면역은 체내에 존재하는 자기 방어체계로, 외부로부터 침입해 오는 다양한 감염원, 각종 물질이나 생명체를 인체가 자기 자신에 대한 이물질로 인식하여 제거하고 대사시키는 과정이다. 생체는 체내 및 체외의 자극에 대해 자신을 보호하고 방어하기 위하여 면역세포의 증식이나 활성화에 의해 항원이나 활성산소종으로부터 숙주를 보호하는 방어체계를 가지고 있으며, 생체 내 산화작용을 예방하기 위해서 지속해서 항산화 물질을 섭취할 필요가 있다(Kang 등, 1998; Lee 등, 2013; Rim 등, 2000). 외부의 자극으로 유전자 수준에서 발현되는 산화질소(nitric oxide, NO)의 경우 세포 활성화 물질 및 reactive oxygen intermediates에 의해 유발된 세포독성을 최소화함으로써 항산화와 더불어 면역 활성 발현에도 관여한다(Cho 등, 2010). 감염원으로부터 건강을 유지하기 위해 면역 기능의 강화가 요구되며, 최근 연구 결과에서 식물 유래 천연물이 면역기능을 증진시키는 것으로 보고된다(Patwardhan과 Gautam, 2005).

이고들빼기[Crepidiastrum dentoculatum (Houtt.) Pak & Kawano, CD]는 한국의 전통적 식물성 식량자원으로써 전초를 이용하여 김치로 소비되는 산채류로 산과 들의 건조한 곳에서 자라며, 한국, 일본, 중국 등에 서식한다(Lee와 Kim, 1989). 이고들빼기에는 사포닌 성분이 함유되어 있어 인삼에 버금가는 항암 효능이 있으며, 혈당조절, 간 건강, 항산화 등에 효능이 있다고 알려져 있다(Yoo 등, 2014).

비장은 초기 면역반응을 담당하는 주요 말초 면역기관으로 혈액 유래 항원에 대한 면역반응을 하며, 노화된 적혈구 및 손상된 세포를 제거하는 역할을 수행한다(Lee 등, 2012). 비장세포는 주로 T림프구, B림프구, 대식세포와 같은 다양한 면역세포로 구성되어 있어(Lee 등, 2012) 면역증진 연구에 많이 이용되고 있다.

T림프구는 세포독성 또는 세포살해 T림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)와 B림프구나 대식세포 등 다른 세포의 활성을 돕는 보조 T림프구(helper T cell, Th cell)로 나뉜다. Th cell에는 Th1 세포와 Th2 세포가 있으며, Th1 세포는 주로 대식세포의 활성을 증가(탐식작용 자극)시키고, interleukin-2(IL-2), interferon-γ(IFN-γ) 등의 사이토카인을 분비한다. Th2 세포는 B림프구의 활성을 자극해 항체 생산을 증가시키고, IL-4, IL-10 등을 주로 생성한다(Kim, 2009).

본 연구는 이고들빼기 열수 추출물(CDW)의 면역증진 효과를 검증하기 위하여 마우스에서 분리한 비장세포에 CDW를 작용시켰을 때 NO 생성량 및 사이토카인 생성에 미치는 영향을 살펴보았으며, 활성 기전을 연구하기 위하여 IκB의 활성 및 MAP kinases의 인산화를 확인하였다. 또한 마우스 동물모델에서 혈액 분석 및 사이토카인 생성에 미치는 영향을 확인하였다.

이고들빼기 열수 추출물의 제조

장흥에서 수확한 이고들빼기 전초를 깨끗하게 세척한 후 열풍 건조하였다. 건조된 이고들빼기 전초 100 g에 증류수 500 mL를 가하여 환류 추출기 100°C에서 3시간 동안 가열･추출 후 Whatman filter 41 size를 이용해 여과하였다. 여과된 추출물을 감압 농축하고, 여과 후 남은 잔사에 동량의 증류수를 사용하여 2회 반복 가열, 추출, 여과, 감압･농축하였다. 농축된 열수 추출물은 동결건조기를 이용해 50°C에서 48시간 동결건조하여 10 g의 추출 분말(CDW)을 획득하였다.

실험동물

수컷 Balb/c 마우스로 생후 5주 내외, 체중 24 g 내외의 것을 샘타코로부터 구입하여 실험에 사용하였다. 동물실험실 환경은 온도 22±3°C, 상대습도 50±20%, 환기횟수 10~15회/시간, 조명주기 12시간(8:00~20:00), 조도 150~300 lux의 사육환경으로 설정된 동물사육실에서 사료와 음용수를 급여하여 사육하였다. 일주일 동안 순화시킨 후 이상이 발생한 개체와 정상적으로 체중이 증가하지 않은 개체를 제외한 후, 각 군간 평균체중 및 표준편차가 균일하도록 군 분리를 하였다. 군 분리는 무처리군(CON), 이고들빼기 열수 추출물(CDW) 50 mg/kg 및 100 mg/kg, 홍삼 열수 추출물(RG) 200 mg/kg 그룹으로 분리하였고, 각 그룹당 10마리씩 14일 동안 경구투여하였다. 무처리군은 생리식염수를 경구투여하였다. 본 실험은 동물실험 윤리위원회 승인하에 진행하였다(승인번호: JINR2306).

실험 재료

Lipopolysaccharide(LPS)는 Escherichia coli(serotype 026:B6)에서 분리 정제된 표준품(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하였다. WST-8은 Takara Bio Inc.에서 구입하였으며, IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10을 측정하기 위한 시약은 Mouse IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10 ELISA kit(#DY402, #DY485, #DY404, #DY417, R&D systems)을 이용하였다. 웨스턴 블롯에 사용된 1차 항체는 phospho-ERK(#4370, 1:1,000, Cell Signaling), total ERK(#4695, 1:1,000, Cell Signaling), phospho-JNK(#4668, 1:1,000, Cell Signaling), total JNK(#9252, 1:1,000, Cell Signaling), phospho-p38 (#4511, 1:1,000, Cell Signaling), total p38(#9212, 1:1,000, Cell Signaling), IκB(#4814, 1:1,000, Cell Signaling), β-actin(sc-47778, 1:1,000, Santacruz)을, 2차 항체는 anti-mouse IgG(#7076, 1:1,000, Cell Signaling)를 사용하였다. 혈액 분석은 DRI-CHEM(NX-700, Fuji) 장비를 이용하여 백혈구, 과립구(호중구, 호염기구, 호산구), 단핵구, 림프구 분석을 진행하였다.

비장세포 배양

Balb/c 마우스의 비장을 적출한 후 10%의 소태아혈청과 항생제 페니실린과 스트렙토마이신(100 unit/mL, 100 μg/mL)을 함유한 Roswell Park Memorial Institute 1640(Invitrogen Co.) 배지로 3회 세척한 후 조직 균질기(tissue grinder, Corning Costar)로 균질화하여 비장세포를 유리시켰다. 세포 현탁액에 적혈구를 구분하기 위하여 Lymphoprep^TM(Axis-shield-Poc1114545)을 첨가하여 적혈구를 제거하였다. 분리한 비장세포는 세포증식능, NO 생성능, 면역 관련 사이토카인 및 단백질 발현 확인을 위해 사용하였다.

비장세포에서의 세포증식 검증

WST-8 Cell Proliferation Assay는 세포증식 또는 세포 생존 능력을 정량 평가하는 방법으로 세포 내 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 발색 물질이 생성되는 것을 흡광도로 측정한다. 마우스 비장세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 CDW의 농도가 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5 µg/mL가 되도록 처리하였다. 24시간 후 세포 생존율은 microplate reader(Molecular Devices)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

비장세포에서의 NO 생성능 확인

비장세포를 96-well plate에 1×10⁴ cells/well이 되도록 분주하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 CDW를 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5 μg/mL 농도별로 처리하였고, 양성대조군으로는 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 24시간 동안 배양 후 세포 상등액 100 µL를 취하여 NO assay 하였다. 취한 상등액에 동량의 Griess reagent(Sigma-Aldrich Co.)를 혼합하여 상온에서 15분 반응시켰다. 이를 ELISA reader(Molecular Devices)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 실험군의 흡광도 값과 LPS만을 처리한 대조군과의 흡광도 값의 차를 구하여 NO 생성 억제 정도를 산출하였다.

사이토카인 분비량 측정

6-Well plate에 세포(0.5×10⁶ cells/mL)를 분주하고 CDW의 농도가 0.5, 1, 5 μg/mL가 되도록 처리한 후 37°C, 5% CO₂ incubator에서 48시간 배양한 다음 배양 상층액을 수거하여 사이토카인(IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10)을 측정하였다. 수거된 배지는 측정 전까지 -70°C에서 보관하였다.

웨스턴 블롯 분석

비장세포를 6-well plate(1.5×10⁶ cells/mL)에 CDW 또는 LPS를 처리하여 일정 시간 배양한 후 원심분리하여 세포를 수거하였다. 회수한 세포를 Proprep(Intron, #17081)으로 분쇄하여 세포 추출물을 준비하였다. 준비된 시료를 bicinchoninic acid 법으로 총단백질량을 구하였다. 정량된 단백질을 동일한 농도로 12% SDS-PAGE에 전기영동 한 후 polyvinylidene difluoride 막에 옮기고 5% skim milk로 2시간 blocking 하였다. β-Actin, iNOS, p38, ERK, JNK, p-p38, pERK, pJNK 단백질의 발현은 각각의 단일클론 항체를 이용하여 확인하였다.

혈액 분석

혈액 분석을 위한 채혈은 투여 종료일인 14일째에 실시하였다. 하루 전날 절식하였으며, 실험 종료일에 마우스를 희생하였다. 혈액의 혈액학적 검사는 백혈구(white blood cell), 림프구(lymphocyte), 단핵구(monocyte), 호염기구(basophil), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil) 등을 혈구분석기(Advia 2120, Sysmex)를 이용하여 측정하였다.

통계분석

실험 결과는 GraphPad Pris version 8.0.1(GraphPad Software Inc.)을 이용하여 mean±SEM으로 나타내었으며, paired test에 따라 one-way ANOVA test로 분석하였다. 시료 간 유의성은 물질을 처리하지 않은 대조군(control group)과 P<0.05, P<0.01, P<0.001 수준에서 비교하였다.

이고들빼기 열수 추출물의 비장세포 증식 평가

마우스에 분리한 비장세포에 CDW를 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5 μg/mL의 농도로 처리하고, 음성대조군은 무처리군(control, CON), 양성대조군은 LPS(1 μg/mL)만 처리하여 24시간 배양 후 WST-8을 이용하여 세포에 대한 증식을 비교하였다. 그 결과 0.5, 1, 5 μg/mL의 농도에서 비장세포 증식이 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 1). 이 결과는 이고들빼기가 비장세포의 증식능을 증가시킴으로써 면역증진에 기여하는 것으로 사료된다.

Fig 1. Proliferation of Crepidiastrum denticulatum water extracts (CDW) on splenocyte cells. Splenocyte cells were treated with various concentrations (0.01, 0.1, 0.5, 1, 5 µg/mL) of CDW. After 24 h proliferation was determined by measuring the absorbance at 450 nm after WST-8 regent addition. The values shown here are means±SEM of three independent experiments. ^*P<0.01, ^***P<0.001 as compared to the untreated cells. CON, control; LPS, lipopolysaccharide.

이고들빼기 열수 추출물의 NO 생성에 미치는 영향

NO는 L-arginine으로부터 nitric oxide synthase를 경유하여 생성되며 라디칼 물질로 세포 내에서 2차 신호전달자 역할을 하며(Palmer 등, 1988), 생체 내에서 고농도의 산화질소 생성은 혈관 확장과 더불어 생체 면역반응을 촉진하게 된다(Jeon 등, 2013). 비장세포에서 CDW에 대한 NO 생성을 확인하기 위하여 CDW를 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5 μg/mL의 농도로 처리하고 24시간 배양 후 세포 배양 상층액에서 NO 생성량을 확인하였다. 그 결과 무처리군에서는 산화질소가 생성되지 않았지만, LPS에서 245.75 µM 정도의 NO가 생성되었으며, CDW 처리군에서는 LPS 처리군보다는 낮지만 농도 의존적(0.5 μg/mL: 10.6 µM, 1 μg/mL: 21.6 µM, 5 μg/mL: 44.5 µM)으로 NO 생성 증가를 확인하였다(Fig. 2). LPS가 면역증강 효과가 너무 강하여 제어하기 힘든 반면, CDW는 농도 의존적 활성을 가진 것으로 보아 NO 활성 제어가 용이할 것으로 사료된다.

Fig 2. Effects of Crepidiastrum denticulatum water extracts (CDW) on the nitric oxide production of the splenocytes. Splenocyte cells were treated with various concentrations (0.01, 0.1, 0.5, 1, 5 µg/mL) of CDW. After 24 h the culture supernatant were subjected the nitric oxide assay. The values shown here are means±SEM of three independent experiments. ^***P<0.001 as compared to the untreated cells. CON, control; LPS, lipopolysaccharide.

비장세포에서 이고들빼기 열수 추출물의 사이토카인 분비량에 미치는 영향

면역기능 증강을 확인하는 방법으로 사이토카인 생산증가, 대식세포 활성 증가, 면역세포의 세포증식능 증가 등 여러 가지 면역기능 증강 연구가 선행되고 있다(Lee 등, 2014). 홍삼은 면역증진에 대표적인 천연물 중의 하나이며, 열 자극에 의해 생성되는 특유 성분인 ginsenoside Rg2, Rg3, Rh1, Rh2 등이 암 예방, 암세포 성장억제, 혈압 강하 작용 등이 있다고 알려지면서 많은 사랑을 받는 인삼 제품이다(Lee 등, 2008). 따라서 홍삼 추출물과 이고들빼기의 면역증진 효능을 비교하기 위하여 비장세포에서 면역 활성 사이토카인인 IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ의 분비량을 효소면역분비법으로 비교 분석하였다.

사이토카인양을 측정하기 위하여 비장세포에 CDW를 0.5, 1, 5 μg/mL 농도로 처리하였으며, 양성대조군으로 홍삼 열수 추출물(RG, 1 μg/mL)을 사용하였다. IL-2 생성량은 무처리군(3.31±0.92 pg/mL) 대비 RG에서 12.02±1.21 pg/mL로 증가하는 것을 확인하였으며, CDW에서도 농도별로(0.5 μg/mL: 8.79±0.63 pg/mL, 1 μg/mL: 10.54±1.06 pg/mL 및 5 μg/mL: 13.6±1.2 pg/mL) 증가하는 것을 확인하였다. IL-2 생성량은 RG 대비 CDW(5 μg/mL)에서 12% 증가율을 보였다. IL-4 생성량은 무처리군(20.71±0.73 pg/mL) 대비 RG에서 28.19±1.82 pg/mL로 증가하는 것을 확인하였으며, CDW에서도 농도별로(0.5 µg/mL: 23±0.75 pg/mL, 1 μg/mL: 24.38±1.23 pg/mL 및 5 µg/mL: 28.5±2.43 pg/mL) 증가하는 것을 확인하였다. IL-10 생성량은 무처리군(11.75±2.43 pg/mL) 대비 RG에서 19.37±4.26 pg/mL로 증가하는 것을 확인하였으며, CDW에서도 농도별로(0.5 μg/mL: 9.75±7.84 pg/mL, 1 μg/mL: 13.21±3.63 pg/mL 및 5 μg/mL: 34.37±2.87 pg/mL) 증가하는 것을 확인하였다. CDW 고농도에서는 양성대조군 대비 56% 이상 효과가 있는 것을 확인하였다. IFN-γ 생성량은 무처리군(3.31±0.92 pg/mL) 대비 RG에서 10.95±1.21 pg/mL로 증가하는 것을 확인하였으며, CDW에서도 농도별로(0.5 µg/mL: 6.33±1.06 pg/mL, 1 µg/mL: 6.79±0.7 pg/mL 및 5 µg/mL: 8.38±1.07 pg/mL) 증가하는 것을 확인하였다. 또한, IL-2, IL-10의 경우에는 CDW 최고 농도인 5 µg/mL에서 RG보다 우수한 효과를 나타내었다(Fig. 3).

Fig 3. Effects of Crepidiastrum denticulatum water extracts (CDW) on cytokines in mouse splenocyte primary cell culture. Mouse splenocytes were cultured with samples for 48 h. Cytokine level in culture supernatant was determined by ELISA assay. All data are expressed as mean of triplicate measurements of experiment; bars, standard deviation. ^***P<0.001, ^**P<0.01, ^*P<0.05 significantly different from the control cells. CON, control; RG, red ginseng water extracts.

이고들빼기 열수 추출물의 IκB 생성에 미치는 영향

대부분 세포에서 NF-κB 단백 이합체는 NF-κB 활성화를 억제하는 inhibitor κB(IκB) 단백과 결합하여 세포질 내에서 비활성화 상태로 존재한다. NF-κB는 면역반응에서 중요한 세포신호전달 역할을 하며, 활성이 증가하기 위해서는 먼저 IκB가 분해되어야 한다(Chen 등, 2001).

그러므로 CDW의 면역증강 활성에 관한 기전 연구로, NF-κB의 활성을 IκB의 양으로 확인하였다. IκB의 존재량을 확인하기 위해 CDW를 0.5, 1, 5, 10 µg/mL의 농도로 처리한 다음, 30분 후에 IκB의 발현량을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과, CDW 처리 후 IκB가 농도 의존적으로 사라지는 것을 확인하였으며, 특히 CDW 10 µg/mL(5,084.01±146.02)에서 LPS 1 µg/mL(4,241.9±43.64) 처리 수준으로 사라지는 것을 확인하였다. 그러나 RG 1 µg/mL(9,734.08±265.77)에서는 IκB 분해가 되지 않은 것을 확인하였다(Fig. 4). CDW에 의해 IκB의 양이 줄어드는 것은 NF-κB의 억제제가 줄어드는 것이므로 NF-κB의 신호가 강해짐을 의미하는 것이다. 이 결과를 토대로 CDW의 면역증진 활성은 NF-κB의 신호와 관련되어 있음을 확인할 수 있었다.

Fig 4. Effects of Crepidiastrum denticulatum water extracts (CDW) on IκB degradation. Splenocyte cells were treated with 0.5, 1, 5, and 10 µg/mL CDW or RG (1 µg/mL). The total protein lysate of each splenocyte cell was prepared after 30 min and cell signaling proteins were detected by western blot analysis. The expression levels of IκB was compared with β-actin as a control. Western blot analysis using a specific antibody was performed in triplicate and all of them showed similar results. The values shown here are means±SEM of three independent experiments. ^*P<0.01, ^**P<0.05, ^***P<0.001 as compared to the untreated cells. CON, control; LPS, lipopolysaccharide; RG, red ginseng water extracts.

이고들빼기 열수 추출물의 MAP kinases 발현에 미치는 영향

MAPK는 NF-κB와 함께 면역반응을 유도하는 데 중요한 역할을 하며, 세포분화, 증식, 생존 및 사멸에 관여한다고 알려져 있다. 또한 MAP kinases에 속하는 신호분자로는 p38, ERK, JNK가 있으며, 이 세 분자 모두 면역활성의 변화에 큰 영향을 주고 있음이 밝혀진 바 있다(Garrington과 Johnson, 1999; Lee 등, 2003; Seo 등, 2004). 따라서 CDW에 의해 비장세포에서 MAPK의 신호 변화를 확인하기 위하여 ERK, JNK, p38 단백질의 인산화 정도를 측정하였다. CDW를 비장세포에 30분간 농도별로 처리하였으며, 양성대조군으로 LPS 및 RG를 처리하였다. 그 결과(Fig. 5) ERK의 발현량은 CON (1,751.58±167.14) 대비 CDW 0.5 μg/mL(6,089.86±118.47), 1 μg/mL(8,171.88±168.52), 5 μg/mL(9,696.2±235.46), 10 μg/mL(9,237.75±223.74)에서 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고, JNK의 발현량은 CON(2,675.81±148.61) 대비 1 μg/mL(2,731.14±336.82), 5 μg/mL(3,728.11±183.19), 10 μg/mL(4,317.43±294.25)에서 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한 p38의 인산화 역시 CON(132.33±17.41) 대비 1 μg/mL(431.99±227.17), 5 μg/mL(2,607.8±271.07), 10 μg/mL(5,057.42±168.99)에서 농도 의존적으로 증가한 것을 확인하였다. 그러나 양성대조군인 RG에서는 CDW만큼의 효과를 확인할 수 없었다. 이 결과를 토대로 CDW는 MAP kinase의 활성을 강하게 증가시킴으로써 면역증진에 관여하는 것으로 사료된다.

Fig 5. Effects of Crepidiastrum denticulatum water extracts (CDW) on phosphorylation of MAP kinases. Splenocyte cells were treated with 0.5, 1, 5 µg/mL CDW or RG (1 µg/mL). The total protein lysate of each splenocyte cell was prepared after 30 min and cell signaling proteins were detected by western blot analysis. The expression levels of p38 MAPK, ERK1/2 and JNK were compared with phosphorylated proteins. Western blot analysis using a specific antibody was performed in triplicate and all of them showed similar results. The values shown here are means±SEM. of three independent experiments. ^*P<0.01, ^**P<0.05, ^***P<0.001 as compared to the untreated cells. CON, control; LPS, lipopolysaccharide; RG, red ginseng water extracts.

Balb/c mice에서 이고들빼기 열수 추출물의 몸무게 및 면역기관에 미치는 영향

흉선은 T 림프구를 생성하는 면역기관으로, 흉선의 크기가 작아짐에 따라 흉선의 기능 또한 감소하게 된다. 비장 역시 면역 체계의 중요한 역할을 담당하며, 혈액에서 세포들을 생산하고 저장하는 기관이다. 면역실험을 하는 데 가장 널리 사용되는 실험동물인 Balb/c 마우스를 이용하여 이고들빼기 열수 추출물이 면역기관에 미치는 영향을 확인하기 위해 CDW를 Balb/c 마우스에 14일 동안 1일/1회 50, 100 mg/kg의 농도로 경구투여하였으며, 양성대조군으로 RG 200 mg/kg을 14일 동안 경구투여하였다. 무처리군에도 식염수를 14일 동안 경구투여하였다. 14일 동안 경구투여한 결과 몸무게는 평균 3 g의 증가를 확인하였으며, 그룹 간 큰 차이는 없었다. 실험 마지막 날에 쥐를 희생하여 간, 신장 및 면역기관 무게를 측정한 결과 간, 신장에서는 그룹 간 큰 차이가 없어 샘플에 대한 독성은 없는 것으로 사료되며, CDW 100 mg/kg에서 CON 대비 흉선(0.3±0.08 g/kg) 및 비장(0.43±0.08 g/kg)의 무게가 유의성 있게 증가한 것을 확인하였다(Table 1).

Table 1 . Effects of Crepidiastrum denticulatum water extracts (CDW) on the weight and organ indices in Balb/c mice.

	CON	RG	CDW 50	CDW 100	C+F 50	C+F 100
Weight gain (g)	3.93±1.38	3.51±1.76	3.66±2.2	3.1±1.09	3.5±1.37	3.46±1.58
Relative tissue weight (g/kg b.w.)
Liver	5.033±0.484	5.107±0.237	5.338±0.246	5.086±0.236	4.977±0.283	5.056±0.307
Spleen	0.397±0.036	0.381±0.074	0.404±0.049	0.433±0.08*	0.351±0.055	0.402±0.063
Kidney	1.603±0.134	1.635±0.115	1.618±0.094	1.603±0.078	1.662±0.121	1.574±0.123
Thymus	0.237±0.047	0.23±0.067	0.258±0.05	0.3±0.085*	0.249±0.06	0.269±0.064

The data are expressed as the mean±SEM. N=10 in each group. ^*P<0.05 versus control..

CON, control; RG, red ginseng water extracts; C+F, fucoidan with CDW..

Balb/c mice에서 이고들빼기 열수 추출물의 면역세포 생성에 미치는 영향

혈액 내를 순환하는 단핵구는 조직 내로 이동하여 대식세포로 분화하며 대식세포는 항원의 침입에 의해 초기에 반응하여 항원 탐식, 림프구에 항원 제시 및 병원체 증식 억제 등을 담당하는 세포이다. 림프구는 흉선, 비장 및 림프절에 들어가 분화 성숙하여 림프구 클론 집단을 형성하고 방출하며, 흉선에 들어간 림프구는 T림프구가 된 후 다른 기관에 들어가 분화 성숙한다. CDW가 이러한 면역세포 생성에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위하여 Balb/c 마우스에 CDW 및 RG를 14일 동안 경구투여한 후 실험 마지막 날 희생하여 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 DRE-CHEM 장비를 이용하여 백혈구, 단핵구, 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구를 분석한 결과(Fig. 6), CDW 100 mg/kg에서 림프구의 퍼센티지가 증가(무처리군 대비 11.6%)하는 것을 확인하였으며, 단핵구에서는 CDW(무처리군 대비 50 mg/kg: 1.2%, 100 mg/kg: 1%) 및 RG(무처리군 대비 0.95%)에서 퍼센티지가 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 백혈구 및 과립구에서는 유의성을 확인할 수 없었다. 이를 토대로 CDW는 탐식작용을 하는 단핵구와 대식세포의 활성을 돕는 T림프구를 활성화하는 것으로 사료된다.

Fig 6. Effects of Crepidiastrum denticulatum water extracts (CDW) on hematological indices in Balb/c mice. After 24 h from the last administration, the peripheral blood was taken for anticoagulation and blood count detection. (A) White blood cell (WBC), (B) Lymphocyte (LYMPH), (C) Monocyte (MONO), (D) Basophil (BASO), (E) Eosinophil (EO), (F) Neutrophil (NEUT). The data are expressed as the mean±SEM. N=10 in each group. ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 versus control. CON, control; RG, red ginseng water extracts.

Balb/c mice에서 이고들빼기 열수 추출물의 사이토카인 생성에 미치는 영향

Balb/c 마우스에 CDW 및 RG를 14일 동안 경구투여한 후 실험 마지막 날 희생하여 혈액을 채취하였고 원심분리기 500×g에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청은 ELISA 기법을 이용하여 사이토카인 분석에 사용하였다. IL-2 생성량은 무처리군(0.64±0.04 pg/mL) 대비 RG 200 mg/kg에서 0.79±0.05 pg/mL로 증가하는 것을 확인하였으며, CDW에서도 농도별로(50 mg/kg: 0.76±0.07 pg/mL 및 100 mg/kg: 0.91±0.06 pg/mL) 증가하는 것을 확인하였다. IL-2 생성량은 RG 대비 CDW에서 14% 증가율을 보였다. IL-4 생성량은 무처리군(1.34±0.03 pg/mL) 대비 RG 200 mg/kg에서 1.70±0.05 pg/mL로 증가하는 것을 확인하였으며, CDW에서도 농도별로(50 mg/kg: 1.68±0.07 pg/mL 및 100 mg/kg: 1.84±0.09 pg/mL) 증가하는 것을 확인하였다. CDW 고농도에서는 양성대조군 대비 9% 이상 효과가 있는 것을 확인하였다. IL-10 생성량은 무처리군(0.53±0.04 pg/mL) 대비 RG 200 mg/kg에서 0.84±0.08 pg/mL로 증가하는 것을 확인하였으며, CDW에서도 농도별로(50 mg/kg: 0.6±0.03 pg/mL 및 100 mg/kg: 0.6±0.04 pg/mL) 증가하는 것을 확인하였다. 무처리군 대비 CDW에서 IL-10 생성량이 증가하는 것을 확인하였으나, RG 활성에는 못미치는 것으로 확인하였다. IFN-γ 생성량은 무처리군(0.32±0.05 pg/mL) 대비 RG 200 mg/kg에서 0.44±0.09 pg/mL로 증가하는 것을 확인하였으며, CDW에서도 농도별로(50 mg/kg: 0.48±0.08 pg/mL 및 100 mg/kg: 0.52±0.08 pg/mL) 증가하는 것을 확인하였다. IFN-γ 생성량은 RG 대비 CDW에서 15% 증가율을 보였다(Fig. 7).

Fig 7. Effects of Crepidiastrum denticulatum water extracts (CDW) on cytokines in Balb/c mice. Cytokine level in Balb/c mice was determined by ELISA assay. (A) Interlurkin-2 (IL-2), (B) Interlurkin-4 (IL-4), (C) Interlurkin-10 (IL-10), (D) Interferon gamma (IFN-γ). The data are expressed as the mean±SEM. N=10 in each group. ^*P<0.05, ^**P<0.01, ^***P<0.001 versus control. CON, control; RG, red ginseng water extracts.

본 연구는 최근 COVID-19 팬데믹으로 인해 면역력 향상에 관심도가 증가함에 따라, 비교적 부작용이 적은 천연물에서 면역증진 소재를 탐색하고자 하였다. 먼저, 이고들빼기 열수 추출물(CDW)의 비장세포에서 증식능을 확인한 결과, 농도 의존적으로 세포증식이 증가하였으며, 생체 내에서 면역반응을 촉진하는 NO 생성능을 확인한 결과 CDW에 의해 농도 의존적으로 NO 생성능이 증가하는 것을 확인하였다. T림프구 중에서 보조 T림프구(Th cell)의 활성을 확인하기 위하여 비장세포에 CDW의 사이토카인 생성량을 확인한 결과 CDW 처리군에서 농도별로 IL-2, IL-4 및 IFN-γ 사이토카인 생성량이 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 IL-10 생성량에는 유의적 변화가 없었다. 또한 NF-κB의 신호 활성을 간접적으로 알아보기 위하여 세포질의 IκB 농도를 측정한 결과 CDW 처리에 의해 세포질의 IκB는 급격하게 감소하였다. 또 다른 면역 활성을 확인하기 위하여 MAP kinases 발현량을 확인한 결과 CDW에서 p38, ERK, JNK의 인산화를 각각 증가시킴을 알 수 있었다. Balb/c 마우스에 CDW를 농도별로 경구투여한 후 흉선, 비장 무게 측정, 혈청에서의 사이토카인 생성량 측정 및 면역세포 혈액 분석 결과, CDW에 의해 흉선 및 비장의 무게가 증가하였고 사이토카인 생성능이 증가하였으며, 림프구 및 단핵구가 증가하는 것을 확인하였다. 이 결과로부터 CDW가 Th1 세포의 활성화에 관여함으로써 대식세포 활성을 증가시키고 IL-2 및 IFN-γ 등의 분비를 자극시키며, 비장세포 면역력 증가 활성은 IκB의 분해를 촉진함으로써 NF-κB의 신호 활성을 증가시킬 뿐만 아니라 MAP kinases인 ERK, JNK, p38의 신호를 보다 강하게 함으로써 면역증진 효과가 발현됨을 알 수 있었다. 마지막으로 면역 동물모델인 blab/c 마우스에서 CDW는 탐식작용을 하는 단핵구와 대식세포의 활성을 돕는 T림프구를 활성화함으로써 면역증진 효능을 나타내는 것으로 사료되며, 부작용이 적은 천연물 면역증진 소재 개발에 도움이 될 것으로 기대된다.

이 논문은 2022년도 중소벤처기업부의 ‘지역특화산업육성+(R&D) 지역주력산업육성사업(S3245383)’의 지원을 받아 수행하였으며, 이에 감사드립니다.