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JKFN Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition



Online ISSN 2288-5978

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Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(4): 321-327

Published online April 30, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.321

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

Evaluation of the Activities of Alcohol Dehydrogenase, Acetaldehyde Dehydrogenase, and Enhancement of In Vivo Alcohol Metabolism by Natural Compound-Derived Complex Extract, Alcut

Cheol-Jong Jung1 , Yeong-Eun Yu1 , Chang-Hyeon Shin1 , Hee-Young Yang2 , and Joonheum Park1

1Central Research Center, Okchundang Inc.
2Preclinical Research Center, Daegu-Gyeongbuk Medical Innovation Foundation

Correspondence to:Joonheum Park, Central Research Center, Okchundang Inc., 142, Yuram-ro, Dong-gu, Daegu 41059, Korea, E-mail: jhpark@okchundang.co.kr

Received: January 18, 2024; Revised: March 4, 2024; Accepted: March 6, 2024

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

This study investigated the effect of a complex extract (Alcut) derived from natural products on the alcohol metabolism. The candidate complex extracts were screened for the alcohol dehydrogenase (ADH) and acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) activities, and a highly active complex extract was selected. The effects of Alcut were evaluated using Sprague-Dawley rats administered a 30% ethanol solution after receiving 80 mg/kg of Alcut or phosphate- buffered saline (control). Blood samples were collected at one and five hours post-administration to assess the blood ethanol and acetaldehyde concentrations, ADH and ALDH enzyme activities, and liver function indicators (aspartate aminotransferase, γ-glutamyl transferase). The blood ethanol concentration decreased in the Alcut group, whereas it increased in the control group, maintaining a lower concentration than the control group. The blood acetaldehyde concentration decreased in the Alcut group, but it was not statistically significant. In particular, the blood ADH and ALDH activities were higher in the Alcut group than the control group, with sustained activity after five hours, unlike the rapid decline observed in the control group. These findings highlight the potential value of Alcut used in this study as a functional food ingredient that promotes the alcohol metabolism and alleviates hangover symptoms. Further research will be needed to explore the underlying mechanisms and potential applications of Alcut in alcohol metabolism.

Keywords: complex extract, alcohol metabolism, alcohol dehydrogenase, acetaldehyde dehydrogenase, hangover symptoms

숙취는 음주 후 알코올이 체내에서 대사되고 작용하는 과정에서 발생하는 갈증, 두통, 근육통, 메스꺼움, 구토 등의 증상을 겪는 것을 의미한다. 보통 숙취의 증상은 술을 마신 뒤 몇 분 혹은 몇 시간 내에 시작되며 이는 혈중알코올농도(BAC: blood alcohol concentration)가 감소하는 것과 관련되어 있고, BAC가 0에 이를 때 가장 심한 숙취 증상이 나타나게 되며 그로부터 하루 이상 지속될 수 있는 것으로 알려져 있다(Verster, 2008). 과도한 음주로 인한 숙취는 개인적인 불편감을 초래하는 것은 물론, 정신적, 육체적으로 문제를 야기하여 사회 전반에 걸쳐 큰 사회경제적 파급효과를 일으킬 수 있다(Brinsi 등, 2022; Gilbertson 등, 2009). 실제로 음주와 숙취로 인한 사회경제적 손실금액이 상당한 규모로 추산되어 있으며, 이러한 문제는 현대 사회에서 심각한 이슈로 부각되고 있다(Rehm 등, 2009). 또한 2012년 한국보건사회연구원 보고서에 따르면 음주로 인한 사회경제적 비용은 연간 7조 3,698억 원에 달하며 매년 증가하는 추세를 보인다(Jung 등, 2012). 따라서 늘어나는 음주와 그로 인한 손실에 대응하기 위해서는 효과적인 숙취 해소물질에 관한 연구가 필요한 실정이다.

알코올은 그 대사산물인 아세트알데히드의 생성으로 인해 프로스타글란딘 생성에 영향을 미쳐 혈관 확장 효과를 초래하게 되므로 두통이나 안면홍조 현상이 나타날 수 있고(Flisiak 등, 1993; Wienecke 등, 2009), 알코올은 히스타민, 세로토닌 및 프로스타글란딘과 같은 두통과 관련된 몇 가지 신경전달물질과 호르몬에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다(Swift와 Davidson, 1998). 세포질의 수용성 단백질인 알코올탈수소효소(ADH: alcohol dehydrogenase)는 알코올을 아세트알데히드로 산화시키므로 알코올 대사란 곧 아세트알데히드의 생성 또는 축적으로 연결될 수 있다(Riveros-Rosas 등, 1997). 아세트알데히드는 화학적 반응성이 아주 큰 물질로 단백질을 비롯한 중요한 생리활성물질과 쉽게 결합하기 때문에 농도가 높아지면 우리 몸의 다양한 기능에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다(Nicholls 등, 1992). 알데히드탈수소효소(ALDH: aldehyde dehydrogenase)는 아세트알데히드를 아세테이트로 산화시키므로 아세트알데히드 축적과 그에 따른 부작용을 막을 수 있는 것으로 알려져 있으나 동양인의 절반 정도에서는 ALDH의 불활성형이 존재하여 음주 시 알데히드가 혈액 중에 축적되므로 소량의 음주로도 고통을 받을 수 있는 것으로 알려져 있다(Harada 등, 1980; Ricciardi 등, 1983).

한의학에서 숙취는 주상(酒傷)에 속한다. 주상은 술에 의한 내상을 의미하며, 병인 분류상 음식상에 포함되며 주상의 일반적 증후는 구토(嘔吐), 오심(惡心), 두통(頭痛), 불능식(不能食), 현훈(眩暈), 신열(身熱), 오한(惡寒), 설리(泄痢), 자한(自汗), 수족전요(手足戰搖) 등으로 나타난다. 주상의 치료는 발한(發汗)하고 이소변(利小便)하여 분소기습(分消其濕) 하는 방법을 위주로 하며, 역대로 갈화해정탕(葛花解酲湯), 대금음자(對金飮子), 오령산(五苓散), 생강사심탕(生薑瀉心湯) 등의 처방이 많이 활용되었다. 이 중에서도 갈화해정탕은 이동원이 제방한 것으로 “음주과상(飮酒過傷), 구토담역(嘔吐痰逆), 수족전요(手足戰搖), 정신혼란(精神昏亂), 음식감소(飮食減少)를 치료한다”라고 하여 주상의 여러 가지 처방 중에서도 숙취에 적절한 처방으로 판단된다. 보이차는 ‘본초강목습유(本草綱目拾遺)’에 술을 깨는 데 효과적이며 소화와 염증을 줄이고 위를 깨끗이 하는 데 도움이 된다고 기술되어 있으며, 중국 고대문학인 ‘홍루몽(紅樓夢)’에서도 보이차는 소화를 돕는 음료로 묘사했다. 또한 최근 연구에 따르면 보이차는 항산화 작용에 효과가 있으며, 알코올의 체내 축적을 억제하고 숙취를 완화하는 데 도움이 된다고 보고되었다(Hwang과 Kim, 2020; Song 등, 2005).

숙취 해소와 관련한 연구로는 칡이나 헛개나무를 비롯한 다양한 약용 식물의 추출물에 관한 효능 연구가 주를 이루고 있으며(Kim, 2004; Lee 등, 2017; Park 등, 2006; Seo 등, 2022), 복합적인 한의학 처방의 효능에 관한 과학적 연구는 부족한 실정이다. 따라서 한의학적 숙취 처방의 이론을 토대로 다양한 조합과 추가적인 공정처리에 따른 효능의 비교연구를 통해 후보물질을 탐색하고 이에 대한 과학적 근거와 실효성을 마련할 필요성이 있다. 본 연구에서는 생강사심탕(生薑瀉心湯), 소시호탕(小柴胡湯), 대금음자(對金飮子), 갈화해정탕(葛花解酲湯)의 4가지 처방을 바탕으로 조성한 배합을 여러 가지 처리 조건으로 추출한 후 in vitro에서 ADH 및 ALDH의 활성 확인을 통해 가장 효과적인 배합과 조건을 토대로 새로운 숙취 해소 기능성 후보물질을 선별한 후, 실험동물에서 후보물질의 알코올 대사와 ADH 및 ALDH의 활성, 간기능의 지표를 확인함으로써 숙취 해소 효능을 객관적으로 검증하였다.

실험물질의 준비

연구를 위한 한약재들은 (주)옥천당 영천지점에서 보유한 규격품을 제공받아 사용했으며, 보이차 추출물은 puer tea extract powder(Sciyu Biotech)를 구매하여 사용하였다. 추출물의 가수분해에는 효소 Pyr-flo(Connell Bros. Co.), Viscozyme® L(Novozymes)을 사용하였다. 최종적인 숙취 해소 기능성 후보물질을 도출하기 위해 Table 1의 4가지 배합에 대하여 Table 2의 6가지 조건으로 각각 추출한 후 동결 건조하여 24가지 실험물질을 준비했으며, 실험물질의 ADH 및 ALDH 활성 측정을 위해 S9 rat liver homogenate(Moltox Co.)를 사용하였다.

Table 1 . Compositions of test materials

GroupComponents
Formulation 1Zingiber officinale Roscoe (17.9%), Scutellariae baicalensis Georgi (14.9%), Panax Ginseng C.A. Meyer (13.4%), Zingiber officinale Roscoe (dry) (14.9%), Pinellia ternata Breitenbach (14.9%), Coptis japonica Makino (9.0%), Zizyphus jujuba Miller (14.9%)

Formulation 2Bupleurum falcatum L. (25.53%), Pinellia ternata Breitenbach (8.82%), Panax Ginseng C.A. Meyer (13.24%), Zizyphus jujuba Miller (14.71%), Glycyrrhiza uralensis Fischer (13.24%), Scutellariae baicalensis Georgi (13.24%), Zingiber officinale Roscoe (13.24%)

Formulation 3Pueraria lobata Ohwi (30.88%), Atractylodes japonica Koidzumi (30.88%), Citrus unshiu Markovich (15.52%), Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo (7.20%)

Formulation 4Pueraria lobata Ohwi (31.79%), Hovenia dulcis Thunb (16.89%), Atractylodes japonica Koidzumi (12.91%), Poria cocos Wolf (12.91%), Citrus unshiu Markovich (12.91%), Alpinia officinarum Hance (4.64%), Zingiber officinale Roscoe (dry) (2.65%), Amomum villosum Lour. (2.65%), Myristica fragrans Houtt. (2.65%)


Table 2 . Process conditions

GroupProcess

Extraction1)Enzymatic hydrolysis2)Pu’er tea
Condition 180°C3)
Condition 2100°C
Condition 3100°CPyr-flo5)
Condition 4100°CViscozyme® L5)
Condition 5100°CPyr-floAddition4)
Condition 6100°CViscozyme® LAddition

1)Add hot water in a 12.2-fold ratio and extract for 3 hours.

2)Enzyme treated for 2 hours followed by inactivation at 95°C for 5 min.

3)Not treated or not added.

4)The Pu’er tea extract was combined with the composite extract at a ratio of 1:3.

5)Pyr-flo (Connell Bros. Co.) and Viscozyme® L (Novozymes) are enzymes used for hydrolysis.



최종 후보물질의 선정 및 ADH와 ALDH 활성 측정(in vitro)

최종 후보물질을 선정하기 위해 24가지 실험물질은 10 mg/mL의 농도로 희석하여 ADH 및 ALDH 활성을 측정했으며, 실험물질의 ADH 및 ALDH 활성 측정을 위한 효소원으로 S9 rat liver homogenate를 사용하였다. 동결건조된 효소원 S9 rat liver homogenate를 0.1% 소혈청 알부민(bovine serum albumin; cat No. A9647, Sigma-Aldrich) 용액에 희석하고 3.3 mg/mL의 단백질 농도로 제조하여 0.45 μm syringe filter로 여과한 후 사용하였다.

ADH 활성 측정은 Blandino의 방법(Bostian과 Betts, 1978)을 변형하여 흡광도 340 nm에서 NADH의 생성 속도를 지표로 사용하였다. 반응액의 조성은 증류수 1.4 mL, 1.0 M Tris-HCl buffer(pH 8.8) 0.75 mL, 20 mM NAD+ 0.3 mL, 95%(v/v) 에탄올 0.3 mL, 실험물질 0.1 mL와 효소원 0.15 mL를 넣어 혼합하였다. 혼합액 200 μL를 30°C에서 5분간 preincubation 한 후, 5분간 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 이때 실험물질을 첨가하지 않은 것을 대조군으로 하고, ADH 활성은 대조군에 대한 상대활성(%)으로 측정하였다.

ALDH 활성 측정은 Bostian과 Betts(1978)의 방법을 변형하여 측정했으며, 흡광도 340 nm에서 NADH의 생성 속도를 지표로 사용하였다. 반응액의 조성은 증류수 2.1 mL, 1.0 M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 0.3 mL, 20 mM NAD+ 0.1 mL, 1.0 M acetaldehyde 0.1 mL, 3.0 M KCl 0.1 mL, 0.33 M 2-mercaptoethanol 0.1 mL, 실험물질 0.1 mL와 10배 희석하여 여과된 효소원 0.1 mL를 넣어 혼합하였다. 혼합액 200 μL를 30°C에서 5분간 preincubation 한 후, 5분간 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 이때 실험물질을 첨가하지 않은 것을 대조군으로 하고, ALDH 활성은 대조군에 대한 상대활성(%)으로 측정하였다. 24가지 실험물질에 대한 ADH 및 ALDH의 상대활성 비교를 통해 가장 우수한 실험물질을 숙취 해소 기능성 평가를 위한 최종 후보물질로 선정하였다(이하 Alcut).

실험동물 준비 및 Alcut 투여

(주)코아텍으로부터 Sprague-Dawley rat 수컷 총 30마리를 공급받아 일정 기간 사육 및 순화를 거쳐 사육 환경에 적응시킨 후 7주령에 실험을 진행하였다. 실험동물의 사육 환경은 12시간 간격의 명암 cycle과 온도 21±1°C, 상대습도 50±10%를 유지하였다. 실험동물의 그룹은 시간별(1시간 혹은 5시간) 2그룹으로 대조군[phosphate-buffered saline(PBS)+ethanol] 각 5마리, 실험군(Alcut+ethanol) 각 10마리씩 나누어 진행하였다. 본 실험에서 Alcut의 동결건조물은 PBS에 녹여 준비하였고, 체내 알코올 대사에 미치는 영향을 최소화하기 위해 절식 16시간 이후 투여 진행하였다. Alcut 80 mg/kg 농도로 대조군은 같은 양의 PBS(10 mL/kg)만 경구투여하였고, 30분 뒤 대조군과 실험군 모두에 30%의 알코올을 3 g/kg의 용량으로 경구투여하였다. 이후 1시간 후와 5시간 후 각각 전혈을 채취한 뒤 혈청만을 분리하였다. 분리된 혈청은 실험별로 일부분씩 분주하여 실험 전까지 -80°C에 보관하였다. 보관된 혈청의 분석은 대구경북첨단의료산업진흥재단 전임상센터에서 수행하였다. 모든 실험동물의 사육관리는 식품의약품안전처 고시 ‘실험동물에 관한 법률’과 농림축산식품부 ‘동물보호법’에 준하여 실시하였다. 본 실험은 동물보호법에 근거한 대구경북첨단의료산업진흥재단 전임상센터 실험동물운영위원회(IACUC)에 승인받고 진행하였다(승인번호: KMEDI-22110204-01).

혈청 내 에탄올 및 아세트알데히드 농도 측정

혈청 내 에탄올 농도는 EnzyChromTM ethanol assay kit(ECET-100, BioAssay Systems)을 사용했으며, 혈청 내 아세트알데히드 농도는 EnzyChromTM acetaldehyde assay kit(EACT-100, BioAssay Systems)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 반응시킨 후, microplate reader(synergy H4 microplate reader, BioTek)를 활용해 565 nm에서 흡광도를 측정하였다.

혈청 내 ADH와 ALDH의 활성 측정

혈청 내의 ADH와 ALDH 활성의 측정은 각각 alcohol dehydrogenase assay kit(ab102533, Abcam)과 ALDH activity assay kit(ab155893, Abcam)을 사용했으며, 제조사의 프로토콜에 따라 반응시킨 후 microplate reader(synergy H4 microplate reader)를 활용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

간 기능 지표 확인

간 기능을 확인하기 위한 지표로 혈청 내 aspartate aminotransferase(AST)와 γ-glutamyl transferase(γ-GTP)의 농도를 자동 화학 분석기(TBA-120FR, Toshiba)를 사용하여 측정하였다.

통계 분석

실험에서 얻은 데이터는 평균±표준편차로 표시했으며, GraphPad Prism 9(GraphPad Software Inc.)을 이용하여 분석하였다. 각 평균값의 차이를 검증하기 위해 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)과 t-test에 의해 P<0.05, P<0.01 수준에서 실험군 평균치의 통계적 유의성을 검정하였다.

실험물질의 ADH 및 ALDH 활성(in vitro)

각 배합과 처리 조건으로 만든 24가지 실험물질 10 mg/mL 농도에서 ADH 및 ALDH를 측정한 결과는 실험물질이 첨가되지 않은 대조군에 대한 상대활성(%)으로 각각 Table 3Table 4에 나타내었다. ADH와 ALDH 상대활성은 formulation 4에서 formulation 1, 2, 3보다 유의적으로 우수한 생리활성을 보였으며, formulation 4의 6가지 처리 조건 중에서는 condition 6으로 처리한 경우가 다른 조건들보다 유의적으로 가장 우수한 ADH 및 ALDH 상대활성이 확인되었다. 따라서 formulation 4인 갈화, 지구자, 백출, 백복령, 진피, 고량강, 건강, 사인, 육두구의 배합을 12.2배수의 정제수로 100°C에서 3시간 추출한 후 Viscozyme® L 효소를 2시간 처리하고 보이차 추출물을 첨가하는 조건으로 준비한 실험물질인 Alcut을 최종 물질로 선정하고 이후 동물실험을 통한 숙취 해소 기능성 평가를 진행하였다.

Table 3 . ADH activity (%) of combinations of four formulations with six conditions

Condition 1Condition 2Condition 3Condition 4Condition 5Condition 6
Formulation 191.55±0.2099.002±0.0799.33±0.0396.95±0.0898.34±0.2490.24±0.11
Formulation 295.01±0.0491.62±0.1293.47±0.08101.38±0.3296.48±0.9197.20±0.31
Formulation 3106.54±0.21103.78±0.11109.68±0.13105.49±0.16109.41±0.15107.65±0.17
Formulation 4115.98±0.18a112.28±0.11a105.24±0.14108.45±0.06a119.26±0.08a122.11±0.08ab

Values are expressed mean±SD of five samples.

The percentage activity was calculated relative to control (no test materials added).

The superscript ‘a’ signifies that under each treatment condition (conditions 1 to 6), formulation 4 demonstrates a significant difference compared to formulations 1, 2, and 3 at a significance level of P<0.01.

The superscript ‘b’ signifies that under formulation 4, condition 6 exhibits a significant difference compared to conditions 1 to 5 at a significance level of P<0.01.



Table 4 . ALDH activity (%) of combinations of four formulations with six conditions

Condition 1Condition 2Condition 3Condition 4Condition 5Condition 6
Formulation 192.84±0.0692.42±0.0597.50±0.0794.37±0.1294.87±0.0794.59±0.06
Formulation 295.24±0.1391.80±0.0595.11±0.0797.16±0.1097.33±0.0295.34±0.05
Formulation 390.76±0.0894.34±0.1197.15±0.0994.23±0.1191.82±0.0796.28±0.08
Formulation 4100.15±0.10a99.95±0.12a100.30±0.12a100.28±0.06a102.46±0.06a104.47±0.10ab

Values are expressed mean±SD of five samples.

The percentage activity was calculated relative to control (no test materials added).

The superscript ‘a’ signifies that under each treatment condition (conditions 1 to 6), formulation 4 demonstrates a significant difference compared to formulations 1, 2, and 3 at a significance level of P<0.01.

The superscript ‘b’ signifies that under formulation 4, condition 6 exhibits a significant difference compared to conditions 1 to 5 at a significance level of P<0.01.



혈청 내 에탄올 및 아세트알데히드 농도 측정

알코올 대사를 확인하기 위해 혈청 내 에탄올과 아세트알데히드의 농도를 측정한 결과는 Fig. 1에 나타내었다. PBS를 투여한 후 알코올을 투여한 대조군의 경우는 1시간 이후(18.93±1.52 μg/dL)보다 5시간 이후(24.17±5.31 μg/dL)에 유의한 혈중 에탄올 농도 상승이 관찰되는 데 반해, Alcut 투여 후 에탄올을 투여한 실험군의 경우 1시간 이후(17.18±3.71 μg/dL)보다 5시간 이후(15.75±4.11 μg/dL) 혈중 에탄올 농도가 감소하는 것이 확인되었다. 이는 Han과 Kim(2004)의 연구에서 알코올 섭취 후 대조군에서 6시간까지 혈중알코올농도가 1시간 대비 증가한 것에 비해 프로폴리스를 이용한 숙취 해소 음료는 6시간까지 서서히 감소한 결과와 일치한다. 따라서 Alcut을 에탄올을 투여하기 전에 섭취하는 경우 혈중 에탄올 농도 상승을 유의미하게 억제하는 것으로 확인하였다. Alcut 투여 후 에탄올을 투여한 경우 시간이 지남에 따라 아세트알데히드 농도가 낮아지는 경향이 관찰되었고 PBS 투여 후 에탄올을 투여한 경우 시간이 지남에 따라 아세트알데히드 농도가 갈수록 높아지는 경향이 관찰되었으나 통계적 유의성은 확인되지 않았다. 다만 초기에 빠른 에탄올 분해 효과는 일시적으로 아세트알데히드의 농도를 높게 유지할 수 있지만, ALDH의 활성이 낮지 않다면 오히려 숙취를 완화한다고 보고되었다(Mackus 등, 2020). 또한, 아세트알데히드 농도의 경우 에탄올 흡수 속도, 에탄올 분해 속도, ALDH 활성 등 여러 요인에 의해 시간대별 조건에 따라 profiling이 급격하게 달라지는 것으로 보이며, 시간대별 알데히드 농도 변화에 관한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Fig. 1. Effect of Alcut (80 mg/kg b.w.) on ethanol, acetaldehyde concentration (μg/dL) in blood serum of 30% ethanol-treated (3 g/kg b.w.) rats. The graph illustrates the temporal changes in (A) ethanol concentrations and (B) acetaldehyde concentrations in blood serum, measured in micrograms per deciliter (μg/dL). The x-axis represents the time elapsed after ethanol treatment, and the y-axis represents the concentration levels of ethanol and acetaldehyde. Asterisk (*) indicates statistical significance at P<0.05.

혈청 내 ADH와 ALDH의 활성 측정

알코올 대사를 확인하기 위해 혈청 내 ADH와 ALDH의 활성을 측정한 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 대조군의 경우 1시간 이후(41.39±15.31 mU/mL)보다 5시간 이후(22.49±12.76 mU/mL)에 ADH의 활성이 유의하게 감소하는 것이 관찰되는 데 반해, 실험군에서는 ADH의 활성이 떨어지지 않고 유지되는 것이 확인되었다(47.26±11.85 mU/mL→44.60±15.20 mU/mL). 또한, 5시간 이후 실험군이 대조군 대비 유의하게 높은 ADH 활성을 유지하는 것이 확인되었다. An 등(1999)의 연구에서 헛개나무와 오리나무 추출물의 ADH의 활성 증진 수준에 따라 혈중알코올농도 또한 같은 경향으로 감소한다는 연구 결과와 마찬가지로 Alcut에 의해 실험군에서의 대조군 대비 높은 ADH 활성이 혈중 에탄올 농도의 유의적인 차이를 가져온 것으로 보인다. 대조군에서 1시간(13.50±4.00 mU/mL)보다 5시간(7.74±3.59 mU/mL)에서 ALDH의 활성이 유의하게 감소하는 것이 관찰되는 데 반해 실험군에서는 ALDH의 활성이 떨어지지 않고 유지되는 것(14.80±3.70→14.24±4.01 mU/mL)이 확인되었다. 또한, 5시간 이후 실험군(14.24±4.01 mU/mL)이 대조군(7.74±3.59 mU/mL) 대비 유의하게 높은 ALDH 활성을 유지하는 것이 확인되었다. Choi 등(2017)의 꾸지뽕나무 뿌리 추출물의 알코올 대사 효소 활성 및 혈액 산성화 기전 조절을 통한 숙취 해소 효과 연구에서 알코올 투여 대조군은 혈중 ADH와 ALDH 활성 모두 급격히 감소하였고, 숙취 해소 음료에서 유지 혹은 증가하는 경향을 보인 결과와 유사하다. 본 연구에서는 Alcut 섭취를 통한 ADH의 활성을 유지함으로써 혈중 알코올의 대사에 영향을 미친 것으로 보인다. 또한, 알코올 대사의 1차 산물인 아세트알데히드의 대사에 가장 큰 영향을 미치는 요소는 ALDH의 활성으로 알려져 있으며(Cederbaum, 2012), Alcut의 5시간까지의 혈중 ALDH 활성을 높게 유지하는 효과는 아세트알데히드 대사를 촉진하여 숙취를 완화할 것으로 사료된다. 본 연구에서는 ADH 및 ALDH의 효소 활성을 측정하여 알코올 대사에 대한 긍정적 측면을 확인했으나, 실제 단백질 발현량의 변화를 확인하지 못하였다는 아쉬움이 존재한다. 단백질 발현량과 효소들의 실제 활성도 차이에 대한 상관관계를 확인하여 Alcut이 알코올 대사에 작용하는 기전에 관한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Fig. 2. Effect of Alcut (80 mg/kg b.w.) on ADH, ALDH activity (mU/mL) in blood serum of 30% ethanol-treated (3 g/kg b.w.) rats. The graph illustrates the temporal changes in (A) alcohol dehydrogenase (ADH) activity and (B) aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity in blood serum. The x-axis represents the time elapsed after ethanol treatment, and the y-axis represents the activity levels of ADH and ALDH. Asterisk (*) indicates statistical significance at P<0.05.

간 기능 지표 확인

간 기능 지표인 AST와 γ-GTP는 간독성에 의해 간이 손상되는 경우 방출되는 효소로 활성이 증가하면 간 손상을 나타낸다(Tominaga 등, 1993; Torruellas 등, 2014). 간기능 지표로 측정한 혈청 내 AST와 γ-GTP의 활성은 Fig. 3에 나타내었다. 대조군의 경우 5시간 이후 AST 활성이 133.8 ±17.3 U/L에서 151.2±25.6 U/L로 증가하는 것이 관찰된 반면, 실험군에서는 134.8±19.8 U/L에서 119.1±7.8 U/L로 오히려 유의하게 감소하는 것이 관찰되었다. 또한, 실험군에서는 5시간 이후 γ-GTP 활성이 0.59±0.1 U/L에서 0.83±0.3 U/L로 증가하는 것이 관찰되었으나, 대조군의 경우 γ-GTP가 0.54±0.3 U/L에서 0.47±0.3 U/L로 오히려 유의미한 감소가 확인되었다. 알코올을 다량 섭취한 경우 간에서 에탄올과 아세트알데히드가 산화적 스트레스를 일으키고 단백질 및 세포구조에 영향을 미쳐 간세포를 파괴하며, 이에 따라 간세포에 존재하는 효소들이 혈액으로 방출되게 된다(Bruha 등, 2012). 대표적인 숙취음료 원료인 헛개나무는 Na 등(2004)의 연구에서 알코올 분해작용에 의해 간독성이 줄어들었고 이는 간세포의 손상을 억제하여 간 기능 지표들의 감소를 불러왔다고 보고하였다. 따라서 대조군에서는 에탄올 투여에 의해 나타난 간독성 효과가 AST와 γ-GTP 활성을 초래하였고, 처리군에서는 Alcut이 간독성을 완화하여 간 기능 지표인 AST와 γ-GTP의 활성을 낮춘 것으로 사료된다. 이는 Lee 등(2011)의 연구에서 약용식물이 첨가된 미네랄이 알코올 분해 효소의 활성을 조절함과 동시에 간 기능 지표를 낮춘 결과와 같이 본 연구에서 알코올 대사 관련 효소의 활성 증가를 통한 실제 혈중 에탄올 농도의 감소와 간 보호 효과의 결과를 토대로 한방 유래 천연물 복합추출물인 Alcut의 숙취 해소 효과의 가능성을 확인하였다.

Fig. 3. Effect of Alcut (80 mg/kg b.w.) on AST (U/L) and γ-GTP activity in blood serum of 30% ethanol-treated (3 g/kg b.w.) rats. The graph illustrates the temporal changes in (A) aspartate aminotransferase (AST) activity and (B) gamma-glutamyl transferase (γ-GTP) activity in blood serum. The x-axis represents the time elapsed after ethanol treatment and the y-axis represents the activity levels of AST and γ-GTP. Asterisk indicates statistical significance at *P<0.05 and **P<0.01.

한의학 기반의 천연물 유래 복합추출물 Alcut이 알코올 대사에 미치는 영향을 조사하였다. 여러 후보 복합추출물 중에서 ADH와 ALDH 활성을 조사하여 가장 높은 활성을 보이는 복합추출물 Alcut을 선정하였다. Alcut의 알코올 대사 효과를 평가하기 위해 Sprague-Dawley rat을 사용하여 Alcut과 PBS를 각각 경구투여한 뒤, 30분 후에 30% 에탄올을 처리하였다. 이후에 1시간 및 5시간 후 혈액을 채취하여 혈액 에탄올 및 아세트알데히드 농도, ADH 및 ALDH 효소 활성 그리고 간 기능 지표(AST, γ-GTP)를 분석하였다. Alcut 투여군에서 혈액 에탄올 농도는 대조군에 비해 낮아지면서 알코올 대사가 개선되었다. 또한, Alcut 투여군에서 혈액 아세트알데히드 농도는 높은 수준으로 유지되었지만, 혈액 ADH와 ALDH 활성 역시 대조군에 비해 높은 수준으로 유지되었고, 이러한 활성은 5시간 후에도 지속해서 유지되었음을 관찰하였다. 이러한 결과는 Alcut이 초기의 빠른 알코올 분해능, 그리고 알코올 대사 효소들의 활성을 유지하면서 지속적인 알코올 대사를 촉진함을 보여준다. 더불어 이러한 알코올 대사의 촉진으로 Alcut 투여군에서는 대조군 대비 AST와 γ-GTP 활성이 유의하게 감소하였다. 이는 Alcut이 알코올 대사를 개선하고 알코올 대사 효소들의 활성을 유지하여 숙취 증상을 완화하는 데 기여할 수 있다는 것을 시사한다. 이 연구 결과로 천연 유래 복합추출물인 Alcut의 알코올 대사 조절 기능성에 대한 잠재적 가치를 확인하였으며, 앞으로의 연구에서는 이 추출물의 기전과 알코올 대사 및 관련 질환 분야에서의 응용 가능성을 더욱 탐구할 필요가 있다.

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Article

Article

Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53(4): 321-327

Published online April 30, 2024 https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.321

Copyright © The Korean Society of Food Science and Nutrition.

천연물 유래 복합 추출물 Alcut의 Alcohol Dehydrogenase와 Acetaldehyde Dehydrogenase 활성 및 체내 알코올의 대사 촉진 효능 평가

정철종1․유영은1․신창현1․양희영2․박준흠1

1(주)옥천당 중앙연구소
2대구경북첨단의료산업진흥재단 전임상센터

Received: January 18, 2024; Revised: March 4, 2024; Accepted: March 6, 2024

Evaluation of the Activities of Alcohol Dehydrogenase, Acetaldehyde Dehydrogenase, and Enhancement of In Vivo Alcohol Metabolism by Natural Compound-Derived Complex Extract, Alcut

Cheol-Jong Jung1 , Yeong-Eun Yu1 , Chang-Hyeon Shin1 , Hee-Young Yang2 , and Joonheum Park1

1Central Research Center, Okchundang Inc.
2Preclinical Research Center, Daegu-Gyeongbuk Medical Innovation Foundation

Correspondence to:Joonheum Park, Central Research Center, Okchundang Inc., 142, Yuram-ro, Dong-gu, Daegu 41059, Korea, E-mail: jhpark@okchundang.co.kr

Received: January 18, 2024; Revised: March 4, 2024; Accepted: March 6, 2024

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

This study investigated the effect of a complex extract (Alcut) derived from natural products on the alcohol metabolism. The candidate complex extracts were screened for the alcohol dehydrogenase (ADH) and acetaldehyde dehydrogenase (ALDH) activities, and a highly active complex extract was selected. The effects of Alcut were evaluated using Sprague-Dawley rats administered a 30% ethanol solution after receiving 80 mg/kg of Alcut or phosphate- buffered saline (control). Blood samples were collected at one and five hours post-administration to assess the blood ethanol and acetaldehyde concentrations, ADH and ALDH enzyme activities, and liver function indicators (aspartate aminotransferase, γ-glutamyl transferase). The blood ethanol concentration decreased in the Alcut group, whereas it increased in the control group, maintaining a lower concentration than the control group. The blood acetaldehyde concentration decreased in the Alcut group, but it was not statistically significant. In particular, the blood ADH and ALDH activities were higher in the Alcut group than the control group, with sustained activity after five hours, unlike the rapid decline observed in the control group. These findings highlight the potential value of Alcut used in this study as a functional food ingredient that promotes the alcohol metabolism and alleviates hangover symptoms. Further research will be needed to explore the underlying mechanisms and potential applications of Alcut in alcohol metabolism.

Keywords: complex extract, alcohol metabolism, alcohol dehydrogenase, acetaldehyde dehydrogenase, hangover symptoms

서 론

숙취는 음주 후 알코올이 체내에서 대사되고 작용하는 과정에서 발생하는 갈증, 두통, 근육통, 메스꺼움, 구토 등의 증상을 겪는 것을 의미한다. 보통 숙취의 증상은 술을 마신 뒤 몇 분 혹은 몇 시간 내에 시작되며 이는 혈중알코올농도(BAC: blood alcohol concentration)가 감소하는 것과 관련되어 있고, BAC가 0에 이를 때 가장 심한 숙취 증상이 나타나게 되며 그로부터 하루 이상 지속될 수 있는 것으로 알려져 있다(Verster, 2008). 과도한 음주로 인한 숙취는 개인적인 불편감을 초래하는 것은 물론, 정신적, 육체적으로 문제를 야기하여 사회 전반에 걸쳐 큰 사회경제적 파급효과를 일으킬 수 있다(Brinsi 등, 2022; Gilbertson 등, 2009). 실제로 음주와 숙취로 인한 사회경제적 손실금액이 상당한 규모로 추산되어 있으며, 이러한 문제는 현대 사회에서 심각한 이슈로 부각되고 있다(Rehm 등, 2009). 또한 2012년 한국보건사회연구원 보고서에 따르면 음주로 인한 사회경제적 비용은 연간 7조 3,698억 원에 달하며 매년 증가하는 추세를 보인다(Jung 등, 2012). 따라서 늘어나는 음주와 그로 인한 손실에 대응하기 위해서는 효과적인 숙취 해소물질에 관한 연구가 필요한 실정이다.

알코올은 그 대사산물인 아세트알데히드의 생성으로 인해 프로스타글란딘 생성에 영향을 미쳐 혈관 확장 효과를 초래하게 되므로 두통이나 안면홍조 현상이 나타날 수 있고(Flisiak 등, 1993; Wienecke 등, 2009), 알코올은 히스타민, 세로토닌 및 프로스타글란딘과 같은 두통과 관련된 몇 가지 신경전달물질과 호르몬에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다(Swift와 Davidson, 1998). 세포질의 수용성 단백질인 알코올탈수소효소(ADH: alcohol dehydrogenase)는 알코올을 아세트알데히드로 산화시키므로 알코올 대사란 곧 아세트알데히드의 생성 또는 축적으로 연결될 수 있다(Riveros-Rosas 등, 1997). 아세트알데히드는 화학적 반응성이 아주 큰 물질로 단백질을 비롯한 중요한 생리활성물질과 쉽게 결합하기 때문에 농도가 높아지면 우리 몸의 다양한 기능에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다(Nicholls 등, 1992). 알데히드탈수소효소(ALDH: aldehyde dehydrogenase)는 아세트알데히드를 아세테이트로 산화시키므로 아세트알데히드 축적과 그에 따른 부작용을 막을 수 있는 것으로 알려져 있으나 동양인의 절반 정도에서는 ALDH의 불활성형이 존재하여 음주 시 알데히드가 혈액 중에 축적되므로 소량의 음주로도 고통을 받을 수 있는 것으로 알려져 있다(Harada 등, 1980; Ricciardi 등, 1983).

한의학에서 숙취는 주상(酒傷)에 속한다. 주상은 술에 의한 내상을 의미하며, 병인 분류상 음식상에 포함되며 주상의 일반적 증후는 구토(嘔吐), 오심(惡心), 두통(頭痛), 불능식(不能食), 현훈(眩暈), 신열(身熱), 오한(惡寒), 설리(泄痢), 자한(自汗), 수족전요(手足戰搖) 등으로 나타난다. 주상의 치료는 발한(發汗)하고 이소변(利小便)하여 분소기습(分消其濕) 하는 방법을 위주로 하며, 역대로 갈화해정탕(葛花解酲湯), 대금음자(對金飮子), 오령산(五苓散), 생강사심탕(生薑瀉心湯) 등의 처방이 많이 활용되었다. 이 중에서도 갈화해정탕은 이동원이 제방한 것으로 “음주과상(飮酒過傷), 구토담역(嘔吐痰逆), 수족전요(手足戰搖), 정신혼란(精神昏亂), 음식감소(飮食減少)를 치료한다”라고 하여 주상의 여러 가지 처방 중에서도 숙취에 적절한 처방으로 판단된다. 보이차는 ‘본초강목습유(本草綱目拾遺)’에 술을 깨는 데 효과적이며 소화와 염증을 줄이고 위를 깨끗이 하는 데 도움이 된다고 기술되어 있으며, 중국 고대문학인 ‘홍루몽(紅樓夢)’에서도 보이차는 소화를 돕는 음료로 묘사했다. 또한 최근 연구에 따르면 보이차는 항산화 작용에 효과가 있으며, 알코올의 체내 축적을 억제하고 숙취를 완화하는 데 도움이 된다고 보고되었다(Hwang과 Kim, 2020; Song 등, 2005).

숙취 해소와 관련한 연구로는 칡이나 헛개나무를 비롯한 다양한 약용 식물의 추출물에 관한 효능 연구가 주를 이루고 있으며(Kim, 2004; Lee 등, 2017; Park 등, 2006; Seo 등, 2022), 복합적인 한의학 처방의 효능에 관한 과학적 연구는 부족한 실정이다. 따라서 한의학적 숙취 처방의 이론을 토대로 다양한 조합과 추가적인 공정처리에 따른 효능의 비교연구를 통해 후보물질을 탐색하고 이에 대한 과학적 근거와 실효성을 마련할 필요성이 있다. 본 연구에서는 생강사심탕(生薑瀉心湯), 소시호탕(小柴胡湯), 대금음자(對金飮子), 갈화해정탕(葛花解酲湯)의 4가지 처방을 바탕으로 조성한 배합을 여러 가지 처리 조건으로 추출한 후 in vitro에서 ADH 및 ALDH의 활성 확인을 통해 가장 효과적인 배합과 조건을 토대로 새로운 숙취 해소 기능성 후보물질을 선별한 후, 실험동물에서 후보물질의 알코올 대사와 ADH 및 ALDH의 활성, 간기능의 지표를 확인함으로써 숙취 해소 효능을 객관적으로 검증하였다.

재료 및 방법

실험물질의 준비

연구를 위한 한약재들은 (주)옥천당 영천지점에서 보유한 규격품을 제공받아 사용했으며, 보이차 추출물은 puer tea extract powder(Sciyu Biotech)를 구매하여 사용하였다. 추출물의 가수분해에는 효소 Pyr-flo(Connell Bros. Co.), Viscozyme® L(Novozymes)을 사용하였다. 최종적인 숙취 해소 기능성 후보물질을 도출하기 위해 Table 1의 4가지 배합에 대하여 Table 2의 6가지 조건으로 각각 추출한 후 동결 건조하여 24가지 실험물질을 준비했으며, 실험물질의 ADH 및 ALDH 활성 측정을 위해 S9 rat liver homogenate(Moltox Co.)를 사용하였다.

Table 1 . Compositions of test materials.

GroupComponents
Formulation 1Zingiber officinale Roscoe (17.9%), Scutellariae baicalensis Georgi (14.9%), Panax Ginseng C.A. Meyer (13.4%), Zingiber officinale Roscoe (dry) (14.9%), Pinellia ternata Breitenbach (14.9%), Coptis japonica Makino (9.0%), Zizyphus jujuba Miller (14.9%)

Formulation 2Bupleurum falcatum L. (25.53%), Pinellia ternata Breitenbach (8.82%), Panax Ginseng C.A. Meyer (13.24%), Zizyphus jujuba Miller (14.71%), Glycyrrhiza uralensis Fischer (13.24%), Scutellariae baicalensis Georgi (13.24%), Zingiber officinale Roscoe (13.24%)

Formulation 3Pueraria lobata Ohwi (30.88%), Atractylodes japonica Koidzumi (30.88%), Citrus unshiu Markovich (15.52%), Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo (7.20%)

Formulation 4Pueraria lobata Ohwi (31.79%), Hovenia dulcis Thunb (16.89%), Atractylodes japonica Koidzumi (12.91%), Poria cocos Wolf (12.91%), Citrus unshiu Markovich (12.91%), Alpinia officinarum Hance (4.64%), Zingiber officinale Roscoe (dry) (2.65%), Amomum villosum Lour. (2.65%), Myristica fragrans Houtt. (2.65%)


Table 2 . Process conditions.

GroupProcess

Extraction1)Enzymatic hydrolysis2)Pu’er tea
Condition 180°C3)
Condition 2100°C
Condition 3100°CPyr-flo5)
Condition 4100°CViscozyme® L5)
Condition 5100°CPyr-floAddition4)
Condition 6100°CViscozyme® LAddition

1)Add hot water in a 12.2-fold ratio and extract for 3 hours..

2)Enzyme treated for 2 hours followed by inactivation at 95°C for 5 min..

3)Not treated or not added..

4)The Pu’er tea extract was combined with the composite extract at a ratio of 1:3..

5)Pyr-flo (Connell Bros. Co.) and Viscozyme® L (Novozymes) are enzymes used for hydrolysis..



최종 후보물질의 선정 및 ADH와 ALDH 활성 측정(in vitro)

최종 후보물질을 선정하기 위해 24가지 실험물질은 10 mg/mL의 농도로 희석하여 ADH 및 ALDH 활성을 측정했으며, 실험물질의 ADH 및 ALDH 활성 측정을 위한 효소원으로 S9 rat liver homogenate를 사용하였다. 동결건조된 효소원 S9 rat liver homogenate를 0.1% 소혈청 알부민(bovine serum albumin; cat No. A9647, Sigma-Aldrich) 용액에 희석하고 3.3 mg/mL의 단백질 농도로 제조하여 0.45 μm syringe filter로 여과한 후 사용하였다.

ADH 활성 측정은 Blandino의 방법(Bostian과 Betts, 1978)을 변형하여 흡광도 340 nm에서 NADH의 생성 속도를 지표로 사용하였다. 반응액의 조성은 증류수 1.4 mL, 1.0 M Tris-HCl buffer(pH 8.8) 0.75 mL, 20 mM NAD+ 0.3 mL, 95%(v/v) 에탄올 0.3 mL, 실험물질 0.1 mL와 효소원 0.15 mL를 넣어 혼합하였다. 혼합액 200 μL를 30°C에서 5분간 preincubation 한 후, 5분간 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 이때 실험물질을 첨가하지 않은 것을 대조군으로 하고, ADH 활성은 대조군에 대한 상대활성(%)으로 측정하였다.

ALDH 활성 측정은 Bostian과 Betts(1978)의 방법을 변형하여 측정했으며, 흡광도 340 nm에서 NADH의 생성 속도를 지표로 사용하였다. 반응액의 조성은 증류수 2.1 mL, 1.0 M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 0.3 mL, 20 mM NAD+ 0.1 mL, 1.0 M acetaldehyde 0.1 mL, 3.0 M KCl 0.1 mL, 0.33 M 2-mercaptoethanol 0.1 mL, 실험물질 0.1 mL와 10배 희석하여 여과된 효소원 0.1 mL를 넣어 혼합하였다. 혼합액 200 μL를 30°C에서 5분간 preincubation 한 후, 5분간 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 이때 실험물질을 첨가하지 않은 것을 대조군으로 하고, ALDH 활성은 대조군에 대한 상대활성(%)으로 측정하였다. 24가지 실험물질에 대한 ADH 및 ALDH의 상대활성 비교를 통해 가장 우수한 실험물질을 숙취 해소 기능성 평가를 위한 최종 후보물질로 선정하였다(이하 Alcut).

실험동물 준비 및 Alcut 투여

(주)코아텍으로부터 Sprague-Dawley rat 수컷 총 30마리를 공급받아 일정 기간 사육 및 순화를 거쳐 사육 환경에 적응시킨 후 7주령에 실험을 진행하였다. 실험동물의 사육 환경은 12시간 간격의 명암 cycle과 온도 21±1°C, 상대습도 50±10%를 유지하였다. 실험동물의 그룹은 시간별(1시간 혹은 5시간) 2그룹으로 대조군[phosphate-buffered saline(PBS)+ethanol] 각 5마리, 실험군(Alcut+ethanol) 각 10마리씩 나누어 진행하였다. 본 실험에서 Alcut의 동결건조물은 PBS에 녹여 준비하였고, 체내 알코올 대사에 미치는 영향을 최소화하기 위해 절식 16시간 이후 투여 진행하였다. Alcut 80 mg/kg 농도로 대조군은 같은 양의 PBS(10 mL/kg)만 경구투여하였고, 30분 뒤 대조군과 실험군 모두에 30%의 알코올을 3 g/kg의 용량으로 경구투여하였다. 이후 1시간 후와 5시간 후 각각 전혈을 채취한 뒤 혈청만을 분리하였다. 분리된 혈청은 실험별로 일부분씩 분주하여 실험 전까지 -80°C에 보관하였다. 보관된 혈청의 분석은 대구경북첨단의료산업진흥재단 전임상센터에서 수행하였다. 모든 실험동물의 사육관리는 식품의약품안전처 고시 ‘실험동물에 관한 법률’과 농림축산식품부 ‘동물보호법’에 준하여 실시하였다. 본 실험은 동물보호법에 근거한 대구경북첨단의료산업진흥재단 전임상센터 실험동물운영위원회(IACUC)에 승인받고 진행하였다(승인번호: KMEDI-22110204-01).

혈청 내 에탄올 및 아세트알데히드 농도 측정

혈청 내 에탄올 농도는 EnzyChromTM ethanol assay kit(ECET-100, BioAssay Systems)을 사용했으며, 혈청 내 아세트알데히드 농도는 EnzyChromTM acetaldehyde assay kit(EACT-100, BioAssay Systems)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 반응시킨 후, microplate reader(synergy H4 microplate reader, BioTek)를 활용해 565 nm에서 흡광도를 측정하였다.

혈청 내 ADH와 ALDH의 활성 측정

혈청 내의 ADH와 ALDH 활성의 측정은 각각 alcohol dehydrogenase assay kit(ab102533, Abcam)과 ALDH activity assay kit(ab155893, Abcam)을 사용했으며, 제조사의 프로토콜에 따라 반응시킨 후 microplate reader(synergy H4 microplate reader)를 활용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

간 기능 지표 확인

간 기능을 확인하기 위한 지표로 혈청 내 aspartate aminotransferase(AST)와 γ-glutamyl transferase(γ-GTP)의 농도를 자동 화학 분석기(TBA-120FR, Toshiba)를 사용하여 측정하였다.

통계 분석

실험에서 얻은 데이터는 평균±표준편차로 표시했으며, GraphPad Prism 9(GraphPad Software Inc.)을 이용하여 분석하였다. 각 평균값의 차이를 검증하기 위해 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)과 t-test에 의해 P<0.05, P<0.01 수준에서 실험군 평균치의 통계적 유의성을 검정하였다.

결과 및 고찰

실험물질의 ADH 및 ALDH 활성(in vitro)

각 배합과 처리 조건으로 만든 24가지 실험물질 10 mg/mL 농도에서 ADH 및 ALDH를 측정한 결과는 실험물질이 첨가되지 않은 대조군에 대한 상대활성(%)으로 각각 Table 3Table 4에 나타내었다. ADH와 ALDH 상대활성은 formulation 4에서 formulation 1, 2, 3보다 유의적으로 우수한 생리활성을 보였으며, formulation 4의 6가지 처리 조건 중에서는 condition 6으로 처리한 경우가 다른 조건들보다 유의적으로 가장 우수한 ADH 및 ALDH 상대활성이 확인되었다. 따라서 formulation 4인 갈화, 지구자, 백출, 백복령, 진피, 고량강, 건강, 사인, 육두구의 배합을 12.2배수의 정제수로 100°C에서 3시간 추출한 후 Viscozyme® L 효소를 2시간 처리하고 보이차 추출물을 첨가하는 조건으로 준비한 실험물질인 Alcut을 최종 물질로 선정하고 이후 동물실험을 통한 숙취 해소 기능성 평가를 진행하였다.

Table 3 . ADH activity (%) of combinations of four formulations with six conditions.

Condition 1Condition 2Condition 3Condition 4Condition 5Condition 6
Formulation 191.55±0.2099.002±0.0799.33±0.0396.95±0.0898.34±0.2490.24±0.11
Formulation 295.01±0.0491.62±0.1293.47±0.08101.38±0.3296.48±0.9197.20±0.31
Formulation 3106.54±0.21103.78±0.11109.68±0.13105.49±0.16109.41±0.15107.65±0.17
Formulation 4115.98±0.18a112.28±0.11a105.24±0.14108.45±0.06a119.26±0.08a122.11±0.08ab

Values are expressed mean±SD of five samples..

The percentage activity was calculated relative to control (no test materials added)..

The superscript ‘a’ signifies that under each treatment condition (conditions 1 to 6), formulation 4 demonstrates a significant difference compared to formulations 1, 2, and 3 at a significance level of P<0.01..

The superscript ‘b’ signifies that under formulation 4, condition 6 exhibits a significant difference compared to conditions 1 to 5 at a significance level of P<0.01..



Table 4 . ALDH activity (%) of combinations of four formulations with six conditions.

Condition 1Condition 2Condition 3Condition 4Condition 5Condition 6
Formulation 192.84±0.0692.42±0.0597.50±0.0794.37±0.1294.87±0.0794.59±0.06
Formulation 295.24±0.1391.80±0.0595.11±0.0797.16±0.1097.33±0.0295.34±0.05
Formulation 390.76±0.0894.34±0.1197.15±0.0994.23±0.1191.82±0.0796.28±0.08
Formulation 4100.15±0.10a99.95±0.12a100.30±0.12a100.28±0.06a102.46±0.06a104.47±0.10ab

Values are expressed mean±SD of five samples..

The percentage activity was calculated relative to control (no test materials added)..

The superscript ‘a’ signifies that under each treatment condition (conditions 1 to 6), formulation 4 demonstrates a significant difference compared to formulations 1, 2, and 3 at a significance level of P<0.01..

The superscript ‘b’ signifies that under formulation 4, condition 6 exhibits a significant difference compared to conditions 1 to 5 at a significance level of P<0.01..



혈청 내 에탄올 및 아세트알데히드 농도 측정

알코올 대사를 확인하기 위해 혈청 내 에탄올과 아세트알데히드의 농도를 측정한 결과는 Fig. 1에 나타내었다. PBS를 투여한 후 알코올을 투여한 대조군의 경우는 1시간 이후(18.93±1.52 μg/dL)보다 5시간 이후(24.17±5.31 μg/dL)에 유의한 혈중 에탄올 농도 상승이 관찰되는 데 반해, Alcut 투여 후 에탄올을 투여한 실험군의 경우 1시간 이후(17.18±3.71 μg/dL)보다 5시간 이후(15.75±4.11 μg/dL) 혈중 에탄올 농도가 감소하는 것이 확인되었다. 이는 Han과 Kim(2004)의 연구에서 알코올 섭취 후 대조군에서 6시간까지 혈중알코올농도가 1시간 대비 증가한 것에 비해 프로폴리스를 이용한 숙취 해소 음료는 6시간까지 서서히 감소한 결과와 일치한다. 따라서 Alcut을 에탄올을 투여하기 전에 섭취하는 경우 혈중 에탄올 농도 상승을 유의미하게 억제하는 것으로 확인하였다. Alcut 투여 후 에탄올을 투여한 경우 시간이 지남에 따라 아세트알데히드 농도가 낮아지는 경향이 관찰되었고 PBS 투여 후 에탄올을 투여한 경우 시간이 지남에 따라 아세트알데히드 농도가 갈수록 높아지는 경향이 관찰되었으나 통계적 유의성은 확인되지 않았다. 다만 초기에 빠른 에탄올 분해 효과는 일시적으로 아세트알데히드의 농도를 높게 유지할 수 있지만, ALDH의 활성이 낮지 않다면 오히려 숙취를 완화한다고 보고되었다(Mackus 등, 2020). 또한, 아세트알데히드 농도의 경우 에탄올 흡수 속도, 에탄올 분해 속도, ALDH 활성 등 여러 요인에 의해 시간대별 조건에 따라 profiling이 급격하게 달라지는 것으로 보이며, 시간대별 알데히드 농도 변화에 관한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Fig 1. Effect of Alcut (80 mg/kg b.w.) on ethanol, acetaldehyde concentration (μg/dL) in blood serum of 30% ethanol-treated (3 g/kg b.w.) rats. The graph illustrates the temporal changes in (A) ethanol concentrations and (B) acetaldehyde concentrations in blood serum, measured in micrograms per deciliter (μg/dL). The x-axis represents the time elapsed after ethanol treatment, and the y-axis represents the concentration levels of ethanol and acetaldehyde. Asterisk (*) indicates statistical significance at P<0.05.

혈청 내 ADH와 ALDH의 활성 측정

알코올 대사를 확인하기 위해 혈청 내 ADH와 ALDH의 활성을 측정한 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 대조군의 경우 1시간 이후(41.39±15.31 mU/mL)보다 5시간 이후(22.49±12.76 mU/mL)에 ADH의 활성이 유의하게 감소하는 것이 관찰되는 데 반해, 실험군에서는 ADH의 활성이 떨어지지 않고 유지되는 것이 확인되었다(47.26±11.85 mU/mL→44.60±15.20 mU/mL). 또한, 5시간 이후 실험군이 대조군 대비 유의하게 높은 ADH 활성을 유지하는 것이 확인되었다. An 등(1999)의 연구에서 헛개나무와 오리나무 추출물의 ADH의 활성 증진 수준에 따라 혈중알코올농도 또한 같은 경향으로 감소한다는 연구 결과와 마찬가지로 Alcut에 의해 실험군에서의 대조군 대비 높은 ADH 활성이 혈중 에탄올 농도의 유의적인 차이를 가져온 것으로 보인다. 대조군에서 1시간(13.50±4.00 mU/mL)보다 5시간(7.74±3.59 mU/mL)에서 ALDH의 활성이 유의하게 감소하는 것이 관찰되는 데 반해 실험군에서는 ALDH의 활성이 떨어지지 않고 유지되는 것(14.80±3.70→14.24±4.01 mU/mL)이 확인되었다. 또한, 5시간 이후 실험군(14.24±4.01 mU/mL)이 대조군(7.74±3.59 mU/mL) 대비 유의하게 높은 ALDH 활성을 유지하는 것이 확인되었다. Choi 등(2017)의 꾸지뽕나무 뿌리 추출물의 알코올 대사 효소 활성 및 혈액 산성화 기전 조절을 통한 숙취 해소 효과 연구에서 알코올 투여 대조군은 혈중 ADH와 ALDH 활성 모두 급격히 감소하였고, 숙취 해소 음료에서 유지 혹은 증가하는 경향을 보인 결과와 유사하다. 본 연구에서는 Alcut 섭취를 통한 ADH의 활성을 유지함으로써 혈중 알코올의 대사에 영향을 미친 것으로 보인다. 또한, 알코올 대사의 1차 산물인 아세트알데히드의 대사에 가장 큰 영향을 미치는 요소는 ALDH의 활성으로 알려져 있으며(Cederbaum, 2012), Alcut의 5시간까지의 혈중 ALDH 활성을 높게 유지하는 효과는 아세트알데히드 대사를 촉진하여 숙취를 완화할 것으로 사료된다. 본 연구에서는 ADH 및 ALDH의 효소 활성을 측정하여 알코올 대사에 대한 긍정적 측면을 확인했으나, 실제 단백질 발현량의 변화를 확인하지 못하였다는 아쉬움이 존재한다. 단백질 발현량과 효소들의 실제 활성도 차이에 대한 상관관계를 확인하여 Alcut이 알코올 대사에 작용하는 기전에 관한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.

Fig 2. Effect of Alcut (80 mg/kg b.w.) on ADH, ALDH activity (mU/mL) in blood serum of 30% ethanol-treated (3 g/kg b.w.) rats. The graph illustrates the temporal changes in (A) alcohol dehydrogenase (ADH) activity and (B) aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity in blood serum. The x-axis represents the time elapsed after ethanol treatment, and the y-axis represents the activity levels of ADH and ALDH. Asterisk (*) indicates statistical significance at P<0.05.

간 기능 지표 확인

간 기능 지표인 AST와 γ-GTP는 간독성에 의해 간이 손상되는 경우 방출되는 효소로 활성이 증가하면 간 손상을 나타낸다(Tominaga 등, 1993; Torruellas 등, 2014). 간기능 지표로 측정한 혈청 내 AST와 γ-GTP의 활성은 Fig. 3에 나타내었다. 대조군의 경우 5시간 이후 AST 활성이 133.8 ±17.3 U/L에서 151.2±25.6 U/L로 증가하는 것이 관찰된 반면, 실험군에서는 134.8±19.8 U/L에서 119.1±7.8 U/L로 오히려 유의하게 감소하는 것이 관찰되었다. 또한, 실험군에서는 5시간 이후 γ-GTP 활성이 0.59±0.1 U/L에서 0.83±0.3 U/L로 증가하는 것이 관찰되었으나, 대조군의 경우 γ-GTP가 0.54±0.3 U/L에서 0.47±0.3 U/L로 오히려 유의미한 감소가 확인되었다. 알코올을 다량 섭취한 경우 간에서 에탄올과 아세트알데히드가 산화적 스트레스를 일으키고 단백질 및 세포구조에 영향을 미쳐 간세포를 파괴하며, 이에 따라 간세포에 존재하는 효소들이 혈액으로 방출되게 된다(Bruha 등, 2012). 대표적인 숙취음료 원료인 헛개나무는 Na 등(2004)의 연구에서 알코올 분해작용에 의해 간독성이 줄어들었고 이는 간세포의 손상을 억제하여 간 기능 지표들의 감소를 불러왔다고 보고하였다. 따라서 대조군에서는 에탄올 투여에 의해 나타난 간독성 효과가 AST와 γ-GTP 활성을 초래하였고, 처리군에서는 Alcut이 간독성을 완화하여 간 기능 지표인 AST와 γ-GTP의 활성을 낮춘 것으로 사료된다. 이는 Lee 등(2011)의 연구에서 약용식물이 첨가된 미네랄이 알코올 분해 효소의 활성을 조절함과 동시에 간 기능 지표를 낮춘 결과와 같이 본 연구에서 알코올 대사 관련 효소의 활성 증가를 통한 실제 혈중 에탄올 농도의 감소와 간 보호 효과의 결과를 토대로 한방 유래 천연물 복합추출물인 Alcut의 숙취 해소 효과의 가능성을 확인하였다.

Fig 3. Effect of Alcut (80 mg/kg b.w.) on AST (U/L) and γ-GTP activity in blood serum of 30% ethanol-treated (3 g/kg b.w.) rats. The graph illustrates the temporal changes in (A) aspartate aminotransferase (AST) activity and (B) gamma-glutamyl transferase (γ-GTP) activity in blood serum. The x-axis represents the time elapsed after ethanol treatment and the y-axis represents the activity levels of AST and γ-GTP. Asterisk indicates statistical significance at *P<0.05 and **P<0.01.

요 약

한의학 기반의 천연물 유래 복합추출물 Alcut이 알코올 대사에 미치는 영향을 조사하였다. 여러 후보 복합추출물 중에서 ADH와 ALDH 활성을 조사하여 가장 높은 활성을 보이는 복합추출물 Alcut을 선정하였다. Alcut의 알코올 대사 효과를 평가하기 위해 Sprague-Dawley rat을 사용하여 Alcut과 PBS를 각각 경구투여한 뒤, 30분 후에 30% 에탄올을 처리하였다. 이후에 1시간 및 5시간 후 혈액을 채취하여 혈액 에탄올 및 아세트알데히드 농도, ADH 및 ALDH 효소 활성 그리고 간 기능 지표(AST, γ-GTP)를 분석하였다. Alcut 투여군에서 혈액 에탄올 농도는 대조군에 비해 낮아지면서 알코올 대사가 개선되었다. 또한, Alcut 투여군에서 혈액 아세트알데히드 농도는 높은 수준으로 유지되었지만, 혈액 ADH와 ALDH 활성 역시 대조군에 비해 높은 수준으로 유지되었고, 이러한 활성은 5시간 후에도 지속해서 유지되었음을 관찰하였다. 이러한 결과는 Alcut이 초기의 빠른 알코올 분해능, 그리고 알코올 대사 효소들의 활성을 유지하면서 지속적인 알코올 대사를 촉진함을 보여준다. 더불어 이러한 알코올 대사의 촉진으로 Alcut 투여군에서는 대조군 대비 AST와 γ-GTP 활성이 유의하게 감소하였다. 이는 Alcut이 알코올 대사를 개선하고 알코올 대사 효소들의 활성을 유지하여 숙취 증상을 완화하는 데 기여할 수 있다는 것을 시사한다. 이 연구 결과로 천연 유래 복합추출물인 Alcut의 알코올 대사 조절 기능성에 대한 잠재적 가치를 확인하였으며, 앞으로의 연구에서는 이 추출물의 기전과 알코올 대사 및 관련 질환 분야에서의 응용 가능성을 더욱 탐구할 필요가 있다.

Fig 1.

Fig 1.Effect of Alcut (80 mg/kg b.w.) on ethanol, acetaldehyde concentration (μg/dL) in blood serum of 30% ethanol-treated (3 g/kg b.w.) rats. The graph illustrates the temporal changes in (A) ethanol concentrations and (B) acetaldehyde concentrations in blood serum, measured in micrograms per deciliter (μg/dL). The x-axis represents the time elapsed after ethanol treatment, and the y-axis represents the concentration levels of ethanol and acetaldehyde. Asterisk (*) indicates statistical significance at P<0.05.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 321-327https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.321

Fig 2.

Fig 2.Effect of Alcut (80 mg/kg b.w.) on ADH, ALDH activity (mU/mL) in blood serum of 30% ethanol-treated (3 g/kg b.w.) rats. The graph illustrates the temporal changes in (A) alcohol dehydrogenase (ADH) activity and (B) aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity in blood serum. The x-axis represents the time elapsed after ethanol treatment, and the y-axis represents the activity levels of ADH and ALDH. Asterisk (*) indicates statistical significance at P<0.05.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 321-327https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.321

Fig 3.

Fig 3.Effect of Alcut (80 mg/kg b.w.) on AST (U/L) and γ-GTP activity in blood serum of 30% ethanol-treated (3 g/kg b.w.) rats. The graph illustrates the temporal changes in (A) aspartate aminotransferase (AST) activity and (B) gamma-glutamyl transferase (γ-GTP) activity in blood serum. The x-axis represents the time elapsed after ethanol treatment and the y-axis represents the activity levels of AST and γ-GTP. Asterisk indicates statistical significance at *P<0.05 and **P<0.01.
Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 2024; 53: 321-327https://doi.org/10.3746/jkfn.2024.53.4.321

Table 1 . Compositions of test materials.

GroupComponents
Formulation 1Zingiber officinale Roscoe (17.9%), Scutellariae baicalensis Georgi (14.9%), Panax Ginseng C.A. Meyer (13.4%), Zingiber officinale Roscoe (dry) (14.9%), Pinellia ternata Breitenbach (14.9%), Coptis japonica Makino (9.0%), Zizyphus jujuba Miller (14.9%)

Formulation 2Bupleurum falcatum L. (25.53%), Pinellia ternata Breitenbach (8.82%), Panax Ginseng C.A. Meyer (13.24%), Zizyphus jujuba Miller (14.71%), Glycyrrhiza uralensis Fischer (13.24%), Scutellariae baicalensis Georgi (13.24%), Zingiber officinale Roscoe (13.24%)

Formulation 3Pueraria lobata Ohwi (30.88%), Atractylodes japonica Koidzumi (30.88%), Citrus unshiu Markovich (15.52%), Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo (7.20%)

Formulation 4Pueraria lobata Ohwi (31.79%), Hovenia dulcis Thunb (16.89%), Atractylodes japonica Koidzumi (12.91%), Poria cocos Wolf (12.91%), Citrus unshiu Markovich (12.91%), Alpinia officinarum Hance (4.64%), Zingiber officinale Roscoe (dry) (2.65%), Amomum villosum Lour. (2.65%), Myristica fragrans Houtt. (2.65%)

Table 2 . Process conditions.

GroupProcess

Extraction1)Enzymatic hydrolysis2)Pu’er tea
Condition 180°C3)
Condition 2100°C
Condition 3100°CPyr-flo5)
Condition 4100°CViscozyme® L5)
Condition 5100°CPyr-floAddition4)
Condition 6100°CViscozyme® LAddition

1)Add hot water in a 12.2-fold ratio and extract for 3 hours..

2)Enzyme treated for 2 hours followed by inactivation at 95°C for 5 min..

3)Not treated or not added..

4)The Pu’er tea extract was combined with the composite extract at a ratio of 1:3..

5)Pyr-flo (Connell Bros. Co.) and Viscozyme® L (Novozymes) are enzymes used for hydrolysis..


Table 3 . ADH activity (%) of combinations of four formulations with six conditions.

Condition 1Condition 2Condition 3Condition 4Condition 5Condition 6
Formulation 191.55±0.2099.002±0.0799.33±0.0396.95±0.0898.34±0.2490.24±0.11
Formulation 295.01±0.0491.62±0.1293.47±0.08101.38±0.3296.48±0.9197.20±0.31
Formulation 3106.54±0.21103.78±0.11109.68±0.13105.49±0.16109.41±0.15107.65±0.17
Formulation 4115.98±0.18a112.28±0.11a105.24±0.14108.45±0.06a119.26±0.08a122.11±0.08ab

Values are expressed mean±SD of five samples..

The percentage activity was calculated relative to control (no test materials added)..

The superscript ‘a’ signifies that under each treatment condition (conditions 1 to 6), formulation 4 demonstrates a significant difference compared to formulations 1, 2, and 3 at a significance level of P<0.01..

The superscript ‘b’ signifies that under formulation 4, condition 6 exhibits a significant difference compared to conditions 1 to 5 at a significance level of P<0.01..


Table 4 . ALDH activity (%) of combinations of four formulations with six conditions.

Condition 1Condition 2Condition 3Condition 4Condition 5Condition 6
Formulation 192.84±0.0692.42±0.0597.50±0.0794.37±0.1294.87±0.0794.59±0.06
Formulation 295.24±0.1391.80±0.0595.11±0.0797.16±0.1097.33±0.0295.34±0.05
Formulation 390.76±0.0894.34±0.1197.15±0.0994.23±0.1191.82±0.0796.28±0.08
Formulation 4100.15±0.10a99.95±0.12a100.30±0.12a100.28±0.06a102.46±0.06a104.47±0.10ab

Values are expressed mean±SD of five samples..

The percentage activity was calculated relative to control (no test materials added)..

The superscript ‘a’ signifies that under each treatment condition (conditions 1 to 6), formulation 4 demonstrates a significant difference compared to formulations 1, 2, and 3 at a significance level of P<0.01..

The superscript ‘b’ signifies that under formulation 4, condition 6 exhibits a significant difference compared to conditions 1 to 5 at a significance level of P<0.01..


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