식용곤충(edible insect)은 식용을 목적으로 하는 곤충을 뜻하며 최근 선진국과 개발도상국 모두에서 많은 관심을 받고 있다. 특히, 곤충은 맛과 영양이 풍부함에 따라 전 세계적으로 여러 문화권에서 오랫동안 식품으로 사용되어왔다(Ayensu 등, 2019; van Huis, 2016). 특히 국제연합식량농업기구(Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2013)에 따르면 2050년에는 세계적으로 현재 인구 대비 두 배 이상의 식량이 필요할 것으로 예측되며, 곡물류, 축산류, 가금류와 같은 기존의 에너지 공급원이 아닌 앞으로의 식량 문제를 해결해 줄 대안으로 식용곤충이 주목받고 있다고 보고되었다. 경제적인 측면에서 식용곤충은 소, 돼지와 같은 가축에 비해 사육에 필요한 면적이 작아 높은 효율을 보이고, 세대 순환이 짧아 대량생산에 용이하다. 환경적인 측면으로는 사육 시 갈색거저리 유충의 경우 돼지 대비 kg당 10배 정도의 온실가스 저감 효과를 보이고 있다(Lee 등, 2016). 식용곤충은 종별에 따라 영양 성분이 다르며, 종별 영양학적 가치는 전 세계적으로 연구가 많이 되어 있고(Feng 등, 2018; Ramos-Elorduy, 2009), 국내에서도 식용곤충을 활용한 식품 제조 및 영양학적 기능 평가 연구가 많이 이루어지고 있다(Ku와 Kim, 2023; Lee 등, 2023; Zhu 등, 2023). 최근 식약처에서도 기존의 한시인정원료로 인정된 식용곤충을 일반원료로 전환하고 있으며, 새로운 식품 원료로 식용곤충의 종류를 증가시키는 추세이다(MFDS, 2021). 한시인정원료로 인정된 다양한 식용곤충 중 쌍별귀뚜라미(Gryllus bimaculatus)와 메뚜기(Oxya chinensis sinuosa)는 항산화 물질, 식품, 화장품으로의 활용 가치 등의 용도로 연구되고 있으나(Chaiyana 등, 2023; Jeong 등, 2023; Kim 등, 2020) 질병에 대응하는 활성 효과에 관한 연구로는 아직 많지 않은 실정이다.

파킨슨병은 다양한 원인과 증상을 보이는 진단 가능한 임상 증후군(clinical syndrome)으로 알려져 있다. 파킨슨병은 빠른 속도로 발생하는 신경퇴행성 질병이며, 아직 명확한 병인 기전이 밝혀지지 않은 이유로 인해 지난 20년 동안 유병률이 급속히 증가하는 양상을 보였다(Dorsey 등, 2018). 파킨슨병의 주 증상과 진행 속도는 개인별 차이가 있지만, 손과 팔다리 등의 근육수축 및 근육경직, 느린 움직임, 우울증과 같은 정서적 변화 등으로 나타나고 있다(Zhang 등, 2018). 파킨슨병에 대한 발병 원인 중 하나로 환경적 요인인 산화 스트레스가 주된 원인으로 알려져 있다. 도파민성 신경세포에 특이하게 작용하는 독소인 1-methyl-4-phenyl-1, 2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP)은 미토콘드리아의 complex I을 불활성화시켜 ATP 농도를 급격하게 낮추며, 6-hydroxydopamine(6-OHDA)은 catecholamine 특이적 독소로 도파민성 신경세포의 신경종말과 신경세포의 변성을 일으킨다. 파킨슨병에 대한 명확한 치료법은 아직 없는 상황이지만, 레보도파(levodopa)와 같은 화학요법으로 운동 및 운동 외의 증상들을 개선하여 삶의 질을 향상시킬 수 있으나, 이 약물을 지속해서 복용하면 약물 내성이 증가하는 등의 부작용이 있으며, 일부 환자에 대해서는 효과가 없는 사례도 있는 것으로 보고되었다(Beckers 등, 2022).

Planaria(Dugesia japonica)는 편형동물(platyhelminthes) 중 하나로 강과 계곡과 같은 수생환경에서 서식하고 있으며, 무성 또는 유성 생식을 병행하는 무척추동물이다. Planaria는 중추 신경계(central nervous system)와 neoblast라 불리는 줄기세포가 뇌, 소화계, 배설계 등 몸 전체에 구성되어 있다(Rink, 2013). 특히 포유류와 같은 고등동물에서 발견되는 신경전달물질과 신호전달시스템이 인간을 포함한 포유동물과 유사하며(Buttarelli 등, 2008), 신경자극으로 운동능력(motility)이 조절되고 흥분성 신경전달물질에 의해서는 발작행동(seizure-like behavior)을 일으킨다고 보고되어 있어서(Raffa 등, 2010; Rawls 등, 2009), 동물의 약리학적 반응 실험에 용이하게 쓰이고 있다(Ross 등, 2017). 예를 들어, 카드뮴에 노출된 planaria는 세로토닌과 도파민의 발현 수준이 감소하였고, monoamine oxidase activity가 변질되어 있음이 확인되었다(Wu 등, 2015). 또한 planaria의 행동 분석을 통하여 guarana 씨앗이 카페인에 비해 높은 수준으로 각성효과가 있음을 확인하였다(Moustakas 등, 2015). 따라서 planaria는 신경 장애 및 행동 장애의 치료를 위한 약물 탐구 연구에 탁월한 연구 소재라고 할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 planaria에 MPTP 및 6-OHDA와 같은 파킨슨병 유도 약물을 노출하고, Gryllus bimaculatus(Gb)와 Oxya chinensis sinuosam(Ocs)의 추출물을 처리했을 때 나타나는 표현형(phenotype), 운동능력(planarian locomotor velocity, pLMV), 발작행동(planarian seizure-like activity, pSLA) 완화 및 세포의 산화적 스트레스 회복을 확인하였다.

실험동물과 시약

Planaria는 우석대학교 제약공학과 생물의약실험실로부터 분양받아 전북대학교 생리활성소재과학과 신경생물학교실에서 번식시키며 유지, 관리하였다. 18°C, 암실, 멸균 수조의 사육환경에서 주 1회 반죽 형태의 소의 간을 먹이로 공급하여 사육하였고, 약 1 cm 크기의 planaria를 선별하여 실험에 사용하기 전 최소 일주일 전부터 먹이 공급을 중단하였다. Planaria에 파킨슨병을 유도하기 위해 대표적인 파킨슨병 유도 약물로 알려진 MPTP(Sigma-Aldrich Co.)와 6-OHDA(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다. 식용곤충으로 사용된 Gb와 Ocs는 각각 Purnae와 꿈꾸는괴산파머에서 구입하여 실험에 사용하였다.

곤충 추출물 제조

본 연구에 사용한 곤충 추출물은 Gb 분말 10 g 및 Ocs 분말 10 g에 멸균 증류수 30 mL를 첨가하여 상온에서 진탕추출(30 rpm, 24시간) 하였다. 원심분리(10,000×g, 10분) 후 상등액을 취하여 동결건조하고 농축시킨 후, 분말 형태의 곤충 추출물을 회수하였다. 그 후 실험에 사용할 설정 농도에 맞게 멸균 증류수로 재희석한 후, 0.22 μm 공극 크기의 수용성 필터를 사용하여 여과 멸균한 추출물을 사용하였다.

Planarian 운동능력 측정

Planaria의 운동능력 및 발작 형태의 측정은 Raffa 등의 방법(2001)을 이용하여 측정하였다. Planaria의 운동능력을 측정하기 위해 진동이 없는 평면 환경에 0.5 cm 간격의 격자무늬 용지를 배치하고 그 위에 투명한 플라스틱 petri dish(직경 14 cm)를 배치하였다. 그 후 petri dish 안에 vehicle, 다양한 농도(1, 10, 100, 1,000 μg/mL)의 MPTP 또는 6-OHDA를 함유한 생수 약 30 mL를 채우고 planaria를 옮겨 담은 후, planaria가 통과하는 격자무늬의 수를 5분 동안 관찰하며 수를 세어 운동성을 평가하였다. 다시 10 μg/mL Gb 또는 1,000 μg/mL Ocs 추출물을 첨가하지 않은 생수와 첨가한 생수로 옮겨 5분 동안 운동성을 측정하였다(Fig. 1A).

Fig 1. Schematic diagram of the experimental design of either 6-OHDA- or MPTP-induced parkinsonian model of planarians, drug treatment, measurement of planarian locomotor velocity (pLMV) and planarian seizure-like activity (pSLA), and assay of anti-oxidant activity. (A) Planarian were administrated with various concentrations (10, 20, and 50 μM) of either 6-OHDA or MPTP for 5 min to induce planarian parkinsonism. 5 min after treatment, 10 μg/mL Gb or 1,000 μg/mL Ocs extracts was treated, and pLMV and pSLA were measured. (B) Planarian were exposed to different concentrations (10, 20, and 50 μM) of either 6-OHDA or MPTP for 24 h, then 10 μg/mL Gb or 1,000 μg/mL Ocs extracts was also administrated for another 24 h. Antioxidant activities and ROS formation were measured in planarian lysates.

Planarian 발작유사행동 측정

Planaria의 발작 또는 경련에 대한 곤충 추출물의 효과를 planaria parkinsonian model에 적용하여 측정하기 위해 Rawls 등의 방법(2009)을 이용하였다. Planaria의 발작유사행동은 planaria의 5분 동안의 운동능력(pLMV) 조사와 동시에 측정하였다. 즉, 약물이 들어 있는 생수에 5분 동안 planaria를 노출하고, 발작이나 경련을 5분간 관찰하면서 정상적인 활주운동이 아닌 head-bop형, C자형 수축운동, 꼬임형(screw-like) 운동, snake형 운동 등 총 4가지 돌발적인 이상행동의 발생 횟수를 측정하였다(Fig. 1A).

산화 스트레스(oxidative stress) 반응 측정을 위한 planaria 샘플 처리

산화 스트레스 활성 측정을 위해 planaria 용해물(lysates)은 Fig. 1B와 같이 약물을 처리한 후에 준비하였다. 즉 planaria를 같은 크기의 투명한 플라스틱 수조에 배치한 후, vehicle, 다양한 농도(1, 10, 100, 1,000 μg/mL)의 MPTP 또는 6-OHDA를 함유한 생수에서 24시간 반응시킨 후, 다시 vehicle, Gb 또는 Ocs 추출물이 포함된 생수에서 24시간 반응시켰다(Fig. 1B). Planaria는 pH 7.4, 100 mM의 potassium phosphate buffer(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 3회 세척 과정을 거치고, -50°C에서 24시간 냉동 후 homogenizer로 균질화하였다. 그 후 4°C에서 원심분리(12,000×g, 20분)하고 상등액만을 취하여 Pierce^TM BCA protein assay kit(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 단백질 농도를 측정한 뒤 샘플 모두 동일한 농도로 희석하였다.

Catalase activity assay

Planaria 샘플에 대한 과산화수소 분해효소(catalase)의 활성을 측정하기 위해 catalase activity colorimetric/fluorometric assay kit(BioVision)을 사용하였다. 준비된 planaria 샘플과 1 mM 과산화수소를 25°C에서 30분간 반응시킨 뒤 stop solution으로 반응을 중지시킨 후, developer solution과 25°C에서 10분간 반응하였고, microplate reader(BioTek Instruments, Inc.)를 이용하여 570 nm 파장에서 광학밀도를 측정하였다.

Glutathione assay

5% metaphosphoric acid(MPA reagent)를 제조한 후, 65 μL의 MPA reagent와 25 μL의 planaria 샘플을 섞어준 후 원심분리(10,000×g, 5분)하였다. 그 후 EnzyChrom^TM GSH/GSSG assay kit(BioVision)에서 제공하는 사용 매뉴얼에 따라 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)와 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate를 섞어준 후 microplate reader(BioTek Instruments, Inc.)를 이용하여 412 nm 파장에서 광학밀도를 측정하였다.

Lipid peroxidation assay

Lipid peroxidation assay kit(Abcam)에 따라 200 μL의 planaria 샘플과 200 μL의 developer buffer를 섞은 후 95°C에서 1시간 반응한 뒤, ice bath에서 10분간 냉각하였다. 그 후 200 μL의 혼합된 용액을 96-well microplate에 분주한 뒤 microplate reader(BioTek Instruments, Inc.)를 이용하여 532 nm 파장에서 광학밀도를 측정하였다.

Superoxide dismutase activity assay

Superoxide dismutase(SOD) activity assay kit(Bio Vision)에서 제공되는 stock solution을 working solution으로 희석한 후, planaria 샘플과 37°C에서 20분간 반응시켜 microplate reader(BioTek Instruments, Inc.)를 이용하여 450 nm 파장에서 광학밀도를 측정하였다.

통계분석

Planaria의 운동능력 및 발작행동 측정, catalase activity 측정, lipid peroxidation 측정, SOD activity 측정 등의 실험 결과는 그룹별 평균과 표준편차(means±SD)로 표시하였다. 그룹별 유의성은 통계프로그램 GraphPad PRISM 8 software를 이용하여 one-way ANOVA 분석 후 Dunnett post-hoc test를 수행하였다. 또한 P의 값이 0.05 이하일 경우 유의적인 차이가 있다고 판단하였다.

Gb와 Ocs 추출물이 planarian 운동능력(pLMV)과 발작행동(pSLA)에 미치는 영향

식용곤충은 영양이 풍부하여, 다양한 유용 효과에 대한 기대감이 있다. 본 연구에서는 Gb와 Ocs의 추출물이 pLMV 및 pSLA에 미치는 효과를 측정하였다. Planaria의 신경계는 인간을 비롯한 척추동물과 기본적인 틀이 비슷하여 다양한 신경자극 약물에 반응하므로 다양한 약물의 신경약리학적 연구 모델로 사용되고 있다(Buttarelli 등, 2008). 콜린성 뉴론이 약물에 의해 자극되면 planaria의 운동저하(hypokinesis)를 유발하고, 콜린성 신경전달 차단 약물은 과잉운동(hyperkinesis)을 유발한다(Buttarelli 등, 2000). 하지만 도파민성 신경전달은 콜린성과 반대로 운동능력에 영향을 준다고 보고되어 있다(Passarelli 등, 1999). pLMV 평가를 위해 먼저 실험실 내 사육하고 있는 planaria 중 약 1 cm 크기의 planaria를 선별하였고, 최소 1주 이상 먹이 공급을 중단한 뒤 실험에 사용하였다. 후에 각각의 곤충 추출물을 다양한 농도(1, 10, 100, 1,000 μg/mL)에 맞춰 희석한 뒤, planaria에서 5분간 노출해 pLMV를 조사하였다. Gb 추출물에 노출된 planaria의 경우 1 μg/mL에서 대조군 대비 pLMV에 유의한 차이가 없었으나, 10 μg/mL 농도에서는 대조군에 비해 약 115% 수준으로 pLMV가 증가하였다(P<0.05, Fig. 2A). 그러나 100 μg/mL의 농도와 1,000 μg/mL의 농도에서는 대조군에 비교하여 pLMV가 감소하여 독성을 나타내었다(Fig. 2A). 또한 Ocs 추출물에 노출된 planaria는 1과 10 μg/mL에서는 대조군 대비 pLMV의 변화가 없었으나, 100과 1,000 μg/mL에서는 대조군 대비 pLMV가 약간 증가하였다(P<0.05, Fig. 2B). 이러한 이유로 이후의 실험에는 10 μg/mL Gb와 1,000 μg/mL Ocs 추출물을 사용하였다.

Fig 2. Effects of Gb and Ocs extracts on motility (pLMV) and seizure-like behavior (pSLA) of planarians. Edible insect extracts, Gb and Ocs, were fed with various concentrations (1, 10, 100, and 1,000 μg/mL) for 5 min and pLMV and pSLA were measured. (A) Relative motility (pLMV) evaluation of fresh water or Gb extracts-treated planarians. (B) Relative locomotion (pLMV) evaluation of fresh water or Ocs extracts-treated planarians. (C) Seizure-like behavior (pSLA) count of fresh water or Gb extract-treated planarians. (D) Seizure-like behavior (pSLA) count of fresh water or Ocs extracts-treated planarians. Mean±SD (n=4). ^*P≤0.05 vs. 0 μg/mL Gb-treated group.

pSLA는 pLMV와 함께 다양한 신경 조절제에 대한 planaria의 신경반응을 확인할 수 있는 대표적인 평가 방식으로 여겨진다. 상기 언급한 다양한 농도로 Gb와 Ocs 추출물을 planaria에 처리했을 때 pSLA는 나타나지 않았다(Fig. 2C, 2D). 따라서 본 실험에 사용한 곤충 추출물은 그 자체로 신경 발작을 유도하지는 않았다.

6-OHDA에 의한 pLMV 및 pSLA 변화에 Gb와 Ocs 추출물이 미치는 영향

10 μM의 6-OHDA 처리가 planaria의 표현형에 미치는 효과를 관찰하고, 10 μg/mL Gb와 1,000 μg/mL Ocs가 6-OHDA로 변화된 planaria의 표현형을 회복시키는지를 조사하였다(Fig. 3A, 3B). 10 μg/mL Gb나 1,000 μg/mL Ocs 추출물을 단독으로 처리하면 planaria의 형태에 변화가 없었으나, 10 μM 6-OHDA를 처리하면 planaria의 형태가 대조군에 비해 얇아지고 가늘어졌다. 그러나 6-OHDA로 처리한 planaria를 Gb나 Ocs 추출물에 노출하면 planaria의 형태가 대조군과 비슷한 수준으로 회복되었다. 이와 비슷하게 처리된 10, 20, 50 μM 6-OHDA 농도 의존적으로 유의하게 pLMV가 감소하였다(Fig. 3C, 3D). 즉, pLMV의 변화를 자세히 분석하면(Fig. 3C, 3D), 10 μM 6-OHDA로 처리된 planaria는 대조군에 비해 약 46%로 pLMV가 감소하였고(P<0.001), 20 μM 6-OHDA는 약 60%(P<0.001), 고농도인 50 μM 6-OHDA는 약 80%(P<0.001)로 pLMV가 현저히 감소하였다(Fig. 3C). 특히 planaria의 표현형 관찰 실험 결과와 비슷하게 planaria를 10 μM 6-OHDA 처리 후 10 μg/mL Gb와 1,000 μg/mL Ocs 추출물에 다시 노출하면 pLMV가 대조군 수준으로 회복하였으나(P<0.001), 처리한 6-OHDA의 농도가 높을수록 Gb와 Ocs를 처리하여도 pLMV가 회복되지 않았다(Fig. 3C, 3D). 마지막으로 6-OHDA에 의해 pSLA가 유도되는지와 유도된 pSLA에 Gb와 Ocs 추출물이 항발작 활성을 보이는지를 관찰하기 위한 실험을 진행하였다(Fig. 3E, 3F). Planaria에서는 6-OHDA 처리로 4가지의 발작 형태 중 head-bop형 발작이 가장 잘 관찰되었고, 꼬임형(screw-like) 운동이 그다음 빈도로 확인되었다. 그러나, C자형과 snake형의 pSLA는 관찰되지 않았다. 특히 6-OHDA 농도 의존적으로 head-bop형 발작이 증가하였으며(P<0.001), screw형 발작은 고농도인 50 μM 6-OHDA에서만 확인되었다. 6-OHDA 유도형 head-bop형 pSLA는 10 μg/mL Gb나 1,000 μg/mL Ocs 추출물을 처리하면 유의하게 감소하였다(P<0.001).

Fig 3. Effects of Gb and Ocs extracts on phenotype, motility, and seizure-like behavior in 6-OHDA-exposed planarians. (A, B) Representative photo images of planarian phenotype administrated with fresh water, Gb or Ocs extracts, 6-OHDA, and 6-OHDA+Gb or 6-OHDA+Ocs. Scale bars, 200 μm. (C, D) pLMV analysis in planarian administrated with different combinations of drugs. (E, F) pSLA analysis in planarian treated with various combinations of drugs. Planarian treated with different concentrations of 6-OHDA (10, 20, and 50 μM), which is an inducer of parkinsonism, for 5 min, re-exposed to either fresh water or either 10 μg/mL Gb extracts or 1,000 μg/mL Ocs extracts for another 5 min with the evaluation of pLMV and pSLA. Statistically analyzed value was graphed. Mean±SD (n=4). ^***P≤0.001 vs. control group; ^#P≤0.05, ^##P≤0.01, ^###P≤0.001 vs. 6-OHDA alone group.

MPTP에 의한 pLMV 및 pSLA 변화에 Gb와 Ocs 추출물이 미치는 영향

20 μM의 MPTP 처리가 planaria의 표현형에 미치는 영향을 확인하고, 10 μg/mL Gb와 1,000 μg/mL Ocs가 MPTP 유도형 planaria의 표현형을 대조군 planaria 수준으로 회복시키는지를 조사하였다(Fig. 4A, 4B). 선행연구처럼 10 μg/mL Gb나 1,000 μg/mL Ocs 추출물을 단독으로 처리하면 planaria의 형태에 변화가 없었으나, 20 μM MPTP를 처리하면 planaria의 형태가 얇아지며 pLMV의 감소를 수반하였다(Fig. 4A, 4B). 특히, 10 μM MPTP를 제외한 20과 50 μM에서는 MPTP 농도 의존적으로 pLMV가 유의하게 감소하였다(P<0.001, Fig. 4C, 4D). 그러나 10 μg/mL Gb와 1,000 μg/mL Ocs 곤충 추출물을 MPTP와 같이 처리하면 유의한 pLMV 변화가 없었고, 오히려 10 μM MPTP를 Gb와 같이 처리했을 때 pLMV 감소가 더 심해지는 양상을 보이는 흥미로운 결과가 도출되었다(P<0.001; Fig. 4C, 4D). 이러한 변화는 6-OHDA를 처리한 planaria와는 상이한 반응이다.

Fig 4. Effects of Gb and Ocs extracts on phenotype, motility, and seizure-like behavior in MPTP-exposed planarians. (A, B) Representative photo images of planarian phenotype administrated with fresh water, Gb or Ocs extracts, MPTP, and MPTP+Gb or MPTP+Ocs. Scale bars, 200 μm. (C, D) pLMV analysis in planarian administrated with different combinations of drugs. (E, F) pSLA analysis in planarian treated with various combinations of drugs. Planarian treated with different concentrations of MPTP (10, 20, and 50 μM), which is an inducer of parkinsonism, for 5 min, re-exposed to either fresh water or either 10 μg/mL Gb extracts or 1,000 μg/mL Ocs extracts for another 5 min with the evaluation of pLMV and pSLA. Statistically analyzed value was graphed. Mean±SD (n=4). ^*P≤0.05, ^***P≤0.001 vs. control group; ^#P≤0.05, ^###P≤0.001 vs. MPTP alone group.

발작행동에 MPTP 및 곤충 추출물이 미치는 영향을 평가하면 특이적인 결과가 도출되었다. 즉, 6-OHDA와는 다르게 본 연구에서 사용된 농도의 MPTP(10, 20, 50 μM)에서는 pLMV는 감소하였으나, pSLA에는 아무런 영향을 주지 않았다(Fig. 4E, 4F). 따라서 Gb와 Ocs가 MPTP 유도형 발작 형태에 미치는 변화 역시 측정할 수 없었다.

6-OHDA에 의한 planarian의 산화적 스트레스에 Gb와 Ocs 추출물이 미치는 효과

6-OHDA의 10, 20, 50 μM의 농도에 따라 24시간 동안 6-OHDA에 노출한 planaria를 10 μg/mL Gb와 1,000 μg/mL Ocs 추출물에 다시 24시간 처리하여 산화적 스트레스 반응을 확인하기 위해 catalase, lipid peroxidation, SOD의 활성을 측정하였다(Fig. 5). 그 결과 catalase 활성(nmol/min/mL)에서 대조군 및 Gb 추출물이 처리된 그룹은 각각 3.67과 4.11 nmol을 보였고, 10 μM의 6-OHDA 단독 처리 그룹에서는 3.83 nmol로 대조군과 큰 차이가 없었다(Fig. 5A). 그러나 20 μM의 6-OHDA에서는 catalase 활성이 3.23 nmol로 유의성은 없지만 감소하였고, Gb 추출물을 다시 처리하면 활성이 4.00 nmol로 대조군과 비슷하게 회복되었다. 특히 50 μM의 6-OHDA가 처리된 그룹에서는 catalase 활성이 1.51 nmol로 가장 크게 떨어졌으나(P<0.05), 10 μg/mL Gb 추출물 처리 후 2.33 nmol로 조금 회복되었다. 자유라디칼에 의한 세포손상 확인 시험(lipid peroxidation) 결과(Fig. 5B), 50 μM의 6-OHDA의 농도에서 5.22 μmol로 세포손상이 확인되었고(P<0.001), 다음으로 10과 20 μM의 6-OHDA에서 각각 2.16 μmol(P<0.05), 3.11(P<0.01)로 세포손상이 되며, 6-OHDA 농도 의존적으로 세포손상을 유도하였다. 그러나 10 μg/mL Gb 추출물을 처리하면 10, 20, 50 μM 농도에서 확인된 LH 활성은 각각 1.23, 1.83(P<0.05), 3.33 μmol(P<0.01)로 대조군 그룹 수준으로 세포손상이 서서히 회복되었다. SOD 활성(U/min/mg) 비교에서도 10 μg/mL Gb 추출물이 단독 처리된 그룹은 대조군과 비슷한 수준으로 SOD 활성을 나타냈으나, 6-OHDA 10, 20, 50 μM가 처리된 그룹에서는 각각 3.95(P<0.01), 3.11(P<0.001), 2.52(P<0.001)로 대조군 그룹에 비해 6-OHDA 농도 의존적으로 활성이 감소하였다(Fig. 5C). 그러나 이 그룹에 Gb 추출물을 처리하면 각각 5.28(P<0.05), 5.21(P<0.01), 3.93(P<0.05)으로 SOD 활성이 회복되었다.

Fig 5. Effect of Gb and Ocs extracts on antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in 6-OHDA-treated planarian. Quantitative analysis of (A) catalase, (B) lipid peroxidation, and (C) superoxide dismutase (SOD) activities in planarian exposed to 6-OHDA together with or without Gb extracts. Quantitative analysis of (D) catalase, (E) lipid peroxidation, and (F) SOD activities in planarian administered with 6-OHDA together with or without Ocs extracts. Mean±SD (n=4). ^*P≤0.05, ^**P≤0.01, ^***P≤0.001 vs. control group; ^#P≤0.05, ^##P≤0.01, ^###P≤0.001 vs. 6-OHDA alone group.

1,000 μg/mL Ocs 추출물이 산화적 스트레스에 미치는 효과를 실험한 결과, catalase 활성의 경우에는 50 μM의 6-OHDA 농도로 처리된 그룹에 같이 처리하면 Gb 추출물을 처리했을 때와는 다르게 유의성은 없지만 오히려 catalase 활성을 감소시키는 경향을 보였다(Fig. 5D). 그러나 lipid peroxidation 활성 시험에서는 6-OHDA 10, 20, 50 μM에서 각각 2.67(P<0.05), 3.11(P<0.01), 5.12(P<0.001)로 자유라디칼에 의한 세포손상을 증가시켰으나, Ocs 추출물 처리 후 1.17, 1.63(P<0.05), 3.67로 손상이 감소하였다(Fig. 5E). SOD 활성 비교 결과, 10, 20, 50 μM의 6-OHDA가 처리된 그룹에서는 각각 3.85(P<0.01), 3.11(P<0.001), 2.51(P<0.001)로 떨어졌던 활성이 Ocs 추출물 처리 후 10과 20 μM 6-OHDA가 처리된 그룹에서는 5.45(P<0.05), 5.34(P<0.01)로 회복되었으나, 50 μM 6-OHDA가 처리된 그룹에서는 3.22로 조금 증가하였다(Fig. 5F).

MPTP에 의한 planarian의 산화적 스트레스에 Gb와 Ocs 추출물이 미치는 영향

MPTP 또한 10, 20, 50 μM의 농도에 따라 24시간 동안 planaria에 노출해 10 μg/mL Gb와 1,000 μg/mL Ocs 추출물에 다시 24시간 처리하고 산화적 스트레스 반응을 조사하였다(Fig. 6). 그 결과 10, 20, 50 μM의 농도로 처리된 MPTP보다 Gb 추출물을 처리하였을 때 유의성은 없지만 오히려 catalase 활성이 조금 증가하였다(Fig. 6A). MPTP 10, 20, 50 μM에서 각각 확인된 catalase 활성(nmol/min/mL)은 3.90, 3.23(P<0.05), 1.63(P<0.001)이었고, Gb 추출물 처리 후 4.73, 3.90, 2.30으로 활성이 높아졌다. Lipid peroxidation 측정으로 세포손상을 확인하면, 10, 20, 50 μM의 MPTP에서 각각 1.93(P<0.01), 2.67(P<0.01), 4.67(P<0.001)이었지만, Gb 추출물을 처리하면 유의성은 없지만 각각 1.17, 1.67, 3.50으로 lipid peroxidation 활성이 감소하였다(Fig. 6B). SOD 활성 결과에서는 MPTP 10, 20, 50 μM 농도에서 각각 4.07(P<0.001), 3.10(P<0.001), 1.77(P<0.001)이었으나, Gb 추출물 처리 후 5.50(P<0.05), 5.20(P<0.01), 3.43(P<0.05)으로 증가하였다(Fig. 6C).

Fig 6. Effect of Gb and Ocs extracts on antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in MPTP-exposed planarian. Quantitative analysis of (A) catalase, (B) lipid peroxidation, and (C) superoxide dismutase (SOD) activities in planarian exposed to MPTP together with or without Gb extracts. Quantitative analysis of (D) catalase, (E) lipid peroxidation, and (F) SOD activities in planarian administered with MPTP together with or without Ocs extracts. Mean±SD (n=4). ^*P≤0.05, ^**P≤0.01, ^***P≤0.001 vs. control group; ^#P≤0.05, ^##P≤0.01 vs. MPTP alone group.

Ocs 추출물 처리 후에는 MPTP 10, 20, 50 μM 농도로 처리한 그룹에서 catalase 활성이 각각 3.90, 3.23(P<0.01), 1.63(P<0.001)이었으나, Ocs 추출물 처리 후에는 4.53, 3.57, 1.83으로 MPTP로 손상된 catalase 활성을 회복시키지 못했다(Fig. 6D). Lipid peroxidation 활성 측정으로 세포손상을 확인한 결과에서도 Ocs 추출물의 회복 효능이 확인되었는데, 1.93(P<0.01), 2.67(P<0.01), 4.67(P<0.001)로 확인된 각각의 10, 20, 50 μM로 MPTP를 처리한 그룹에서 유의성은 없지만 Ocs 추출물 처리 후에는 1.33, 1.83, 3.77로 LH 활성을 감소하여 세포손상이 보호되었다(Fig. 6E). 또한 SOD 활성에서도 10, 20, 50 μM MPTP 농도 처리로 각각 4.07(P<0.001), 3.10(P<0.001), 1.77(P<0.001)로 감소한 활성이 Ocs 추출물 처리 후 4.83(P<0.01), 3.93(P<0.05), 2.93(P<0.01)으로 유의하게 증가하였다(Fig. 6F).

본 연구에서는 6-OHDA나 MPTP로 유도된 parkinsonian planaria 모델을 이용하여 서로 다른 두 가지 곤충인 Gb와 Ocs 유래 추출물의 파킨슨병 개선 또는 치료와 항산화 효과에 관하여 확인하였다. Planaria는 포유류와 같은 고등동물에서 발현되는 주요 신경전달물질이 발현되고 있고, 이에 따라 다양한 약물의 독성학적, 약리학적 효능을 탐색, 평가하기 위한 모델로 사용되고 있다(Ireland 등, 2020; Wu 와 Li, 2018). 또한 planaria의 경우, 운동과 발작행동 반응을 관찰함으로써 다양한 질병에 대한 약물 후보군을 좀 더 빠르게 스크리닝할 수 있어 실험동물로 널리 사용되고 있다(Ramakrishnan과 DeSaer, 2011; Rawls 등, 2009).

곤충은 고단백과 고함량의 불포화지방산을 함유하여 영양학적으로 우수하므로 여러 질환 환자나 노인에게 좋은 식품으로 평가받고 있다. Park 등(2005)이 보고한 바에 의하면 용매의 종류에 따라 곤충의 유효 지표성분이 다르게 추출되는데, 특히 증류수를 이용한 곤충 추출물에서는 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)이라는 자유라디칼의 소거능 활성이 높게 나타났다. 이에 따라 본 연구에서는 Gb와 Ocs 각각의 분말에 대해 용매의 독성 등을 고려하여 증류수로 추출하였다. 또한 Kim 등(2021)은 세포독성 실험인 MTT 실험으로 Gb 추출물의 독성을 파악하였는데, 그 결과 낮은 농도(50, 250 μg/mL)에서 독성이 확인되지 않았지만, 500 μg/mL 이상의 고농도에서 독성을 확인하였다. Yoon 등(2014)의 경우는 Ocs 에탄올 추출물을 이용하여 MTT로 독성을 평가하였고, 그 결과 2,000 μg/mL까지는 독성이 확인되지 않았다. 즉, 위 두 가지 연구에서는 본 연구와 마찬가지로 고농도의 Gb 추출물에서는 독성을 나타냈고, Ocs 추출물은 고농도임에도 불구하고 독성이 따로 확인되지 않았다. 이러한 보고와 planaria 표현형 및 pLMV 측정 결과를 바탕으로 본 실험에서는 독성이 나타나지 않는 추출물 농도, 즉 Gb에서는 10 μg/mL, Ocs에서는 1,000 μg/mL로 설정하여 실험을 진행하였다(Fig. 2A, 2C).

본 연구와 같이 planaria에 도파민성 뉴런 소실을 유도하기 위해 6-OHDA를 처리한 뒤 행동 분석을 진행한 선행연구 보고가 있다. Nishimura 등(2011)은 2 μg의 6-OHDA를 planaria에 주사한 뒤 planaria가 이동하는 거리를 측정했는데, 최초 주사한 날에는 planaria의 이동 거리가 대조군 대비 현저히 거리가 짧았으나, 주사 후 5일이 지나면 운동능력을 회복하였다. Caronti 등(1999)은 planaria의 또 다른 종인 D. gonocephala s.l.에 6-OHDA를 24 μg/mL 농도로 24시간과 7일 동안 노출해 행동 분석을 조사하였다. 24시간 노출된 planaria는 pLMV가 저하되었으며, 7일 동안 노출된 planaria는 움직임이 확인되지 않았다. 또한 Kitamura 등(2003)은 planaria에 50~300 μM의 MPTP와 rotenone을 5일간 노출해 생존 테스트를 진행한 결과, 50 μM의 MPTP에 노출된 planaria는 모두 생존하였으나, 100, 200, 300 μM 농도의 MPTP를 처리하면 3일 전후로 모두 자가용해(autolysis) 되었다. 그러나 본 연구 결과처럼 MPTP에 노출했을 때 pSLA가 확인되지 않았으나(Fig. 4E, 4F), rotenone을 처리한 planaria에서는 pSLA가 나타났다. 또한 Jackson-Lewis와 Przedborski(2007)는 MPTP 처리한 마우스에서 파킨슨병의 전형적인 행동 장애를 나타내지는 않았지만, 도파민 뉴런 손실에 따른 운동 변화는 관찰되었다고 보고하였다. 이는 planaria에서 파킨슨병 모델을 유도하기 위해 사용하기에 적합한 약물의 종류와 처리 농도가 상이할 수 있으며, 약물에 따라 차별화된 작용기전 때문에 planaria의 행동 분석 방법도 다를 수 있을 것으로 추측된다. 본 연구 결과에서도 6-OHDA를 처리하면 planaria의 pLMV 감소가 관찰되었고, 곤충 추출물을 추가로 처리하면 6-OHDA로 유도된 planaria의 pLMV 감소가 유의적으로 회복되었다(Fig. 3C, 3D).

6-OHDA와 MPTP는 세포 내의 작용기전이 상이하다. 6-OHDA는 도파민이나 norephinephrine과 구조적으로 유사하여 dopamine transporter(DAT)나 norepinephrine transporter에 친화도가 높아 도파민성과 noradrenaline성 신경세포체와 신경종말의 변성을 야기하고 중추신경계와 말초신경계의 catecholamine성 작용기전을 모두 손상시키며, 활성산소, 퀴논, 멜라닌의 생성을 촉진하여 결과적으로 세포에서 산화적 스트레스를 증가시킨다(Blum 등, 2001). 반면 MPTP는 흡수된 후 MPP⁺로 대사되어 도파민성 신경세포의 DAT와 결합하고 미토콘드리아의 전자전달계 복합체 I을 손상시켜, 신경세포 내 활성산소종의 축적을 야기하는 것으로 알려져 있다(Kitamura 등, 2003). 생쥐를 이용한 실험에서 파킨슨병을 유발하기 위해 MPTP를 많이 사용해 왔으나, MPTP의 효과는 생쥐의 여러 가지 복합요인인 나이, 품종, 온도, 계절 등에 따라 효능에 차이가 커서 실험동물의 모델링에 어려움이 있는 것으로 보고되어 있다. 본 연구에서도 MPTP에 노출된 planaria는 pSLA가 야기되지 않았고, pLMV도 6-OHDA에 비해 저하된 패턴을 보였다(Fig. 3, Fig. 4). 또한 Gb와 Ocs 추출물이 MPTP에는 효능을 보이지 않았지만, 6-OHDA에 의해 유도된 planaria의 pLMV와 pSLA 등에는 효과를 보였으므로 본 연구에 사용한 곤충 추출물 역시 6-OHDA의 작용기전에 더 큰 영향을 주는 것으로 추측되며, 이에 관한 후속 연구가 필요하다.

잘 알려진 또 다른 곤충의 생리활성으로는 항산화 활성이 있다. 보고된 선행연구에 따르면, 실제로 쌍별귀뚜라미에서 에탄올을 이용하여 단백질을 추출하고 DPPH assay를 통해 항산화 효과를 확인하였으며(Ganguly 등, 2021; Kim 등, 2020), 벼메뚜기의 에탄올 추출물로는 마우스의 췌장세포에서 항산화 효과를 확인하였다(Im 등, 2019; Park과 Han, 2021). 또한 보고된 선행연구 결과(Zielińska 등, 2017)에 따르면 메뚜기를 포함하여 5가지 곤충의 항산화 효과를 평가하였는데, 각각의 식용곤충은 항라디칼 활성을 포함하여 금속 이온의 킬레이트화 능력과 환원력 억제 능력으로 항산화 효과가 확인되었다. 쌍별귀뚜라미의 경우, 분말과 분말 단백질 추출물에는 항산화 효능을 보이는 폴리페놀 함량이 식물성 더덕이나 당근만큼 풍부하며, 시스테인, 글루타티온, 방향족아민, 아스코르브산 등이 풍부하여 약 75%의 DPPH 라디칼 소거능을 보였고, 이는 16.20%의 갈색거저리 DPPH 라디칼 소거능에 비해 현저히 높은 항산화 활성이다(Kim 등, 2020). 본 연구 결과에서도 대표적 parkinsonian drugs인 6-OHDA와 MPTP로 유도된 산화적스트레스가 천연물인 Gb와 Ocs 추출물로 완화되었다(Fig. 5, Fig. 6).

본 연구는 Gb와 Ocs라는 2가지 곤충의 추출물을 이용하였고, parkinsonian planaria에서 발생하는 운동능력, 발작행동, 항산화 활성 같은 다중 기능 억제를 보호하였다. 두 가지 곤충 추출물 중, Ocs 추출물이 Gb에 비해 동일 농도에서 더 높은 antiparkinsonian 효능을 보였으므로, 추출물의 유효 지표성분을 분리•정제하여 다양한 parkinsonian 실험동물 모델에 적용해 그 효능 및 작용기전을 규명하는 후속 연구를 통해 천연물 유래 신규 파킨슨병의 후보물질 및 천연 항산화제 개발을 도출해 낼 수 있을 것이다.

본 연구에서는 MPTP와 6-OHDA를 이용해 planaria에 parkinsonism을 유도하였다. 6-OHDA에 의해 유도된 planaria parkinsonism에 Gb와 Ocs의 수용성 추출물을 처리했을 때, 운동 장애의 회복과 발작행동의 감소가 확인되었다. 또한 산화적스트레스에 대한 저항성을 조사하기 위해 catalase, lipid peroxidation, SOD 활성을 측정하여 Gb와 Ocs의 추출물이 항산화 효능이 있다는 것을 확인하였다. Gb가 Ocs보다 항산화 활성의 회복 및 운동실조와 발작행동의 회복에 더 크게 기여했다. 위와 같은 결과를 종합하면, Gb와 Ocs의 수용성 추출물은 항산화와 관련된 질병의 예방 및 치료와 신경독성 물질로 유발된 parkinsonism을 개선하는 데 기여할 수 있는 유용한 천연물 유래 추출물이다. 특히 무척추 편형동물인 Dugesia japonica planaria로 설계한 parkinsonian model에서는 MPTP에 노출된 planaria는 발작행동이 유발되지 않았고 항산화 활성 억제가 6-OHDA보다 낮았으나, 6-OHDA에 노출된 planaria는 운동능력 및 발작행동 모두 변화를 유발했고 항산화 활성 억제 능력도 더 컸다. Gb와 Ocs 추출물도 6-OHDA에 더 특이하게 반응했기 때문에 6-OHDA가 MPTP보다 더 유용한 parkinsonian neurotoxin이 될 수 있다는 것을 확인하였다.

본 연구는 한국연구재단 중견연구자지원사업 연구비(과제번호 NRF-2021R1A2C1005980)의 지원을 받아 수행되었습니다.