인체 내 면역계는 자외선, 환경오염 물질 등 각종 외부 환경 및 바이러스, 박테리아와 같은 외부 감염원에 민감하여 이에 대응하고자 항상성을 유지하는 것이 매우 중요하다(Hong 등, 2022). 면역계는 크게 자연 면역이라 불리며 대식세포, 림프구 등이 관여하는 선천 면역과 적응 면역이라 불리는 후천 면역으로 분류된다(Ji 등, 2021). 이 중 선천 면역은 비특이적 면역 반응으로, 이 과정에서 대식세포는 항원의 탐식, 림프구에 항원 제시 등 중요한 역할을 담당할 뿐만 아니라 사이토카인 생성을 유도하며, 분비된 사이토카인은 각종 병원균 제거에 관여한다(Choo 등, 2017). 이에 더불어 호산구, 호염기구, 호중구를 모집해 수지상세포와 자연살해세포를 활성화하여 선천 면역을 활성화하는 것으로 알려져 있다(Yoo 등, 2022a). 또한, 외부 항원을 인식하여 반응하는 T세포에 전달함으로써 후천 면역 활성에도 크게 관여하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 선천 면역에는 nuclear factor-κB(NF-κB)의 전사와 mitogen activated protein kinases(MAPKs) family의 인산화가 관여하는 것으로 알려져 있다(Byun, 2017; Yoo 등, 2022b). 후천 면역은 선천 면역 반응 이후 특정 항원에 반응하는 특이적 면역 반응을 말한다(Jeong과 Lee, 2023). 두 면역 체계에 의한 면역 반응은 병원성 물질의 침입을 통제할 뿐만 아니라 병원성 물질에 대한 항체 생산을 증가시켜 각종 질병을 예방하는 것으로 알려져 있다(Cho 등, 2018a). Kim 등(2019b)의 보고에 따르면 최근 천연물에 함유된 다량의 단백질 성분을 바탕으로 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이 중 식용곤충이 우수한 면역 활성 등 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 보고된 바 있다(Cho 등, 2019).

식용곤충은 단백질과 더불어 무기질과 생리활성 성분 물질을 풍부하게 함유하고 있으며 천연 항산화제로 활용되고 있는 것으로 알려져 있다(Choi 등, 2016). 농촌진흥청과 식품의약품안전처에서 지정한 국내의 식용곤충은 기존에 인정되었던 누에 유충, 누에 번데기, 백강잠 등과 더불어 최근 식품 원료로 등록된 쌍별귀뚜라미, 장수풍뎅이 유충까지 총 10종류가 식품 원료로 인정된 바 있다(Jang 등, 2022). 이 중 딱정벌레목 장수풍뎅이과에 속하는 장수풍뎅이 유충은 한국, 인도, 중국, 일본 등 다양한 나라에 분포하고 있으며, 건강보조용 약제로 널리 이용되고 있을 뿐만 아니라 현재는 식용소재로의 활용 가능성에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다(Kim과 Kim, 2020; Lee 등, 2017).

한편, 식용곤충 등의 고단백 원료는 가공 온도 조건에 따라 함유한 영양성분 및 특성이 달라질 수 있다(Xu 등, 2015). 희시무르귀뚜라미(Gryllodes sigillatus), 갈색거저리(Tenebrio molitor) 등의 식용곤충에 함유된 단백질 성분들을 고온에서 열처리하였을 때 변성된 것으로 보고된 바 있다(Mishyna 등, 2021). 더불어 Kim 등(2023b)의 연구 결과에 따르면 5°C에서 추출을 진행한 갈색거저리 추출물이 대식세포 내에서 면역력이 효과적으로 증가한 것으로 보고되었다. 또한, 저온에서 추출할 경우 고온에서 추출하는 경우보다 상대적으로 낮은 독성을 나타내며 생리활성 물질이 변성 및 파괴되지 않는다고 보고되었다(Han 등, 2009).

현재까지 장수풍뎅이 유충에 대하여 간보호 효능 및 항암활성(Lee 등, 2015), 치매예방 및 항당뇨(Kim 등, 2022a) 등 다양한 생리활성 기능이 보고된 바 있지만, 저온에서 추출한 장수풍뎅이 유충 추출물의 면역 활성 효과에 관한 연구는 아직 진행되지 않고 있다.

따라서 본 연구에서는 대표적인 대식세포 중 하나인 RAW 264.7 cell에 대한 장수풍뎅이 유충 저온 추출물(Allomyrina dichotoma larvae extracts; ADL)의 대식세포 내 면역 활성 효과 및 작용 기전을 확인하였고, 이를 기반으로 면역 증강 기능성 소재로의 이용 가능성을 평가하고자 한다.

추출 온도 조건에 따른 장수풍뎅이 유충 추출물 제조

본 연구에 사용된 장수풍뎅이 유충은 (주)퓨처푸드랩에서 구매하여 분쇄기(KM-250KF, Kitchen-Art Co., Ltd.)를 이용해 분쇄하였다. 장수풍뎅이 유충 건조 분말 10 g에 ascorbic acid(0.16%)가 함유된 증류수 100 mL를 가하여 5°C 냉장고와 75°C 교반기에서 교반 및 가열하여 24시간 동안 추출을 진행하였다. 추출된 용액을 5°C, 1,977×g 조건에서 원심분리하여 상등액을 획득하였다. 이 추출 상등액은 거름종이(grade 4 qualitative filter papers, Whatman)로 필터링한 다음 동결건조하여 -70°C에서 보관하여 실험에 사용하였다.

RAW264.7 cell 배양

마우스에서 유래한 RAW264.7 cell은 한국세포주은행에서 분양받아 배양하였다. RAW 264.7 cell 배양 시 10% fetal bovine serum(Gibco)과 1% antibiotics(100 unit/mL penicillin, 100 unit/mL streptomycin)를 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Welgene) 배지를 사용하였다. 배양 시 37°C, 5% CO₂를 유지한 세포배양기(Thermo Fisher)에서 진행하였다.

단백질 함량 측정

추출 온도에 따른 장수풍뎅이 유충 추출물의 단백질 함량을 확인하기 위하여 bicinchoninic acid(BCA) assay kit(Thermo Fisher)을 이용하여 측정하였다. 5°C 및 75°C 추출물을 각각 5, 100, 200, 250 및 500 μg/mL의 농도로 12.5 μL씩 96-well plate에 분주하였다. 이후 BCA reagent(bicinchoninic acid solution:copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate 4% solution)를 50:1 비율로 혼합하여 100 μL씩 분주하였고 30분간 암실에서 반응시켰다. 최종적으로 흡광도 마이크로플레이트 리더(BioTek)를 통해 562 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 단백질 함량은 bovine serum albumin을 표준물질로 사용하여 표준곡선으로부터 산출하였다.

총 폴리페놀 함량(total polyphenol content; TPC) 측정

추출 온도에 따른 장수풍뎅이 유충 추출물의 총 폴리페놀 함량을 확인하기 위하여 Folin-Denis 분석법을 참고하여 측정하였다. 농도별(100, 200 μg/mL) 5°C 및 75°C 추출물에 증류수 500 μL를 가한 후, 2 N Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma-Aldrich Co.) 40 μL를 넣은 다음 교반하였다. 이 용액에 20% Na₂CO₃ 400 μL를 가한 다음 37°C에서 30분 동안 반응시키고 흡광도 마이크로플레이트 리더를 이용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물의 총 폴리페놀 함량은 갈산을 표준물질로 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 산출하였으며, 이에 관한 결과를 mg GAE/g으로 나타내었다.

대식세포 생존율 평가

ADL이 RAW264.7 cell의 생존율에 미치는 영향을 알아보고자 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay를 이용하여 측정하였다. RAW264.7 cell을 96-well plate에 1×10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 37°C, 5% CO₂ 세포배양기에서 16시간 동안 완전히 부착시켰다. 이후 100, 200 μg/mL 농도의 ADL과 200 ng/mL 농도의 lipopolysaccharide(LPS)를 양성대조군으로 처리하여 24시간가량 배양한 다음, 5 mg/mL 농도의 MTT 용액(thiazolyl blue tetrazolium bromide, Sigma-Aldrich Co.)을 제조 후 10배 희석하여 20 μL/well씩 첨가하여 반응시켰다. 30분간 반응 후 상층액을 제거한 다음 dimethyl sulfoxide(DMSO; Sigma-Aldrich Co.)를 100 μL씩 분주하여 formazan을 녹였다. 이후 흡광도 마이크로플레이트 리더를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

사이토카인 분비 유도능 평가

ADL 처리가 사이토카인 분비에 미치는 영향을 알아보고자 enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)를 진행하였다. RAW264.7 cell을 48-well plate에 5×10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 37°C, 5% CO₂ 세포배양기에서 16시간 동안 완전히 부착시켰다. 이후 100, 200 μg/mL 농도의 ADL과 200 ng/mL 농도의 LPS를 양성대조군으로 처리하여 24시간가량 배양하였다. 이후 배양 상등액을 분리하여 사이토카인(IL-6, IL-1β)을 확인하였다. 측정 시 ELISA kit(eBioscience Co.)을 이용하였고, 흡광도 마이크로플레이트 리더를 통해 450 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 측정된 사이토카인(IL-6, IL-1β)의 농도는 ELISA kit에 포함된 IL-6(1,000 pg/mL) 및 IL-1β(1,000 pg/mL)의 표준 용액으로부터 산출된 표준곡선을 이용하여 계산하였다.

Western blot

6-Well plate에 1×10⁶ cell/well의 농도로 분주하여 37°C, 5% CO₂ 세포배양기에서 16시간 동안 부착시켰다. 완전히 부착된 세포에 5°C에서 추출한 ADL(100, 200 μg/mL)과 LPS(200 ng/mL)를 처리한 뒤 30분 동안 배양시킨 후 세포를 회수하였다. NP40 cell lysis buffer(Biosource)로 cell lysis시켜 16,000×g, 30분 동안 원심분리하여 cell lysate를 분리하였으며, 단백질 정량은 BCA protein detection kit을 이용하여 정량하였다. SDS-PAGE 진행 시 cell lysate를 10~12% SDS-polyacrylamide gel에 10 μg씩 loading 하였으며, polyvinylidene difluoride membrane (Millipore, Merck KGaA)으로 transfer 하였다. 이후 membrane에 5% 탈지유로 1시간 정도 blocking 하였다. 이후 TBS-T(20 nM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5)를 이용하여 세척한 다음, 1차 항체(Cell Signaling Technology)로 phospho-extracellular signal-regulated kinase 1/2(p-ERK1/2), phospho-c-Jun N terminal kinase(p-JNK), phospho-serine/threonine protein kinase(p-p38), inhibitory-κB-α(IκB-α) 및 NF-κB를 1:3,000으로 희석하여 4°C에서 overnight 하였다. 24시간 뒤 TBS-T로 5분간 3회 세척 후, 2차 항체(goat-anti rabbit IgG, Calbiochem)를 1:3,000으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. TBS-T로 3회 최종 세척한 뒤, chemiluminescence detection solution(EZ-western Lumi Femto)을 사용하여 단백질의 발현을 확인하였다.

통계처리

실험 결과의 통계처리는 GraphPad Prism 8.0.1 프로그램(GraghPad Prism Software)을 이용하였다. 대조군에 대한 통계적 유의성은 Tukey’s multiple test에 따라 일원배치 분산분석(one-way ANOVA test)으로 분석하였고, P<0.1, P<0.01, P<0.001 및 P<0.0001 수준에서 비교하였다.

추출 온도별 ADL의 단백질 및 총 폴리페놀 함량 비교

ADL의 면역 활성을 평가하기에 앞서 추출 온도별 ADL을 농도별(50, 100, 200, 250 및 500 μg/mL)로 처리하여 단백질 함량을 측정하였다(Fig. 1). 그 결과, 모든 농도에서 5°C에서 추출한 ADL이 75°C에서 추출한 ADL보다 더 높은 함량을 나타내었다. 5°C 및 75°C에서 추출한 ADL은 각각 18.50, 79.00, 242.00, 313.67 및 685.67 μg/g과 0.00, 0.00, 46.00, 78.33 및 201.33 μg/g의 단백질 함량을 나타내었으며, 5°C 추출 ADL이 75°C ADL 대비 우수한 단백질 함량을 나타내었다. 식품 내 다양한 성분은 추출 온도에 영향을 받으며, 고온으로 추출할 경우 유효성분의 파괴 및 손실이 따르는 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2016). 이러한 연구 결과를 기반으로 5°C 추출 ADL이 더 높은 함량의 단백질을 함유하는 것으로 사료된다.

Fig 1. Protein content in Allomyrina dichotoma larvae extract (ADL) depending on extraction temperatures (5°C, 75°C). The bar graph indicates the mean±SD (n=3 samples). ^***P<0.001 and ^****P<0.0001, compared with 5°C ADL and 75°C ADL. ns: not significant.

폴리페놀성 물질은 항산화와 항균 효과 등 다양한 기능을 가지고 있어 여러 생리활성 물질의 지표가 되며, TPC가 높으면 높은 항산화능과 면역 활성 등을 기대할 수 있다(Cho 등, 2018b). 또한 75°C에서 추출한 ADL의 TPC는 88.43±5.31 mg GAE/g, 5°C에서 추출한 ADL의 TPC는 140.33±2.24 mg GAE/g으로, 5°C에서 추출한 ADL이 더 높은 TPC를 나타내었다(Table 1).

Table 1 . Total polyphenols content of Allomyrina dichotoma larvae depending on extraction temperatures (5°C, 75°C).

Sample	Total polyphenols (mg GAE/g)
Allomyrina dichotoma L. extract (5°C)	140.33±2.24a1)
Allomyrina dichotoma L. extract (75°C)	88.43±5.31b

¹⁾Mean±SD. Values (a,b) are significantly different (P<0.001)..

앞서 폴리페놀은 고온에서 에피머화에 의해 구조가 변성되어 불안정화되고 단위체 분해되는 것으로 보고된 바 있다(Kim 등, 2022b). 따라서 75°C에서 추출한 ADL이 5°C에서 추출한 ADL 대비 낮은 폴리페놀 함량을 나타내는 것은 고온으로 인한 에피머화로 유도된 성분 파괴 및 변성에 의한 것으로 사료된다.

ADL의 대식세포 독성 평가

미토콘드리아의 탈수소효소 작용으로 노란색의 수용성 기질을 청자색의 비수용성 formazan으로 환원시키는 원리를 이용하는 MTT assay는 세포 생존율을 측정하기 위하여 보편적으로 사용되는 분석 방법이다(Byun 등, 2020). 따라서 ADL이 대식세포의 세포독성에 미치는 영향을 확인하고 세포 생존율을 측정하고자 MTT assay를 진행하였다. 먼저 RAW264.7 cell에 100, 200 μg/mL 농도의 ADL을 처리한 뒤, 선천면역 반응을 유도하여 면역 조절 인자인 사이토카인을 분비하는 것으로 알려진 LPS(200 ng/mL)를 양성대조군으로 처리하였다. 그 결과, Fig. 2에 나타낸 바와 같이 대조군(normal control, CON) 대비 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, ISO에서 제시한 세포독성 기준인 80%보다 높은 세포 생존율을 나타낸 것을 확인하였다(Shin 등, 2022). 따라서 이를 통해 ADL이 세포독성을 나타내지 않았음을 확인하였으며, 이후 실험에서 75°C 대비 높은 세포 생존율을 나타낸 5°C ADL(100, 200 μg/mL)로 고정하여 진행하였다.

Fig 2. Effect of Allomyrina dichotoma larvae extract (ADL) on cell proliferation depending on extraction temperatures (5°C, 75°C) in RAW264.7 cells. ADL were treated at the concentration of 100 and 200 μg/mL. Lipopolysaccharides (LPS) were treated at the concentration of 200 ng/mL as a positive control group. After 24 h, cell viability was evaluated by MTT assay. The bar graph indicates the means±SD (n=3 samples).

5°C ADL의 사이토카인 분비능에 미치는 영향

면역 체계에는 백혈구, 대식세포, 자연살해세포 등으로 구성되어 있다. 그중 대식세포는 감염원에 대응하고자 사이토카인(cytokine)을 분비하고, 분비된 사이토카인은 다른 면역세포들을 감염소로 유인하여 감염체를 제거하는 작용을 하는데, 대표적으로 인터류킨(interleukins; ILs)류가 존재한다(Park, 2022). 인터류킨류의 사이토카인에는 IL-6와 IL-1β가 있으며, IL-6는 단백질 합성과 항암효과를 유도하고 IL-1β는 주로 대식세포에서 합성되어 T세포에 대한 lymphokine의 생산과 B세포의 성장 및 분화를 촉진하는 중요한 역할을 한다(Park과 Ryu, 2013). 이들은 체내 면역 방어에 있어서 핵심적인 요소이기 때문에 이러한 사이토카인의 분비를 향상시키는 것에 관한 관심이 집중되고 있는 추세이다(Heo와 Jung, 2021).

ADL이 이러한 사이토카인을 분비하여 면역 활성능을 나타내는지 평가하고자 ELISA kit assay를 이용하여 IL-6 및 IL-1β의 분비능을 확인하였다. ADL(100, 200 μg/mL)과 LPS(200 ng/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 결과(Fig. 3), 100, 200 μg/mL 농도의 ADL을 처리하였을 때 IL-6 분비능의 경우, 아무것도 처리하지 않은 CON 대비 13.6배, 16.3배로 유의하게 증가하였으며, IL-1β 분비능은 CON 대비 2.3배, 3.9배로 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 추후 실험에서 ADL의 농도를 100, 200 μg/mL로 고정하여 western blot analysis를 진행하였다.

Fig 3. Effect of Allomyrina dichotoma larvae extract (5°C) on cytokine production level in RAW264.7 cells. Cytokines (IL-6 and IL-1β) productions in supernatant were measured by using ELISA kit. The bar graph indicates the mean±SD (n=3 samples.) ^*P< 0.1, ^***P<0.001, and ^****P<0.0001 when compared to the normal control (CON) group.

5°C ADL이 MAPKs 및 NF-κB의 활성에 미치는 영향

MAPK family는 다양한 세포에서 증식, 분화 및 사멸 등의 중요한 역할을 수행하는데, 특히 면역세포에서 사이토카인 생성 및 선천성 면역세포의 생존력과 하원 제시세포(antigen-presenting cell)의 기능을 조절하여 선천 면역 반응에서 중요하게 작용한다고 보고된 바 있다(Kim 등, 2023a). MAPK family에는 extracellular signal regulated kinase(ERK), c-Jun N-terminal kinase(JNK), p38이 있으며, 이들은 스트레스에 의해 유발되는 신호를 조절하는 역할을 담당할 뿐만 아니라, 다양한 세포 기능에도 관여하는 것으로 알려져 있다(Kim 등, 2019a). MAPK family의 활성화는 IκB의 인산화 및 분해로 이어지고, 이러한 과정이 NF-κB를 핵 내부로 유도하여 면역 활성 관련 유전자의 활성을 유발한다(Cha 등, 2021). NF-κB는 면역시스템 조절, 세포 증식, 상피세포 분화 등에 관여하는 단백질로, 신호전달 체계의 중심에 있다(Park 등, 2023).

따라서 앞서 ADL의 처리로 인하여 사이토카인의 분비량이 증가한 것이 이러한 MAPK family(p38, JNK, ERK)의 인산화와 NF-κB의 핵 내 전사에 의해 활성화되는 것인지 알아보고자 RAW264.7 cell에 ADL(100, 200 μL/mL)과 LPS(200 ng/mL)를 처리하여 western blot analysis를 진행하였다. 그 결과(Fig. 4), ADL 및 LPS 처리군 모두에서 MAPK family(p38, JNK, ERK)의 인산화가 효과적으로 유도된 것을 알 수 있었다. 더불어 농도별 ADL 처리 시 나타난 NF-κB의 발현은 CON 대비 4.6배, 4.1배 증가하였으며, IκB-α의 인산화는 CON 대비 14배, 40배로 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 MAPK family(p38, JNK, ERK)의 인산화 및 NF-κB의 핵 내 전사가 ADL 처리에 의해 효과적으로 유도됨을 나타낸다. 따라서 본 연구에서 농도별 ADL 처리에 따른 RAW264.7 cell의 면역 활성 증가는 MAPK family(p38, JNK, ERK)의 인산화 및 NF-κB의 핵 내 전사에 의한 것으로 사료된다.

Fig 4. Effect of Allomyrina dichotoma larvae extract (5°C) on activation of MAPKs phosphorylation and NF-κB signals in RAW264.7 cells. ADL were treated at the concentration of 100 and 200 μg/mL for 30 minutes. MAPKs phosphorylation analyzed by western blot analysis using specific antibodies to phospho (p)-p38, p-JNK, p-ERK (A). And NF-κB expression analyzed by western blot analysis using specific antibodies to phospho-IκB-α, IκB-α (B), NF-κB p65 (C). The bar graph indicates the mean±SD (n=3 samples). ^*P<0.1, ^**P<0.01, ^***P<0.001, and ^****P<0.0001 when compared to the normal control (CON) group.

한편, 장수풍뎅이 유충은 식육과 비교하였을 때 높은 단백질량을 함유하고 있고 FAO 등(2007)의 권고 필수아미노산을 만족시키는 것으로 보고되었으며(Jeong 등, 2020), Lee 등(2006)의 장수풍뎅이 유충 내 지표성분 분석 연구에 따르면 장수풍뎅이 유충 내 inosine이 다량 함유되어 있다고 보고되었다. Inosine은 생체 내 염증 유발 효과를 감소시키고, T세포와 상호작용하여 면역 조절 효과를 일으키는 것으로 알려져 있다.

더불어 Baek 등(2017)의 식용곤충 영양분석 연구에 따르면 세포 분화 등 다양한 생리활성에 관여하는 철분과 칼슘 성분이 장수풍뎅이 유충에 풍부한 것으로 보고되었으며, Kang 등(2017)에 의해 대식세포에서 항원전달능력을 조절하여 면역 활성 효과를 나타내는 것으로 알려진 불포화지방산을 다량 함유하는 것으로 보고되었다. 이러한 선행연구를 기반으로 장수풍뎅이 유충의 면역 활성 증진 효과는 식용곤충 내 함유된 다양한 영양성분의 생리활성 작용에 의한 것으로 사료된다.

또한 Park 등(2018)의 연구에 따르면 흰점박이꽃무지 유충 추출물이 체내에서 L-시트룰린과 산화질소의 생성을 증가시켜 대식세포 내 면역조절 효과를 증진한다고 보고되었다. Seo 등(2019)의 연구에 따르면 갈색거저리 유충으로부터 추출한 lysine, glycosine 등의 아미노산 성분에 의해 항염증 효과가 발현되는 것으로 보고된 바 있다. 이들은 장수풍뎅이 유충 추출물과 비교하였을 때 고농도의 처리를 필요로 하였으며, 이를 통해 장수풍뎅이 유충이 다른 식용곤충보다 높은 생리활성을 나타낼 것으로 사료된다.

본 연구는 5°C에서 추출한 장수풍뎅이 유충 저온 추출물(ADL)의 면역 활성을 평가하고, 면역 증강 관련 기능성 소재로서의 활용 가능성을 평가하고자 대표적인 대식세포로 알려진 RAW264.7 cell을 활용하여 면역 활성을 측정하였다. 이에 앞서 우수한 단백질 및 총 폴리페놀 함량(TPC)을 나타내는 추출 온도를 알아내고자 BCA assay 및 TPC 측정법을 진행하였다. 5°C 및 75°C에서 추출한 ADL에 대해 평가한 결과, 5°C ADL이 75°C ADL 대비 뛰어난 단백질 및 TPC를 나타내었다. Cell viability에 대하여 측정한 결과, 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았으며, 5°C ADL이 75°C ADL 대비 높은 세포 생존율을 나타내어 추후 실험에서 5°C ADL로 고정하여 진행하였다. 이후 사이토카인(IL-6, IL-1β) 분비능 및 면역 활성 신호전달 경로를 측정하였으며, 농도별(100, 200 μg/mL) 5°C ADL의 처리에 따라 두 사이토카인(IL-6, IL-1β)의 분비능이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 더불어 5°C ADL의 처리가 MAPKs family의 인산화 및 NF-κB 전사 기전을 통해 대식세포 내 면역 활성 증가를 유도하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 연구 결과를 통하여 장수풍뎅이 유충 저온 추출물이 면역 활성을 증강시키는 기능성 소재로서의 가능성을 확인하였지만, 이와 관련된 정확한 생리활성을 나타내는 유효성분을 명확히 규명할 수 없으므로 후속 연구가 필요한 실정이다.

본 연구는 2022년도 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기본연구사업(No. NRF-2022R1F1A1063850)으로 수행되었으며, 그 지원에 감사드립니다.