well microplate의 well마다 5×10⁶ cells만큼 넣어 배양한 뒤 괭생이모자반 추출물을 0, 100, 500 및 1,000 μg/mL 농도로 처리하였다. 괭생이모자반 추출물 처리 24시간 후 Jurkat 세포를 RNeasy mini kit (QIAGEN)을 사용하여 total RNA를 추출하고, 추출된 total RNA에서 Maxime^TM RT pre-mix(Intron)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 primer를 넣고 real-time PCR(7500 fast system, Applied Biosystems) 방법으로 증폭시켜 측정하였다. 측정하고자 하는 mRNA는 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase로 수치를 정량화하였고 7500 software(ver. 2.3, Applied Biosystems)를 사용하여 계산하였다. mRNA primer(Cosmogenetech) 정보는 Table 1과 같다.

Table 1 . Primer sequences for qPCR analysis of IL-2, IFN-γ, and GAPDH gene expression.

Gene	Primer	Sequence
IL-2	Forward	GCA CCC ACT TCA AGC TCC A
	Reverse	AAA TTT GAA GGT GAG CAT CCT G
IFN-γ	Forward	CCT GCG GCC TAG CTC GA
	Reverse	CAG CCA GAA ACA GCC ATG AG
GAPDH	Forward	CAT CGC CTT CCG TGT TCC TA
	Reverse	GCG GCA CGT CAG ATC CA

Western blot에 의한 단백질 발현 분석

Jurkat 세포를 6-well microplate의 well마다 5×10⁶ cell만큼 넣고 배양하였다. 세포 안정화 이후 괭생이모자반 추출물을 0, 100, 500 및 1,000 μg/mL 농도로 처리하였다. 괭생이모자반 추출물 24시간 처리 후 상등액을 버리고 남은 세포를 nuclear and cytoplasmic extraction reagents kit(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 세포질 내의 단백질을 균질화하였고 BCA protein detection kit(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 정량하였다. 10% Tris-glycine mini gel(Invitrogen)에 well당 20 μg의 단백질을 loading 하여 SDS-PAGE로 분리하였으며, poly-vinylidene difluoride membrane(Invitrogen)으로 transfer 한 후, membrane을 10 mL의 blocking solution에 1시간 동안 방치하였다. 이후 blocking buffer를 제거하고, 1×TBS-tween 20(TBST, Intron)로 5회 세척한 후 1차 항체인 p-ERK(Cell Signaling Technology), t-ERK(Cell Signaling Technology), p-JNK(Cell Signaling Technology), t-JNK(Cell Signaling Technology), p-p38(Cell Signaling Technology) 그리고 t-p38(Cell Signaling Technology)을 1:1,000으로 5% skim milk에 희석하여 4°C에서 overnight 반응시켰다. 이후 1×TBST로 10분씩 4회 세척하고, 2차 항체를 5% skim milk에 1:1,000으로 희석하여 1시간 동안 반응시키고 1×TBST로 10분간 4회 세척하였으며, West femto maximum sensitivity substrate(Thermo Fisher Scientific)와 LAS-4000(GE Healthcare Life Sciences)을 이용하여 밴드를 분석하였다.

통계분석

본 연구의 실험 결과는 통계분석 SAS 8.2를 이용하여 two-way analysis of variation(ANOVA) 검정을 실시한 후, Bonferroni post tests의 다중범위검정과 Student’s t test로 P<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다. 모든 실험군은 3회 이상 반복하여 동일한 실험 결과로 사용하였으며 결과는 평균±표준편차로 나타냈다.

면역억제 BALB/c mice에서 괭생이모자반 추출물이 체중, 비장 및 흉선 조직에서 미치는 영향

동물모델에 CPA 투여는 면역조절에 있어서 중요한 역할을 하는 비장, 흉선 및 림프절 등의 조직에 직접적인 영향을 주어 무게가 감소하는 것으로 알려져 있다(Huang 등, 2020; Larsen과 Spärck, 1983). CPA는 T세포에 대해 농도에 따른 선택적인 효능을 나타내며(Ahlmann과 Hempel, 2016), 주로 자가면역질환(Brodsky, 2010), 림프종(Wall과 Conrad, 1961), 그 외 유방암 및 폐암(Davis 등, 1969; Helsby 등, 2021) 등 면역억제 조절을 통한 질환 치료제로 사용되고 있다. 따라서 면역억제 조절의 특징을 지닌 CPA는 면역세포 및 동물모델에서 면역억제를 위한 물질로 활용되고 있다(Kumar와 Venkatesh, 2016). 본 연구에서는 CPA에 의한 면역억제 동물모델에서 괭생이모자반 추출물 처리가 비장 및 흉선 조직에서 무게 감소에 관한 보호 효과와 더불어 체중 변화량에 대해 분석하였다(Fig. 1). 동물모델에서 CPA 처리군에서 정상군 대비 10%의 유의적 체중 감소를 확인하였다. 하지만 괭생이모자반 추출물 처리는 CPA에 의한 체중 감소 현상을 유의적으로 억제함을 확인하였다(Fig. 1A). 비장 및 흉선은 면역조절에 중요한 역할을 하는 대표적인 장기이며, 이전 연구를 통해(Kim 등, 2022; Yan 등, 2021) CPA 처리에 의해 비장 및 흉선의 무게가 감소할 수 있음을 보고한 바 있다. 본 연구에서 CPA 처리는 정상군 대비 비장 및 흉선 조직의 무게를 각각 69.13% 및 73.49%로 유의하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 괭생이모자반 추출물 처리는 CPA 처리군 대비 비장 및 흉선 조직의 무게를 유의적으로 증가시켰으며, 각 조직의 크기 또한 육안 평가를 통해 증가함을 확인하였다(Fig. 1B, 1C). 이러한 결과는 괭생이모자반 추출물이 CPA에 의한 부작용인 체중 감소를 억제할 뿐만 아니라 면역조절에 있어서 중요 조직인 비장 및 흉선에 대한 보호 효과가 있을 것으로 사료된다.

Fig 1. Effects of SH on immune function in a CPA-induced immunosuppressed in vivo model. SH was orally administrated in BALB/c mice for 21 days. CPA was injected on days 14 and 16 to induce immunosuppression. After sacrifice, immune-related parameters were measured. (A) The body weight of each group was measured, as well as the issue weight and size of (B) spleen tissues and (C) thymus tissues. ^#P<0.05 vs. naïve mice, ^*P<0.05 vs. CPA-injected mice. Results are displayed as mean±SD of n=8 per group. SH, Sargassum horneri extract; CPA, cyclophosphamide.

면역억제 BALB/c mice에서 괭생이모자반 추출물이 혈액학적 효능에 미치는 영향

면역억제제인 CPA 투여는 혈액 내 적혈구, 백혈구, 혈소판 수의 감소를 유발하는 것으로 알려져 있다(Feng 등, 2016). 본 연구 결과에서는 면역조절의 중요 지표 인자 중 하나인 혈액 내 백혈구 수치 및 그 구성 세포인 림프구, 호중구, 단핵구 수치에 대한 분석을 진행하였다(Fig. 2). 그 결과, CPA 처리는 정상군과 비교하여 백혈구, 림프구, 호중구 및 단핵구 수치를 유의적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 하지만 괭생이모자반 추출물 처리는 CPA에 의한 백혈구 수치 감소를 농도 의존적으로 억제하였으며, 또한 림프구, 호중구 및 단핵구 수치가 괭생이모자반 추출물 150 mg/kg 농도에서 CPA 대비 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(Fig. 2A). 면역세포로 불리는 백혈구는 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구, 단핵구 등으로 구성되어 있다. 림프구는 NK 세포, T세포 및 B세포로 구성되어 면역조절에 중요한 역할을 하며(Jaffe 등, 2003), 호중구 및 단핵구는 대식세포의 분화 및 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다(Anderson, 2009; Schulz 등, 2021). 본 연구 결과는 괭생이모자반 추출물은 CPA 처리로 인한 백혈구 감소를 억제함으로써 면역세포에 대한 보호 효과를 나타낼 것으로 예상된다. 특히 백혈구 내 림프구, 호중구 및 단핵구에 대한 보호 효과가 확인되었으며, 이는 외부 자극에 대한 면역조절 작용에 역할을 할 것으로 사료된다.

Fig 2. Effects of SH on immune cell count and immunoglobulin expression in a CPA-induced immunosuppressed in vivo model. SH was orally administrated in BALB/c mice for 21 days. CPA was injected on days 14 and 16 to induce immunosuppression. After sacrifice, blood was collected, and the immune cell count of (A) total white blood cell (WBC), neutrophils (NEU), lymphocytes (LYM) and monocyte (MONO) was measured. (B) The immunoglobulin A, G, and M in blood were measured using the ELISA method. ^#P<0.05 vs. naïve mice, ^*P<0.05 vs. CPA-injected mice. Results are displayed as mean±SD of n=10 per group. SH, Sargassum horneri extract; CPA, cyclophosphamide.

IgG, IgM 및 IgA는 외부로부터 유입되는 병원체에 대해 항원-항체 생성을 유도하여 감염성 감소 및 세포 독성 유발 등의 면역반응 촉진 역할을 한다. 본 연구 결과는 괭생이모자반 추출물의 면역조절 효과를 확인하기 위해 면역글로불린인 IgG, IgM 및 IgA에 대해 분석하였다. 본 연구 결과는 IgA 및 IgG에서 CPA 처리 시 정상군과 비교하여 유의적으로 수치가 감소하는 것을 확인할 수 있었으나, IgM의 감소 경향은 확인하였으나, 통계적인 유의성은 없었다. 괭생이모자반 추출물이 면역글로불린에 대해 미치는 효능을 확인하기 위해 괭생이모자반 추출물을 50, 100 및 150 mg/kg 농도로 투여한 후 CPA를 처리하였다. IgA와 IgM은 CPA군 대비 괭생이모자반 추출물 최고 농도인 150 mg/kg에서 각각 70.17%, 70.24%만큼 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 2B). IgG의 경우 괭생이모자반 추출물의 최저 농도인 50 mg/kg부터 최고 농도인 150 mg/kg까지 CPA군 대비 각각 12.63%, 7.48% 및 17.44%만큼 유의적으로 증가하였다(Fig. 2B). B 림프구는 항원 감지, 항체 생성 등 적응면역에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. B 림프구에서 생성 및 분비되는 면역글로불린은 기능적으로 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 나눌 수 있으며 이 중 IgG, IgA 및 IgM이 혈액 내에서 상대적으로 양이 많아 분석하기 용이한 것으로 알려져 있다(Schroeder와 Cavacini, 2010). IgG는 혈액 및 조직액에 가장 많이 존재하는 면역글로불린으로 유일하게 태반을 통과할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 이전 연구에 따르면 IgG를 유아가 섭취할 경우 면역력을 높이는 데 효과가 있음이 밝혀져 있다(Rath 등, 2013). IgA는 주로 눈물 및 초유 등 신체 분비물에서 많이 발견되며 점막에 위치한 B세포에서 생성된다. 따라서 IgA는 점막의 면역에 주요 역할을 하며, 그 외에도 감염방지 미생물의 증식과 분화 조절, 장내 미생물의 다양성의 조절 등에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Woof와 Kerr, 2006). IgM은 B세포가 성숙하면서

생성되는 대표적 면역글로불린으로써 B세포의 표면에 많이 존재하며, 박테리아 등의 외부 병원체에 부착하여 서로 응집시키는 역할을 한다(Boes, 2000). 최근 연구에 따르면 면역글로불린인 IgG, IgA 및 IgM이 천연물 투여를 통해 증가하였음을 확인하였으며(Lee 등, 2023), 이는 면역글로불린이 면역조절에 관한 확인 지표로 활용이 가능함을 보여준다. 본 연구 결과에 따르면 CPA에 의해 감소한 혈액 내 IgG, IgA 및 IgM의 수치가 괭생이모자반 추출물 투여에 의해 유의적으로 증가함을 확인하였으며, 이는 괭생이모자반 추출물이 B세포 조절을 통해 면역증진 효과를 나타내는 것으로 사료된다.

면역억제 BALB/c mice에서 괭생이모자반 추출물이 면역세포의 보호 및 활성화에 미치는 영향

본 연구는 괭생이모자반 추출물의 신체 내 면역을 조절하는 중요 조직인 비장 내 면역세포에 대한 보호 효과를 조사하였다. 본 연구에서는 비장 조직에서 splenocyte 및 NK 세포를 각각 분리하여 총 세포 수를 측정하였다(Fig. 3). 그 결과 정상군과 비교하여 CPA 처리군에서 splenocyte의 수가 96.87% 감소하였으며, NK 세포 수는 96.44% 감소함을 확인하였다. 하지만 괭생이모자반 추출물 투여는 CPA군과 비교하여 splenocyte 및 NK 세포 수를 농도 의존적으로 증가시킴을 확인할 수 있었으며, 최고 농도 150 mg/kg에서 최대 각 31.24% 및 35.2% 증가하는 것으로 분석되었다(Fig. 3A). 괭생이모자반 추출물의 면역 활성화 연구를 위해 splenocyte 세포에서의 IL-2 및 IFN-γ 분비와 NK 세포의 활성화 수준을 확인하였다. 군별로 분리된 비장에서 동일한 수의 splenocyte 세포를 분리 배양한 후, Con A를 24시간 처리하여 IL-2 및 IFN-γ 분비량을 측정한 결과 정상군과 비교하여 CPA 처리 시 유의하게 IL-2 및 IFN-γ의 분비량이 감소함을 확인하였다. 하지만 괭생이모자반 추출물 투여 시, CPA 처리군과 비교하여 IL-2 발현량이 100 및 150 mg/kg 농도에서 2.06 및 2.16배의 유의적인 증가 효과가 있었으며, IFN-γ의 발현량은 10.04 및 12.12배의 유의적 증가 효과를 확인하였다(Fig. 3B). Fig. 3C에서는 비장 조직에서 분리된 NK 세포와 YAC-1 세포주를 1:1, 10:1 및 20:1 비율로 24시간 공배양하여, 암세포의 사멸을 유도하는 NK 세포 활성도를 측정하였다. 그 결과 괭생이모자반 추출물 처리는 CPA에 의해 감소한 NK 세포의 활성도를 농도 의존적으로 증가시킴을 확인하였다(Fig. 3C).

Fig 3. Effects of SH on immune functions of splenocytes isolated from CPA-induced immunosuppressed mice. SH was orally administrated in BALB/c mice for 21 days. CPA was injected on days 14 and 16 to induce immunosuppression. After sacrifice, splenocytes were isolated, and (A) splenocyte numbers and NK cells numbers were measured. (B) The cytokine expression of IL-2 and IFN-γ were measured using the ELISA method. (C) NK cells were purified from splenocytes, and YAC-1-targeting activity was measured. ^#P<0.05 vs. splenocytes from naïve mice, ^*P<0.05 vs. splenocytes from CPA-injected mice. Results are displayed as mean±SD of three or more separate experiments. SH, Sargassum horneri extract; CPA, cyclophosphamide.

CPA는 자가 면역질환의 치료 및 수혈, 골수 이식 중 면역관용 유도를 위해 주로 사용되고 있으나(Emadi 등, 2009), 과량 투여 시 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성에 기인하여 생체 내 항산화 체계를 무력화시켜 백혈구 및 림프구 등의 면역세포를 감소시키고(Cui 등, 2016), 더불어 체내 가장 큰 이차 면역기관으로 면역반응의 항상성 유지에 중추적 역할을 담당하는 비장의 무게를 감소시키는 것으로 보고되었다(Cesta, 2006).

IL-2와 IFN-γ는 면역반응 활성 지표 인자로, NK 세포 활성에 직접적인 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Wang 등, 2012). NK 세포는 선천면역의 기능을 담당하는 세포로, 필요로 하지 않는 표적세포를 인지하여 세포 사멸을 유도한다(Biron 등, 1999). NK 세포의 활성은 다양한 신호전달에 의해 조절이 되며, 이런 조절은 감염된 세포만을 제거할 수 있게 한다. NK 세포의 이러한 특징으로 인해 항암 연구나 면역증진 효능 연구에 활용 중이다. 본 연구에서 괭생이모자반 추출물의 투여는 생체 내 면역세포의 활성을 통하여 CPA 유도 면역억제 동물모델에서 비장세포 및 NK 세포 등의 면역세포의 세포 사멸을 감소시키고(Fig. 3A), 비장 조직 내 면역세포가 분비하는 cytokine인 IL-2 및 IFN-γ 분비를 증가시키는 것으로 관찰되었다(Fig. 3B). 더욱이 괭생이모자반 추출물이 NK 세포 활성 증진에 효과가 있음을 확인하였다(Fig. 3C).

면역억제 BALB/c mice에서 괭생이모자반 추출물 처리를 통한 비장의 조직학적 평가

본 연구는 CPA에 의해 면역이 억제된 마우스에서 괭생이모자반 추출물이 비장세포에 미치는 영향을 조직학적으로 확인하기 위하여 H&E 염색법을 통해 분석하였다(Fig. 4). H&E 염색을 통해 정상군과 비교하였을 때, CPA 처리군은 white pulp(WP) 및 red pulp(RP) 영역의 현저한 감소를 확인하였다. 하지만 괭생이모자반 추출물 처리는 CPA 처리 군보다 WP 및 RP의 면적이 확연히 증가한 것을 확인하였다.

Fig 4. Effects of SH on the H&E and IHC staining of spleen tissue in a CPA-induced immunosuppressed in vivo model. SH was orally administrated in BALB/c mice for 21 days. CPA was injected on days 14 and 16 to induce immunosuppression. After sacrifice, spleen tissue was isolated, and (A) images of the H&E stained spleen sections. (B) Images of the IHC staining of CD3 and CD4 expression. SH, Sargassum horneri extract; CPA, cyclophosphamide; RP, red pulp; WP, white pulp.

비장 조직 내 WP 및 RP 영역은 CD3, CD4 및 CD8 등이 발현된 T 림프구들이 혼재된 것으로 밝혀져 있다. 괭생이모자반 추출물 투여가 T세포에 주는 영향을 확인하기 위하여 비장 조직 내 T 림프구를 인지할 수 있는 표지자인 CD3 및 CD4를 활용하여 면역조직화학을 통해 분석하였다. 그 결과, 정상군과 비교하여 CPA 처리 시 WP 및 RP 영역에서 CD3 및 CD4의 발현량이 매우 감소함을 확인할 수 있었다. 하지만 CPA군과 비교하여 괭생이모자반 추출물의 투여는 WP 및 RP 영역에서 CD3와 CD4의 발현량을 확연히 증가시키는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

병원체를 식별하고 제거하는 기능을 하는 비장 조직은 체내에서 가장 큰 림프기관으로 B 림프구, T 림프구, 단핵구 및 대식세포 등 면역조절에 중요한 역할을 하는 세포들의 집합 기관이다(Mebius와 Kraal, 2005). 일반적으로 B 림프구 및 T 림프구는 주로 WP 영역 내에 위치해 있으며(Veerman과 van Ewijk, 1975), T 림프구를 표지하는 CD3, CD4 및 CD8은 FACS 및 면역조직화학 분석을 통해 발현량을 확인할 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구 결과는 면역이 억제된 마우스의 비장 조직에서 괭생이모자반 추출물 투여가 T 림프구의 집합영역인 WP 영역에 미치는 보호능을 확인하였으며, WP 내 CD3 및 CD4의 발현량이 CPA군 대비 늘어남을 확인함으로써 괭생이모자반 추출물 투여는 T 림프구의 활성화 및 보호능이 매우 뛰어남을 확인할 수 있었다.

T(Jurkat)세포에서 괭생이모자반 추출물이 면역 활성에 미치는 영향

T세포와 B 세포는 각각 세포성 면역반응과 체액성 면역 반응을 일으킨다(Park 등, 2011). Jurkat 세포는 immortalized T cell lymphocyte로 mitogen인 Con A 처리 시 T-cell receptor와 transcription factors인 nuclear factor of activated T cells, NF-κB 및 activator protein 1이 상호작용하여 IL-2, IFN-γ 등의 immunoregulatory cytokines를 생성하는 특징을 지니고 있다(Tsatsanis 등, 1998). Jurkat 세포에서 밝혀진 특징은 천연물의 면역 활성 연구에 활용되고 있다. 본 연구 결과는 괭생이모자반 추출물이 T세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 Jurkat 세포를 활용하여 면역 활성 효과를 확인하였다. 괭생이모자반 추출물 투여가 T세포의 증식능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Jurkat 세포에 괭생이모자반 추출물을 50 μg/mL부터 1,000 μg/mL 농도로 처리하였다. 그 결과, 무처리군인 대조군과 비교하여 괭생이모자반 추출물은 25 μg/mL 농도부터 1.3배의 유의적인 세포 증식 효과가 있음을 확인하였으며, 50, 100, 500, 1,000 μg/mL에서 농도 의존적으로 대조군 대비 각각 3.2, 3.74, 3.91, 3.86배의 세포 증식 효과가 있음을 확인하였다(Fig. 5). 이후 시험은 괭생이모자반 추출물 처리 시 세포 증식 효과가 있는 최고 농도인 1,000 μg/mL부터 500, 100 μg/mL를 선정하여 면역 활성 평가를 진행하였다. 면역조절에 있어서 IL-2 및 IFN-γ는 중요한 지표 인자로 사용되고 있는 cytokine으로 알려져 있다. IL-2는 T lymphocyte 및 NK 세포의 성장을 유도하는 것으로 밝혀져 있으며(Ben 등, 1987), IFN-γ는 Th1 cell 및 NK 세포에서 분비되어 면역세포에서

Fig 5. Effects of SH on cell proliferation in Jurkat cells. SH were treated at the concentration of 0, 1, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750, and 1,000 μg/mL. After 24 h, cell proliferation was determined by MTT assay. Results are expressed as the mean ±SD (n=3). Statistical analysis was performed using Student’s t-test with a significant level of ^*P<0.05 compared to 0 μg/mL (Control) group. SH, Sargassum horneri extract.

세포 증식과 항체 생성을 유도하며, 대식세포에서 외부 병원균에 대한 제거에 작용하는 것으로 밝혀져 있다(Swann 등, 2007; Wald 등, 2006). 괭생이모자반 추출물 투여가 T세포에서 면역 활성이 유도되는지 확인하기 위하여, Jurkat 세포에 괭생이모자반 추출물 100, 500 및 1,000 μg/mL를 처리하여 ELISA를 통한 cytokine 함량을 측정하였고, qPCR을 통해 IL-2, IFN-γ 및 IL-4의 발현량을 확인하였다(Fig. 6A). ELISA 분석을 통해 IL-2의 발현량을 확인한 결과, 대조군과 비교하여 괭생이모자반 추출물 100, 500 및 1,000 μg/mL 처리는 각각 1.02, 1.3, 1.3배 증가시키는 경향이 있음을 확인하였으나, 1,000 μg/mL 농도에서만 유의적인 효과가 있었다. IFN-γ 발현에서도 IL-2 발현과 유사하게 괭생이모자반 추출물 100 및 500 μg/mL에서는 유의적인 증가 효과를 확인할 수 없었으나, 1,000 μg/mL 농도에서는 대조군과 비교하여 3.3배의 유의적인 증가 효과를 확인할 수 있었다. 동일 농도(100, 500 및 1,000 μg/mL)로 알레르기 유도 반응의 biomarker인 cytokine IL-4의 발현을 관찰하였을 때, 괭생이모자반 추출물의 처리는 IL-4의 발현에는 영향을 미치지 않았다. qPCR 실험을 통한 IL-2와 IFN-γ 분석에서는 괭생이모자반 추출물 100, 500 및 1,000 μg/mL 처리 시 대조군과 비교하여 IL-2 mRNA 발현량이 각각 1.9, 2.2 및 1.8배 유의적으로 증가하였다(Fig. 6B). IFN-γ mRNA 발현량 또한 각각 1.4, 1.3 및 1.4 배의 유의적인 증가율을 확인할 수 있었으나, IL-4 mRNA 발현량은 유의적인 변화가 없었다(Fig. 6B).

Fig 6. Effects of SH on cytokine expression in Jurkat cells. SH were treated at the concentration of 0, 100, 500, and 1,000 μg/mL. After 24 h, (A) cytokine production of IL-2, IFN-γ, and IL-4 in culture supernatant were investigted by ELISA kits. (B) mRAN levels of IL-2, IFN-γ, and IL-4 in Jurkat cell treated with SH. Results are expressed as the mean±SD (n=3). Statistical analysis was performed using Student’s t-test with a significant level of ^*P<0.05 compared to 0 μg/mL (Blank) group. SH, Sargassum horneri extract.

Helper T cell은 발현되는 cytokine의 종류에 따라 Th1 및 Th2로 구분할 수 있다. Th1 cytokine은 대식세포, 림프구 및 호중구 등을 자극하여 면역 활성을 유도하는 것으로 알려져 있으며 Th2 cytokine은 면역과민 반응을 촉진해 알레르기 면역반응을 일으킨다(Murphy와 Reiner, 2002). 대표적인 Th1 cytokine으로 IL-2, IFN-γ 및 TNF-α 등이 있으며, IL-2는 다양한 면역세포에 영향을 주는데, 그중에서도 CD4+ T세포와 CD8+ T세포에서 연관성이 밝혀져 있으며(Paliard 등, 1988), 항원 특이 killer T세포와 NK 세포, LAK 세포의 활성을 촉진하고(Siegel 등, 1987), B 림프구의 증식과 분화를 촉진하는 것이 알려져 있다(Jelinek 등, 1986). IFN-γ 또한 T세포, 대식세포, NK 세포와 같은 면역세포에서 분비되는 대식세포의 중요한 조절자로 알려져 있으며, Janus kinase(JAK)-STAT1 pathway에 의해 interferon-stimulated genes의 활성화(Clark 등, 2022) 및 mitogen-activated protein kinase(MAPK) 신호전달과 상호작용(Matsuzawa 등, 2012)을 통해 면역 활성 기능에 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다. Th2 cytokine은 대표적으로 IL-4, IL-10, IL-13 등이 있으며, 이와 같은 cytokine류는 IgE의 생성 능력을 촉진하여 면역과민 반응을 일으키는 것으로 보고되었다(Maggi, 1998). 이전 연구에서는 괭생이모자반 추출물이 면역증진 효과가 밝혀져 있었으나, 그 효과가 대식세포의 활성화에 한정되어 있었다. 본 연구를 통하여 T 세포주에서 괭생이모자반 추출물 처리는 IL-2, IFN-γ의 단백질 및 mRNA 발현량을 증가시키고 IL-4의 단백질 및 mRNA 발현량에는 영향을 주지 않는 것으로 관찰되었으며, 이러한 결과로 미루어 보아 괭생이모자반 추출물의 처리는 면역과민 반응의 유도 없이 T세포의 활성화를 통해 면역증가에 기여하는 것으로 사료된다.

T(Jurkat)세포에서 괭생이모자반 추출물의 MPAK 신호전달 활성에 미치는 영향

MAPKs 신호전달경로는 T세포에서 세포의 증식, 성장 및 활성을 조절하는 데 중요한 역할을 하고 있다. 특히 IL-2 및 IFN-γ와 연관되어 MAPK 신호전달경로는 인산화를 통해 상호 작용을 하며, 면역 또는 염증 반응 조절에 중요한 기능을 하고 있다. 이에 본 연구 결과는 괭생이모자반 추출물이 면역 활성화 효과의 분자적 기전을 확인하기 위해 MAPK의 대표적 인자인 ERK1/2, JNK, p38의 단백질 발현도를 확인하였다(Fig. 7). ERK1/2 단백질 발현은 대조군과 비교하여 괭생이모자반 추출물 처리 시 농도 의존적으로 4.3, 5.6 및 6.3 배의 유의적인 증가를 확인하였다. JNK 및 p38의 단백질 발현도 또한 ERK1/2 발현도와 유사하게 유의적인 발현 증가가 나타났다(Fig. 7). MAPK는 앞서 언급한 대로 기본적으로 다양한 세포에서 세포의 증식, 분화 및 사멸을 조절하며, 면역세포인 선천성 면역세포와 antigen-presenting cell에서도 중요한 분자조절기전으로 밝혀져 있다(Kim 등, 2013; Nakahara 등, 2006). MAPK의 대표적 단백질인 ERK 및 p38은 mitogen-activated T 림프구 및 NK 세포에서 IL-2 및 IL-12에 의해 조절됨이 밝혀져 있으며(Yu, 2000), 다른 연구에 의하면 JNK 및 ERK가 Jurkat 세포에서 IL-2 및 TNF-a의 생산에 관여한다는 것을 밝혔다(Kaewthawee와 Brimson 등, 2013). 이렇듯 T세포에서 MAPK 신호전달의 조절은 면역 활성 조절을 하는 중요한 신호전달 중 하나로 주목받고 있으며, 이를 활용하여 T세포에서 MAPK 신호전달의 활성화를 통한 천연물의 면역증강 효과에 관한 연구가 진행되고 있다(Chan 등, 2006). 본 연구에서는 Jurkat 세포에서 괭생이모자반 추출물 처리가 MAPK 단백질 발현을 유의적으로 증가시킴을 확인하였으며, 이는 괭생이모자반 추출물이 T세포에서 MAPK 기전을 통해 면역 활성에 기여하는 것으로 사료된다.

Fig 7. Effect of SH extracts on the MAPKs phospholylation in Jurkat cells. SH were treated at the concentration of 12.5, 25, and 50 μg/mL for 24 h. MAPKs (p38, JNK, ERK) protein expressions was analyzed by western blot analysis. Results are expressed as the mean±SD (n=3). Statistical analysis was performed using Student’s t-test with a significant level of ^*P<0.05 compared to 0 μg/mL (Blank) group. SH, Sargassum horneri extract.

본 연구에서는 괭생이모자반 추출물의 면역증강 효과를 확인하기 위하여 CPA 유도를 통한 면역억제 동물모델과 T 세포주인 Jurkat을 활용하여 분석하였다. 동물모델에서 괭생이모자반 추출물 투여는 체중과 더불어 면역조절에 관여하는 중요한 조직인 비장 및 흉선에서 CPA에 의한 조직 무게 감소의 억제 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 혈액학적 평가를 통해 백혈구, 림프구, 호중구, 단핵구의 수치와 면역글로불린인 IgM, IgA 및 IgG의 발현량이 괭생이모자반 추출물 투여를 통해 CPA에 의한 수치 감소를 억제하는 것을 확인하였다. 괭생이모자반 추출물을 투여는 CPA에 의한 비장 총 세포 수 및 NK 총 세포 수의 감소를 억제하였으며, 면역세포 활성 지표 인자인 IL-2 및 IFN-γ가 CPA군 대비 증가함을 확인하였다. 또한, NK 세포 활성화 분석을 통해 괭생이모자반 투여가 NK 세포 활성 증가를 유도할 수 있음을 확인하였다. 비장 조직에서 H&E 염색 및 면역조직화학 분석을 통해 조직학적 병변과 T 림프구의 대표 표현형인 CD3 및 CD4의 발현량을 측정한 결과, 괭생이모자반 추출물 투여는 WP 및 RP 영역이 CPA에 의해 감소하는 것을 억제하였으며, 면역조직화학 분석을 통해 CD3 및 CD4의 발현량이 CPA군 대비 증가하는 것을 확인하였다. T세포(Jurkat) 모델에서 괭생이모자반 추출물 처리는 T세포 증식능을 증가시키고, 과민면역반응의 지표인 IL-4 분비능의 증가 없이 IL-2/IFN-γ 사이토카인 분비능을 증가시키는 것으로 확인되었으며, 이는 세포 증식 및 cytokines 분비와 밀접한 관련을 하는 MAPK의 세포 내 조절을 통하여 이루어짐을 확인하였다. 이러한 결과로 미루어 보아 괭생이모자반 추출물의 투여는 T세포 및 B세포의 활성을 통하여 CPA 유도 면역저하 동물모델에서 면역증강 효능을 나타내는 것으로 사료된다. 괭생이모자반 추출물은 면역 활성 유도 기능성과 관련하여, 건강기능식품 원료로 개발하는 데 있어 그 잠재적 가치가 매우 클 것으로 사료된다.

이 논문은 2021년도 해양수산부 재원으로 해양수산과학기술진흥원의 지원을 받아 수행된 연구입니다(20210656, 빅데이터 기반 해양바이러스 제어 및 마린바이오틱스 개발).